一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用獸疫鏈球菌來源的透明質(zhì)酸合酶hasA整合于枯草芽孢桿菌實現(xiàn)了透明質(zhì)酸的生產(chǎn)；同時，對HA的合成途徑關(guān)鍵基因進(jìn)行過表達(dá)實現(xiàn)HA在枯草芽孢桿菌的高產(chǎn)。在此基礎(chǔ)上，引入水蛭來源的透明質(zhì)酸酶整合至枯草芽孢桿菌基因組上，置于受IPTG誘導(dǎo)控制的啟動子Pgrac下分泌表達(dá)，通過控制透明質(zhì)酸酶的分泌表達(dá)量和誘導(dǎo)啟動時間來制備不同分子量的小分子透明質(zhì)酸產(chǎn)物，制備的產(chǎn)物分子量范圍有差異，對于微生物直接生產(chǎn)特定范圍的小分子透明質(zhì)酸具有重要的指導(dǎo)借鑒意義。本發(fā)明為高效制備小分子透明質(zhì)酸奠定了一定的基礎(chǔ)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組枯草芽孢桿菌

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組枯草芽孢桿菌，尤其是一種構(gòu)建重組枯 草芽孢桿菌發(fā)酵葡萄糖聯(lián)產(chǎn)透明質(zhì)酸酶和小分子透明質(zhì)酸的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid, HA)，是一種高分子粘性多糖，以其獨特的分子結(jié)構(gòu) 和理化性質(zhì)，使其具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保 濕性最好的物質(zhì)，同時無任何免疫原性和毒性，被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥等行業(yè)領(lǐng) 域。近年來研究發(fā)現(xiàn)，低分子量的HA和透明質(zhì)酸寡糖（低于IXlO 4)具有獨特的生物學(xué) 功能。此外，HA寡糖容易被人體吸收而用于人體自身HA等多糖合成的前體，因此，HA寡 糖在食品保健以及醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。目前，雖然已有報道采用從頭合成的 方法來制備HA寡糖，但由于化學(xué)合成存在底物昂貴、步驟繁瑣以及合成效率低等多問題， 難以實現(xiàn)HA寡糖制備應(yīng)用。相比較，酶法催化合成HA寡糖是一種很有潛力的方法，但需 要制備大量的透明質(zhì)酸酶液和控制反應(yīng)條件。因此，將微生物發(fā)酵生產(chǎn)HA和透明質(zhì)酸酶 (Hyaluronidase, HAase)相偶聯(lián)，實現(xiàn)一菌發(fā)酵直接生產(chǎn)獲取HA寡糖和透明質(zhì)酸酶兩種產(chǎn) 物，具有一定的研究意義和工業(yè)化潛力。
[0003] HA廣泛地存在于各種動物組織內(nèi)，如雞冠、關(guān)節(jié)滑液、軟骨、眼玻璃體等，同時發(fā)現(xiàn) HA也存在于產(chǎn)氣桿菌、綠膿桿菌和A、B、C溶血性鏈球菌等部分細(xì)菌中。由于動物提取工藝 復(fù)雜、效率低以及存在病毒種間交叉感染和其它風(fēng)險性的感染，近些年以來，透明質(zhì)酸的獲 取已經(jīng)普遍由傳統(tǒng)的動物組織提法轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑸锇l(fā)酵法，而應(yīng)用最廣的是致病性弱的溶血 性鏈球菌C族菌，如Streptococcus equi和S. zooepidemicus，而且微生物發(fā)酵法獲得的 HA多為大分子量的HA。隨著DNA重組技術(shù)、DNA測序技術(shù)以及代謝工程的發(fā)展，構(gòu)建重組 工程菌株合成HA也引起了廣泛關(guān)注。在過去幾年里，雖然微生物發(fā)酵合成HA已經(jīng)獲得普 遍的應(yīng)用，然而微生物發(fā)酵法獲得的HA的分子量多為大分子量的HA和中分子量的HA，而直 接發(fā)酵合成小分子HA尚無報道。如何構(gòu)建微生物重組菌株合成不同分子量HA、尤其是小分 子量HA已經(jīng)成為迫切需要解決的問題。
[0004] 隨著小分子HA和HA寡糖的研究與應(yīng)用迅速興起，近些年以來，國內(nèi)外開始重視 HA的降解及其降解產(chǎn)物的制備研究。目前，HA降解的方法主要有物理降解、化學(xué)降解、生 物降解3大類。物理降解方法主要有加熱、機械剪切力、紫外線、超聲波、 6tlCo照射、Y-射 線輻射等因素均可使HA發(fā)生降解。但是，物理法制備的HA分子量普遍高于1萬以上，產(chǎn)生 的分子量范圍分布較大，產(chǎn)品穩(wěn)定性較差。HA的化學(xué)降解方法有水解法和氧化降解法，水 解法分酸水解（HCl)和堿水解（NaOH)，氧化降解常用的氧化劑為次氯酸鈉（NaClO)和過氧 化氫（H 2O2)15盡管使用化學(xué)降解方法降解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量可以通過改變酸堿或氧化劑 的加入量和反應(yīng)時間來控制，降解成本較低，易于大規(guī)模生產(chǎn)，但化學(xué)降解法引入了化學(xué)試 齊U，反應(yīng)條件復(fù)雜，易給HA性質(zhì)產(chǎn)生影響和產(chǎn)品的純化帶來困難，且產(chǎn)生大量的工業(yè)廢水。 生物酶法降解是HA在透明質(zhì)酸酶（HAase)的作用下，糖鏈上的糖苷鍵斷裂發(fā)生降解。酶解 法是溫和的降解方法，不但可以制備小分子HA，而且利用此方法可制得鏈長為4?22的寡 糖，而且經(jīng)過凝膠色譜分離后可以制得單一 HA寡糖。但是，目前商品化的透明質(zhì)酸酶價格 昂貴，不適合應(yīng)用于工業(yè)化制備小分子HA。
[0005] 透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase, HAase),是廣泛分布于自然界中的一類可降解 透明質(zhì)酸的酶的總稱。根據(jù)HAase的來源、結(jié)構(gòu)和作用機制，HAase可以分為三類：內(nèi) 切-P-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（EC 3. 2. 1.35,主要存在于哺乳動物以及蜜蜂、蛇、蜘蛛等 毒液）、內(nèi)切-￠-葡萄糖醛酸苷酶（EC 3.2. 1.36,主要存在于水蛭）以及透明質(zhì)酸裂解酶 (EC 4.2.2. 1，主要存在于細(xì)菌、噬菌體以及真菌）。透明質(zhì)酸酶作為"擴散因子"在臨床上 被廣泛應(yīng)用于藥物擴散助劑，而目前商品化的透明質(zhì)酸酶主要以牛睪丸組織提取制備，產(chǎn) 品質(zhì)量差，價格昂貴和具有動物疫源感染風(fēng)險。
[0006] 本發(fā)明在食品級微生物Bacillus subtilis中構(gòu)建HA的合成途徑，通過對合成HA 的途徑中的關(guān)鍵基因進(jìn)行調(diào)控表達(dá)（M)P-GlcNAc和UDP-GlcA兩個前體物的合成途徑關(guān)鍵 基因），實現(xiàn)HA在食品級微生物Bacillus subtilis中的高產(chǎn)。同時，在構(gòu)建的合成HA工 程菌中進(jìn)行分泌表達(dá)水蛭HAase，實現(xiàn)一菌同步發(fā)酵生產(chǎn)HA和HAase，在發(fā)酵液中直接制備 生產(chǎn)HA寡糖產(chǎn)物。這一偶聯(lián)模式不僅解決了當(dāng)前微生物生產(chǎn)HA過程中由于粘度過高導(dǎo)致 發(fā)酵停滯，產(chǎn)量難以獲得大幅度突破的瓶頸問題，尤其是本項目首次實現(xiàn)微生物高效合成 HA寡糖，這具有巨大的應(yīng)用價值和經(jīng)濟效益。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌內(nèi) 構(gòu)建了合成透明質(zhì)酸的途徑并偶聯(lián)分泌表達(dá)透明質(zhì)酸酶。為構(gòu)建產(chǎn)透明質(zhì)酸的途徑，在 枯草芽孢桿菌中表達(dá)了編碼透明質(zhì)酸合酶的基因hasA、UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD、 UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU和氨基轉(zhuǎn)移酶的基因glmS。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌宿主為Bacillus subtilis 168。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述透明質(zhì)酸合酶編碼基因hasA可以來源于獸疫 鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌（Streptococcus equi)或類馬鏈球菌 (Streptococcus equissp)。在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述透明質(zhì)酸合酶的基因 hasA來源于獸疫鏈球菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，tuaD、glmU和glmS可選擇鏈球菌屬（Streptococcus species)、大腸桿菌（Escherichia coli)或芽孢桿菌（Bacillus)來源。在本發(fā)明的一種實 施方式中，編碼所述的途徑關(guān)鍵基因來源于枯草芽孢桿菌=UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，編碼所述UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼所述氨基轉(zhuǎn)移酶的基因glmS的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4 所示。
[0011] 表達(dá)HA合成途徑的基因的載體為選擇游離型載體pP43NMK。
[0012] 表達(dá)HA合成途徑的基因的啟動子為誘導(dǎo)型啟動子如Pgrac、Pxyl等。本領(lǐng)域人員 也可以嘗試枯草芽孢桿菌組成型啟動子如Pveg、PtufA或者P43等。本發(fā)明游離型質(zhì)粒上 選擇組成型啟動子P43,基因組上選擇木糖誘導(dǎo)型啟動子Pxyl。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述hasA整合于于枯草芽孢桿菌基因組上，以木糖 啟動子Pxyl啟動表達(dá)。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述tuaD、glmU和glmS分別融合P43 RBS序列后， 串聯(lián)連接到表達(dá)載體PP43NMK，轉(zhuǎn)化整合表達(dá)hasA的枯草芽孢桿菌。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述透明質(zhì)酸酶的基因來源于水蛭（SEQ ID NO. 5)，進(jìn)一步融合編碼6個組氨酸的序列使得編碼的透明質(zhì)酸酶的N端帶有6個組氨酸， 融合編碼yweA信號肽和Pgrac啟動子的序列后整合到含透明質(zhì)酸合成途徑的枯草芽孢桿 菌基因組上進(jìn)行表達(dá)。編碼所述透明質(zhì)酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。啟動透 明質(zhì)酸酶表達(dá)的啟動子可以為芽孢桿菌來源的誘導(dǎo)型啟動子，本發(fā)明的一種實施方式采用 IPTG誘導(dǎo)型啟動子Pgrac。引導(dǎo)透明質(zhì)酸酶分泌的信號肽為amyX、Bpr、Csn、nprE、oppA、 yweA等，本發(fā)明的一種實施方式采用yweA信號肽。
[0016] 本發(fā)明還提供一種構(gòu)建所述重組枯草芽孢桿菌的方法，主要包括以下步驟：
[0017] (1)構(gòu)建透明質(zhì)酸的合成途徑：將編碼透明質(zhì)酸合酶的基因hasA與pAXOl質(zhì)粒 (自身帶有木糖啟動子Pxyl)重組，置于木糖誘導(dǎo)型啟動子Pxyl控制下，整合于枯草芽孢 桿菌基因組0 -半乳糖苷酶（IacA)位點上表達(dá)，將編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD與 P43 RBS序列融合，UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU與P43 RBS序列融合，編 碼所述氨基轉(zhuǎn)移酶的基因glmS與P43 RBS序列融合，再將三個融合片段串聯(lián)重組至表達(dá)載 體PP43NMK，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌得到含透明質(zhì)酸合成途徑的重組菌株；
[0018] ⑵偶聯(lián)表達(dá)透明質(zhì)酸酶：將透明質(zhì)酸酶基因融合編碼6各組氨酸的序列、啟動子 Pgrac和YweA信號肽（SEQ ID NO. 9)后整合到步驟（1)所得重組枯草芽孢桿菌的基因組 中，獲得偶聯(lián)表達(dá)透明質(zhì)酸酶的重組枯草芽孢桿菌。
[0019] 在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟（2)選定枯草芽孢桿菌基因組上乳酸脫氫酶基 因作為透明質(zhì)酸酶整合位點。
[0020] 所述步驟（2)中的透明質(zhì)酸酶的表達(dá)量可采用對啟動子的誘導(dǎo)強度和誘導(dǎo)時間 進(jìn)行調(diào)整。透明質(zhì)酸酶的表達(dá)量越大，重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)的HA的分子量就越小。
[0021] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)低分子量HA(104Da〈Mr〈10 5Da) 或透明質(zhì)酸寡糖（MKlO4Da)的方法，發(fā)酵培養(yǎng)基為以蔗糖或葡萄糖作為碳源的無機鹽培 養(yǎng)基 ：2-5%酵母粉，2-7(%葡萄糖，磷酸二氫鈉15.68/1，；硫酸鉀3.9 8/1，硫酸鎂0.5-28/ L。在37°C下，發(fā)酵培養(yǎng)到第2h左右時，添加0. 5-10g/L的木糖，誘導(dǎo)HA的合成，發(fā)酵培養(yǎng) 的第0-24h時，添加0. 1-500 ii M的IPTG誘導(dǎo)透明質(zhì)酸酶基因表達(dá)，控制發(fā)酵培養(yǎng)時間為 48_96h，獲得分子量IO5Da以下的小分子透明質(zhì)酸。
[0022] 發(fā)酵結(jié)束后繼續(xù)靜置一段時間，還可獲得主要產(chǎn)物為低分子量或者HA-4、HA_6、 HA-8、HA-10等透明質(zhì)酸寡糖。
[0023] 在本發(fā)明的一種實施方式中，采用低濃度0. IuM IPTG誘導(dǎo)，所得重組菌株發(fā)酵生 產(chǎn)的HA平均分子量為I X IO5道爾頓。
[0024] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，采用較低濃度Iy M IPTG誘導(dǎo)，所得重組枯草芽孢 桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的HA平均分子量為67500道爾頓。
[0025] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，采用高濃度100 PM IPTG誘導(dǎo)，所得重組枯草芽孢 桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的HA平均分子量低于I X IO4道爾頓。
[0026] 在本發(fā)明的一種實施方式中，發(fā)酵溫度控制為37°C，發(fā)酵時間控制為48h。
[0027] 所得發(fā)酵液中的透明質(zhì)酸酶分離純化后可用于食品、醫(yī)藥或臨床等用途。
[0028] 本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)透明質(zhì)酸，與其他工程菌相比，該發(fā)明具有非常大的 應(yīng)用優(yōu)勢。首先，本發(fā)明過程中使用的宿主為食品級，完全滿足醫(yī)療衛(wèi)生和食品安全的要 求，無內(nèi)毒素和病原感染的風(fēng)險，不會對產(chǎn)物的醫(yī)用食品安全帶來隱患；其次，在產(chǎn)高分子 HA的過程中，HA被同時分泌至胞外的透明質(zhì)酸酶降解為小分子透明質(zhì)酸，具有直接的目的 性。本發(fā)明偶聯(lián)表達(dá)透明質(zhì)酸酶，降低了發(fā)酵液粘稠度，增加了溶氧和提高了 HA的產(chǎn)量；其 次，發(fā)酵液中酶水解制備的小分子寡聚透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率高達(dá)95%以上，產(chǎn)物的分子量 小余IO 5道爾頓，且主要產(chǎn)物為低分子量寡聚糖，易于純化回收。基于應(yīng)用分析，本發(fā)明方 法在工業(yè)上用于制備特定小分子的透明質(zhì)酸具有潛在而非常廣泛的價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1所示為水蛭透明質(zhì)酸酶整合片段的構(gòu)建示意圖。
[0030] 圖2所示為第8h采用不濃度的IPTG誘導(dǎo)水蛭透明質(zhì)酸酶的表達(dá)對HA產(chǎn)量的影 響：〇,未添加誘導(dǎo)劑；1，IPTG誘導(dǎo)濃度為0. IiiM ;2, IPTG誘導(dǎo)濃度為IiiM ;3, IPTG誘導(dǎo)濃 度為100 U M。
[0031] 圖3所示為采用I i! M的IPTG在不同時間誘導(dǎo)水蛭透明質(zhì)酸酶的表達(dá)對HA產(chǎn)量 的影響：〇,未添加誘導(dǎo)劑；1，第Oh誘導(dǎo)；2,第4h誘導(dǎo)；3,第8h誘導(dǎo)；4,第24h誘導(dǎo)。

【具體實施方式】
[0032] 序列表中為相關(guān)核苷酸序列信息：SEQ ID NO. 1為獸疫鏈球菌來源的透明質(zhì)酸合 酶hasA基因編碼序列；SEQ ID NO. 2為枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶tuaD基因 編碼序列；SEQ ID NO. 3為枯草芽孢桿菌來源的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶glmU基 因編碼序列；SEQ ID NO. 4為枯草芽孢桿菌來源的氨基轉(zhuǎn)移酶glmS基因編碼序列；SEQ ID NO. 5序列信息為水蛭來源的透明質(zhì)酸酶LHyal基因序列；SEQ ID NO. 6序列信息為人工構(gòu) 建片段XMZ序列；SEQ ID NO. 7序列信息為Lacl+Pgrac片段序列；SEQ ID NO. 8序列信息為 xylR+Pxyl (木糖阻遏蛋白和啟動子）片段序列；SEQ ID NO. 9序列信息為枯草芽孢桿菌來 源的yweA信號肽核苷酸序列信息。
[0033] 發(fā)酵產(chǎn)物HA分子量檢測分析方法：使用安捷倫公司的高效液相色譜儀1260進(jìn)行 分析，選擇示差檢測器RID，使用凝膠色譜柱Ultrahydrogel Linear進(jìn)行分析。流動相選擇 0. IM硝酸鈉進(jìn)行洗脫，柱子溫度設(shè)定為40攝氏度，進(jìn)樣量40 y L，每個樣品洗脫時間25min， 使用中國食品藥品檢定研究院出產(chǎn)的右旋糖酐作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用GPC軟件進(jìn)行平均分子質(zhì) 量的計算。
[0034] 實施例1整合重組質(zhì)粒pAXOl-hasA的構(gòu)建
[0035] 本發(fā)明所用的透明質(zhì)酸合酶hasA基因來源于為獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicus ATCC 35246，Streptococcus zooepidemicus 菌株接種于 5ml M17 液體培 養(yǎng)基，在37°C 200rpm培養(yǎng)16h。收集菌體，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取獸疫鏈球菌株 的基因組DNA。
[0036] 根據(jù)已公布的基因組信息序列，分別設(shè)計引物hasA-F/hasA-R，以提取的基因組 DNA為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴增體系和程序，擴增獲取hasA基因。
[0037] 引物序列信息：5' -3'方向
[0038] hasA-F ：CGCGGATCCATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC
[0039] hasA-R ： TGCATGCATTTATAATAATTTTTTACGTGTTCC
[0040] 在上下游引物兩端分別引入BamHI和SacII限制性酶切位點。PCR擴增獲取的 hasA片段和質(zhì)粒pAXOl分別采用BamHI和SacII進(jìn)行雙酶切，采用瓊脂糖凝膠核酸電泳進(jìn) 行切膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，體系10 :1 雙切的載體，4 ill雙切的目的片段，5 ill Solution連接酶，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子 進(jìn)行測序，比對正確，重組質(zhì)粒pAXOl-hasA構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis 168,以20 y g/ml的紅霉素平板進(jìn)行篩選整合重組子，并對重組菌株進(jìn)行PCR驗證和測序驗 證，對成功整合Pxyl-hasA的枯草芽孢桿菌菌株命名為ZHA168。
[0041] 實施例2重組質(zhì)粒pP43NMK/tuaD-glmU-glmS的構(gòu)建
[0042] Bacillus subtilis 168 菌株接種于 5mlLB 培養(yǎng)基，37°C，200rpm 培養(yǎng) 16h。收 集菌體，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取獸疫鏈球菌株的基因組DNA。根據(jù)已公布的 Bacillus subtilis 168 基因組信息序列，分別設(shè)計引物 tuaD-F/tuaD-R、glmU-F/glmU-R 和glmS-F/glmS-R。在上游引物tuaD-F的5端引入KpnI限制性酶切位點和P43 RBS序列 (AAGAGAGGAATGTACAC)，在下游引物tuaD-R的5端引入XhoI和SacI限制性酶切位點；在 上游引物glmU-F的5端引入SacI限制性酶切位點和P43 RBS序列，在下游引物glmU-R的 5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位點；在上游引物glmS-F的5端引入SpeI (XbaI的同尾 酶）限制性酶切位點和P43 RBS序列，在下游引物glmS-R的5端引入XhoI和XbaI限制性 酶切位點。引物信息如下：
[0043] tuaD-F ：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGG
[0044] tuaD-R ： CCGCTCGAGCGGTACATTCGAGCTCTTATAAATTGACGCTTCCCAAG
[0045] glmU-F:CGGGGTACCGAGCTCAAGAGAGGAATGTACACATGGATAAGCGGTTTGCAGTTG
[0046] glmU-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTATTTTTTATGAATATTTTTCAC
[0047] glmS-F ：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGTGTGGAATCGTAGGTTATATCGG
[0048] glmS-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCCACAGTAACACTCTTCGC
[0049] 以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴增體系和程序，分別 擴增獲取tuaD、glmU和glmS基因。
[0050] 質(zhì)粒pP43NMK采用KpnI和XhoI雙酶切，同時PCR擴增獲得的tuaD基因產(chǎn)物也 采用KpnI和XhoI雙酶切，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目標(biāo)條帶，回收產(chǎn)物進(jìn)行 連接，體系IOu I :1 Ul雙切的載體，4 雙切的目的片段，5 ill Solution連接酶，16°C 連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進(jìn)行測序，比對正確， pP43NMK/tuaD質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0051] 同理，按上述操作將重組質(zhì)粒pP43NMK/tuaD進(jìn)行SacI和XhoI雙酶切，glmU片段 PCR產(chǎn)物也進(jìn)行SacI和XhoI雙酶切?；厥盏膬蓚€片段進(jìn)行連接，體系10 ill :1 ill雙切的 載體，4 ill雙切的目的片段，5 ill Solution連接酶，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì) 胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進(jìn)行測序，結(jié)果比對正確，pP43NMK/tuaD-glmU質(zhì)粒構(gòu) 建成功。
[0052] 在pP43NMK/tuaD-glmU質(zhì)?；A(chǔ)上，按上述操作進(jìn)行g(shù)lmS基因的組裝：pP43NMK/ tuaD-glmU質(zhì)粒采用XbaI和XhoI進(jìn)行雙酶切，而glmS片段的PCR產(chǎn)物采用SpeI和XhoI 雙酶切，此步采用一對同尾酶進(jìn)行連接，體系IOul :lul雙切的載體，4iU雙切的目的片 段，5 ill Solution連接酶，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗證，陽 性重組子進(jìn)行測序，結(jié)果比對正確，pP43NMK/tuaD-glmU-glmS質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0053] 上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化ZHA168宿主，獲得高產(chǎn)HA的重組枯草芽孢桿菌菌 株：ZHA168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS。
[0054] 實施例3水蛭透明質(zhì)酸酶LHyal基因整合片段的構(gòu)建
[0055] 以大腸桿菌來源的毒素基因mazF和博來霉素抗性基因Zeocin作為雙篩選標(biāo)記， 構(gòu)建枯草芽孢桿菌基因組無痕改造片段XMZ (SEQ ID NO. 6)。將mazF基因置于木糖誘導(dǎo) 的啟動子Pxyl控制下，具體操作如下：設(shè)計引物對Pxyl-F/R、mazF-F/R和Zeo-F/R，分別 擴增xylR+Pxyl (木糖阻遏蛋白和啟動子）片段、mazF和Zeocin片段，具體操作程序如 下：xylR+Pxyl和mazF片段各取2 ill混合于PCR管內(nèi)，加入無菌水21 ill和25 ill 2 X super pfu Master Mix (杭州寶賽生物科技有限公司），混勻后置于PCR儀，按如下程序運 行：94°C 3min，[94°C 30s，50°C 30s，72°C lmin] X10, 72°C 5min。無引物自融合 PCR 結(jié)束后， 立即加入引物Pxyl-F和mazF-R各liil，混勻后按如下程序運行：94°C 3min，[94°C 30s， 55°C 30s，72°C lmin] X32, 72°C 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目標(biāo) 條帶，獲得Pxyl-mazF片段。
[0056] 同理，按上述融合PCR操作，將Pxyl-mazF片段與zeocin片段進(jìn)行融合，獲得目標(biāo) 片段 XMZ :Pxyl-mazF_zeocin
[0057] 引物對信息如下：
[0058] Pxyl-F ： CTAACTTATAGGGGTAACACTT
[0059] Pxyl-R： GTATCGGCTTACCATTGTACATTTCCCCCTTTGATTTTTAG
[0060] mazF-F ：AAAGGGGGAAATGTACAATGGTAAGCCGATACGTACC
[0061] mazF-R ： TAAAAAGCCATATCAAGCTACCCAATCAGTACGTTAATT
[0062] Zeo-F ：ACGTACTGATTGGGTAGCTTGATATGGCTTTTTATATGTG
[0063] Zeo-R ： TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG
[0064] 選定枯草芽孢桿菌基因組上乳酸脫氫酶Idh基因位點作為透明質(zhì)酸酶整合位點。 采用XMZ無痕操作技術(shù)，構(gòu)建整合片段（見附圖1)。先采用融合PCR技術(shù)，將來源于質(zhì)粒 pHTOl的Lacl+Pgrac片段與yweA_sp_H6LHyal基因（在LHyal序列前段已融合yweA信號 肽序列和6個組氨酸序列CACCACCACCACCACCAC)進(jìn)行融合；在Idh基因兩端各取500bp左 右的DNA片段作為同源重組的同源臂Arm-F和Arm-R,同時取Arm-R下游約33bp的序列作 為二次交換序列（DR)，融合于XMZ片段前端。最后，采取多次重疊PCR技術(shù)，按實施例3融 合片段操作過程和附圖2所示順序，構(gòu)建完整的基因整合片段。此實施例引物信息序列如 下：
[0065] Arm-F-F ：GAAGTGTTGCACAATATAAATGTG
[0066] Arm-R ：GGAAAGCGGGCAGTGAATGTTGCGTAAGTCAGGATATCAACCG
[0067] Arm-R-F ：CGAGGAGCAGGACTGACGGCCTGCCAAAAGAGCGGGTGAT
[0068] Arm-R-R ：TTAGTTGACTTTTTGTTCTGC
[0069] LacI/Pgrac-F ：TCCTGACTTACGCAACATTCACTGCCCGCTTTCCAGTCG
[0070] Lacl/Pgrac-R ：AATGAAGTTCTTTTTAGCATATCCTTCCTCCTTTAATTGG
[0071] H6LHyal-F ：TAAAGGAGGAAGGATATGCTAAAAAGAACTTCATTCGTATC
[0072] H6LHyal-R ：
[0073] AGCTCAGTGATACCTGCGATCCCTCCGCGATTATTTTTTGCAGGCTTCAACG
[0074] XMZ-F:AGGGATCGCAGGTATCACTGAGCTGAACTAACTTATAGGGGTAACACTT
[0075] XMZ-R：GCTCTTTTGGCAGGCCGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG
[0076] 重組片段制備濃度為500ng/ iil，電轉(zhuǎn)產(chǎn)HA的重組宿主ZHA168/pP43NMK/ tuaD-glmU-glmS，涂布含有25 ii g/mlZeocin的LB平板，置于37°C培養(yǎng)12h，發(fā)生同源重組 的菌落攜帶XMZ片段，可以在此平板上生長。對長出的單菌落轉(zhuǎn)移至含有2 %木糖為的LB 平板上，置于37°C培養(yǎng)12h。在此過程中，以DR序列發(fā)生第二次交換，使得XMZ片段丟失， 實現(xiàn)H6LHyal的無痕整合。若未發(fā)生二次交換，XMZ未丟失，木糖啟動子在誘導(dǎo)下表達(dá)毒性 蛋白mazF，使得宿主死亡。因此，在含木糖的LB平板上能生長的菌為成功重組H6LHyal的 宿主，通過提取基因組進(jìn)行PCR驗證和測序，該宿主改造成功，含有水蛭透明質(zhì)酸酶的重組 菌株命名為 LH168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS。
[0077] 實施例4重組LH168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS菌株的搖瓶發(fā)酵
[0078] 挑取 LH168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS 重組菌單克隆接種于 5ml 含有 50 ii g/ml Kan的LB培養(yǎng)基，置于200rpm37°C過夜培養(yǎng)。發(fā)酵過程操作：16h后接種于250ml三角搖瓶 (裝液量25ml)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基：2 %酵母粉，7 %葡萄糖，磷酸二氫鈉15. 6g/ L，硫酸鉀3. 9g/L。按10%的接種量轉(zhuǎn)接于搖瓶（此起點設(shè)為第Oh)，置于200rpm37°C培 養(yǎng)，在接種后第2h添加2g/L的木糖進(jìn)行誘導(dǎo)hasA基因表達(dá)，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)46h。發(fā)酵過程 中第8h分別進(jìn)行不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，控制H6LHyal的分泌表達(dá)量，以達(dá)到不同分子量的 HA，IPTG誘導(dǎo)濃度分為三個梯度：0.1 iiM、Iii MUOOii M。同時，采用Iii M的誘導(dǎo)濃度在不 同的時間點開始誘導(dǎo)：發(fā)酵第〇h、4h、8h和24h。
[0079] 收集發(fā)酵液，IOOOOrpm下室溫離心lOmin。發(fā)酵液上清轉(zhuǎn)移置另一離心管中，加入 2倍體積的無水乙醇充分混勻沉淀發(fā)酵液中的透明質(zhì)酸。室溫下靜置lh，再IOOOOrpm下室 溫離心20min，去除干凈液體，白色沉淀加入發(fā)酵液等體積的IM NaCl溶液充分溶解，適當(dāng) 稀釋后，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法檢測HA酸含量。從附圖2看出，在第8h采用不同的 IPTG誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)H6LHyal的表達(dá)，對HA產(chǎn)量的影響幅度在30%左右，100 ii M濃度的IPTG 誘導(dǎo)HA產(chǎn)量比0. I y M的誘導(dǎo)高出45%，說明透明質(zhì)酸酶的表達(dá)量大有助于降解HA，并對 HA的合成有促進(jìn)作用。同時根據(jù)附圖3所示不同的誘導(dǎo)時間看出，透明質(zhì)酸酶的誘導(dǎo)表達(dá) 時間在菌體生長的對數(shù)后期，對HA的產(chǎn)量較其它誘導(dǎo)時間高一點，但差別不是很大。
[0080] 根據(jù)HA產(chǎn)物的分子量測定，不同的IPTG誘導(dǎo)控制透明質(zhì)酸酶的表達(dá)量，所得重組 菌株發(fā)酵生產(chǎn)的小分子HA的平均分子量之間有區(qū)別。在低濃度0. I y M的誘導(dǎo)劑控制下， 發(fā)酵重組菌株獲得的平均分子量為I X IO5道爾頓。而在I ii M的誘導(dǎo)濃度下表達(dá)透明質(zhì)酸 酶，發(fā)酵重組菌株獲得的平均分子量為67500道爾頓。進(jìn)一步提高IPTG的誘導(dǎo)濃度，加大 透明質(zhì)酸酶的分泌表達(dá)，所得重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的HA平均分子量低于I X IO4道 爾頓，并且，在發(fā)酵結(jié)束后，離心收集發(fā)酵液上清，繼續(xù)放置l_3h，繼續(xù)水解可以獲得HA10、 HA8、HA6和HA4等寡糖產(chǎn)物。
[0081] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌內(nèi)構(gòu)建合成透明質(zhì) 酸的途徑并偶聯(lián)誘導(dǎo)分泌表達(dá)透明質(zhì)酸酶；所述構(gòu)建合成透明質(zhì)酸的途徑，是在枯草芽孢 桿菌中表達(dá)了編碼透明質(zhì)酸合酶的基因 haSA、UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD、UDP-N-乙酰 氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU和氨基轉(zhuǎn)移酶的基因 glmS。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述透明質(zhì)酸合酶編碼基 因 hasA 來源于獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌（Streptococcus equi)或類馬鏈球菌（Streptococcus equissp) ;tuaD、glmU和glmS來源于鏈球菌屬 (Streptococcus species)、大腸桿菌（Escherichia coli)或芽抱桿菌（Bacillus) 〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述hasA整合于枯草芽 孢桿菌基因組上，以木糖誘導(dǎo)型啟動子Pxyl啟動表達(dá)；所述tuaD、glmU和glmS分別融合 P43RBS序列后，以表達(dá)載體pP43NMK串聯(lián)表達(dá)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，編碼所述透明質(zhì)酸酶的基 因來源于水蛭，進(jìn)一步融合編碼6個組氨酸的序列使得編碼的透明質(zhì)酸酶的N端帶有6個 組氨酸，融合yweA信號肽和Pgrac啟動子后整合到含透明質(zhì)酸合成途徑的枯草芽孢桿菌基 因組上進(jìn)行表達(dá)。
5. -種構(gòu)建所述重組枯草芽孢桿菌的方法，主要包括以下步驟： (1) 構(gòu)建透明質(zhì)酸的合成途徑：將編碼透明質(zhì)酸合酶的基因 hasA置于木糖誘導(dǎo)型啟動 子Pxyl控制下，整合于枯草芽孢桿菌基因組lacA位點上表達(dá)，將編碼UDP-葡萄糖脫氫酶 的基因 tuaD與P43RBS序列融合，UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU與P43RBS 序列融合，編碼所述氨基轉(zhuǎn)移酶的基因 glmS與P43RBS序列融合，再將三個融合片段串聯(lián)重 組至表達(dá)載體PP43NMK，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌得到含透明質(zhì)酸合成途徑的重組菌株； (2) 偶聯(lián)表達(dá)透明質(zhì)酸酶：將透明質(zhì)酸酶基因融合編碼6個組氨酸的序列、YweA信號肽 和啟動子Pgrac后整合到步驟（1)所得重組枯草芽孢桿菌的基因組中，獲得偶聯(lián)表達(dá)透明 質(zhì)酸酶的重組枯草芽孢桿菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（2)選定枯草芽孢桿菌基因組上乳酸 脫氫酶基因作為透明質(zhì)酸酶整合位點。
7. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，通過控制誘導(dǎo)劑的 濃度、誘導(dǎo)時間或者信號肽的分泌強度來控制透明質(zhì)酸酶酶量，以獲得不同分子量的小分 子透明質(zhì)酸產(chǎn)物。
8. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸寡 糖的方法，所述小分子透明質(zhì)酸的分子量為l〇 4Da〈Mr〈105Da，透明質(zhì)酸寡糖的分子量為 Mr〈104Da，發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉20-50g/L，葡萄糖或蔗糖20-70g/L，磷酸二氫鈉15. 6g/L，硫 酸鉀3. 9g/L，硫酸鎂0. 5-2g/L，在37°C下，發(fā)酵培養(yǎng)第2h時，添加0. 5-10g/L的木糖，誘導(dǎo) HA的合成，發(fā)酵培養(yǎng)的第0-24h時，添加0. 1-500 μ Μ的IPTG誘導(dǎo)透明質(zhì)酸酶基因表達(dá)，控 制發(fā)酵培養(yǎng)時間為48-96h，獲得小分子透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸寡糖。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)第2h時，添加2%的木糖誘導(dǎo) 培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)至第8h時，添加1 μ MIPTG誘導(dǎo)，IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)40h，得到HA平均分子量為 67500道爾頓。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)第2h時，添加2%的木糖誘 導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)至第8h時，添加100 μ MIPTG誘導(dǎo)，IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)40h，得到HA平均分子 量低于IX 1〇4道爾頓。
【文檔編號】C12N1/21GK104293726SQ201410555019
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】康振, 陳堅, 堵國成, 金鵬 申請人:江南大學(xué)