一種磷酸鈣轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞的方法
【專利摘要】一種磷酸鈣轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞的方法，該方法包含如下步驟：a.按合適的濃度將HEK293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞貼壁完全，長至50％-80％即可開始轉(zhuǎn)染；b.轉(zhuǎn)染前1h換液，用新鮮的完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基；c.在圓底無菌管中，再加入無菌水，混勻；d.將2×HBS緩沖液與100×PO4混合后，加入上述含DNA-CaCl2溶液的圓底透明管中；e.馬上將混合溶液逐滴均勻加入HEK293T細(xì)胞中；f.磷酸鈣-DNA沉淀加入HEK293T細(xì)胞后，再加入轉(zhuǎn)染促進劑處理細(xì)胞；g.3-6h后，吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀，用1×PBS溶液洗2遍，然后換上新鮮培養(yǎng)基；16-48h后通過熒光觀察計算其轉(zhuǎn)染效率。
【專利說明】一種磷酸鈣轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)染促進劑輔助下高效的磷酸鈣轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的研宄中，如何將外源性DNA高效、便捷、廉價的導(dǎo)入靶細(xì)胞，是相關(guān)領(lǐng)域工作成敗的前提。1973年發(fā)展起來的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法至今仍然是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染最常用的方法之一；該方法主要是通過形成磷酸鈣-DNA沉淀復(fù)合物，促進DNA在細(xì)胞表面的附著，進而利用細(xì)胞的內(nèi)吞作用將外源DNA攝入；它具有低毒、廉價、操作簡便等優(yōu)點。但是在轉(zhuǎn)染過程中，影響轉(zhuǎn)染成功與否及轉(zhuǎn)染效率高低的因素較多，經(jīng)常會造成轉(zhuǎn)染的低效率和不穩(wěn)定性。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染雖然轉(zhuǎn)染效率比較高，但是通過哺乳細(xì)胞大量表達蛋白，成本太尚O
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種通過把GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，在外源DNA用量、混勻方法和轉(zhuǎn)染促進劑使用三個方面進行研宄，綜合確立了最佳反應(yīng)條件，建立一種高效的磷酸鈣轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的方法。
[0004]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的，一種磷酸鈣轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的方法，該方法包含如下步驟:
[0005]a.按合適的濃度將HEK293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，在含5% 0)2的37°C溫箱中培養(yǎng)8-24h，當(dāng)細(xì)胞貼壁完全，長至50% -80%即可開始轉(zhuǎn)染；
[0006]b.轉(zhuǎn)染前Ih換液，用新鮮的完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基；
[0007]c.在圓底無菌管中，將GFP質(zhì)粒與2.5M CaCl2溶液混合，再加入無菌水，混勻；
[0008]d.將2 X HBS緩沖液與100XP04混合后，加入上述含DNA-CaCl2S液的圓底透明管中；將該管垂直放在混勻器上，渦旋混勻；
[0009]e.馬上將混合溶液逐滴均勻加入HEK293T細(xì)胞中，邊加邊輕輕晃動混勻；
[0010]f.磷酸鈣-DNA沉淀加入HEK293T細(xì)胞后，再加入轉(zhuǎn)染促進劑處理細(xì)胞，將細(xì)胞置于5% 0)2的37°C溫箱中培養(yǎng)；
[0011]g.3-6h后，吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀，用I XPBS溶液洗2遍，然后換上新鮮培養(yǎng)基；繼續(xù)將HEK293T細(xì)胞放在溫箱總培養(yǎng)，16-48h后通過熒光觀察計算其轉(zhuǎn)染效率；
[0012]本發(fā)明在所述的步驟中，主要考慮如下三個方面優(yōu)化條件:
[0013]第(I)方面是外源DNA用量對轉(zhuǎn)染效率的影響，具體是:
[0014]步驟c中，在制備磷酸鈣-DNA沉淀時，分別采用不同的DNA用量；轉(zhuǎn)染24h后通過熒光顯微鏡觀察HEK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；最后選用轉(zhuǎn)染率最高的DNA用量；
[0015]第(2)方面是不同渦旋振蕩時間對轉(zhuǎn)染效率的影響，具體是:
[0016]步驟d中，將2XHBS與100XP04混合溶液加入DNA-CaCl2S液中時，分別采用不同的渦旋振蕩時間；轉(zhuǎn)染24h后觀察HEK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；最后選擇轉(zhuǎn)染率最高的渦旋振蕩時間；
[0017]第(3)方面是轉(zhuǎn)染促進劑轉(zhuǎn)染效率的影響，具體是:
[0018]步驟f中，磷酸鈣-DNA沉淀加入HEK293T細(xì)胞后，再加入適量的轉(zhuǎn)染促進劑處理HEK細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后觀察HEK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；最后選用轉(zhuǎn)染率最高的轉(zhuǎn)染促進劑
[0019]本發(fā)明具有低毒、廉價、操作簡便，轉(zhuǎn)染成功率和轉(zhuǎn)染效率高，穩(wěn)定性好，成本低等特點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1是添加不同量的外源DNA，轉(zhuǎn)染24h后，293T細(xì)胞在熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果O
[0021]圖2是采用不同的渦旋振蕩時間混合溶液，轉(zhuǎn)染24h后，293T細(xì)胞在熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果。
[0022]圖3是用15%的甘油處理293T細(xì)胞，分別作用不同的時間，轉(zhuǎn)染24h后，293T細(xì)胞在熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果。
[0023]圖4是分別采用不同濃度的丁酸鈉作為轉(zhuǎn)染促進劑，轉(zhuǎn)染24h后，293T細(xì)胞在熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果。
[0024]圖5是單獨或同時使用5mM 丁酸鈉和15%甘油處理293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，293T細(xì)胞在熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果。
[0025]圖6是單獨或同時使用500uM氯喹和15%甘油處理293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，細(xì)胞在熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合實例對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明。本發(fā)明所述的一種磷酸鈣轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的方法，該方法包含如下步驟:
[0027]a.按合適的濃度將HEK293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，在含5% 0)2的37°C溫箱中培養(yǎng)8-24h，當(dāng)細(xì)胞貼壁完全，長至50% -80%即可開始轉(zhuǎn)染；
[0028]b.轉(zhuǎn)染前Ih換液，用新鮮的完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基；
[0029]c.在圓底無菌管中，將GFP質(zhì)粒與2.5M CaCl2溶液混合，再加入無菌水，混勻；
[0030]d.將2 X HBS緩沖液與100XP04混合后，加入上述含DNA-CaCl2S液的圓底透明管中；將該管垂直放在混勻器上，渦旋混勻；
[0031]e.馬上將混合溶液逐滴均勻加入HEK293T細(xì)胞中，邊加邊輕輕晃動混勻；
[0032]f.磷酸鈣-DNA沉淀加入HEK293T細(xì)胞后，再加入轉(zhuǎn)染促進劑處理細(xì)胞，將細(xì)胞置于5% 0)2的37°C溫箱中培養(yǎng)；
[0033]g.3-6h后，吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀，用I XPBS溶液洗2遍，然后換上新鮮培養(yǎng)基；繼續(xù)將HEK293T細(xì)胞放在溫箱總培養(yǎng)，16-48h后通過熒光觀察計算其轉(zhuǎn)染效率；
[0034]本發(fā)明在所述的步驟中，還主要考慮如下三個方面優(yōu)化條件:
[0035]第(I)方面是外源DNA用量對轉(zhuǎn)染效率的影響，具體是:
[0036]步驟c中，在制備磷酸鈣-DNA沉淀時，分別采用不同的DNA用量；轉(zhuǎn)染24h后通過熒光顯微鏡觀察HEK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；最后選用轉(zhuǎn)染率最高的DNA用量；
[0037]第⑵方面是不同渦旋振蕩時間對轉(zhuǎn)染效率的影響，具體是:
[0038]步驟d中，將2XHBS與100XP04混合溶液加入DNA-CaCl2S液中時，分別采用不同的渦旋振蕩時間；轉(zhuǎn)染24h后觀察HEK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；最后選擇轉(zhuǎn)染率最高的渦旋振蕩時間；
[0039]第(3)方面是轉(zhuǎn)染促進劑轉(zhuǎn)染效率的影響，具體是:
[0040]步驟f中，磷酸鈣-DNA沉淀加入HEK293T細(xì)胞后，再加入適量的轉(zhuǎn)染促進劑處理HEK細(xì)胞，主要選用甘油，丁酸鈉和氯喹作為轉(zhuǎn)染促進劑，轉(zhuǎn)染24h后觀察HEK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；最后選用轉(zhuǎn)染率最高的轉(zhuǎn)染促進劑
[0041]實施例:
[0042]1.1實驗材料
[0043]GFP質(zhì)粒DNA，HEK293T細(xì)胞(由本實驗室保存)
[0044]1.2試劑與耗材
[0045]2 X HBS:Hepes 10g/L，NaCl 16g/L，調(diào) pH 至 7.05，定容至 1L，0.2 μ m 濾膜過濾除菌，4°C儲存?zhèn)溆茫?br>
[0046]100XP04:70mM Na 2HP04，70mM NaH2PO4等體積混合，0.2 μ m濾膜過濾除菌，4°C儲存?zhèn)溆?
[0047]10mM氯喹二磷酸貯存液:0.2 μ m濾膜過濾除菌，_20°C儲存?zhèn)溆茫?br>
[0048]超純水和2.5M CaCl2均需0.2 μ m濾膜過濾除菌后，4°C儲存?zhèn)溆茫?br>
[0049]氯喹和12ml聚丙烯雙位管刻度圓底培養(yǎng)管均購自上海生工生物，質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生物，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自GIBCO公司，六孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自greiner b1_one0
[0050]1.3實驗步驟
[0051]以六孔板培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，每孔用500ul反應(yīng)總體積為例:
[0052]1.3.1優(yōu)化后的具體步驟
[0053](I)準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞。
[0054]a.按合適的濃度將HEK293T細(xì)胞接種于六孔板，在含5% 0)2的37°C溫箱中培養(yǎng)8-24ho當(dāng)細(xì)胞貼壁完全，長至50% -80%可以開始轉(zhuǎn)染。
[0055]b.轉(zhuǎn)染前l(fā)h，用新鮮的完全培養(yǎng)基換掉舊的培養(yǎng)基。
[0056](2)制備制備磷酸鈣-DNA沉淀。
[0057]c.在一只12ml的圓底透明無菌塑料管中，將3ug GFP質(zhì)粒與25ml 2.5M CaCl2S液混合，然后加入無菌水至總體積為250ul，混勻。
[0058]d.將250ul的2 X HBS緩沖液與1ul的100XP04混合后，加入上述含DNA-CaCl2混合液的塑料管中。把該管垂直放在混勻器上，渦旋混勻10s。
[0059]e.馬上將混合液逐滴均勻加入293T細(xì)胞中，邊加邊輕輕晃動混勻。
[0060](3)用轉(zhuǎn)染促進劑處理。
[0061]f.磷酸鈣-DNA沉淀加入293T細(xì)胞后，再加入轉(zhuǎn)染促進劑處理細(xì)胞。將細(xì)胞置于5% C02的37°C溫箱中培養(yǎng)。
[0062]g.3-6h后，吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀，用I XPBS溶液洗2遍，然后換上新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)將細(xì)胞放在溫箱中培養(yǎng)。24h后通過熒光顯微鏡觀察計算其轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染率可達30%左右。
[0063]1.3.2優(yōu)化條件
[0064](I)外源DNA的用量對轉(zhuǎn)染效率的影響。
[0065]在制備磷酸鈣-DNA沉淀時，分別用3 yg、4yg和5 yg的GFP質(zhì)粒與25ml 2.5MCaCl2溶液混合。轉(zhuǎn)染24h后觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，如圖1所示，加入3 μ g質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率最尚O
[0066](2)不同渦旋振蕩時間對轉(zhuǎn)染效率的影響。
[0067]將2XHBS與100XP04混合溶液加入DNA-CaCl2溶液中時，采用不同的渦旋振蕩時間:5s、1s和15s。轉(zhuǎn)染24h后觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，如圖2所示，渦旋振蕩1s時的轉(zhuǎn)染效率最高。
[0068](3)轉(zhuǎn)染促進劑對轉(zhuǎn)染效率的影響。
[0069]使用上述優(yōu)化條件轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，研宄不同轉(zhuǎn)染促進劑對轉(zhuǎn)染效率的影響。
[0070]a.甘油
[0071]甘油可以增加細(xì)胞膜的通透性，顯著地促進質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。使用上述優(yōu)化條件轉(zhuǎn)染細(xì)胞，正常培養(yǎng)6h后，吸去培養(yǎng)液，加入15%的甘油，分別作用2.5min，4.5min和
6.5min，移走甘油，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。24h后，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果。如圖3所示，經(jīng)15%甘油處理6.5min的受體細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率最高，不僅GFP的表達增強，GFP表達的百分率也略有提尚。
[0072]b.丁酸鈉
[0073]丁酸鈉可以在猴源和人源細(xì)胞中增強帶SV40早期啟動子/增強子的重組質(zhì)粒的表達。細(xì)胞類型不同，所用丁酸鈉濃度也不同。我們在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞過程中分別添加OmM、
和1mM 丁酸鈉作為轉(zhuǎn)染促進劑，轉(zhuǎn)染24h后觀察細(xì)胞。如圖4所示，添加5mM 丁酸鈉后的轉(zhuǎn)染率最高。
[0074]另外，在轉(zhuǎn)染過程中，丁酸鈉可以直接加入培養(yǎng)液處理細(xì)胞，也可以待細(xì)胞經(jīng)過甘油短暫處理后再加入培養(yǎng)液中。通過對比實驗，轉(zhuǎn)染24h后觀察細(xì)胞。如圖5所示，經(jīng)15%甘油休克(6.5min)后，再接受5mM的丁酸鈉處理的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率最高，且GFP表達強度也有所增強。
[0075]c.氯喹
[0076]氯喹是一種弱堿，在多數(shù)情況下，用氯喹處理細(xì)胞，可提高DNA攝入率，推測是通過抑制細(xì)胞內(nèi)溶酶體水解酶降解DNA而發(fā)揮作用。本實驗中，在磷酸鈣-DNA共沉淀物加入細(xì)胞之后，直接將10mM氯喹二磷酸貯存液稀釋(I:1000)于培養(yǎng)液中，處理3_5h后，棄去培養(yǎng)液和沉淀，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入培養(yǎng)液正常培養(yǎng)24h，觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。此外，在氯喹處理之后，可用15%甘油短暫處理細(xì)胞(6.5min)。正常培養(yǎng)24h后，觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。如圖6所示，細(xì)胞經(jīng)500 μ m氯喹處理3-5h后，轉(zhuǎn)染效率最高。
【權(quán)利要求】
1.一種磷酸鈣轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的方法，其特征在于該方法包含如下步驟: a.按合適的濃度將HEK293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，在含5%0)2的37 °C溫箱中培養(yǎng)8-24h，當(dāng)細(xì)胞貼壁完全，長至50% -80%即可開始轉(zhuǎn)染； b.轉(zhuǎn)染前Ih換液，用新鮮的完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基； c.在圓底無菌管中，將GFP質(zhì)粒與2.5M CaCl2S液混合，再加入無菌水，混勻； d.將2XHBS緩沖液與100XP04混合后，加入上述含DNA-CaCl2溶液的圓底透明管中；將該管垂直放在混勻器上，渦旋混勻； e.馬上將混合溶液逐滴均勻加入HEK293T細(xì)胞中，邊加邊輕輕晃動混勻； f.磷酸鈣-DNA沉淀加入HEK293T細(xì)胞后，再加入轉(zhuǎn)染促進劑處理細(xì)胞，將細(xì)胞置于5% CO2的37°C溫箱中培養(yǎng)； g.3-6h后，吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀，用I XPBS溶液洗2遍，然后換上新鮮培養(yǎng)基；繼續(xù)將HEK293T細(xì)胞放在溫箱總培養(yǎng)，16-48h后通過熒光觀察計算其轉(zhuǎn)染效率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷酸鈣轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的方法，其特征在于所述的步驟中，還主要考慮如下三個方面優(yōu)化條件: 第(I)方面是外源DNA用量對轉(zhuǎn)染效率的影響，具體是: 步驟c中，在制備磷酸鈣-DNA沉淀時，分別采用不同的DNA用量；轉(zhuǎn)染24h后通過熒光顯微鏡觀察HEK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；最后選用轉(zhuǎn)染率最高的DNA用量； 第(2)方面是不同渦旋振蕩時間對轉(zhuǎn)染效率的影響，具體是: 步驟d中，將2XHBS與100XP04混合溶液加入DNA-CaCl2S液中時，分別采用不同的渦旋振蕩時間；轉(zhuǎn)染24h后觀察HEK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；最后選擇轉(zhuǎn)染率最高的渦旋振蕩時間； 第(3)方面是轉(zhuǎn)染促進劑轉(zhuǎn)染效率的影響，具體是: 步驟f中，磷酸鈣-DNA沉淀加入HEK293T細(xì)胞后，再加入適量的轉(zhuǎn)染促進劑處理HEK細(xì)胞，選用甘油，丁酸鈉和氯喹作為轉(zhuǎn)染促進劑；轉(zhuǎn)染24h后觀察HEK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；最后選用轉(zhuǎn)染率最高的轉(zhuǎn)染促進劑。
【文檔編號】C12N15/85GK104513832SQ201410632029
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】歐文斌, 房友榮, 施思, 孟凡國, 李海龍, 劉麗 申請人:浙江理工大學(xué), 嘉興博泰生物科技發(fā)展有限公司