一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，包括：以miRNA-505-3P基因為特異性的轉(zhuǎn)錄本，分別將該逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的莖部堿基對的數(shù)量和環(huán)部的堿基個數(shù)規(guī)律的設(shè)計對應(yīng)的幾個梯度，經(jīng)過對miRNA-505-3P的逆轉(zhuǎn)錄和real time-PCR檢測，最終篩選出一個對于miRNA-505-3P基因特異性逆轉(zhuǎn)錄時效率最佳的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物。本發(fā)明避免了對成熟體檢測的干擾，通過莖環(huán)引物在莖部和環(huán)部的梯度性的調(diào)整，可以分別明確的看出環(huán)部堿基的結(jié)構(gòu)和莖部堿基的結(jié)構(gòu)分別對逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的逆轉(zhuǎn)錄效率的影響，因此更容易設(shè)計出合理高效的逆轉(zhuǎn)錄引物。
【專利說明】一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測miRNA領(lǐng)域，特別涉及一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前檢測miRNA的技術(shù)主要有Northern印跡雜交（Reinhart BJ，Weinstein EG，Rhoades MW，et al. MicroRNAs in plants[J] · Genes Dev，2002, 16 (13):1616"1626)、 微陣列（Reinhart BJ，Weinstein EG，Rhoades MW，et al. MicroRNAs in plants [J]· Genes Dev，2002, 16(13) :1616"1626)和RT-PCR技術(shù)，但最常用和最靈敏的miRNA檢測技術(shù)為 qRT-PCR。qRT-PCR最終產(chǎn)物的熒光信號濃度不僅僅取決于miRNA的初始表達(dá)量高低，它 還受到逆轉(zhuǎn)錄以及PCR擴(kuò)增效率的影響。2005年，Chen等將反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)引入到 miRNA的檢測當(dāng)中，建立了名為莖環(huán)的反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)（stem-loop RT-PCR).他首先 設(shè)計了一個通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，隨后在該序列的3'端加上5?8個堿基，與目的 miRNA的3'端反向互補(bǔ)。當(dāng)目標(biāo)miRNA存在時，該引物與其雜交進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，再 加入正反引物和Taqman探針，進(jìn)行定量PCR，這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)大大提高了反轉(zhuǎn)錄的效率和特 異性（Chen C，Ridzon D A，Broomer A J，et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT~PCR[J]. Nucleic acids research,2005,33 (20):el79-el79 ；Pieter Mestdaghj Tom Feysj Nathalie Bernard,et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA[J]. Nucleic Acids Research，2008, 36 (21):el43)〇
[0003] miR-505 位于小鼠 X 染色體 X:57647578-57647667 處，ATPllC 基因的第一和 第二外顯子之間的第一個內(nèi)含子中。2010年，Verduci L等發(fā)現(xiàn)miR-505能通過作用 于其靶標(biāo)ASF/SF2 (可變剪接因子）發(fā)揮調(diào)控小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的增殖和衰老/凋亡 的作用（Verduci，L，Simili M，Rizzo M，Mercatanti A，Evangelista M et al. (2010) MicroRNA(miRNA)-mediated Interaction between Leukemia/Lymphoma-related Factor (LRF) and Alternative splicing factor/splicing factor2(ASF/SF2) affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis.J Biol Chem，285:39551-39563) ,Kami R等發(fā)現(xiàn)在許多細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ASF/SF2可以激活mTOR部分信 號通路（Kami Rj Hippo Yj Lowe SWjKrainer AR(2008) The splicing-factor oncoprotein SF2/ASF activates mTORCLProc Natl Acad Sci USA 105(40):15323-15327),但是 ASF參與調(diào)控mTOR的具體方式還不清楚。Yamamoto Y等在研究腫瘤多藥抗性時，發(fā)現(xiàn) miR-505是一個新的腫瘤抑制miRNA，與其呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的蛋白Akt3,與mTOR通路上的AKT 屬于同一基因家族（Yamamoto Y，Yoshioka Y，Minoura K，Takahashi R，Takeshita F et al., (2011)An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells. Mol Cancer，10:13539551-39563)。因此miR-505極有可能通過調(diào)控mTOR信號通路發(fā)揮其生物 學(xué)功能，而mTOR通路是目前分子生物學(xué)研究的熱點，它能整合細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號，起 到調(diào)控細(xì)胞代謝，生長，增殖和存活等過程的中心調(diào)控者的作用，mTOR通路的改變與多種疾 病相關(guān)（Mathieu Laplante and David M. Sabatini，mTOR signaling at a glance (2009) J Cell Sci 122, 3589-3594.)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，通過運(yùn)用以2005 年，Chen等設(shè)計的通用莖環(huán)引物作為基本骨架，以miRNA-505-3P基因為特異性的轉(zhuǎn)錄 本，分別將該逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的莖部堿基對的數(shù)量和環(huán)部的堿基個數(shù)規(guī)律的設(shè)計對應(yīng)的 幾個梯度，經(jīng)過對miRNA-505-3P的逆轉(zhuǎn)錄和real time-PCR檢測，最終篩選出一個對于 miRNA-505-3P基因特異性逆轉(zhuǎn)錄時效率最佳的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物。
[0005] 本發(fā)明的一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，包括：
[0006] (1)設(shè)計3個梯度在固定莖部為14對堿基互補(bǔ)配對時的特異性逆轉(zhuǎn)錄 miRNA-505-3P基因的莖環(huán)引物；
[0007] (2)設(shè)計4個梯度在固定環(huán)部為21對堿基互補(bǔ)配對時的特異性逆轉(zhuǎn)錄 miRNA-505-3P基因的莖環(huán)引物；
[0008] (3)設(shè)計real time-PCR的擴(kuò)增引物；其中，上游引物 5' -GCGAGCACCGTCAACACTTG-3'，下游引物 5' -TGCAGGGTCTGACTTATT-3';
[0009] (4)采用（1)和⑵中的莖環(huán)引物將mir-505-3P基因逆轉(zhuǎn)錄為CDNA ;
[0010] (5)固定逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的莖部結(jié)構(gòu)為14個堿基對，3個梯度的環(huán)部結(jié)構(gòu)所逆轉(zhuǎn) 錄出的CDNA進(jìn)行real time-PCR的檢測；PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測；
[0011] (6)固定逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的環(huán)部結(jié)構(gòu)為21個堿基對，4個梯度的莖部結(jié)構(gòu)所逆轉(zhuǎn) 錄出的CDNA進(jìn)行real time-PCR的檢測；PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測；
[0012] (7)比對（5)、（6)結(jié)果，進(jìn)行real time-PCR的二次檢測，確定逆轉(zhuǎn)效率最佳的莖 環(huán)引物。
[0013] 所述步驟（1)中的莖環(huán)引物分別為：
[0014] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATAGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '
[0015] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '
[0016] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '。
[0017] 所述步驟（2)中的莖環(huán)引物分別為：
[0018] 5' -AGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTAGAAAACCAG-3'
[0019] 5' -TCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGAAGAAAACCAG-3'
[0020] 5 ' -GTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACAGAAAACCAG-3 '
[0021] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '。
[0022] 所述步驟（4)中逆轉(zhuǎn)錄前進(jìn)行莖環(huán)引物處理，具體上機(jī)程序為95°C 30s，80°C 30s， 70°C 30s, 60°C 30s, 50°C 30s, 40°C 30s, 30°C 30s, 20°C 30s〇
[0023] 所述步驟（4)中的逆轉(zhuǎn)錄具體方法為：將莖環(huán)引物特異性的結(jié)合在miRNA-505_3P 序列上，隨后將mir-505-3P的特異性逆轉(zhuǎn)錄為⑶NA,最后將酶滅活，低溫保存。
[0024] 所述莖環(huán)引物特異性的結(jié)合的上機(jī)程序為16°C 15min，所述mir-505-3P的特異性 逆轉(zhuǎn)錄的上機(jī)程序為為35°C 60min，80°C 15min。
[0025] 所述步驟（5)和（6)中的PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min，95°C變性15s，60°C 退火30s，70°C延伸30s，從第二步開始共反應(yīng)40個循環(huán)。
[0026] 所述步驟（5)和（6)中的電泳檢測使用2%的瓊脂糖凝膠。
[0027] 本發(fā)明旨在針對哺乳動物的miRNA-505基因構(gòu)建一個既高效又特異性的逆轉(zhuǎn)錄 莖環(huán)引物。針對miRNA-505基因，通過改變通用莖環(huán)引物來進(jìn)行高效逆轉(zhuǎn)錄引物的摸索，將 通用莖環(huán)引物先保持莖部堿基對的數(shù)目不變，再梯度改變環(huán)部的堿基個數(shù)，經(jīng)過后續(xù)檢測 可以判斷哪個組合的逆轉(zhuǎn)錄效率最好。然后以最好那組的環(huán)部結(jié)構(gòu)不變，再梯度改變莖部 堿基對的數(shù)目，經(jīng)過后續(xù)檢測即可以判斷出莖環(huán)引物的最佳莖部堿基的結(jié)構(gòu)和環(huán)部結(jié)構(gòu)的 組合。
[0028] 本發(fā)明的工藝過程，以2005年，Chen等設(shè)計的通用莖環(huán)引物作為基本骨架，以 miRNA-505-3P基因為特異性的轉(zhuǎn)錄本，首先保持莖環(huán)引物的莖部堿基的配對數(shù)不變，再對 其環(huán)部設(shè)計3個梯度的堿基個數(shù)，同時還要在3'端加上10個堿基，與目的miRNA-505-3P 的3'端反向互補(bǔ)，以確保逆轉(zhuǎn)錄時的特異性。通過這3條逆轉(zhuǎn)錄引物同時將小鼠總mRNA 中的miRNA-505-3P逆轉(zhuǎn)錄為CDNA ;同時還要設(shè)計出real time-PCR的引物，莖環(huán)法的上游 引物較特殊，是由5'端堿基（模板外）與3'特異序列（模板內(nèi)））部分組成的，這源于莖 環(huán)法特殊的模板鏈延長方式。上游引物的3'端有12個堿基與成熟體miRNA-505-3P的5' 端同源，而引物的5'端則人為延伸8個堿基，以增加目的片段的長度；下游引物固定設(shè)計18 個堿基在莖環(huán)引物的環(huán)部結(jié)構(gòu)處，與環(huán)部結(jié)構(gòu)的堿基同源。經(jīng)過對成熟體miRNA-505-3P的 逆轉(zhuǎn)錄以及real time-PCR的檢測，以篩選出逆轉(zhuǎn)錄效率最高時所得到的莖環(huán)部堿基結(jié)構(gòu) 組成的莖環(huán)引物。再保持該莖環(huán)引物環(huán)部結(jié)構(gòu)不變，莖部分別設(shè)計4個梯度的堿基配對數(shù)， 經(jīng)過對成熟體miRNA-505-3P的逆轉(zhuǎn)錄以及real time-PCR的檢測，最終可以得到一個對于 miRNA-505-3P基因特異性逆轉(zhuǎn)錄時，效率最高時最佳莖部和環(huán)部堿基結(jié)構(gòu)組合的逆轉(zhuǎn)錄莖 環(huán)引物。
[0029] 將設(shè)計好的針對miRNA-505-3P基因特異性逆轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)引物，對小鼠下丘腦組 織所提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并分別將CDNA稀釋兩個梯度，進(jìn)行real time-PCR檢測，以確 認(rèn)其擴(kuò)增效率是穩(wěn)定和高效的，以證明設(shè)計的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物高效性的可靠性。
[0030] 有益效果
[0031] (1)本發(fā)明對miRNA-505-3P成熟體的逆轉(zhuǎn)錄，成功的避開了對其前體的逆轉(zhuǎn)錄， 因為前體在自然狀態(tài)下也存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因此無法與反轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合，因此避免了對成熟 體檢測的干擾；
[0032] (2)通過莖環(huán)引物在莖部和環(huán)部的梯度性的調(diào)整，可以分別明確的看出環(huán)部堿基 的結(jié)構(gòu)和莖部堿基的結(jié)構(gòu)分別對逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的逆轉(zhuǎn)錄效率的影響，因此更容易設(shè)計出 合理高效的逆轉(zhuǎn)錄引物，為以后在針對其它miRNA設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄引物時提供重要的參考信 肩、。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1為作為骨架的通用逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物；
[0034] 圖2為3條在固定莖部為14對堿基互補(bǔ)配對時的特異性逆轉(zhuǎn)錄miRNA-505-3P基 因的莖環(huán)引物；
[0035] 圖3為4條在固定環(huán)部為21個堿基數(shù)時的特異性逆轉(zhuǎn)錄miRNA-505-3P基因的莖 環(huán)引物；
[0036] 圖4為莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增的示意圖；
[0037] 圖5為固定逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的莖部結(jié)構(gòu)為14個堿基對，3個梯度的環(huán)部結(jié)構(gòu)所逆 轉(zhuǎn)錄出的CDNA的融解曲線；
[0038] 圖6為固定逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的莖部結(jié)構(gòu)為14個堿基對，3個梯度的環(huán)部結(jié)構(gòu)所逆 轉(zhuǎn)錄出的CDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；
[0039] 圖7為固定逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的環(huán)部結(jié)構(gòu)為21個堿基對，4個梯度的莖部結(jié)構(gòu)所逆 轉(zhuǎn)錄出的CDNA的融解曲線；
[0040] 圖8為固定逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的環(huán)部結(jié)構(gòu)為21個堿基對，4個梯度的莖部結(jié)構(gòu)所逆 轉(zhuǎn)錄出的CDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。

【具體實施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0042] 實施例1
[0043] (1)選擇一個莖環(huán)引物骨架。（圖1)
[0044] (2)針對mir-505-3P基因，固定逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的莖部結(jié)構(gòu)為14個堿基對，設(shè)計 3個梯度的環(huán)部結(jié)構(gòu)：（圖2)
[0045] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATAGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '
[0046] 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '
[0047] 5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3'。
[0048] (3)針對mir-505-3P基因，固定逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的環(huán)部結(jié)構(gòu)為21個堿基，設(shè)計4 個梯度的莖部結(jié)構(gòu)：（圖3)
[0049] 5' -AGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTAGAAAACCAG-3'
[0050] 5' -TCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGAAGAAAACCAG-3'
[0051] 5 ' -GTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACAGAAAACCAG-3 '
[0052] 5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3'。
[0053] (4)設(shè)計real time-PCR的擴(kuò)增引物
[0054] PCR 的上游引物為 20bp :5，-GCGAGCACCGTCAACACTTG-3，
[0055] PCR 的下游引物為 18bp :5，-TGCAGGGTCTGACTTATT-3，。
[0056] 設(shè)計的不同的莖環(huán)引物所對應(yīng)的PCR產(chǎn)物大小：
[0057]
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，包括： (1) 設(shè)計3個梯度在固定莖部為14對堿基互補(bǔ)配對時的特異性逆轉(zhuǎn)錄miRNA-505-3P 基因的莖環(huán)引物； (2) 設(shè)計4個梯度在固定環(huán)部為21對堿基互補(bǔ)配對時的特異性逆轉(zhuǎn)錄miRNA-505-3P 基因的莖環(huán)引物； (3) 設(shè)計real time-PCR的擴(kuò)增引物；其中，上游引物 5' -GCGAGCACCGTCAACACTTG-3'，下游引物 5' -TGCAGGGTCTGACTTATT-3'; (4) 采用（1)和（2)中的莖環(huán)引物將mir-505-3P基因逆轉(zhuǎn)錄為CDNA; (5) 固定逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的莖部結(jié)構(gòu)為14個堿基對，3個梯度的環(huán)部結(jié)構(gòu)所逆轉(zhuǎn)錄出 的CDNA進(jìn)行real time-PCR的檢測；PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測； (6) 固定逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物的環(huán)部結(jié)構(gòu)為21個堿基對，4個梯度的莖部結(jié)構(gòu)所逆轉(zhuǎn)錄出 的CDNA進(jìn)行real time-PCR的檢測；PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測； (7) 比對（5)、（6)結(jié)果，進(jìn)行real time-PCR的二次檢測，確定逆轉(zhuǎn)效率最佳的莖環(huán)引 物。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，其特征在于：所 述步驟（1)中的莖環(huán)引物分別為： 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATAGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3， 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3， 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，其特征在于：所 述步驟（2)中的莖環(huán)引物分別為： 5 ' -AGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTAGAAAACCAG-3， 5 ' -TCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGAAGAAAACCAG-3 ' 5 ' -GTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACAGAAAACCAG-3 ' 5 ' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3 '。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，其特征在于：所 述步驟（4)中逆轉(zhuǎn)錄前進(jìn)行莖環(huán)引物處理，具體上機(jī)程序為95°C 30s，80°C 30s，70°C 30s，60 °C 30s, 50°C 30s, 40°C 30s, 30°C 30s, 20°C 30s〇
5. 如權(quán)利要求1所述的一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，其特征在于：所 述步驟（4)中的逆轉(zhuǎn)錄具體方法為：將莖環(huán)引物特異性的結(jié)合在miRNA-505-3P序列上，隨 后將mir-505-3P的特異性逆轉(zhuǎn)錄為⑶NA，最后將酶滅活，低溫保存。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，其特征在于：所 述莖環(huán)引物特異性的結(jié)合的上機(jī)程序為16°C 15min，所述mir-505-3P的特異性逆轉(zhuǎn)錄的上 機(jī)程序為為 35°C 60min，80°C 15min。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，其特征在于：所 述步驟（5)和（6)中的PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min，95°C變性15s，60°C退火30s， 70°C延伸30s，從第二步開始共反應(yīng)40個循環(huán)。
8. 如權(quán)利要求1所述的一種逆轉(zhuǎn)錄miR-505的莖環(huán)引物的設(shè)計方法，其特征在于：所 述步驟（5)和（6)中的電泳檢測使用2%的瓊脂糖凝膠。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372083SQ201410606864
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】熊黎, 肖君華, 周宇荀, 仝莉, 王茂春 申請人:東華大學(xué)