一種淀粉糖原的合成方法
【專利摘要】一種淀粉糖原的合成方法，屬于變性淀粉資源開發(fā)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明原理基于利用淀粉分支酶的轉(zhuǎn)糖基作用，將聚合度均一化糊精嫁接于支鏈淀粉分子上，制備高度支化，結(jié)構(gòu)類似動物糖原的植物性淀粉糖原。主要步驟為：以一定比例的DP10-20的糊精和A鏈DP10-20糯米淀粉為底物，分散于100mL的50mM、pH7.4的Tris-HCl緩沖液中，沸水浴糊化20min，冷卻至37℃后加入600U來源于灌漿期糯米籽粒的淀粉分支酶，恒溫水浴反應(yīng)6h，沸水浴10min滅酶，3000g離心5min去除沉淀，用5倍體積的無水乙醇分離淀粉產(chǎn)物，40℃烘干、粉碎即得淀粉糖原產(chǎn)品。該類淀粉糖原為短多分支淀粉（A鏈DP10-20），適用于光敏性組分包埋保護(hù)、藥物緩釋等領(lǐng)域。
【專利說明】一種淀粉糖原的合成方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種淀粉糖原的合成方法，涉及糯米來源的淀粉分支酶催化糯米淀粉和直鏈糊精底物形成類似動物糖原結(jié)構(gòu)的高分支淀粉的合成過程，屬于變性淀粉資源開發(fā)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]在植物的sul突變體內(nèi)存在一種高度支化的可溶性的a -D-葡聚糖，稱為植物糖原。該葡聚糖具有與動物糖原幾乎完全相同的鏈長和分支結(jié)構(gòu)，分子量在15數(shù)量級，分支密度遠(yuǎn)高于支鏈淀粉，而平均鏈長則明顯小于后者。目前國內(nèi)外學(xué)者對其的研究集中在合成機理、性質(zhì)及結(jié)構(gòu)等方面。
[0003]淀粉分支酶是支鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶，可以切斷α -1，4糖苷鍵，同時以α -1，6糖苷鍵的形式將直鏈轉(zhuǎn)移到支鏈上形成新的分支。目前國內(nèi)外研究集中在利用淀粉分支酶作用單純淀粉底物，考察該酶對淀粉回生、慢消化性等影響方面的研究。
[0004]本發(fā)明團(tuán)隊前期發(fā)現(xiàn)，灌漿期糯米來源的淀粉分支酶在體外可以將高直鏈的淀粉轉(zhuǎn)化為分子量為15數(shù)量級的類似糖原結(jié)構(gòu)的高度支化淀粉。當(dāng)?shù)孜镏兄辨湹矸?或直鏈糊精)的聚合度較低且分布集中時，所得的植物糖原分支程度提高且側(cè)鏈分布更為集中。本發(fā)明即以DP10-20直鏈糊精和A鏈聚合度DP10-20的糯米淀粉為底物，利用灌漿期糯米籽粒淀粉分支酶合成短側(cè)鏈高分支的淀粉糖原產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種淀粉糖原的合成方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種淀粉糖原的合成方法，包括聚合度均一化底物糊精的制備、灌漿期糯米淀粉分支酶的篩選、淀粉糖原的酶法合成步驟，以聚合度DP10-20的直鏈糊精和A鏈DP10-20糯米淀粉為底物，利用從灌漿期糯米籽粒胚乳中提取的淀粉分支酶的轉(zhuǎn)糖基作用來催化轉(zhuǎn)化底物，將糊精接到糯米淀粉分支上，合成短鏈DP10-20、高分支化類似動物糖原的植物性淀粉糖原產(chǎn)品。合成步驟為:
1.底物的制備與選擇。底物一:糯米淀粉，平均鏈長DP為17.4，A鏈DP10-20 ;底物:DP10-20直鏈糊精，采用醇酸降解-聚乙二醇沉淀法獲取DP10-20的直鏈糊精；
2.灌漿期糯米籽粒淀粉分支酶的提取。采用的淀粉分支酶由灌漿12-15天的傳統(tǒng)糯米籽粒胚乳中提取獲得。稱取50g灌漿12-15天的傳統(tǒng)糯米籽粒，加入150mL的50mM、pH7.4的Tris-HC緩沖液，經(jīng)勻漿、過濾、離心后獲得粗酶液，并進(jìn)一步過DEAE柱、ToyopearlHW-55F柱，收集活性成分并用SDS-PAGE電泳鑒定酶的組成與純度，于4°C下儲存，備用；
3.淀粉糖原的合成。按質(zhì)量比1:1?1:2的比例稱取A鏈DP10-20的糯米淀粉和DP10-20直鏈糊精，共10g，分散于10mL的Tris-HCl (50mM、pH 7.4)緩沖液中，沸水浴中加熱20min至完全糊化，冷卻至37°C，加入600U淀粉分支酶，于37°C振蕩水浴中反應(yīng)6h。沸水浴1min滅酶,3000g離心5min,去掉沉淀,清液用5倍體積的無水乙醇沉淀,5000g下離心15min。沉淀用乙醇反復(fù)洗滌三次，于40°C烘箱中過夜，干燥、粉碎得到淀粉糖原產(chǎn)品。
[0007]4.淀粉糖原分子結(jié)構(gòu)鑒定。采用高效排阻色譜聯(lián)合多角度激光檢測器檢測淀粉糖原的分子量和分散系數(shù)；利用異淀粉酶對淀粉糖原進(jìn)行脫支處理，用高效陰離子色譜分析其側(cè)鏈分布。結(jié)果證明淀粉糖原產(chǎn)品的平均分子量為15 Da數(shù)量級，分散系數(shù)小于1.4，側(cè)鏈鏈長DP10-20，呈非晶簇狀，具有與動物糖原相似的結(jié)構(gòu)與空間多維包埋能力。
[0008]本發(fā)明的有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種短鏈多分支淀粉糖原的體外制備方法，具有底物利用率高，副產(chǎn)物少，多維空間包埋性能優(yōu)越等優(yōu)點。

【具體實施方式】
[0009]實施例1
淀粉分支酶的提取:稱取50g灌漿12-15天的傳統(tǒng)糯米籽粒，加入150mL的Tris-HCl(50mM、pH 7.4)緩沖液，經(jīng)勻漿、過濾、離心后獲得粗酶液，并進(jìn)一步過DEAE柱、ToyopearlHW-55F柱，收集活性成分并用SDS-PAGE電泳鑒定酶的組成與純度，于4°C下儲存，備用。
[0010]采用醇酸降解-聚乙二醇沉淀法獲取DP10-20的糊精:稱取50g木薯淀粉分散于500mL正丁醇中，加入5mL濃鹽酸，于40°C下水解3d，加入IM NaNO3終止反應(yīng)，4000g離心15min，用50%乙醇洗滌沉淀數(shù)次至無氯離子，40°C烘箱干燥24h，粉碎，過篩。將水解的淀粉用蒸餾水配置成10mL的3.2%的糊精溶液，逐步加入數(shù)均分子量8000Da的聚乙二醇(化學(xué)純)，加熱攪拌至聚乙二醇溶解，在空氣中自然冷卻到25°C，置于25°C水浴鍋24h，于4000g下離心20min。取聚乙二醇加入量在50-60g之間離心得到的濃相，用三氯甲烷洗滌除去殘留的聚乙二醇，40°C干燥24h，粉碎，所得糊精的重均分子量為2.440X 13Da,分散系數(shù)為
1.27。
[0011]分別以1:1的比例稱取該糊精和糯米淀粉共10g，分散于10mL Tris-HCl (50mM、pH 7.4)緩沖液中并于沸水浴中加熱20min至完全糊化，冷卻至37°C，加入600U淀粉分支酶,于37°C振蕩水浴中反應(yīng)6h。沸水浴1min滅酶，3000g下離心5min,去掉沉淀,清液用5倍體積無水乙醇沉淀，5000g下離心15min。沉淀用乙醇反復(fù)洗滌三次，于40°C烘箱中干燥過夜，粉碎，得到重均分子量為4.578 X 15 Da，分散系數(shù)為1.24的淀粉糖原，其分支側(cè)鏈的DP為10-17，平均鏈長DP為11.3。
[0012]實施例2
稱取50g灌漿12-15天的傳統(tǒng)糯米籽粒，加入150mL的Tris-HCl (50mM、pH 7.4)緩沖液，經(jīng)勻漿、過濾、離心后獲得粗酶液，并進(jìn)一步過DEAE柱、Toyopearl HW-55F柱，收集活性成分并用SDS-PAGE電泳鑒定酶的組成與純度，于4°C下儲存，備用。
[0013]采用醇酸降解-聚乙二醇沉淀法獲取DP10-20的糊精:稱取50g木薯淀粉分散于500mL正丁醇中，加入5mL濃鹽酸，于40°C下水解3d，加入IM NaNO3終止反應(yīng)，4000g離心15min，用50%乙醇洗滌沉淀數(shù)次至無氯離子，40°C烘箱干燥24h，粉碎，過篩。將水解的淀粉用蒸餾水配置成10mL的3.2%的糊精溶液，逐步加入數(shù)均分子量8000Da的聚乙二醇(化學(xué)純)，加熱攪拌至聚乙二醇溶解，在空氣中自然冷卻到25°C，置于25°C水浴鍋24h，于4000g下離心20min。取聚乙二醇加入量在50-60g之間離心得到的濃相，用三氯甲烷洗滌除去殘留的聚乙二醇，40°C干燥24h，粉碎，所得糊精的重均分子量為2.440X 13Da,分散系數(shù)為
1.27。
[0014]以2:1的比例稱取該糊精和糯米淀粉共10g，分散于10mL Tris-HCl (50mM、pH7.4)緩沖液中并于沸水浴中加熱20min至完全糊化，冷卻至37°C，加入600U淀粉分支酶，于37°C振蕩水浴中反應(yīng)6h。沸水浴1min滅酶，3000g下離心5min,去掉沉淀,清液用5倍體積無水乙醇沉淀，5000g下離心15min。沉淀用乙醇反復(fù)洗滌三次，于40°C烘箱中干燥過夜，粉碎，得到重均分子量為5.339 X 15 Da，分散系數(shù)為1.31的淀粉“糖原”，其分支側(cè)鏈的DP為10-20，平均鏈長DP為14.1。
【權(quán)利要求】
1.一種淀粉糖原的合成方法，其特征在于包括聚合度均一化底物糊精的制備、灌漿期糯米淀粉分支酶的篩選、淀粉糖原的酶法合成步驟；以聚合度DP10-20的糊精和A鏈DP10-20糯米淀粉為底物，利用從灌漿期糯米籽粒胚乳中提取的淀粉分支酶的轉(zhuǎn)糖基作用來催化轉(zhuǎn)化底物，將糊精接到糯米淀粉分支上，合成短鏈DP10-20、高分支化類似動物糖原的植物性淀粉糖原產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淀粉糖原的合成方法，其特征在于具體步驟為: (1)底物的制備與選擇:選取A鏈DP10-20的糯米淀粉和DP10-20直鏈糊精為底物?’聚合度均一化的DP10-20直鏈糊精，由木薯淀粉經(jīng)過醇酸降解，6000Da的聚乙二醇逐步沉淀分級得到； (2)灌漿期糯米籽粒淀粉分支酶的提取:采用的淀粉分支酶由灌漿12-15天的傳統(tǒng)糯米籽粒胚乳中提取獲得；稱取50g灌漿12-15天的傳統(tǒng)糯米籽粒，加入150mL的50mM、pH7.4的Tris-HC緩沖液，經(jīng)勻漿、過濾、離心后獲得粗酶液，并進(jìn)一步過DEAE柱、ToyopearlHW-55F柱，收集活性成分并用SDS-PAGE電泳鑒定酶的組成與純度，于4°C下儲存，備用； (3)淀粉糖原的合成:稱取A鏈DP10-20的糯米淀粉和DP10-20直鏈糊精，質(zhì)量比1:1?1:2，總共1g,分散于10mL的50mM pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中，沸水浴中加熱20min至完全糊化，冷卻至37°C，加入600U淀粉分支酶，于37°C振蕩水浴中反應(yīng)6h ;沸水浴1min滅酶,3000g離心5min,去掉沉淀,清液用5倍體積的無水乙醇沉淀,5000g下離心15min ;沉淀用乙醇反復(fù)洗滌三次，于40°C烘箱中過夜，干燥、粉碎得到產(chǎn)品淀粉糖原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的淀粉糖原的合成方法，其特征在于所得到的淀粉糖原產(chǎn)品平均分子量為15 Da數(shù)量級，分散系數(shù)小于1.4，側(cè)鏈鏈長0?10-20，呈非晶簇狀，具有與動物糖原相似的結(jié)構(gòu)與空間多維包埋能力。
【文檔編號】C12P19/04GK104293864SQ201410579495
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】田耀旗, 陳煌莉, 王萬里, 金征宇, 魏本喜, 謝正軍, 趙建偉, 楊哪 申請人:江南大學(xué)