一株赭曲霉毒素a的產(chǎn)生菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株赭曲霉毒素A的產(chǎn)生菌，分類命名為：黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號為：9668，保藏日期為：2014年9月16日，所述菌株的最適產(chǎn)毒pH為7.0，最適產(chǎn)毒溫度為25℃，靜置培養(yǎng)5d產(chǎn)毒量達到最大。本發(fā)明的赭曲霉毒素A的產(chǎn)生菌所產(chǎn)赭曲霉毒素A的最適pH為7.0，最適溫度為25℃，發(fā)酵5d產(chǎn)量達到最高，其在30℃以上雖然菌體生長良好但不會產(chǎn)生赭曲霉毒素A。本發(fā)明篩選的赭曲霉毒素A產(chǎn)生菌具有較高的毒素產(chǎn)量，其發(fā)酵液經(jīng)純化后可獲得赭曲霉毒素A純品，可作為赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品的生產(chǎn)菌株；亦可作為模式菌，用于涉及黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物過程中，產(chǎn)赭曲霉毒素A菌株的檢測及其產(chǎn)生機理的研究。CGMCC No 966820140916
【專利說明】-株赭曲霉毒素 A的產(chǎn)生菌

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說是一株赭曲霉毒素 A的產(chǎn)生菌。 技術(shù)背景
[0002] 赭曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產(chǎn)生的一類有毒次級代謝產(chǎn)物，該類 物質(zhì)以異香豆素交聯(lián)L-苯丙氨酸為基本結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上包含多種衍生物，其中赭曲霉 素 A(0chratoxinA, 0ΤΑ)是分布最廣、毒性最強的一種真菌毒素，已被國際癌癥研究機構(gòu) (IARC)定為2B類致癌物。由于OTA產(chǎn)生菌廣泛分布于自然界，同時OTA理化性質(zhì)較穩(wěn)定， 不易降解，因此，OTA的污染在全球范圍內(nèi)都比較嚴(yán)重，在糧食、飼料和糧谷類食物中均有檢 出的報道。鑒于OTA污染的嚴(yán)重性和廣泛性，對其生成機制、遷移及降解規(guī)律以及早期預(yù)警 的研究已成為當(dāng)今的研究熱點。
[0003] 目前對于OTA的生成機制已經(jīng)有一定的進展，可以確認(rèn)OTA的苯基丙氨酸部分來 自于莽草酸途徑，二氫異香豆素部分來自于聚五酮途徑。青霉和曲霉產(chǎn)生OTA的途徑并不 相同，相比青霉，目前對于曲霉中OTA的生成機制的研究更為欠缺，對于其中OTA具體的生 成途徑和催化反應(yīng)還遠未闡明。為了深入開展OTA的相關(guān)研究，篩選并鑒定不同種屬的OTA 產(chǎn)生菌是當(dāng)務(wù)之急。目前，已報道的OTA產(chǎn)生菌主要包括：青霉和曲霉這兩個屬。青霉屬中， 鮮綠青霉（Penicillium viridicatum)、產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum)、變幻青霉 (Penicillium variabile)、純綠青霉（Penicillium polonicum)、圓弧青霉（Penicillium cyclopium)和日耳曼青霉（Penicillium nordicum)等可以產(chǎn)生OTA。曲霉屬中，赫曲 霉（Aspergillus °C hraceus)、黑曲霉（Aspergillus niger)、炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius)、佩特曲霉（Aspergillus petrakii)、洋蔥曲霉（Aspergillus alliaceus)、 硫色曲霉（Aspergillus sulphureus)、蜂蜜曲霉（Aspergillus melleu)及寄生曲霉 (Aspergillus parasiticus)等也能產(chǎn)生 0ΤΑ。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了以一株赭曲霉毒素 A的產(chǎn)生菌，本發(fā)明篩選的赭曲霉毒素 A產(chǎn)生菌 具有較高的毒素產(chǎn)量，其發(fā)酵液經(jīng)純化后可獲得赭曲霉毒素 A純品，可作為赭曲霉毒素 A標(biāo) 準(zhǔn)品的生產(chǎn)菌株；亦可作為模式菌，用于涉及黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物過程中，產(chǎn)赭曲 霉毒素 A菌株的檢測及其產(chǎn)生機理的研究。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] 一株赭曲霉毒素 A的產(chǎn)生菌，菌名稱為：1062,分類命名為：黑曲霉（Aspergillus niger)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會微生物中心，保藏編號為：CGMCC No. 9668,保藏日期為：2014年9月16日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0007] 而且，所述菌株的最適產(chǎn)毒pH為7. 0,最適產(chǎn)毒溫度為25°C，靜置培養(yǎng)5d產(chǎn)毒量 達到最大。
[0008] 而且，所述菌株在20-40°C及YES固體培養(yǎng)基上pH在5. 0-9. 0之間時均能良好生 長。
[0009] 而且，所述菌株在30°C以上不產(chǎn)生赭曲霉毒素 A。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果：
[0011] 1、本發(fā)明的赭曲霉毒素 A的產(chǎn)生菌所產(chǎn)赭曲霉毒素 A的最適pH為7.0,最適溫度 為25°C，發(fā)酵5d產(chǎn)量達到最高，其在30°C以上雖然菌體生長良好但不會產(chǎn)生赭曲霉毒素 A。 本發(fā)明篩選的赭曲霉毒素 A產(chǎn)生菌具有較高的毒素產(chǎn)量，其發(fā)酵液經(jīng)純化后可獲得赭曲霉 毒素 A純品,可作為赭曲霉毒素 A標(biāo)準(zhǔn)品的生產(chǎn)菌株。
[0012] 2、本發(fā)明涉及的菌株在YES培養(yǎng)基中，在較短的時間內(nèi)（5d)，在適合的環(huán)境條件 下，OTA產(chǎn)量在35 μ g/g干菌絲左右；在OTA誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，OTA產(chǎn)量 可達500 μ g/g干菌絲以上。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明的菌株1062菌絲體電子顯微鏡照片（X 400);
[0014] 圖2為本發(fā)明的菌株1062的電鏡照片（X 650);
[0015] 圖3為本發(fā)明的產(chǎn)赭曲霉毒素 A的最適時間圖；
[0016] 圖4為本發(fā)明的產(chǎn)赭曲霉毒素A的最適pH值圖；
[0017] 圖5為本發(fā)明的產(chǎn)赭曲霉毒素 A的最適溫度圖。
[0018] 具體的實施方式
[0019] 為了理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明：下述實施例是說明性 的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
[0020] 本發(fā)明篩選的赫曲霉毒素 A的廣生囷，名稱為1062，分類命名為：黑曲霉 (Aspergillus niger)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會微生物中心，保藏編號 為：CGMCC No. 9668,保藏日期為：2014年9月16日，其最適產(chǎn)毒pH為7. 0,最適產(chǎn)毒溫度為 25°C，靜置培養(yǎng)5d產(chǎn)毒量達到最大，在20-40°C及YES固體培養(yǎng)基上pH在5. 0-9. 0之間時 均能良好生長，其在30°C以上雖然菌體生長良好但不會產(chǎn)生赭曲霉毒素 A。
[0021] 本發(fā)明赭曲霉毒素 A的產(chǎn)生菌的篩選鑒定方法如下：
[0022] 1、菌株的分離和篩選：將從發(fā)霉的葡萄中分離純化的霉菌轉(zhuǎn)接到PDA平板中， 25°C培養(yǎng)5d，三點接種法將菌株接種到CYA和YES培養(yǎng)基，25°C避光培養(yǎng)7d，用打孔器從 菌落中心到外沿依次取直徑為9mm的3塊帶有菌絲體的培養(yǎng)物放入2mL離心管中，加入 500 μ L甲醇震蕩lmin，避光靜置lh，用孔徑0.22 μ L濾器過濾，通過HPLC-FLD及HPLC-MS 進行檢測和鑒定篩選出能產(chǎn)赭曲霉毒素 A的菌株。
[0023] 2、菌株的初步鑒定：
[0024] ⑴根據(jù)菌落形態(tài)及顯微特征鑒定，菌株在察氏培養(yǎng)基上整體成棕色，最外圍有一 圈白色菌絲，中間顏色最深為棕色孢子，表面干燥，整體較薄無褶皺。該菌株在YES培養(yǎng)基 上整體呈黃色，質(zhì)地薄，中心稍有凸起，菌落表面有大量褶皺呈輻射狀溝紋，干燥，從內(nèi)向外 分為四個部分，最中間一圈顏色呈淡黃色，向外一圈為白色，第三圈為鮮黃色，最外一圈為 白色菌絲，菌落邊緣不齊，菌落表面長有大量菌絲并帶有灰白色孢子；其在CYA培養(yǎng)基上整 體呈棕色，有大量的棕色孢子并有少許小水珠狀滲出液，整體薄有大量褶皺，中間有一圓形 褶皺，褶皺從中間向外沿呈放射狀，菌落最外圍呈黃色乳黃色菌絲，菌落邊緣整齊。菌株的 分生孢子梗細(xì)長，菌絲中存在隔膜，菌絲頂端連接分生孢子頭，上面有大量孢子，屬于典型 的曲霉屬細(xì)胞形態(tài)。
[0025] ⑵根據(jù)ITSDNA序列通過NCBI網(wǎng)站上的Blast程序與Genbank中核酸數(shù)據(jù)庫進行 比對，發(fā)現(xiàn)1062的ITSDNA序列和Aspergillus niger NJA-I的同源性達100%。菌株的 ITS DNA序列GenBank登錄號為KM259827。菌株的ITS DNA序列為：>1062
[0026] TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGT CTATTGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGC CCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTC AACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAG TGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGC CCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGC GTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCAT TCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA
[0027] 結(jié)合菌株的菌落形態(tài)，微觀形態(tài)及ITS DNA同源性分析等方面的區(qū)別特征，初步鑒 定菌株 1062 為黑曲霉（Aspergillus niger)。
[0028] ⑶菌株的發(fā)酵：
[0029] 孢子懸液的制備：用適量的無菌生理鹽水洗下平板上新鮮、生長旺盛的孢子，然后 移入裝有玻璃珠的三角瓶中，在振蕩器上充分振蕩，使孢子均勻分散。
[0030] 將孢子懸液以2%。的接種量接種到含有IOOmL發(fā)酵液（YES液體培養(yǎng)基）的錐形瓶 中，置于恒溫培養(yǎng)箱中25°C避光培養(yǎng)4-7d。
[0031] ⑷HPLC-FLD檢測及HPLC-MS鑒定方法：
[0032] 用孔徑0· 22 μ L濾器過濾發(fā)酵液，采用Kromstar?HPLC反相C18柱（250X4. 6mm， 5 μ m);柱溫：30°C ;激發(fā)波長330nm，發(fā)射波長460nm ;流動相：V (乙腈）：V (水）：V (乙 酸）=99 : 99 : 2;流速：1.0mL/min;進樣量：20μ?。質(zhì)譜條件：大氣壓電噴霧離子源 (API-ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（multi-resolution mesh, MRM);毛細(xì)管電壓4kV;干 燥氣體溫度300°C。
[0033] 本發(fā)明的赭曲霉毒素A的產(chǎn)生菌在YES培養(yǎng)基中所產(chǎn)赭曲霉毒素A的最適pH為 7.0,最適溫度為25°C。發(fā)酵5d產(chǎn)量達到最高。在30°C以上雖然菌體生長良好但不會產(chǎn)生 赭曲霉毒素 A。
[0034] 本發(fā)明涉及的菌株在YES培養(yǎng)基中，在較短的時間內(nèi)（5d)，在適合的環(huán)境條件下， OTA產(chǎn)量在35 μ g/g干菌絲左右；在OTA誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，OTA產(chǎn)量可 達500yg/g干菌絲以上。與國內(nèi)外文獻中的報道相比，該菌株有兩個顯著的特點：一是產(chǎn) 毒速度快，5d即可達到最高產(chǎn)毒水平，而大部分報道的產(chǎn)毒菌的最高產(chǎn)毒時間都在7d甚至 14d ;二是產(chǎn)毒量高，遠高于國內(nèi)文獻中普遍報道的OTA產(chǎn)量范圍（0. 001 μ g/g干菌絲-幾 十μ g/g干菌絲）。
[0035] 實施例1
[0036] ⑴菌株的篩選
[0037] 將實驗室已從葡萄中分離純化的真菌轉(zhuǎn)接到PDA平板中，25°C培養(yǎng)5d，三點接種 法將菌株接種到CYA和YES培養(yǎng)基，25°C避光培養(yǎng)7d，用打孔器從菌落中心到外沿依次取直 徑為9mm的3塊帶有菌絲體的培養(yǎng)物放入2mL離心管中，加入500 μ L甲醇震蕩lmin，避光 靜置lh，用孔徑0. 22 μ L濾器過濾，通過HPLC-FLD及HPLC-MS進行檢測和鑒定篩選出能產(chǎn) 赫曲霉毒素 A的囷株。
[0038] 所用培養(yǎng)基
[0039] PDA培養(yǎng)基：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOmL ;YES培養(yǎng)基：蔗糖 15g，酵母提取物20g，硫酸鎂0. 5g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOmL ;CYA培養(yǎng)基：酵母提取物5g， 蔗糖30g，K2HP04 lg，察氏濃縮液10mL，瓊脂15g ;察氏培養(yǎng)基：蔗糖30g，NaN03 2g，K2HP04 lg，KC10. 5g，MgS04 · 7H20 0· 5g，F(xiàn)eS04 · 7H20 0· Olg，瓊脂 15 ?25g，蒸餾水 IOOOml。
[0040] OTA誘導(dǎo)培養(yǎng)基：葡萄糖70g，果糖30g，酒石酸7g，蘋果酸10g，（NH4) 2S040 . 67g， (NH4)2HPO4O. 67g,KH2PO4L 5g, MgSO4 ·7Η200. 75g, NaClO. 75g, CaCl2O. 15g, CuCl2O. 0015g, FeSO 4 · 7H200. 021g, ZnSO4O. 0075g,兒茶素 0· 05g.
[0041] ⑵菌株的鑒定
[0042] 根據(jù)菌落形態(tài)，微觀特征及ITSDNA序列分析進行系統(tǒng)分類
[0043] 菌株為黑曲霉（Aspergillus niger)，在察氏培養(yǎng)基上整體成棕色，最外圍有一圈 白色菌絲，中間顏色最深為棕色孢子，表面干燥，整體較薄無褶皺。該菌株在YES培養(yǎng)基上 整體呈黃色，質(zhì)地薄，中心稍有凸起，菌落表面有大量褶皺呈輻射狀溝紋，干燥，從內(nèi)向外分 為四個部分，最中間一圈顏色呈淡黃色，向外一圈為白色，第三圈為鮮黃色，最外一圈為白 色菌絲，菌落邊緣不齊，菌落表面長有大量菌絲并帶有灰白色孢子；其在CYA培養(yǎng)基上整體 呈棕色，有大量的棕色孢子并有少許小水珠狀滲出液，整體薄有大量褶皺，中間有一圓形褶 皺，褶皺從中間向外沿呈放射狀，菌落最外圍呈黃色乳黃色菌絲，菌落邊緣整齊。菌株的分 生孢子梗細(xì)長，菌絲中存在隔膜，菌絲頂端連接分生孢子頭，上面有大量孢子。菌株的ITS DNA序列分析對比與黑曲霉（Aspergillus niger)的親緣性最高。
[0044] 3、菌株的發(fā)酵
[0045] 孢子懸浮液的制備：用適量的無菌生理鹽水洗下平板上新鮮、生長旺盛的孢子，然 后移入裝有玻璃珠的三角瓶中，在振蕩器上充分振蕩，使孢子均勻分散。
[0046] 將孢子懸液以2%。的接種量接種到含有IOOmL發(fā)酵液（YES液體培養(yǎng)基）的錐形瓶 中，置于恒溫培養(yǎng)箱中25°C避光培養(yǎng)4-7d。
[0047] 4、赭曲霉毒素 A的檢測及鑒定方法
[0048] 1、用孔徑0. 22 μ L濾器過濾發(fā)酵液，通過HPLC-FLD及HPLC-MS進行檢測和鑒定 赭曲霉毒素 Α。所用方法如下：采用KromstarTM HPLC反相C18柱（250X4. 6mm，5ym); 柱溫：30°C;激發(fā)波長330nm，發(fā)射波長460nm;流動相：V(乙腈）：V(水）：V(乙 酸）=99 : 99 : 2;流速：1.0mL/min;進樣量：20μ?。質(zhì)譜條件：大氣壓電噴霧離子源 (API-ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（multi-resolution mesh, MRM);毛細(xì)管電壓4kV;干 燥氣體溫度300°C。
【權(quán)利要求】
1. 一株赭曲霉毒素A的產(chǎn)生菌，其特征在于：菌名稱為：1062,分類命名為：黑曲霉 (Aspergillus niger)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會微生物中心，保藏編號 為：CGMCC No. 9668,保藏日期為：2014年9月16日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的赭曲霉毒素A的產(chǎn)生菌，其特征在于：所述菌株的最適產(chǎn)毒 pH為7. 0,最適產(chǎn)毒溫度為25°C，靜置培養(yǎng)5d產(chǎn)毒量達到最大。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的赭曲霉毒素A的產(chǎn)生菌，其特征在于：所述菌株在20-40°C及 YES固體培養(yǎng)基上pH在5. 0-9. 0之間時均能良好生長。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的赭曲霉毒素A的產(chǎn)生菌，其特征在于：所述菌株在30°C以上 不產(chǎn)生赭曲霉毒素A。
【文檔編號】C12N1/14GK104388318SQ201410577019
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】張健, 王小霞, 張穎, 高強, 王德培 申請人:天津科技大學(xué)