一種人血漿中miR-9熒光定量PCR的檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法。其特征在于首先設計特異性的“莖環(huán)狀”逆轉錄引物以及特異性的miR-9PCR擴增引物，然后建立和優(yōu)化實時定量反應體系和反應程序，最后根據(jù)△Ct法計算出miR-9的相對表達量。本發(fā)明由于利用了特異性的逆轉錄引物以及PCR引物，使得熒光定量PCR的特異性得到了保障，是一種高靈敏度、高特異性、快速而準確地檢測miR-9的方法，為臨床腫瘤的診斷、監(jiān)測以及預后提供了一個實用的方法。
【專利說明】—種人血漿中miR-9熒光定量PCR的檢測方法和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人血漿中miR-9熒光定量PCR的檢測方法和試劑盒，可用于腫瘤病人血漿中miR-9的檢測。屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]MicroRNAs (miRNAs)是一種非編碼的、內(nèi)源性的小分子RNA，長度約20-23個核苷酸。miRNAs能夠特異性地與靶基因mRNAs上3’非編碼區(qū)(3’UTR)的互補序列結合，從而阻止蛋白的合成。每個miRNA可以有多個祀基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡既可以通過一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調(diào)控某個基因的表達。miRNAs有著很強的保守性，不同種屬以及組織器官之間相同的miRNAs具有相似的調(diào)節(jié)功能。另外，miRNAs又有著很強的特異性，不同的組織細胞中miRNAs的表達譜是不同的。miRNAs主要是通過轉錄后抑制基因的表達，從而在生物體內(nèi)的各種生理過程中起著重要的調(diào)控作用。研究報道顯示，miRNAs在體內(nèi)參與多種細胞的發(fā)育、成熟、增殖、分化和凋亡。miRNA的表達、功能在不同的生理系統(tǒng)的發(fā)育中起著非常重要的作用。miRNA的異常表達會導致機體正常生理功能的紊亂，從而導致多種疾病的發(fā)生。大量研究表明，miRNA的表達和功能與人類多種疾病有著密切的聯(lián)系，包括腫瘤、代謝性疾病、神經(jīng)性疾病、感染、慢性炎癥以及自身免疫病等。大量研究指出，miR-9的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系。然而，在不同的腫瘤類型中，miR-9的表達量又是不盡相同的。因此miR-9的檢測對于不同腫瘤的診斷以及預后有著重要的意義。
[0003]目前,檢測miRNA主要有三種方法:第一,通過Northern印跡分析,是通過雜交檢測RNA的常用方法，但由于其操作繁雜，耗時長，不能進行大量的篩選試驗，且檢測的動態(tài)范圍只能達到兩個數(shù)量級，特異性不高，因此就限制了臨床珍惜標本的檢測，亦不利于開展大量的實驗研究。第二，通過微點陣分析，也是基于雜交原理來檢測RNA的一種方法，采用高密度的熒光標記探針與RNA樣本雜交，通過熒光掃描，相關軟件分析對miRNA進行定量。此方法能對miRNA進行高通量的檢測分析，但是標本需求量也較大，且不能區(qū)分序列差異很小的miRNA，亦造成假陽性。第三種方法是實時定量PCR，此方法先利用一種莖環(huán)狀引物進行逆轉錄，再設計PCR特異性擴增引物，然后進行實時定量PCR。該方法特異性、靈敏度都很高，且樣本需求量也少，為臨床標本的檢測以及科學研究提供了非常好的技術平臺。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明采用實時 熒光定量PCR技術，通過設計特異性莖環(huán)狀逆轉錄引物和特異性PCR擴增引物的方法，從而提高了檢測的特異性，為臨床提供了一種能夠實時、準確、檢測人血漿中miR-9表達的檢測方法和試劑盒。
[0005]本發(fā)明所采用的技術方案如下:
[0006]一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR檢測方法:首先設計特異性的莖環(huán)狀逆轉錄引物和特異性PCR擴增引物，然后經(jīng)過逆轉錄、實時熒光定量PCR程序，優(yōu)化反應體系，采用Δ Ct法計算miR-9的相對表達量。
[0007]hsa-miR-9特異性逆轉錄引物,序列如下:
[0008]5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCATACA-3’ (SEQ IDN0.1)
[0009]hsa-miR-9熒光定量PCR引物，序列如下:
[0010]正向引物:5’-GGGTCTTTGGTTATCTAGC-3’(SEQ ID N0.2)
[0011]反向引物:5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’(SEQ ID N0.3)
[0012]本發(fā)明檢測方法中，所述熒光定量PCR20 μ I反應體系由下列組分構成:10μ ISYBR 1^乂，1(^]?正向引物、反向引物各14 1，14 1樣本cDNA，補充滅菌水至于20 μ I。
[0013]本發(fā)明檢測方法中，所述PCR反應程序為95°C 10min，95° cl5sec，60°C 15sec，72°C 15sec，擴增40個循環(huán)。
[0014]一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測試劑盒:該試劑盒含有特異性miR_9逆轉錄引物(如SEQ ID N0.1所示)；特異性的miR-9PCR擴增引物(如SEQ ID N0.2和3所示)；逆轉錄試劑；PCR試劑。
[0015]進一步地，所述的逆轉錄試劑含有5X逆轉錄緩沖液，2.5mM的dNTP，200U/y IMMLV逆轉錄酶，40U/ μ I RNA酶抑制劑和無核酸酶的水。
[0016]進一步地，所述的PCR試劑為SYBR Mix。
`[0017]本發(fā)明利用熒光定量PCR技術提供了一種能夠實時、快速、準確地檢測人血漿中miR-9的檢測方法，從而填補了該miRNA在檢測方法方面的空白。
[0018]本發(fā)明由于利用了特異性的逆轉錄引物以及PCR引物，使得熒光定量PCR的特異性得到了保障，是一種高靈敏度、高特異性、快速而準確地檢測miR-9的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為熒光定量PCR樣本擴增的融解曲線
[0020]圖中橫坐標代表解鏈溫度[0021 ]圖中縱坐標代表相對熒光強度。
[0022]圖2為熒光定量PCR樣本擴增的熒光信號圖
[0023]圖中橫坐標代表循環(huán)數(shù)
[0024]圖中縱坐標代表相對熒光強度
[0025]圖中平行于橫坐標的直線代表循環(huán)閾值。
【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實施例來進一步闡述本發(fā)明，但應當理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。
[0027]材料:
[0028]血衆(zhòng)miRNA 提取試劑盒(Macherey-Nagel), NanoDroplOOO (Thermo),MMLV 逆轉錄酶(Takara), 5X 逆轉錄緩沖液(Takara), 2.5mM dNTP (Takara), RNA 酶抑制劑(Takara),SYBR Green Real Time PCR Kit (Thermo), DEPC 水，普通 PCR 儀(ABI)，CFX-96 熒光定量PCR 儀(Biorad)。[0029]實施例:
[0030]肺癌患者血漿中miR-9的檢測
[0031]1、引物的設計與合成
[0032]先從http://www.mirbase.0rg/ 中查找 hsa-miR-9 的成熟序列(MIMAT0000441),然后設計三條引物序列，送上海生物工程有限公司合成。
[0033]hsa-miR-9的成熟序列如下:
[0034]UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA (SEQ ID N0.4)
[0035]hsa-miR-9特異性逆轉錄引物，序列如下:
[0036]5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCATACA-3’ (SEQ IDN0.1)
[0037]hsa-miR-9熒光定量PCR引物，序列如下:
[0038]正向引物:5，-GGGTCTTTGGTTATCTAGC-3，(SEQID N0.2)
[0039]反向引物:5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’(SEQ ID N0.3)
[0040]2、血漿miRNA的抽提
[0041]取300 μ I肺癌患者血漿于1.5ml離心管中，按照血漿miRNA提取試劑盒中所述的步驟提取血漿中的miRNA(見廠家使用說明書)，通過NanoDrop1000測量RNA的濃度與純度，質(zhì)量良好的標本進行下一步實驗。
[0042]3、hsa-miR-9特異性逆轉錄
[0043]使用由上海生工生物有限公司合成的miR-9特異性的逆轉錄引物，以及Takara公司提供的MMLV逆轉錄酶、5 X逆轉錄緩沖液，2.5mM dNTP, RNA酶抑制劑進行逆轉錄，10 μ1
逆轉錄體系如下:
[0044]
【權利要求】
1.一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于首先設計特異性的“莖環(huán)狀”逆轉錄引物以及特異性的miR-9 PCR擴增引物，然后經(jīng)逆轉錄、熒光定量PCR程序，最后根據(jù)Λ Ct法計算出miR-9的相對表達量。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，其中特異性的miR-9逆轉錄引物的序列如SEQ ID N0.1所示；特異性的miR-9 PCR擴增引物序列如SEQ ID N0.2和3所示。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，其10 μ I逆轉錄體系如下:5Χ逆轉錄緩沖液2μ1，62.5ηΜ的特異性逆轉錄引物I μ I，2.5mM 的 dNTP 0.5 μ I，200U/ μ I 的 MMLV 逆轉錄酶 0.5 μ I，40U/ μ I 的 RNA 酶抑制劑.0.2 μ I, lug 樣本 RNA,補充 DEPC 水至 10 μ L.
4.根據(jù)權利要求1所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，逆轉錄程序如下:先將RNA與DEPC水混合，于PCR儀上預變性，70 oC IOmin,冰上靜置.2min ;再將其他試劑加入，于PCR儀上42 oC 60min, 70 oC IOmin0
5.根據(jù)權利要求1所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，熒光定量PCR中，20 μ I PCR反應體系由下列組分構成:10 μ I SYBR Mix，10 μ M正向引物、反向引物各I μ 1，I μ I樣本cDNA,補充滅菌水至于20 μ I。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，其 PCR 反應程序如下:95°C 10min,95°c 15sec,60°C 15sec , 72°C 15 sec，擴增 40 個循環(huán)。
7.—種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有特異性miR-9逆轉錄引物，如SEQ ID N0.1所示；特異性的miR-9 PCR擴增引物，如SEQ ID N0.2和3所示；逆轉錄試劑；PCR試劑。
8.根據(jù)權利要求7所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測試劑盒，其特征在于，所述的逆轉錄試劑含有5 X逆轉錄緩沖液，2.5mM的dNTP，200U/y I MMLV逆轉錄酶，.40U/ μ I RNA酶抑制劑以及無核酸酶的水。
9.根據(jù)權利要求7所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測試劑盒，其特征在于，所述的PCR試劑為SYBR Mix。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882129SQ201410101603
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月19日 優(yōu)先權日:2014年3月19日
【發(fā)明者】田潔, 王勝軍, 馬斌, 芮棵, 馬潔, 湯新逸, 田新宇, 沈培, 許化溪 申請人:江蘇大學