一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，該方法包括如下步驟:1)復(fù)蘇293細(xì)胞并傳代擴(kuò)增；2)將擴(kuò)增后的細(xì)胞接種于生物反應(yīng)器中繼續(xù)培養(yǎng)；3)當(dāng)細(xì)胞當(dāng)日葡萄糖消耗量達(dá)到70?100克時，進(jìn)行病毒接種；4)收集細(xì)胞培養(yǎng)物，進(jìn)行凍融、離心、超濾和離子交換層析；5)檢測離子交換層析洗脫液病毒顆粒濃度，并將其稀釋至目標(biāo)濃度。本發(fā)明方法制備的工作毒種質(zhì)量穩(wěn)定可靠；同時具有節(jié)省勞動力、顯著提升產(chǎn)量的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備病毒毒種庫的方法，具體地，涉及一種制備重組人5型腺病毒 毒種庫的方法，更具體地，涉及一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 重組人5型腺病毒是利用基因工程技術(shù)刪除人5型腺病毒ElB-55kD區(qū)及E3區(qū)78.3 ~85.8mu基因片段而獲得的一種溶瘤腺病毒。由于其是一種選擇復(fù)制性病毒，只在腫瘤細(xì) 胞中復(fù)制，特異性殺滅腫瘤細(xì)胞，而不損害正常細(xì)胞，故其在臨床研究中顯示了良好的抗腫 瘤療效和安全性。
[0003] 在正常細(xì)胞中，ElB-55kD對腺病毒復(fù)制過程中晚期mRNA的出核起很重要的作用。 當(dāng)被刪除后，復(fù)制過程在轉(zhuǎn)錄翻譯階段被打斷，不能有效復(fù)制。而腫瘤細(xì)胞由于遺傳的不穩(wěn) 定性，可以彌補(bǔ)ElB-55kD所起的作用，因此即使病毒刪除了 ElB-55kD，病毒晚期mRNA的出核 不受影響，從而可以順利的完成晚期蛋白的翻譯、合成和裝配。所以重組人5型腺病毒可在 腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的裂解，從而起到殺滅腫瘤的目的。
[0004] ElB-55kD蛋白的功能是作用于正常細(xì)胞中的P53基因產(chǎn)物，使其失活，從而阻止 P53基因誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞分裂停止或細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使病毒得以復(fù)制、繁殖。通過這種方 式，人5型腺病毒可在p53基因正常的細(xì)胞中有效繁殖。而缺失了 ElB-55kD基因的人5型腺病 毒，由于不能產(chǎn)生這個蛋白來與P53基因產(chǎn)物作用，一旦進(jìn)入細(xì)胞后，該病毒便不能有效地 繁殖。在p53基因突變的細(xì)胞中，由于p53蛋白功能的喪失，缺失ElB-55kD基因的重組人5型 腺病毒可以不受抑制，在細(xì)胞中有效繁殖，進(jìn)而殺死宿主細(xì)胞。因此，由于重組人5型腺病毒 不能編碼ElB-55kD蛋白來與細(xì)胞中的p53基因產(chǎn)物作用，使得重組人5型腺病毒在p53+或 p53-的細(xì)胞中的繁殖能力具有顯著差別。重組人5型腺病毒在p53 -細(xì)胞中的繁殖能力要 比其在P53基因正常細(xì)胞中高約100倍。這樣就造成了重組人5型腺病毒在p53-的細(xì)胞中特 異性生長。如前所述，很多人體腫瘤細(xì)胞P53基因產(chǎn)生突變，重組人5型腺病毒對這些腫瘤可 以產(chǎn)生特異性殺傷。這種殺傷性質(zhì)上屬于病毒對細(xì)胞所能產(chǎn)生的殺傷作用。
[0005] 重組人5型腺病毒基因中另一刪除區(qū)E3區(qū)78.3~85.8mu基因片段。此段基因刪除 后，重組人5型腺病毒對抗機(jī)體免疫清除機(jī)制的能力大為降低，在正常細(xì)胞內(nèi)存在時間縮 短。因此，重組人5型腺病毒在體內(nèi)的安全性明顯提高。
[0006] 制備重組人5型腺病毒毒種的技術(shù)難點(diǎn)主要集中在兩個方面：（1)哺乳動物細(xì)胞大 規(guī)模培養(yǎng)上，盡可能多的為腺病毒擴(kuò)增提供優(yōu)質(zhì)宿主細(xì)胞；（2)腺病毒在宿主細(xì)胞中的大規(guī) 模增殖。通過利用生物反應(yīng)器來制備毒種庫，可解決這兩方面的技術(shù)難點(diǎn)。
[0007]重組人5型腺病毒(安柯瑞)作為有效的載體近年來越來越多地被用于基因治療的 研究，工作毒種是制備重組人5型腺病毒(安柯瑞)的首要條件，原工作毒種制備主要采用細(xì) 胞瓶，以293細(xì)胞為宿主細(xì)胞，待宿主細(xì)胞擴(kuò)增至一定數(shù)量后，以主毒種感染293細(xì)胞，培養(yǎng) 收獲細(xì)胞培養(yǎng)物即為安柯瑞工作種子批，工作種子批用于制備安柯瑞原液?，F(xiàn)有細(xì)胞瓶法 的缺點(diǎn)為勞動強(qiáng)度大，耗時耗力，產(chǎn)量很低，導(dǎo)致幾乎每2年就必須制備安柯瑞工作毒種;并 且收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物中含有大量的宿主蛋白和核酸，導(dǎo)致收獲液無法進(jìn)行無菌過濾，這對 制備的環(huán)境和操作提出了巨大的挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法， 解決現(xiàn)有細(xì)胞瓶法勞動強(qiáng)度大，耗時耗力，產(chǎn)量低的問題。
[0009] 同時本發(fā)明還解決收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物中含有大量的宿主蛋白和核酸，導(dǎo)致收獲液 無法進(jìn)行無菌過濾，這對制備的環(huán)境和操作提出了巨大的挑戰(zhàn)的問題。
[0010] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0011] 本發(fā)明提供一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，該方法包 括如下步驟：1)復(fù)蘇293細(xì)胞并傳代擴(kuò)增；2)將擴(kuò)增后的細(xì)胞接種于生物反應(yīng)器中繼續(xù)培 養(yǎng);3)當(dāng)細(xì)胞當(dāng)日葡萄糖消耗量達(dá)到70-100克時，進(jìn)行病毒接種;4)收集細(xì)胞培養(yǎng)物，進(jìn)行 凍融、離心、超濾和離子交換層析;5)檢測離子交換層析洗脫液病毒顆粒濃度，并將其稀釋 至目標(biāo)濃度。
[0012] 優(yōu)選地，步驟2)的具體方法如下：每瓶細(xì)胞傾去細(xì)胞培養(yǎng)液后加入消化液進(jìn)行消 化，消化完全后加入完全培養(yǎng)基終止消化，制成細(xì)胞懸浮液，合并細(xì)胞懸浮液入接種瓶內(nèi)； 將細(xì)胞懸浮液接種于已加入新的完全培養(yǎng)液的生物反應(yīng)器中繼續(xù)培養(yǎng)，接入細(xì)胞總量在 10 9個以上;細(xì)胞接入后每日取樣，測培養(yǎng)液的葡萄糖濃度;細(xì)胞處于對數(shù)生長期后，細(xì)胞代 謝產(chǎn)物可能使生物反應(yīng)器內(nèi)完全培養(yǎng)液pH值下降，系統(tǒng)自動補(bǔ)加碳酸氫鈉溶液調(diào)控生物反 應(yīng)器內(nèi)pH值。
[0013] 優(yōu)選地，步驟3)的具體方法如下：當(dāng)細(xì)胞當(dāng)日葡萄糖消耗量達(dá)到70~100克時，打 空生物反應(yīng)器內(nèi)的完全培養(yǎng)液，將病毒種子液接入生物反應(yīng)器內(nèi)，并補(bǔ)加接毒培養(yǎng)液進(jìn)行 病毒接種;接入量不低于1E13TCID 5q ;接毒8小時后恢復(fù)灌注接毒培養(yǎng)液，每天的灌注量根據(jù) 細(xì)胞培養(yǎng)階段的灌注量進(jìn)行灌注。
[0014] 優(yōu)選地，步驟4)的具體方法如下：接毒48-120小時后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，-20°C以下 至室溫反復(fù)凍融2-4次，并對其進(jìn)行離心，丟棄細(xì)胞碎片，收集上清液;對上清液進(jìn)行濃縮和 洗濾;離子交換層析，收集病毒峰，病毒峰在〇D 26Q不低于300mAU時開始收集，持續(xù)收集至吸 收值下降，吸收值低于600mAU時放棄收集。
[0015] 優(yōu)選地，步驟5)的具體方法如下：檢測離子交換層析洗脫液病毒顆粒濃度，用含 5%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基將其稀釋至目標(biāo)濃度，作為生產(chǎn)用毒種。
[0016] 優(yōu)選地，步驟2)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)定的參數(shù)為:培養(yǎng)溫度35-38 °C、pH值7.0-7.6、溶氧 30-60%、轉(zhuǎn)速90-150rpm、模式為灌注模式。
[0017]優(yōu)選地，步驟3)的病毒培養(yǎng)設(shè)定的參數(shù)為：病毒培養(yǎng)溫度在34-36 °C，pH值7.0-7.6、溶氧30-60 %、轉(zhuǎn)速90-150rpm、模式為灌注模式。
[0018]優(yōu)選地，步驟2)接入細(xì)胞懸浮液之前，先將細(xì)胞貼壁載體和PBS緩沖溶液裝入生物 反應(yīng)器中，檢查生物反應(yīng)器是否正常工作；再將生物反應(yīng)器放入滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌90分 鐘。
[0019]優(yōu)選地，步驟2)生物反應(yīng)器滅菌后放空PBS緩沖溶液，接入完全培養(yǎng)液，在37 °C環(huán) 境中試運(yùn)行，至細(xì)胞上罐;試運(yùn)行期間檢菌培養(yǎng)時間必須大于48小時。
[0020] 優(yōu)選地，步驟2)中由測得的葡萄糖濃度計算每日糖耗，以糖耗值作為細(xì)胞生長狀 態(tài)的指標(biāo);細(xì)胞上罐后第2天開始灌注，設(shè)定灌注體積為2L/天，第3天則根據(jù)每日糖耗來調(diào) 節(jié)完全培養(yǎng)液的灌注量，使培養(yǎng)罐內(nèi)培養(yǎng)液的殘?zhí)侵悼刂圃? ± 〇. 5g/L。
[0021] 優(yōu)選地，完全培養(yǎng)液的配方:碳酸氫鈉3.7g//L、DMEM(高糖)粉13.48g/L、已滅活的 胎牛血清l〇〇ml/L;所述接毒培養(yǎng)液的配方為:碳酸氫鈉3.7g/L、DMEM(高糖)粉13.48g/L、已 滅活的胎牛血清50ml/L。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于:本發(fā)明提供一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型 腺病毒毒種庫的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1)用生物反應(yīng)器法代替細(xì) 胞瓶法制備工作毒種，可解決勞動強(qiáng)度大，耗時耗力的問題，操作人員相對于細(xì)胞瓶法減少 了一半，生產(chǎn)周期也縮短了25%; (2)利用生物反應(yīng)器來制備工作毒種，并且對生物反應(yīng)器 收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行純化，去除其中大量的核酸和蛋白，使得培養(yǎng)物可以進(jìn)行無菌過濾 處理，制備出的工作毒種的活性為3. 16X10nTCID5Q/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞瓶法6. 15X 1010TCID5〇/ml。
[0023] 生物反應(yīng)器操作簡單，運(yùn)行穩(wěn)定可靠，自動化控制程度高、培養(yǎng)表面積大、易于規(guī) ?；a(chǎn)，并且生物反應(yīng)器能夠提供更加良好的細(xì)胞生長環(huán)境，利于病毒繁殖。該方法制備 的工作毒種質(zhì)量穩(wěn)定可靠，經(jīng)檢驗，完全符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，同時具有節(jié)省了勞動力、顯著 提升產(chǎn)量的優(yōu)點(diǎn)。
[0024] 本發(fā)明利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫可解決勞動強(qiáng)度大，耗時耗 力的問題。對收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行凍融和離心，起到釋放病毒并收集病毒液的作用;對病 毒液進(jìn)行超濾和離子交換層析，從而對其起到濃縮和洗濾的作用。通過以上純化步驟能夠 去除病毒液中大量的核酸和蛋白，使得病毒液可以進(jìn)行無菌過濾處理，從而使制備出的毒 種活性和產(chǎn)量均顯著提高。
【附圖說明】
[0025] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0026] 圖1為采用細(xì)胞瓶法制備工作毒種的具體流程圖。
[0027] 圖2為細(xì)胞瓶法與生物反應(yīng)器法制備的工作毒種量對比圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0029]生物材料及儀器：
[0030] (1)生物反應(yīng)器:NBS公司Celligen plus basket反應(yīng)器。
[0031] (2)細(xì)胞貼壁載體(DISK):Fibra-cel Disk為NBS公司研發(fā)生產(chǎn)。
[0032] (3)293細(xì)胞：引進(jìn)于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，代數(shù)為第35代，為貼壁細(xì)胞。
[0033] 原工作毒種制備主要采用細(xì)胞瓶法，復(fù)蘇一支工作細(xì)胞，經(jīng)幾次傳代后，取部分細(xì) 胞感染主毒種，然后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，剩余細(xì)胞繼續(xù)傳代，傳代至一定數(shù)量后，取部分進(jìn)行 感染，剩余繼續(xù)傳代，如此重復(fù)，直至細(xì)胞代次達(dá)到規(guī)定要求后停止，具體流程如圖1所示。
[0034] 本發(fā)明利用生物反應(yīng)器來制備工作毒種，具體實施例如下：
[0035]實施例1:細(xì)胞復(fù)蘇與傳代
[0036] 從細(xì)胞庫中取出細(xì)胞凍存管，立刻投入37°C水浴中，并不時攪動，快速解凍。
[0037] 在超凈臺內(nèi)，用無菌移液管吸出凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸浮液，注入無菌離心管中，在離 心管中添加完全培養(yǎng)液做2倍以上稀釋，以1800rpm離心5min，去上清。
[0038]向離心管中加入完全培養(yǎng)液，用無菌移液管吹吸混懸均勾后，轉(zhuǎn)入已加有完全培 養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶內(nèi)終體積以約35ml/l 75cm2為參照比例。
[0039]在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞在瓶底長至80 %滿時準(zhǔn)備傳代。
[0040]傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，每瓶加入消化液3ml/l 75cm2，蓋好瓶蓋，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使消 化液浸潤瓶底，待細(xì)胞完全脫離瓶底并散開后，每瓶加入30ml/175cm2完全培養(yǎng)液終止消 化。
[0041 ]吹吸細(xì)胞懸浮液，使懸浮液中的細(xì)胞分散，將細(xì)胞懸浮液分為3份，分別傳入與原 瓶培養(yǎng)面積相同的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液于已傳入細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶內(nèi)終 體積以35ml/l 75cm2為參照比例。
[0042]傳代后的細(xì)胞及時放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中水平靜置培養(yǎng)。
[0043]實施例2:生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞
[0044] 合并細(xì)胞懸浮液入接種瓶內(nèi)，接種瓶內(nèi)的細(xì)胞懸浮液體積不得超過2L，計算接入 細(xì)胞總量，細(xì)胞總量應(yīng)在1〇9個以上，一般必須超過90瓶細(xì)胞。
[0045] 關(guān)閉生物反應(yīng)器所有的自動控制，打空生物反應(yīng)罐內(nèi)的用于檢菌的完全培養(yǎng)基， 加入適量完全培養(yǎng)液，體積控制在8L，設(shè)定控制溫度為33°C，進(jìn)行預(yù)熱。
[0046] 將接種瓶內(nèi)的擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞種子液接入生物反應(yīng)器中，補(bǔ)入完全培養(yǎng)液至生物反 應(yīng)器生產(chǎn)體積（10L)，設(shè)置生物反應(yīng)器參數(shù)：溫度為37 °C、溶氧50 %、pH值為7.3、轉(zhuǎn)速為 120rpm、氣體流量為 0.4L/min。
[0047] 培養(yǎng)細(xì)胞接入后每日取樣，測培養(yǎng)液的葡萄糖濃度，由測得的葡萄糖濃度計算每 日糖耗，以糖耗值作為細(xì)胞生長狀態(tài)的指標(biāo)。
[0048]細(xì)胞上罐后第2天，開始灌注，設(shè)定灌注體積為2L/天。細(xì)胞上罐后第3天，根據(jù)每日 糖耗來調(diào)節(jié)完全培養(yǎng)液的灌注量，使培養(yǎng)罐內(nèi)培養(yǎng)液的殘?zhí)侵悼刂圃趌±〇.5g/L。
[0049] 細(xì)胞處于對數(shù)生長期后，細(xì)胞代謝產(chǎn)物可能使罐內(nèi)完全培養(yǎng)液pH值下降，系統(tǒng)自 動補(bǔ)加碳酸氫鈉溶液調(diào)控罐內(nèi)pH值。
[0050] 在每日糖耗值為75.5g/D時，準(zhǔn)備接入病毒種子。
[0051] 實施例3:生物反應(yīng)器病毒接毒及培養(yǎng)
[0052]病毒接種瓶中加入1.5L的接毒培養(yǎng)液，生物反應(yīng)器接毒，中間毒種的接入量多 1E13TCID50。
[0053]將中間毒種液在37°C水浴中溶解，在生物安全柜中，用無菌移液管吸出并加入上 述病毒接種瓶中，然后混合均勻。
[0054]打空生物反應(yīng)器內(nèi)的完全培養(yǎng)液，將混合均勻的中間毒種液接入生物反應(yīng)器內(nèi)， 向生物反應(yīng)器內(nèi)補(bǔ)加接毒培養(yǎng)液或細(xì)胞培養(yǎng)階段剩余的完全培養(yǎng)基至10L。
[0055] 設(shè)置生物反應(yīng)器參數(shù):溫度為36°C、溶氧50%、？!1為7.3、轉(zhuǎn)速為150印111、氣體流量 為0·4L/min〇
[0056] 8小時后恢復(fù)灌注接毒培養(yǎng)液，每天的灌注量根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)階段的灌注量進(jìn)行灌 注，生物反應(yīng)器病毒培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)階段的灌注量為參考，逐步降低病毒培養(yǎng)階段的灌 注量。
[0057] 當(dāng)接毒培養(yǎng)基使用完畢后，改用大罐維持液進(jìn)行灌注，維持液配方為碳酸氫鈉 3 · 7g/L、DMEM(低糖)粉9 · 9g/L、已滅活的胎牛血清20ml/L。
[0058] 實施例4:病毒液的收獲及純化
[0059] 接毒72小時后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，將其放置在-80°C至室溫反復(fù)凍融3次，再放入 Beckman J-25高速離心機(jī)中，8000rpm、4°C離心10min，收集上清液，即病毒液。
[0060] 收獲的病毒液經(jīng)MILLPORE PELLICON 2超濾膜包（lOOOkDa)進(jìn)行超濾純化，整個超 濾過程收集回流液丟棄透過液。先將病毒液濃縮至2.5L，并對濃縮液進(jìn)行洗濾；當(dāng)緩沖液使 用約13L時，添加 Benzonase核酸酶進(jìn)行處理，添加量控制在80IU/ml之內(nèi)，室溫放置30min后 繼續(xù)超濾;最后將病毒液濃縮到約2L。
[0061 ] 超濾后的病毒液通過GE公司生產(chǎn)的填料為SOURCE 30Q的FINELINE 200L離子交換 柱進(jìn)行離子交換層析。樣品進(jìn)樣流速為80ml/min;進(jìn)樣完畢后，設(shè)定6%梯度，梯度長度為 〇min，流速200ml/min，平衡柱5個柱體積;進(jìn)行線性梯度洗脫，梯度洗脫條件流速為180ml/ min，梯度長度為180min;收集OD26Q 600mAU-900mAU時的病毒峰。
[0062] 對上述離子交換層析洗脫液進(jìn)行顆粒數(shù)檢測，并用不含胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng) 基將其稀釋，混勻后用〇. 22μπι無菌過濾器進(jìn)行過濾，過濾后加入胎牛血清;最終胎牛血清的 濃度為5%，病毒液的濃度稀釋到2.8E12vp/ml;將病毒液分裝于50ml管中，置超低溫冰箱中 保存。
[0063] 制備的毒種按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗，其檢項全部符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，具體檢項與 結(jié)果見下表。
[0066] 對于毒種而言，其最關(guān)鍵的指標(biāo)為活性，本發(fā)明制備的工作毒種的活性為3.16 X lOUTCIDso/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)彡3 X 101()TCID5()/ml。用細(xì)胞瓶法制備的工作毒種，其平均 活性為6.15X10 1()TCID5Q/ml。用生物反應(yīng)器制備的工作毒種的活性明顯高于細(xì)胞瓶法，其 本質(zhì)原因是對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行了粗純化。
[0067] 將細(xì)胞瓶法與生物反應(yīng)器法制備的工作毒種效率進(jìn)行對比，具體內(nèi)容見下表及附 圖2:
[0069]利用生物反應(yīng)器制備了 1批工作毒種，其批號為WV20140529,所得到的病毒量為 6.1 X 1014TCID5Q，制備一批安柯瑞原液所需要的毒種量為1 X 1013TCID5Q，可以制備61批安柯 瑞原液。將用細(xì)胞瓶法制備的工作毒種(批號為WV20120523)與生物反應(yīng)器制備制備的工作 毒種進(jìn)行比較，由附圖2可以看出，細(xì)胞瓶法制備的1批毒種，其病毒量只有6.8 X 1013TCID5Q，可以制備6.8批安柯瑞原液，而用生物反應(yīng)器制備的工作毒種的量是細(xì)胞瓶法 的9倍。
[0070] 從表中可以看出新的制備工藝大大提高了效率，人力節(jié)省了 1倍，毒種產(chǎn)量提高9 倍。由于安柯瑞在制備毒種的時候是無法進(jìn)行安柯瑞原液生產(chǎn)的，主要原因是其共用相關(guān) 設(shè)備，使用新工藝后，安柯瑞的設(shè)備利用率可以大大提高。
[0071] 采用生物反應(yīng)器法制備安柯瑞工作毒種其毒種制備量是原先工藝的9倍，而且質(zhì) 量穩(wěn)定可靠，此工藝大大節(jié)省了人力和動力成本。按照目前的安柯瑞年生產(chǎn)量，此批毒種可 用于今后10年的安柯瑞原液生產(chǎn)，再也不用像以往一樣每隔1-2年就進(jìn)行1批工作毒種的制 備，這充分保證了安柯瑞原液批與批之間的穩(wěn)定性。
[0072] 以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影 響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項】
1. 一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，其特征在于，該方法包括 如下步驟：1)復(fù)蘇293細(xì)胞并傳代擴(kuò)增;2)將擴(kuò)增后的細(xì)胞接種于生物反應(yīng)器中繼續(xù)培養(yǎng)； 3)當(dāng)細(xì)胞當(dāng)日葡萄糖消耗量達(dá)到70-100克時，進(jìn)行病毒接種;4)收集細(xì)胞培養(yǎng)物，進(jìn)行凍 融、離心、超濾和離子交換層析;5)檢測離子交換層析洗脫液病毒顆粒濃度，并將其稀釋至 目標(biāo)濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，其 特征在于，所述步驟2)的具體方法如下:每瓶細(xì)胞傾去細(xì)胞培養(yǎng)液后加入消化液進(jìn)行消化， 消化完全后加入完全培養(yǎng)基終止消化，制成細(xì)胞懸浮液，合并細(xì)胞懸浮液入接種瓶內(nèi)；將細(xì) 胞懸浮液接種于已加入新的完全培養(yǎng)液的生物反應(yīng)器中繼續(xù)培養(yǎng)，接入細(xì)胞總量在IO 9個 以上;細(xì)胞接入后每日取樣，測培養(yǎng)液的葡萄糖濃度;細(xì)胞處于對數(shù)生長期后，細(xì)胞代謝產(chǎn) 物可能使生物反應(yīng)器內(nèi)完全培養(yǎng)液PH值下降，系統(tǒng)自動補(bǔ)加碳酸氫鈉溶液調(diào)控生物反應(yīng)器 內(nèi)pH值。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，其 特征在于，所述步驟3)的具體方法如下：當(dāng)細(xì)胞當(dāng)日葡萄糖消耗量達(dá)到70-100克時，打空生 物反應(yīng)器內(nèi)的完全培養(yǎng)液，將病毒種子液接入生物反應(yīng)器內(nèi)，并補(bǔ)加接毒培養(yǎng)液進(jìn)行病毒 接種;接入量不低于1E13TCID5Q;接毒8小時后恢復(fù)灌注接毒培養(yǎng)液，每天的灌注量根據(jù)細(xì)胞 培養(yǎng)階段的灌注量進(jìn)行灌注。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，其 特征在于，所述步驟4)的具體方法如下：接毒48-120小時后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，-20°C以下至 室溫反復(fù)凍融2-4次，并對其進(jìn)行離心，丟棄細(xì)胞碎片，收集上清液;對上清液進(jìn)行濃縮和洗 濾;離子交換層析，收集病毒峰，病毒峰在OD 26q不低于300mAU時開始收集，持續(xù)收集至吸收 值下降，吸收值低于600mAU時放棄收集。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，其 特征在于，所述步驟5)的具體方法如下:檢測離子交換層析洗脫液病毒顆粒濃度，用含5 % 胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基將其稀釋至目標(biāo)濃度，作為生產(chǎn)用毒種。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，其 特征在于，所述步驟2)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)定的參數(shù)為:培養(yǎng)溫度35-38°C、pH值7.0-7.6、溶氧30-60%、轉(zhuǎn)速90-150印111、氣體流量為0.2-1171^11、模式為灌注模式。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，其 特征在于，所述步驟3)的病毒培養(yǎng)設(shè)定的參數(shù)為:病毒培養(yǎng)溫度在34-36°C，pH值7.0-7.6、 溶氧30-60%、轉(zhuǎn)速90-150印111、氣體流量為0.2-1171^11、模式為灌注模式。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，其 特征在于，所述步驟2)接入細(xì)胞懸浮液之前，先將細(xì)胞貼壁載體和PBS緩沖溶液裝入生物反 應(yīng)器中，檢查生物反應(yīng)器是否正常工作;再將生物反應(yīng)器放入滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌90分鐘。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法，其 特征在于，所述步驟2)生物反應(yīng)器滅菌后放空PBS緩沖溶液，接入完全培養(yǎng)液，在37°C環(huán)境 中試運(yùn)行，至細(xì)胞上罐;試運(yùn)行期間檢菌培養(yǎng)時間必須大于48小時。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種利用生物反應(yīng)器制備重組人5型腺病毒毒種庫的方法， 其特征在于，所述步驟2)中由測得的葡萄糖濃度計算每日糖耗，以糖耗值作為細(xì)胞生長狀 態(tài)的指標(biāo);細(xì)胞上罐后第2天開始灌注，設(shè)定灌注體積為2L/天，第3天則根據(jù)每日糖耗來調(diào) 節(jié)完全培養(yǎng)液的灌注量，使培養(yǎng)罐內(nèi)培養(yǎng)液的殘?zhí)侵悼刂圃贗 ±〇. 5g/L。
【文檔編號】C12N7/02GK105950566SQ201610333138
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】傅暉, 劉建飛, 鄭劍, 岑仡, 王愛霞, 任素賢
【申請人】上海三維生物技術(shù)有限公司