一種制備bmp-2蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備BMP-2蛋白的方法。本發(fā)明提供的制備BMP-2蛋白的方法，包括如下步驟：將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，然后按照如下參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵：37.0℃；溶氧>40％；pH7.0-7.3；起始溶氧>90％；200rpm；起始通氣量3.0SLPM；采用補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料；待發(fā)酵體系的OD600nm值為9時(shí)加入IPTG并使其濃度為1.0mM，然后按如下參數(shù)進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵4-6小時(shí)：37.0℃；溶氧>40％；pH7.20-7.40；BMP-2蛋白如序列表的序列1所示；所述重組菌的制備方法如下：將具有所述BMP-2蛋白的編碼基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌。本發(fā)明提供的方法具備產(chǎn)業(yè)化價(jià)值。
【專利說明】-種制備BMP-2蛋白的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備BMP-2蛋白的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP)是由骨基質(zhì)分泌的一種疏 水性蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β)超家族成員，由Urist等人于1965年首次提出， 1972年定義，并于1982年首次從脫鈣骨基質(zhì)提取物中分離得到。BMP家族包括BMP-1、 BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12 和BMP-14 等，其中BMP-2 具有明顯誘導(dǎo)未分化 的成纖維細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞的作用并能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)異 位骨形成和促進(jìn)骨折愈合。BMP-2是骨生成的啟動(dòng)因子，可以加速骨的重建，是骨修復(fù)基因 治療的理想目的基因，是目前唯一能誘導(dǎo)異位成骨的細(xì)胞因子，因而成為骨組織工程學(xué)研 究中最重要的生長(zhǎng)因子。目前，BMP-2已成功地用于治療骨不連和骨缺損的修復(fù)。
[0003]BMP-2的活性形式是二聚體，在成熟肽單鏈中有七個(gè)半胱氨酸殘基，形成三個(gè)肽鏈 內(nèi)二硫鍵，兩條肽鏈間再通過一個(gè)二硫鍵連接后才具有活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種制備BMP-2蛋白的方法。
[0005] 本發(fā)明提供的制備BMP-2蛋白的方法，包括如下步驟：
[0006] 將種子液按10%的體積比接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，然后按照如下參數(shù)進(jìn) 行第一階段發(fā)酵：
[0007]培養(yǎng)溫度：37.(TC;
[0008] 培養(yǎng)階段溶氧：MO%;
[0009]培養(yǎng)pH:7. 0-7. 3;
[0010] 接種種子液后的起始溶氧：〉90%;
[0011] 接種種子液后的起始轉(zhuǎn)速：200rpm;
[0012] 接種種子液后的起始通氣量：3.OSLPM;
[0013] 待發(fā)酵體系的OD6tltol值為9時(shí)加入IPTG并使其濃度為I. OmM，然后按如下參數(shù)進(jìn) 行第二階段發(fā)酵，第二階段發(fā)酵即誘導(dǎo)發(fā)酵：
[0014]誘導(dǎo)溫度：37. (TC;
[0015] 誘導(dǎo)發(fā)酵階段溶氧：>40%;
[0016]誘導(dǎo)發(fā)酵階段pH:7. 20-7. 40;
[0017] 誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)間：4_6小時(shí)；
[0018] 包括第一階段發(fā)酵和第二階段發(fā)酵在內(nèi)的發(fā)酵過程中，采用補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ) 料；
[0019] 所述BMP-2蛋白如序列表的序列1所示；
[0020] 所述種子液為(》6_"值=3. 0-5. 0的重組菌菌液；所述重組菌的制備方法如下：將 具有所述BMP-2蛋白的編碼基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌；
[0021] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如 下：1. 0g/100mL胰蛋白胨、0· 5g/100mL酵母粉、0· 5g/100mLNaCl、0.lg/100mLMgS04、 0· 05g/100mLCaCl2、0. 5g/100mLNa2HPO4 和 0· 25g/100mLKH2PO4 ;
[0022] 所述補(bǔ)料培養(yǎng)基由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下： 40g/L甘油、30g/L蛋白胨和15g/L酵母粉。
[0023] 所述BMP-2蛋白的編碼基因具體可如序列表的序列2所示。
[0024] 所述重組質(zhì)粒的制備方法具體如下：將序列表的序列2自5'末端第64-477位核 苷酸所示的雙鏈DNA分子插入載體pET-28a(+)的NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，得到重組 質(zhì)粒。
[0025] 所述方法中，"采用補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料"的方案如下：對(duì)于裝有3L所述發(fā)酵培養(yǎng) 基的5L發(fā)酵罐來說，從發(fā)酵體系OD6tltlmi = 1. 5開始補(bǔ)料，初始補(bǔ)料速度為2ml/min，每半小 時(shí)增加0. 4ml/min，增加至6ml/min后再每半小時(shí)減少0. 4ml/min，直至補(bǔ)料速度為0。
[0026] 所述方法中，"采用補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料"的方案如下：對(duì)于裝有30L所述發(fā)酵培 養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐來說，從發(fā)酵體系OD6tltlmi = 1. 5開始補(bǔ)料，初始補(bǔ)料速度為12ml/min，每 半小時(shí)增加2. 4ml/min，增加至36ml/min后再每半小時(shí)減少2. 4ml/min，直至補(bǔ)料速度為0。
[0027] 所述種子液的制備方法具體如下：挑取所述重組菌的單克隆，接種至種子培養(yǎng)基 中，37°C、220rpm振蕩培養(yǎng)至0D600nm值=3. 0-5. 0,即為種子液。
[0028] 所述種子培養(yǎng)基由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下： 1.0g/100mLTyptone、0.5g/100mLYeast和 0.5g/100mLNaCl。
[0029] 所述種子液的OD6cicinm值=4· 0。
[0030] 所述誘導(dǎo)發(fā)酵的時(shí)間為5小時(shí)。
[0031] 所述方法還包括如下步驟：
[0032] (1)完成所述誘導(dǎo)發(fā)酵后，收集菌體，用ρΗ8· 0、IM的PBS緩沖液懸浮，加入MgCl2并 使其濃度為1Μ，加入菌體質(zhì)量的0. 5%的溶菌酶，攪拌30min;然后在4°C下用高壓均質(zhì)機(jī)破 壁處理，然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心30min， 收集沉淀；
[0033] (2)用包涵體溶解液溶解步驟（1)得到的沉淀，然后在4°C下用高壓均質(zhì)機(jī)破壁處 理，然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心30min，收集 沉淀；
[0034] 所述包涵體溶解液由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為pH8. 5、150mmol/L的Tris-HCl 緩沖液；所述溶質(zhì)及其濃度如下：5mmol/LEDTA、體積比為2 %的TritonX-100和 2. 5MUera；
[0035] (3)用pH8. 0、IM的PBS緩沖液溶解步驟⑵得到的沉淀，然后在4°C下用高壓均 質(zhì)機(jī)破壁處理，然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心 30min，收集沉淀。
[0036] 所述步驟（1)中：用高壓均質(zhì)機(jī)破壁處理3_5(具體可為4次），每次的參數(shù)均 為：工作壓力為760bar;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5 (具體可為4次），每次的參數(shù)均為： 800W，超聲5s，停5s，總時(shí)間30min;
[0037] 所述步驟（2)中：用高壓均質(zhì)機(jī)破壁處理3-5(具體可為4次），每次的參數(shù)均 為：工作壓力為760bar;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5 (具體可為4次），每次的參數(shù)均為： 800W，超聲5s，停5s，總時(shí)間30min;
[0038] 所述步驟（3)中：用高壓均質(zhì)機(jī)破壁處理3-5(具體可為4次），每次的參數(shù)均 為：工作壓力為760bar;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5 (具體可為4次），每次的參數(shù)均為： 800W，超聲5s，停5s，總時(shí)間30min。
[0039] 本發(fā)明的發(fā)明人首先通過搖瓶發(fā)酵，初步摸索通過發(fā)酵所述重組菌制備BMP-2蛋 白的方法中的各個(gè)參數(shù)，最佳參數(shù)如下：在培養(yǎng)體系的OD6tltlmi值為0. 9時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘 導(dǎo)，IPTG濃度為ImM時(shí)誘導(dǎo)效果最佳，采用37°C的誘導(dǎo)溫度最佳。
[0040] 在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的發(fā)明人建立了制備BMP-2蛋白的方法，可以應(yīng)用 于工業(yè)生產(chǎn)，具有遺傳背景清楚、使用安全、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高、生產(chǎn)周期短和成本低的優(yōu) 點(diǎn)，經(jīng)過連續(xù)三批中試規(guī)模（5L體積）和三批50L發(fā)酵罐的生產(chǎn)，證實(shí)本發(fā)明提供的方法具 備產(chǎn)業(yè)化價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1為實(shí)施例3的步驟一的結(jié)果。
[0042] 圖2為實(shí)施例3的步驟二的結(jié)果。
[0043] 圖3為實(shí)施例3的步驟三的結(jié)果。
[0044] 圖4為實(shí)施例4的結(jié)果（方案一）。
[0045] 圖5為實(shí)施例4的結(jié)果（方案二）。
[0046] 圖6為實(shí)施例4的結(jié)果（方案三）。
[0047] 圖7為實(shí)施例6的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0048] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0049] 實(shí)施例1、重組菌的構(gòu)建
[0050] 1、將序列表的序列2自5'末端第64-477位核苷酸所不的雙鏈DNA分子插入載體 pET-28a(+)的NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒中，插入的雙鏈DNA 分子與質(zhì)粒本身的部分DNA融合，形成序列表的序列2所示的融合基因，表達(dá)序列表的序列 1所示的融合蛋白。
[0051]2、將步驟1得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌。
[0052] 實(shí)施例2、種子培養(yǎng)參數(shù)的優(yōu)化（種子培養(yǎng)基的優(yōu)化）
[0053] 挑取實(shí)施例1得到的重組菌的單克隆，接種至種子培養(yǎng)基（分別采用1#培養(yǎng)基、 2#培養(yǎng)基或3#培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基）中，37°C、220rpm振蕩培養(yǎng)，每2小時(shí)無菌取樣檢 測(cè)OD6tltlmi 值。
[0054] 1# 培養(yǎng)基：溶劑為水，含I. 0g/100mLTyptone、0. 5g/100mLYeast和 0· 5g/100mL NaCl。
[0055] 2# 培養(yǎng)基：溶劑為水，含I. 0g/100mLTyptone、0. 5g/100mLYeast和I. 0g/100mL NaCl。
[0056] 3# 培養(yǎng)基：溶劑為水，含I.Og/lOOmLTyptoneU.Og/lOOmLYeast、0. 5g/100mL NaCl、0·lg/lOOmLMgSO4 和 0· 05g/100mLCaCl2。
[0057] 米用各個(gè)種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)2h、4h或6h后的OD6tltlmi值見表1。
[0058] 表1米用各個(gè)種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)2h、4h或6h后的OD6tltlmi值
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備BMP-2蛋白的方法，包括如下步驟： 將種子液按10 %的體積比接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，然后按照如下參數(shù)進(jìn)行第 一階段發(fā)酵： 培養(yǎng)溫度：37. 0°C ; 培養(yǎng)階段溶氧：>40% ; 培養(yǎng) pH :7. 0-7. 3 ; 接種種子液后的起始溶氧：〉90*% ; 接種種子液后的起始轉(zhuǎn)速：200rpm ; 接種種子液后的起始通氣量：3. 0SLPM ; 待發(fā)酵體系的〇D6(l(lmi值為9時(shí)加入IPTG并使其濃度為1. OmM，然后按如下參數(shù)進(jìn)行第 二階段發(fā)酵，第二階段發(fā)酵即誘導(dǎo)發(fā)酵： 誘導(dǎo)溫度：37. 0°C ; 誘導(dǎo)發(fā)酵階段溶氧：>40 % ; 誘導(dǎo)發(fā)酵階段pH :7. 20-7. 40 ; 誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)間：4-6小時(shí)； 包括第一階段發(fā)酵和第二階段發(fā)酵在內(nèi)的發(fā)酵過程中，采用補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料； 所述BMP-2蛋白如序列表的序列1所不； 所述種子液為(?^^值二3. 0-5. 0的重組菌菌液；所述重組菌的制備方法如下：將具有 所述BMP-2蛋白的編碼基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下： l.Og/lOOmL 胰蛋白胨、0.5g/100mL 酵母粉、0.5g/100mL NaCl、0.1g/100mL MgS04、 0? 05g/100mL CaCl2、0. 5g/100mL Na2HP04 和 0? 25g/100mL KH2P04 ; 所述補(bǔ)料培養(yǎng)基由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下：40g/L甘 油、30g/L蛋白胨和15g/L酵母粉。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述BMP-2蛋白的編碼基因如序列表的序 列2所示。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述重組質(zhì)粒的制備方法如下：將序列表的 序列2自5'末端第64-477位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入載體pET-28a(+)的Nde I 和Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，"采用補(bǔ)料培養(yǎng)基 進(jìn)行補(bǔ)料"的方案如下：對(duì)于裝有3L所述發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐來說，從發(fā)酵體系0D6(l(lnm=1. 5開始補(bǔ)料，初始補(bǔ)料速度為2ml/min，每半小時(shí)增加0. 4ml/min，增加至6ml/min后再 每半小時(shí)減少〇. 4ml/min，直至補(bǔ)料速度為0。
5. 如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，"采用補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn) 行補(bǔ)料"的方案如下：對(duì)于裝有30L所述發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐來說，從發(fā)酵體系0D6(l(lnm=1. 5開始補(bǔ)料，初始補(bǔ)料速度為12ml/min，每半小時(shí)增加2. 4ml/min，增加至36ml/min后 再每半小時(shí)減少2. 4ml/min，直至補(bǔ)料速度為0。
6. 如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述種子液的0D6(l(lmi值=4. 0。
7. 如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述誘導(dǎo)發(fā)酵的時(shí)間為5小時(shí)。
8. 如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法還包括如下步驟： (1) 完成所述誘導(dǎo)發(fā)酵后，收集菌體，用PH8. 0、1M的PBS緩沖液懸浮，加入MgCl2并使 其濃度為1M，加入菌體質(zhì)量的0. 5%的溶菌酶，攪拌30min ;然后在4°C下用高壓均質(zhì)機(jī)破壁 處理，然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心30min，收 集沉淀； (2) 用包涵體溶解液溶解步驟（1)得到的沉淀，然后在4°C下用高壓均質(zhì)機(jī)破壁處理， 然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心30min，收集沉 淀； 所述包涵體溶解液由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為pH8. 5、150mmol/L的Tris-HCl緩沖 液；所述溶質(zhì)及其濃度如下：5mmol/L EDTA、體積比為2%的Triton X-100和2. 5MUera ; (3) 用pH8. 0、1M的PBS緩沖液溶解步驟（2)得到的沉淀，然后在4°C下用高壓均質(zhì)機(jī)破 壁處理，然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心30min， 收集沉淀。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于： 所述步驟（1)中：用高壓均質(zhì)機(jī)破壁處理3-5(具體可為4次），每次的參數(shù)均為：工作 壓力為760bar ;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5(具體可為4次），每次的參數(shù)均為：800W，超 聲5s，停5s，總時(shí)間30min ; 所述步驟（2)中：用高壓均質(zhì)機(jī)破壁處理3-5(具體可為4次），每次的參數(shù)均為：工作 壓力為760bar ;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5(具體可為4次），每次的參數(shù)均為：800W，超 聲5s，停5s，總時(shí)間30min ; 所述步驟（3)中：用高壓均質(zhì)機(jī)破壁處理3-5(具體可為4次），每次的參數(shù)均為：工作 壓力為760bar ;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5(具體可為4次），每次的參數(shù)均為：800W，超 聲5s，停5s，總時(shí)間30min。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104357519SQ201410541699
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月14日
【發(fā)明者】張東剛, 楊建軍, 彭繼學(xué) 申請(qǐng)人:煙臺(tái)正海生物技術(shù)有限公司