分泌抗柑橘衰退病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分泌抗柑橘衰退病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用?？寺×烁涕偎ネ瞬《荆–TV）的外殼蛋白基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了該病毒的外殼蛋白，用表達(dá)純化的蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗CTV單抗的雜交瘤細(xì)胞株14H11，其保藏號(hào)為CGMCCNo.9335。14H11單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10-8，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。建立的dot-ELISA方法能準(zhǔn)確、特異、靈敏地檢測(cè)田間柑橘類樣品中的CTV病毒?？笴TV單抗的制備及其檢測(cè)方法的建立為該柑橘病毒病的診斷、檢測(cè)及科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。CGMCC No933520140703
【專利說(shuō)明】分泌抗柑橘衰退病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種分泌抗柑橘衰退病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus , CTV)廣泛分布于世界各柑橘產(chǎn)區(qū)，其引起的衰退病是最具危害性的柑橘病害之一，該病毒主要通過(guò)蚜蟲和帶毒接穗傳播。CTV存在明顯的株系分化現(xiàn)象，除少數(shù)株系在某些柑橘品種上不產(chǎn)生可見癥狀外，大部分株系能在柑橘上產(chǎn)生明顯癥狀，常見癥狀可分為三大類型，即速衰型、莖陷點(diǎn)型和苗黃型。速衰型癥狀主要表現(xiàn)在以酸橙作砧木的甜橙等感病柑橘上；莖陷點(diǎn)癥狀的發(fā)生與砧木種類無(wú)關(guān)，常導(dǎo)致葡萄柚或甜橙產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降、植株矮化；苗黃癥狀在田間很少發(fā)生，主要是在酸橙、來(lái)檬或葡萄柚的苗期引起嚴(yán)重褪綠和矮化。CTV為長(zhǎng)線形病毒科(Closteroviridae)長(zhǎng)線形病毒屬(Closterovirus )成員，病毒粒子細(xì)長(zhǎng)彎曲，大小約2 OOOnm X (10?12) nm，其基因組全長(zhǎng)約為2 X 104個(gè)核苷酸，是已知植物病毒中基因組最大的病毒。CTV具有2種外殼蛋白，其中主要外殼蛋白(CP)分子量為25 kD，包裹了病毒粒子長(zhǎng)度的95 %;次要外殼蛋白(dCP)分子量為27kD，包裝在病毒粒子的尾部。針對(duì)CTV引起的柑橘衰退病，各國(guó)普遍采取的防治措施是使用無(wú)病毒的種苗和采用抗病或耐病砧木。而在美國(guó)和巴西等國(guó)利用弱毒株系對(duì)強(qiáng)毒株系的交叉保護(hù)作用對(duì)該病取得了很好的控制效果。病毒的檢測(cè)是無(wú)病毒種質(zhì)培育和弱毒株系篩選過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，目前，美國(guó)、西班牙、日本和意大利等國(guó)均已研制出針對(duì)該國(guó)特定CTV株系的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒。我國(guó)對(duì)CTV的研究始于20世紀(jì)50?60年代，大量的研究表明該病毒的多種株系在我國(guó)有廣泛的分布，傳毒性強(qiáng)的介體褐色橘姆(Toxoptera citricidaKirkaldy)也廣泛存在，隨著我國(guó)柑橘品種結(jié)構(gòu)的調(diào)整，強(qiáng)毒株系的危害變得日益嚴(yán)重。近些年來(lái)，柑橘無(wú)病毒種質(zhì)的培育和具有區(qū)域化特點(diǎn)的弱毒株系篩選已引起我國(guó)相關(guān)科研工作者的高度重視。而目前僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法和核酸雜交、RT-PCR等方法對(duì)小樣本進(jìn)行病毒檢測(cè)。本發(fā)明以原核表達(dá)的CTV衣殼蛋白(CP)為抗原通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了 I株抗CTV的特異性單克隆抗體，以制備的單抗為核心建立了檢測(cè)CTV的高通量的血清學(xué)方法，并成功應(yīng)用于田間CTV的檢測(cè)，從而為我國(guó)柑橘衰退病毒病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警、檢測(cè)、科學(xué)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗柑橘衰退病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。
[0004]分泌抗柑橘衰退病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株14H11，能分泌抗柑橘衰退病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株14H11于2014年7月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.9335 ； 雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗柑橘衰退病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10'抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體能與柑橘衰退病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，該單抗檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:10240倍稀釋；
雜交瘤細(xì)胞株14H11分泌的抗柑橘衰退病毒的單克隆抗體僅與柑橘衰退病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病類病毒、柑橘花葉病毒、柑橘皺葉病毒、柑橘粗糙病毒、柑橘鱗皮病毒、香蕉線條病毒、黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番茄斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘蔗花葉病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0005]抗柑橘衰退病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0006]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果:I)提供的雜交瘤細(xì)胞株能分泌抗柑橘衰退病毒的特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA和TAS-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)柑橘衰退病毒；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)柑橘衰退病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間植物中柑橘衰退病毒的檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0007]圖1是dot-ELISA方法檢測(cè)柑橘CTV的靈敏度分析；
圖2是dot-ELISA方法檢測(cè)柑橘類樣品中CTV的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0008]分泌抗柑橘衰退病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，于2014年7月3日，保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編:100101，保藏號(hào)為CGMCC N0.9335，它能分泌抗柑橘衰退病毒的單克隆抗體。
[0009]雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗柑橘衰退病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_8，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體能與柑橘衰退病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，該單抗檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:10240倍稀釋。
[0010]雜交瘤細(xì)胞株14H11分泌的抗柑橘衰退病毒的單克隆抗體僅與柑橘衰退病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病類病毒、柑橘花葉病毒、柑橘皺葉病毒、柑橘粗糙病毒、柑橘鱗皮病毒、香蕉線條病毒、黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番爺斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘蔗花葉病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0011]抗柑橘衰退病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0012]本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株能大量分泌抗柑橘衰退病毒單抗，且該單抗特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立了檢測(cè)CTV的高通量的血清學(xué)方法，并成功應(yīng)用于田間CTV的檢測(cè)，從而為我國(guó)柑橘衰退病的診斷、早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警、科學(xué)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014]一、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備
1.免疫原的制備
根據(jù)已報(bào)道的CTV編碼外殼蛋白基因序列(登錄號(hào):EU693526)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物:CP-F (5，-CTGCTA④iZ^ACGACGAAACAAAGAAATTG-3’，劃線部分為 Nco I 酶切位點(diǎn)和 CP-R(5’ -TTGTAGCTtMGACGTGTGTTGAATTT
CCCAAG-3’，劃線部分為ZAo I酶切位點(diǎn))，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。利用Trizol法提取柑橘病樣的基因組總RNA，以總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，37°C，15min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，98°C 5min滅活酶后將cDNA保存于4°C或者_(dá)20°C。以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，即模板 ?μ?，5XPrimeSTARTM Buffer (含 Mg2+) ΙΟμΙ, dNTP Μ?χ4μ1, PrimeSTARTMDNA Polymerase (2.5 U/μ L) 0.5μ1，上下游引物各?μ?，最后雙蒸無(wú)菌水補(bǔ)足反應(yīng)終體積為50μ1。PCR反應(yīng)體系如下:預(yù)變性94°C 2 min,變性94°C 30 s，退火58°C 40 s，延伸72°C 60 s，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后延伸72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并用PCR凝膠回收試劑盒(AxyGEN)回收DNA片段，具體操作參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將純化的PCR產(chǎn)物末端加A與克隆載體pMD-18T vector連接，重組質(zhì)粒命名為PMD18-T-CP，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α的感受態(tài)細(xì)胞中，用質(zhì)粒提取試劑盒(AxyGEN)提取重組質(zhì)粒，對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體pMD18-T-CP中所攜帶的CP基因序列及讀碼框的正確性，序列分析軟件為DNAstar、NCB1-BLAST,所用的數(shù)據(jù)庫(kù)為GeneBank等。重組質(zhì)粒pMD18_T_CP中CP基因片段經(jīng)Afco I和通ο I雙酶切后定向插入經(jīng)同樣酶切的pET-28a表達(dá)載體中。PCR、酶切篩選陽(yáng)性克隆，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證重組原核表達(dá)載體pET-28a-CP中所攜帶CP基因序列未突變且讀碼框正確。并把原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CP 42°C熱擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)中，挑取單菌落接種到含氨卞青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，按1: 100的比例將培養(yǎng)物接種于含氨卞青霉素抗性的新鮮LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D600 ^ 0.5，加入終濃度為ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集菌體。部分菌體加入I X SDS-PAGE上樣緩沖液懸浮，沸水中處理5-10 min, 12 000 rpm離心后取上清10 μ?進(jìn)行12.5% SDS-PAGE電泳分析，其余菌體經(jīng)超聲波破碎，收集上清按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行用Ni2+-NTA親和層析柱純化目的蛋白。以純化的重組CP蛋白作為免疫原及檢測(cè)抗原。
[0015]2.免疫動(dòng)物
用純化的CTV-CP蛋白免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠:純化的CP蛋白以生理鹽水稀釋與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射
0.2ml每只，過(guò)3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0016]3.細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按7:1的比例，在無(wú)血清的RPM1-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (Sigma，分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用無(wú)血清的RPM1-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C，5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0017]4.雜交瘤細(xì)胞、陽(yáng)性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5%-50%時(shí)，以表達(dá)純化的CTV-CP為包被抗原用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲60多個(gè)陽(yáng)性孔。選擇5個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得I株能分泌抗CTV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株14H11。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。
[0018]5.單克隆抗體的特異性檢測(cè)
用感染柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病類病毒、柑橘花葉病毒、柑橘皺葉病毒、柑橘粗糙病毒、柑橘鱗皮病毒、香蕉線條病毒、黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番茄斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘蔗花葉病毒的組織提取液包被ELISA反應(yīng)板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對(duì)照，以感染柑橘衰退病毒的柑橘病汁葉為陽(yáng)性對(duì)照，用間接ELISA法測(cè)定單抗的特異性反應(yīng)。間接ELISA方法具體為上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30 (w/v, g /mL)加入ELISA包被液研磨后10ul/孔包被ELISA板，4°C過(guò)夜或37°C 2小時(shí)，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3-6%牛血清封閉30-60min;加入單抗10ul/孔，37°C 1-2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入按說(shuō)明書稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)100ul/孔，37°C 1-2小時(shí)，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD4tl5的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14H11單抗對(duì)柑橘衰退病毒有特異性反應(yīng)，而與柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病類病毒、柑橘花葉病毒、柑橘皺葉病毒、柑橘粗糙病毒、柑橘鱗皮病毒、香蕉線條病毒、黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番爺斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘蔗花葉病毒均無(wú)反應(yīng)。
[0019]6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10 X 15個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取I倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水),室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清I小時(shí)，12000rpm離心20min,收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70°C保存。
[0020]7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果為14H11單抗亞類為IgGUkappa鏈。用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，結(jié)果為上述單抗腹水效價(jià)在10 一8。
[0021]二、病毒檢測(cè)免疫學(xué)方法及其試劑盒 1.檢測(cè)CTV的TAS-ELISA檢測(cè)方法
1.1.TAS-ELISA方法的操作流程
(1)抗CTV-CP的兔抗血清1:3000倍稀釋后(由純化的原核表達(dá)CTV-CP免疫兔子制備)10ul/孔包被聚苯乙烯板，370C，2-4h或4°C，過(guò)夜；
(2)PBST洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3-6%牛血清封閉200ul/孔于 37°C 封閉 30-60min ；
(3)加入檢測(cè)樣品10ul/孔。以CTV病葉為陽(yáng)性對(duì)照，以相應(yīng)的健康樣品作陰性對(duì)照，370C l-2h ；
(4)洗滌后用封閉液5000倍稀釋單抗腹水，10ul/孔，37°Cl_2h ；
(5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(Sigma) 10ul/孔，37°Cl-2h ；
(6)PBST洗滌后拍干，加PNPP底物于室溫顯色5-30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽(yáng)性，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)405nm的OD值，以P/N> 2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0022]檢測(cè)結(jié)果表明該TAS-ELISA方法可以特異性地檢測(cè)樣品中的CTV。
[0023]1.2.TAS-ELISA檢測(cè)方法最適條件的確定
采用TAS-ELISA方陣試驗(yàn)進(jìn)行，即橫向加用包被緩沖液從1: 100至1: 128000倍比稀釋的兔抗CTV血清；CTV病葉汁勻漿液；縱向加用封閉液從1: 1000至1: 512000倍比稀釋單抗腹水；AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗按Sigma公司說(shuō)明書稀釋，I: 10000倍；按TAS-ELISA方法流程進(jìn)行操作。結(jié)果為CTV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為1:3000、I: 5000。
[0024]1.3.TAS-ELISA方法檢測(cè)靈敏度的確定
在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將CTV病葉汁用含3% BSA的PBS倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELISA測(cè)定，結(jié)果為:TAS-ELISA檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:10240倍稀釋(w/v，g /mL)，說(shuō)明本方法具有很好的靈敏度。
[0025]2.dot-ELISA方法的建立及田間檢測(cè)應(yīng)用
2.1.dot-ELISA檢測(cè)柑橘科植物中CTV方法的建立及其田間樣品檢測(cè)
將柑橘葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10?30 (w/v, g /!!11^)加入0.01 mol/LPBS (pH7.4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ I上清點(diǎn)到NC膜上，同時(shí)設(shè)置健康和感病柑橘葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； NC膜放入1:5000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ;用PBST洗膜3?4次，每次3 min ； NC膜放入1:8000倍稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30?60 min; PBST洗膜4?5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0.1 mol/LTris Cl,0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0026]用方陣試驗(yàn)確定dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明14H11單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測(cè)CTV病葉的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當(dāng)柑橘葉片稀釋到1:1280倍(w/v, g/mL)時(shí)，以14H11單抗建立的dot-ELISA檢測(cè)仍呈現(xiàn)紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，即其檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:1280倍稀釋(圖1)。
[0027]用建立的dot-ELISA方法對(duì)采自浙江、重慶等柑橘田間疑似發(fā)病樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60個(gè)檢測(cè)樣品中有15個(gè)樣品產(chǎn)生紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)(圖2)，陽(yáng)性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的dot-ELISA陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到CTV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測(cè)序表明陽(yáng)性樣品感染CTV。說(shuō)明該dot- ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于柑橘類樣品中柑橘衰退病毒的檢測(cè)。
[0028]2.2檢測(cè)柑橘衰退病毒dot- ELISA試劑盒
1)試劑盒主要成分
CTV單克隆抗體I管0.2 ml
AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗I管0.1 ml
NBT/BCIP底物各I瓶分別為2 ml和Iml
陽(yáng)性對(duì)照I (CTV柑橘組織)I管2 ml
陰性對(duì)照I (健康柑橘組織)I管2 ml
抗體稀釋液(10X) I瓶80ml
以上試劑均保存于4°C下硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)操作步驟
a.將柑橘葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10?30(w/v, g /mL)加入0.01 mol/L PBS (pH7.4)后研磨；
b.病汁液5000rpm離心3 min;
c.取3μ I上清點(diǎn)到NC上，同時(shí)設(shè)置健康和感病柑橘葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，室溫干燥10-20 min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
e.NC膜放入1:2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ；
f.用PBST洗膜3?4次，每次3min ； NC膜放入1:3000稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育30?60 min;
g.PBST洗膜4?5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、ρΗ9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
h.待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯(紫色)，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0029]3)保存及有效期于2?8°C避光保存，有效期12個(gè)月。
[0030] 4)緩沖液配方
磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L, ρΗ7.4):
NaCl8 g
KCl0.2 g
KH2PO40.2 g
Na2HPO4.12H203 g
疊氮化鈉0.2 g
加蒸餾水950溶解后調(diào)pH至7.4，定容至1000 ml ELISA 洗滌液(0.01 mol/L PBST):
1000 ml 0.01mol/L PBS 中加 0.5 ml Tween-20 ELISA封閉液:
0.0lmol/L PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5% (W/V)。
【權(quán)利要求】
1.一種分泌抗柑橘衰退病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株14H11，其特征在于能分泌抗柑橘衰退病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株14H11于2014年7月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.9335。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗柑橘衰退病毒單克隆抗體,其特征在于所述的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)1θΛ抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體能與柑橘衰退病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，該單抗檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:10240倍稀釋。
3.如權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株14H11分泌的抗柑橘衰退病毒的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體僅與柑橘衰退病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病類病毒、柑橘花葉病毒、柑橘皺葉病毒、柑橘粗糙病毒、柑橘鱗皮病毒、香蕉線條病毒、黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番爺斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘鹿花葉病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
4.一種如權(quán)利要求2所述的抗柑橘衰退病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104403999SQ201410626880
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】吳建祥, 洪健, 陳浙, 周雪平, 劉震, 劉金香, 周常勇 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所