寡核苷酸序列及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】寡核苷酸序列及其制備方法與應(yīng)用，涉及哈維氏弧菌的識(shí)別檢測。提供可用于滅活哈維氏弧菌識(shí)別檢測的寡核苷酸序列及其應(yīng)用方法。該寡核苷酸序列不僅具有檢測快速、操作簡單、穩(wěn)定性高于抗體等特點(diǎn)，而且制備方法容易、制備周期較短。所述寡核苷酸序列為SEQ ID No.1，采用該序列就能完成滅活哈維氏弧菌的識(shí)別檢測。合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫；將寡核苷酸文庫與滅活哈維氏弧菌混合后進(jìn)行SELEX篩選，直到親和力不再明顯上升為止，再克隆測序，選擇其中的高拷貝ssDNA進(jìn)行親和特異性的驗(yàn)證和親和常數(shù)的測定，得相應(yīng)適配子?？捎糜诟黝悩悠分袦缁罟S氏弧菌的識(shí)別檢測。
【專利說明】寡核苷酸序列及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及哈維氏弧菌的識(shí)別檢測，尤其是涉及可用于滅活哈維氏弧菌識(shí)別檢測 的寡核苷酸序列及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在養(yǎng)殖業(yè)中，每年約有10%的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物死于感染性病害，其中弧菌感染導(dǎo)致 的疾病占了相當(dāng)大的比重。雖然化學(xué)藥品和抗生素可控制其感染，但是藥物防治常會(huì)產(chǎn)生 不良后果，如在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)積累、殘留，容易產(chǎn)生耐藥菌株和易污染環(huán)境等問題，因此建 立病原弧菌的快速檢測技術(shù)，以提早防治病害的發(fā)生和流行仍是目前的主要手段。
[0003] 目前，弧菌的檢測方法主要是根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊，通過對微生物的生理生 化特征檢測進(jìn)行鑒定，由于需要測試的項(xiàng)目較多，因此該方法工作量較大、操作較繁瑣。 16SRNA的分子生物學(xué)方法雖有較高的準(zhǔn)確性，但需要提取病原菌的16SRNA，手續(xù)較繁瑣， 且對檢測設(shè)備有一定要求，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場的快速檢測需要；免疫學(xué)方法制備的抗血清雖能 實(shí)現(xiàn)快速檢測，但由于制備的抗血清為多克隆抗體，實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰 性，即使采用單克隆抗體。由于制備技術(shù)要求較高、周期較長，因此其應(yīng)用受到限制。
[0004] 指數(shù)富集配體進(jìn)化技術(shù)（Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)，簡稱SELEX技術(shù)，是近年來新發(fā)展起來的一種系統(tǒng)篩選技術(shù)。它利用寡核苷 酸分子可在空間形成多種多樣的三維結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)建的隨機(jī)寡核苷酸庫，從中篩選出與目 標(biāo)靶分子有特異識(shí)別作用的高親和力的寡核苷酸分子--適配子，其分子識(shí)別能力可達(dá)到 甚至超過了單克隆抗體的水平，而制備技術(shù)則比單克隆抗體簡單、快速。運(yùn)用該技術(shù)目前已 篩選出腫瘤細(xì)胞、炭疽桿菌等的適配子，可用于腫瘤細(xì)胞和炭疽桿菌的檢測、識(shí)別。
[0005] SELEX技術(shù)的出現(xiàn)為微生物的快速檢測提供了新的研究思路，其應(yīng)用也將越來越 廣泛。在SELEX篩選中，以滅活菌為靶目標(biāo)進(jìn)行篩選，不僅具有較好的安全性，而且使目標(biāo) 菌的形態(tài)相對穩(wěn)定和固定，從而有效提高了篩選的效率和效果。同時(shí)，以滅活菌為靶目標(biāo)， 還能有效避免環(huán)境因子對活菌的影響，使篩選的穩(wěn)定性得到較好的改善。因此，開展以滅活 菌為靶目標(biāo)的SELEX篩選，具有重要意義。
[0006] 哈維氏弧菌（Vibrio harveyi)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要條件致病菌，它不僅能引發(fā)多 種水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病，還可以通過食物鏈引起食物中毒，威脅到人類的健康。因此，運(yùn)用SELEX 技術(shù)篩選滅活哈維氏弧菌適配子，并將其應(yīng)用于滅活哈維氏弧菌的識(shí)別鑒定，能大大提高 哈維氏弧菌檢測的靈敏度和特異性，成為本發(fā)明的重點(diǎn)。
[0007] 本 申請人:在中國專利201110259244. 8中已公開了 3條適配子序列，分別如下：
[0008] 序列 I :5 , -GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGC GACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3;；
[0009] 序列 2 :5 ' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCT CCTTCCCTCT GGGGTCTCCC TCTTGTGC-3;；
[0010] 序列 3 :5 ， -GCACAAGAGG GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGC GACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-Si 。
[0011] 本 申請人:在中國專利201110090419. 7中已公開了 4條適配子序列，分別如下：
[0012] 8 號(hào)適配子：5，-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGAGTCG TGGAGAGGGT GAACGGAGGG GGGAAACAGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3,
[0013] 10號(hào)適配子：5，-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGGTGGC GAGTTGCGAA GGACTGTGTC GAGTGTTG GC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3^
[0014] 37號(hào)適配子：5，-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGCGGGA TGAGGGAGTA GGAGGGCCAC AGTGGACT GCACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3,
[0015] 46號(hào)適配子：5，-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCT CCTTCCCTCT GGGGTCTC-3^ 。
[0016] 本 申請人:在中國專利201210079530. 0中已公開了 4條適配子序列，分別如下：
[0017] 序列 I :5 ' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC GGGGGCGCGGTGAGGGGCTG CACAAGAGGGAG GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3,;
[0018] 序列 2 :5 ' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGG GGAAGGCACAAGAGGGA GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3,;
[0019] 序列 3 :5 ' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC GGGGGCGCGGTGAGGGGCT GCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAG GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3,;
[0020] 序列 4 :5 ' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAG GCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAG GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3,;
[0021] 本 申請人:在中國專利201210552569. X中已公開了 6條適配子序列，分別如下：
[0022] 序列 1 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAG GGAG GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGAGGG-3,;
[0023] 序列 2 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGACGAGATGGGCGGGAAACGAGGCACA AGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG-3,;
[0024] 序列 3 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGTAGGAGGTAGTCGGAGAGGCGAATGAG AGGGGAAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAGGGA GAC CCC AGA GGG-3,;
[0025] 序列 4 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC AGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCAGCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3,;
[0026] 序列 5 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCAGCACA AGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG-3,;
[0027] 序列 6 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACA AGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG-3,;


【發(fā)明內(nèi)容】

[0028] 本發(fā)明的目的在于提供不僅具有檢測快速、操作簡單、穩(wěn)定性高于抗體等特點(diǎn)，而 且制備方法容易、制備周期較短的寡核苷酸序列及其制備方法。
[0029] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述寡核苷酸序列的應(yīng)用。
[0030] 所述寡核苷酸序列，為SEQ ID No. 1，所述SEQ ID No. 1可記為"19適配子";所述 SEQ ID No.1 為：5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGGTGGAGGAGGACGAAGTGAGAGCACA AGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG-3,。
[0031] 所述寡核苷酸序列的制備方法，包括以下步驟：
[0032] 1)合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫（5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 為 35個(gè)隨機(jī)寡核苷酸；
[0033] 2)將寡核苷酸文庫與滅活哈維氏弧菌混合后進(jìn)行SELEX篩選，直到親和力不再明 顯上升為止；
[0034] 3) SELEX篩選完成后對適配子富集文庫進(jìn)行克隆測序，選擇其中的高拷貝ssDNA 進(jìn)行親和特異性的驗(yàn)證和親和常數(shù)的測定，獲得相應(yīng)適配子。
[0035] 在步驟2)中，所述SELEX篩選的具體步驟可為：
[0036] 2. 1滅活哈維氏弧菌菌液的制備
[0037] 用生理鹽水將培養(yǎng)24h的哈維氏弧菌菌落從斜面上洗漆下來，6000rpm離心5min, 棄上清液，再加入含6%甲醛的生理鹽水于62. 5°C水浴lh，離心后生理鹽水洗滌3次，再用 2X結(jié)合緩沖液懸浮滅火的菌沉淀，4°C保存。
[0038] 2. 2與弧菌結(jié)合
[0039] 取合成好的濃度為100μ M的ssDNA寡核苷酸文庫4 μ L，用2X結(jié)合緩沖液稀釋 至100yL，95°C變性5min，冰浴IOmin后加入到10(^1^滅活的哈維氏弧菌菌懸液中，301： 搖床結(jié)合2h，再6000rpm離心5min，棄上清，然后用I X結(jié)合緩沖液洗沉淀1次，棄上清，貝丨J 沉淀部分為滅活哈維氏弧菌沉淀和與其相結(jié)合的ssDNA ;
[0040] 在步驟2. 2中，所述2X結(jié)合緩沖液為20X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的 溶液，所述IX結(jié)合緩沖液為20X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液；所述20X結(jié) 合緩沖液配方為 IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2, pH 7.4。
[0041] 2· 3分離結(jié)合的ssDNA
[0042] 在步驟2. 2所得的沉淀部分中加入IX結(jié)合緩沖液100 μ L，95°C加熱5min，使與 弧菌結(jié)合的ssDNA變性，從而與弧菌分離，然后15000rpm離心lOmin，取上清液，則可分離得 到與弧菌結(jié)合的ssDNA。
[0043] 2. 4 不對稱 PCR 擴(kuò)增 ssDNA
[0044] 總體積為25 μ L的不對稱PCR的擴(kuò)增體系如表1所示。
[0045] 表 1
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 寡核苷酸序列，其特征在于為SEQ ID No. 1所示的寡核苷酸序列，所述SEQ ID No. I 記為 "19 適配子";所述 SEQ ID No. 1 為：5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGGTGGAG GAGGACGAAGTGAGAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG-3,。
2. 如權(quán)利要求1所述寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫C -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 為 35個(gè)隨機(jī)寡核苷酸； 2) 將寡核苷酸文庫與滅活哈維氏弧菌混合后進(jìn)行SELEX篩選，直到親和力不再明顯上 升為止； 3. SELEX篩選完成后對適配子富集文庫進(jìn)行克隆測序，選擇其中的高拷貝ssDNA進(jìn)行 親和特異性的驗(yàn)證和親和常數(shù)的測定，獲得相應(yīng)適配子。
3. 如權(quán)利要求2所述寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述SELEX 篩選的具體步驟為： 2. 1滅活哈維氏弧菌菌液的制備 用生理鹽水將培養(yǎng)24h的哈維氏弧菌菌落從斜面上洗滌下來，6000rpm離心5min，棄上 清液，再加入含6 %甲醛的生理鹽水于62. 5°C水浴lh，離心后生理鹽水洗滌3次，再用2 X 結(jié)合緩沖液懸浮滅火的菌沉淀，4°C保存； 2. 2與弧菌結(jié)合 取合成好的濃度為1〇〇μ M的ssDNA寡核苷酸文庫4μ L，用2X結(jié)合緩沖液稀釋至 100 μ L，95°C變性5min，冰浴IOmin后加入到100 μ L滅活的哈維氏弧菌菌懸液中，30°C搖床 結(jié)合2h，再6000rpm離心5min，棄上清，然后用I X結(jié)合緩沖液洗沉淀1次，棄上清，則沉淀 部分為滅活哈維氏弧菌沉淀和與其相結(jié)合的ssDNA ; 2. 3分離結(jié)合的ssDNA 在步驟2. 2所得的沉淀部分中加入I X結(jié)合緩沖液100 μ L，95°C加熱5min，使與弧菌 結(jié)合的ssDNA變性，從而與弧菌分離，然后15000rpm離心10min，取上清液，則分離得到與弧 菌結(jié)合的ssDNA ; 2. 4不對稱PCR擴(kuò)增ssDNA 總體積為25 μ L的不對稱PCR的擴(kuò)增體系如表1所示； 表1

引物 Pl 序列為：5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-3' ； 引物 P2 序列為：5' -CCC TCT GGG GTC TCC CTC TTG TGC-3' ； 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（94°C變性30s，58°C退火30s，72°C 延伸20s)，最后72°C延伸7min ; 2. 5親和力的測定 2. 5. 1不對稱PCR擴(kuò)增：用帶有地高辛標(biāo)記的引物Pl和引物P2不對稱PCR擴(kuò)增篩選 出來的ssDNA文庫，擴(kuò)增條件和參數(shù)與步驟2. 4的不對稱PCR相同； 2. 5. 2測定親和力： TMB顯色系統(tǒng)：以四甲基聯(lián)苯胺為底物，辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗地高辛抗體IgG的顯 色系統(tǒng)來測定吸附到弧菌表面的適配子量； 2. 6重復(fù)篩選 以每一輪不對稱PCR的產(chǎn)物作為下一輪的篩選文庫，重復(fù)上述SELEX篩選步驟2. 1? 2. 5,直到親和力不再明顯上升為止，最終篩選得到適配子的富集文庫。
4. 如權(quán)利要求3所述寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟2. 2中，所述2X結(jié) 合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的溶液，所述IX結(jié)合緩沖液為20 X結(jié) 合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液；所述20X結(jié)合緩沖液配方為IM NaCl、50mM KC1、 500mM Tris-HClUOmM MgCl2, pH 7.4。
5. 如權(quán)利要求3所述寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟2. 5. 2中，所述測定 親和力的具體步驟為： 2. 5. 2. 1將TMB用無水乙醇配成lmg/mL，4°C遮光保存，用前再進(jìn)一步按比例配制， TMB :底物緩沖液：30%過氧化氫=100 : 900 : 1，即配即用； 2. 5. 2. 2與菌結(jié)合：取步驟2. 5. 1擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物，用超微量分光光度計(jì)測定其中 的ssDNA濃度，再取1 μ L PCR產(chǎn)物，用2 X結(jié)合緩沖液稀釋到100 μ L，95°C變性5min，冰浴 IOmin后，加入滅活菌液100 μ L混合，30°C，IOOrpm搖床結(jié)合30min，然后離心分離細(xì)菌沉 淀，棄上清液；同時(shí)做一空白，用結(jié)合緩沖液代替ssDNA ; 2. 5. 2. 3洗滌：在上述細(xì)菌沉淀中加入I X結(jié)合緩沖液500 μ L，混勻后，將菌懸液轉(zhuǎn)移 至新的離心管中，6000rpm離心5min，棄上清，取菌沉淀； 2. 5. 2. 4與酶標(biāo)兔抗地高辛抗體結(jié)合：在菌沉淀中加入100 μ L I : 900TBS稀釋過的 過量的酶標(biāo)兔抗地高辛抗體，混合后，反應(yīng)IOmin,使之與菌沉淀中的地高辛標(biāo)記的ssDNA 結(jié)合； 2. 5. 2. 5洗滌：6000rpm離心5min，棄上清，再用I X結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌3次，每 次洗滌都將菌懸液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，最后棄上清，得菌沉淀； 2. 5. 2. 6ΤΜΒ顯色：加入400 μ L雙蒸水重懸菌沉淀，再加入200 μ L TMB顯色液，避光顯 色I(xiàn)Omin后，以2mol/L H2SO4IOO μ L終止反應(yīng)，測定450nm處的吸光值OD45tl，該值即反映與 菌結(jié)合的ssDNA的親和力，即OD結(jié)合，空白同樣進(jìn)行上述步驟2. 5. 2. 3, 2. 5. 2. 4, 2. 5. 2. 5和 2. 5. 2. 6,得到空白相應(yīng)的吸光度ODse ; 2· 5· 2· 7計(jì)算相應(yīng)文庫的親和力：
6.如權(quán)利要求2所述寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述對適配 子富集文庫進(jìn)行克隆測序，選擇其中的高拷貝ssDNA進(jìn)行親和特異性的驗(yàn)證和親和常數(shù)的 測定，獲得相應(yīng)適配子，其具體方法為： 將步驟2)篩選出的適配子富集文庫進(jìn)行不對稱PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同步驟2. 4,擴(kuò)增產(chǎn) 物送測序公司進(jìn)行克隆，并隨機(jī)挑取5個(gè)以上克隆進(jìn)行測序，得到一系列寡核苷酸序列或 ssDNA ;然后對獲得的一系列ssDNA進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)有些ssDNA是完全相同的，或者說有 些ssDNA在測序結(jié)果中有2個(gè)以上的拷貝；若沒有發(fā)現(xiàn)這種多拷貝ssDNA，則重復(fù)步驟3)， 繼續(xù)克隆測序，直到獲得至少一個(gè)多拷貝的ssDNA，然后選擇這些多拷貝ssDNA進(jìn)行親和特 異性驗(yàn)證，獲得相應(yīng)的適配子，具體過程如下： 3. 1合成需要進(jìn)行驗(yàn)證的ssDNA序列，并在5'端標(biāo)記地高辛； 3. 2滅活微生物的準(zhǔn)備 選取水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境常見的病原微生物--溶藻弧菌（V. alginolyticus)、嗜水氣單胞 菌（Aeromonas hydrophila)、遲純愛德華氏菌（Edwardsiella tarda)作為對照菌，與哈 維式弧菌（Vibrio harveyi) -起，在無菌條件下分別接種到胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中， 30°C下IOOrpm搖床培養(yǎng)8?10h，然后取菌液離心，棄上清培養(yǎng)液，再加入含6%甲醛的生 理鹽水于62. 5°C水浴lh，離心后生理鹽水洗滌3次，再用2X結(jié)合緩沖液懸浮滅火的菌沉 淀，4°C保存； 3. 3親和力的測定和親和特異性驗(yàn)證 3. 3. 1與菌結(jié)合：取合成出的ssDNA序列IOpmol用2X結(jié)合緩沖液稀釋到100 μ 1，95°C 變性5min，冰浴IOmin后，分別與上述4種滅活菌的菌液各100 μ Γ混合，菌數(shù)量約為3 X IO8 個(gè)，在28-C、100rpm搖床結(jié)合40min，然后6000rpm離心5min，分離菌沉淀與上清液，同時(shí)做 一不加 ssDNA的空白，用2X結(jié)合緩沖液代替； 3. 3. 2洗滌：將上述滅活菌的菌沉淀用I X結(jié)合緩沖液500 μ 1洗滌1次，6000rpm離心 5min，棄上清，取菌沉淀； 3. 3. 3與辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗地高辛抗體結(jié)合：在菌沉淀中加入100μ 1用TBS 稀釋的過量的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗地高辛抗體，TBS的稀釋比例為1 : 900,混合反應(yīng) IOmin ； 3. 3. 4洗滌：10000rpm離心5min，再用IX結(jié)合緩沖液500 μ 1洗滌3次，棄上清，取菌 沉淀； 3. 3. 5顯色：加入400 μ 1雙蒸水重懸菌沉淀，再加入200 μ I TMB顯色液，避光顯色 IOmin后，以2mol/L H2S04200 μ 1終止反應(yīng)，測定450nm處的吸光值OD45tl，該值即反映結(jié)合 的酶標(biāo)抗地高辛的OD值，即為空白同樣進(jìn)行上述步驟5. 3. 2、5. 3. 3、5. 3. 4和5. 3. 5， 得到白相應(yīng)的吸光度OD空白，相應(yīng)適配子的未和力=OD結(jié)合-OD空白； 3. 3. 6數(shù)據(jù)處理分析 用EXCEL軟件中的統(tǒng)計(jì)函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)采用T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)概 率p〈0. 05為顯著差異，p〈0. 01為極顯著的差異，統(tǒng)計(jì)分析后獲得相應(yīng)序列對上述四種菌： 溶藻弧菌（V. alginolyticus)、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)、遲鈍愛德華氏菌 (Edwardsiella tarda)、哈維式弧菌（Vibrio harveyi)的識(shí)別效果，從而確定該序列對滅 活溶藻弧菌是否具有親和特異性，能否用于滅活溶藻弧菌的識(shí)別檢測； 3. 4親和常數(shù)的測定 親和特異性驗(yàn)證后，選擇親和特異性較好的這個(gè)適配子19進(jìn)行親和常數(shù)的測定，具體 方法為： 合成這個(gè)適配子，并在5'端標(biāo)記地高辛；用2X結(jié)合緩沖液稀釋到ssDNA終濃度分別 為10ηΜ，20ηΜ，40ηΜ，60ηΜ，80ηΜ，ΙΟΟηΜ，120nM，140nM，再與滅活哈維氏弧菌結(jié)合后，分別按 步驟3. 3中的方法測定親和力，做親和力與ssDNA濃度間的關(guān)系圖，用origin 8軟件進(jìn)行 擬合計(jì)算得到相應(yīng)適配子的親和常數(shù)，相應(yīng)的親和常數(shù)為Kd = 29. 17±7. 24nM。
7. 如權(quán)利要求1所述寡核苷酸序列在各類樣品中對滅活哈維氏弧菌識(shí)別檢測中的應(yīng) 用，所述應(yīng)用不用于疾病診斷。
8. 如權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于所述識(shí)別檢測的具體方法為： 1) 待測滅活菌液的制備：取樣品，蒸餾水溶解浸泡后，接種到胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng) 基中，30°C下IOOrpm搖床培養(yǎng)約8?10h，然后取菌液離心，棄上清培養(yǎng)液，再加入含6%甲 醛的生理鹽水于62. 5°C水浴lh，離心后生理鹽水洗滌3次，再用2 X結(jié)合緩沖液懸浮滅活 的菌沉淀，4°C保存； 2) 應(yīng)用檢測方法1即地高辛法：取待測滅活菌液，用5'端標(biāo)記有地高辛的上述寡核苷 酸序列（19)按步驟3. 3的親和力測定方法對待測滅活菌液進(jìn)行檢測；同時(shí)用滅活哈維氏弧 菌代替待測菌液，同樣按步驟3. 3的親和力測定方法進(jìn)行檢測，得到陽性對照；用無菌蒸餾 水代替待測滅活菌液，同樣按步驟3. 3的親和力測定方法進(jìn)行檢測，得到陰性對照；結(jié)果顯 示，陽性對照組顏色為黃色，陰性對照組不顯色；若待測樣品檢測結(jié)果呈現(xiàn)黃色，則說明樣 品中有哈維氏弧菌，為陽性，若待測樣品檢測結(jié)果不顯色，則說明樣品中沒有哈維氏弧菌； 或 應(yīng)用檢測方法2即基于PCR的定性檢測法：具體流程分為結(jié)合、洗滌、分離、擴(kuò)增和電泳 檢測，具體如下：取5 μ L濃度為IOuM的上述ssDNA(I9)，用2X結(jié)合緩沖液稀釋至100 μ L， 95°C變性5min，冰浴IOmin后，分別加入滅活的待測菌懸液中，菌濃度在IO2個(gè)/mL以上，轉(zhuǎn) 速IOOrpm搖床結(jié)合30min ;然后6000rpm離心5min,棄上清，沉淀部分為菌沉淀和其相結(jié)合 的ssDNA，用500 μ L IX結(jié)合緩沖液洗滌5次；然后向沉淀中加入IX結(jié)合緩沖液IOOul， 95?加熱5min,使其與菌結(jié)合的ssDNA變性，從而與弧菌分離，然后15000rpm離心IOmin, 取上清液，則分離到可與菌結(jié)合的ssDNA，然后取樣進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μ L的 普通PCR參數(shù)如表3所示； 表3

反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性4min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延 伸20s，最后72°C延伸7min，得到與滅活待測菌結(jié)合的ssDNA的PCR產(chǎn)物，簡稱待測菌的PCR 產(chǎn)物； 分別用滅活哈維氏弧菌菌液和無菌水代替待測滅活菌液，同樣按上述方法進(jìn)行結(jié)合、 洗滌、分離和擴(kuò)增，得到3個(gè)梯度的陽性對照的PCR產(chǎn)物和陰性對照的PCR產(chǎn)物，最后將滅 活待測菌的PCR產(chǎn)物、陽性對照菌的PCR產(chǎn)物和陰性對照的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖電泳進(jìn)行檢 測，紫外拍照顯示，陰性對照沒有亮帶、三組陽性對照有亮帶，如果待測組有亮帶，說明樣品 中有哈維氏弧菌，為陽性，若待測組沒有亮帶，則說明樣品中沒有哈維氏弧菌；所述滅活哈 維氏弧菌菌液的濃度分別為IO 2UO3UO4個(gè)/mL。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104388422SQ201410576464
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】鄭江, 鄢慶枇, 郝聚敏, 唐花 申請人:集美大學(xué)