轉(zhuǎn)基因苜蓿草j101品系特異性定性pcr檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性定性PCR檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法。本發(fā)明針對(duì)針對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)部未頒發(fā)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書的轉(zhuǎn)基因苜蓿草品系J101，根據(jù)其基因組DNA序列5’端外源插入片段P-eFMV與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)，首次設(shè)計(jì)和提供一對(duì)特異性引物，并成功建立定性PCR檢測(cè)體系。結(jié)果表明，本發(fā)明定性PCR檢測(cè)方法特異性良好，檢測(cè)的最低DNA濃度為80pg，相當(dāng)于50拷貝的基因組DNA；適合于J101品系快速、穩(wěn)定的定性檢測(cè)。
【專利說明】轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性定性PCR檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性的定性PCR檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前我國(guó)存欄數(shù)為1500萬頭奶牛，對(duì)優(yōu)質(zhì)飼草需求最非常大。轉(zhuǎn)基因苜蓿通過飼料進(jìn)入動(dòng)物養(yǎng)殖的食物鏈，致使牛奶、肉等制品成為轉(zhuǎn)基因食品，可能對(duì)于人的健康產(chǎn)生影響。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，凡是在中國(guó)境內(nèi)銷售的轉(zhuǎn)基因生物，必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)。為保障消費(fèi)者的知情權(quán)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度在30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)應(yīng)用。中國(guó)目前實(shí)施無閥值的強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)制度。
[0003]對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)需要檢測(cè)方法的支撐。目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)主要包括對(duì)蛋白質(zhì)和核酸檢測(cè)兩大類，后者均以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，PCR技術(shù)具高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，檢測(cè)周期短，成本較低。能過普通凝膠電泳觀察條帶的有無判定擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，通過電泳條帶的濃度可以分析檢測(cè)方法的靈敏度。一方面中國(guó)目前實(shí)施無閥值的強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)制度，可采用普通定性PCR滿足對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的需求，另一方對(duì)普通定性PCR對(duì)操作者技術(shù)水平要求較低，僅需價(jià)格低廉的簡(jiǎn)單PCR儀即可進(jìn)行，適用于基層實(shí)驗(yàn)推廣應(yīng)用。
[0004]根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)片段位置的不同，基于核酸基礎(chǔ)上的PCR檢測(cè)又可以分為4種檢測(cè)策略:1)篩查法:對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的啟動(dòng)子、終止子等通用基因進(jìn)行篩查；2)基因特異性檢測(cè):對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的外源目的基因進(jìn)行檢測(cè)；3)構(gòu)建特異性檢測(cè):對(duì)外源目的基因與啟動(dòng)子或終止子的特異連接序列進(jìn)行檢測(cè)；4)品系特異性/轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè):對(duì)外源片段與宿主基因組DNA特異連接序列進(jìn)行檢測(cè)。
[0005]品系特異性檢測(cè)方法是基于外源插入片段和宿主基因接合區(qū)的邊界序列建立特異性的檢測(cè)方法。品系性特異性PCR檢測(cè)方法可以對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系進(jìn)行判定，被認(rèn)為是最適合轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)的檢測(cè)判定方法。zimmmermanm等首次使用inverse PCR策略獲得Btll的接合區(qū)序列并建立品系特異性檢測(cè)方法。
[0006]轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系由孟山都公司開發(fā)的耐除草劑的轉(zhuǎn)基因品系，2005年美國(guó)和加拿大批準(zhǔn)環(huán)境釋放和作為飼料應(yīng)用，目前我國(guó)尚批準(zhǔn)其進(jìn)口。還未獲得我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全證書，目前未見到有該作物品系特異性定性PCR檢測(cè)方法相關(guān)文獻(xiàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因苜蓿草尚無品系特異性檢測(cè)方法、不能準(zhǔn)確的對(duì)轉(zhuǎn)基因苜蓿草的品系進(jìn)行識(shí)別，無法對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)的技術(shù)不足，提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)用引物，其具有較高特異性和靈敏度及良好的穩(wěn)定性，基于所述引物，可成功建立轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系進(jìn)行定性檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系進(jìn)行定性檢測(cè)的方法。
[0009]本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明通過創(chuàng)造性地分析和大量實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)，在轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系的5’端外源插入片段P-eFMV與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列，結(jié)合序列生物學(xué)信息的分析，設(shè)計(jì)得到一對(duì)特異性的引物，以及探針。并確定了精確地檢測(cè)條件，建立特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性良好的轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系定性PCR檢測(cè)方法。
[0010]具體地，提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)用引物J101-1和J101-2，其序列如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示:
SEQ ID N0.1 J101-1:5’ - CGTATTCATGTCATGTGTTTTGTACTG-3’，
SEQ ID N0.2 J101-2: 5’ - GACTCTGTACCCTGACCTTGTTGA-3’。
[0011]同時(shí)提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)方法，包括以步驟:
51.提取DNA作為反應(yīng)的模板；
52.采用引物J101-1和JlO1-2進(jìn)行定性PCR檢測(cè)；
其中，S2所述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和 J101-2 各為 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0012]S2所述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，30個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
[0013]本發(fā)明采用以下方法驗(yàn)證本發(fā)明方法的特異性、靈敏度等:
采用引物J101-1和J101-2對(duì)7種常見作物進(jìn)行定性PCR檢測(cè)，測(cè)試檢測(cè)體系特異性。
[0014]采用引物J101-1和J101-2對(duì)不同濃度的JlOl基因組DNA進(jìn)行定性PCR檢測(cè)，測(cè)試檢測(cè)體系靈敏度。
[0015]上述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和J101-2 引物分別為 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0016]上述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 10s, 60°C 30s，72°C 30s, 30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
[0017]本發(fā)明可以很好地應(yīng)用于鑒別轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系與其他作物，尤其優(yōu)選應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因苜蓿草J1i品系與轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系NK63、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿等作物的鑒別檢測(cè)。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)主要包括對(duì)蛋白質(zhì)和核酸檢測(cè)兩大類，而后者主要采用PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)體系，因?yàn)椴僮骱?jiǎn)便、穩(wěn)定性好以及易于推廣等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)片段位置的不同，基于核酸基礎(chǔ)上的PCR檢測(cè)又可以分為4種檢測(cè)策略，即篩選檢測(cè)、基因特異性檢測(cè)、構(gòu)建特異性檢測(cè)和品系(轉(zhuǎn)化事件)特異性檢測(cè)(徐茂軍，2001)，其中品系特異性檢測(cè)由于可以鑒定出具體的轉(zhuǎn)基因作物品系，因此是特異性最高的檢測(cè)方法。但由于進(jìn)境農(nóng)作物特別是含多種品系的作用，有的只有一部分品系允許進(jìn)口，另一些可能尚未曾頒發(fā)證書，采用篩選檢測(cè)、基因特異檢測(cè)、構(gòu)建特異性檢測(cè)均無法區(qū)分具體的品系，無法對(duì)進(jìn)境產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成份進(jìn)行標(biāo)識(shí)。因此目前是采用啟動(dòng)子、終止子或EPSPS結(jié)構(gòu)特異性基因或其組合的篩查檢測(cè)策略，這只能鑒定苜蓿草是否為轉(zhuǎn)基因，但是不能準(zhǔn)確的檢測(cè)其具體的轉(zhuǎn)基因苜蓿草品系，出入境檢驗(yàn)監(jiān)管部門無法對(duì)同一作物具多個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理。公眾也無法具體知道其轉(zhuǎn)基因的具體情況。此外，采用多個(gè)基因聯(lián)合篩查的方式會(huì)使人力物力大量增加。
[0019]本發(fā)明首次設(shè)計(jì)和提供了一對(duì)特異性引物，基于所述引物，本發(fā)明成功建立了JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明基于外源插入片段FMV35S啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl基因組DNA的5’端旁鄰序列建立了轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性(event-specific)定性PCR方法，可以通過成功地?cái)U(kuò)增可特異性的鑒別區(qū)分目前尚未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系，滿足對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的閥值標(biāo)識(shí)需求，對(duì)我國(guó)進(jìn)境轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl的監(jiān)管和標(biāo)識(shí)提供有力的技術(shù)支撐。
[0020]本發(fā)明檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。通過對(duì)苜蓿草JlOl等農(nóng)作物進(jìn)行的特異性試驗(yàn)表明，本發(fā)明建立的定性PCR檢測(cè)方法僅對(duì)苜蓿草JlOl品系的檢測(cè)結(jié)果為陽性；大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，定性PCR方法特異性良好，檢測(cè)的最低DNA濃度為80pg，相當(dāng)于50拷貝的基因組DNA，能夠快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的用于JlOl品系定性和定量檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl品系外源插入片段示意圖。A為擴(kuò)增區(qū)域。
[0022]圖2是JlOl品系特異性定性PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果，其中7為J101，1-6為6種非JlOl作物。
[0023]圖3是JlOl品系特異性定性PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果，其中，1-6分別為100ng、16ng、1.6ng、0.16ng、0.08ng 和 0.016ng 的 JlOl 基因組 DNA 模板。

【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明方法。下述實(shí)施例和附圖僅用于示例性說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。除非特別說明，下述實(shí)施例中使用的生物材料、試劑原料為常規(guī)市購或商業(yè)途徑獲得的生物材料和試劑原料，除非特別說明，下述實(shí)施例中使用的方法和設(shè)備為本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和設(shè)備。
[0025]實(shí)施例1:建立JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)體系設(shè)計(jì)引物:
本發(fā)明通過創(chuàng)造性地分析和大量實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)，在轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系的5’端外源插入片段P-eFMV與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列，結(jié)合序列生物學(xué)信息的分析，設(shè)計(jì)得到一對(duì)特異性的引物，以及探針。并確定了精確地檢測(cè)條件，建立特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性良好的轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系定性PCR檢測(cè)方法。
[0026]具體地，提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)用引物J101-1和J101-2，其序列分別如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示:
SEQ ID N0.1 J101-1:5’ - CGTATTCATGTCATGTGTTTTGTACTG-3’。
[0027]SEQ ID N0.2 J101-2: 5’ - GACTCTGTACCCTGACCTTGTTGA-3’
所述弓I物可采用本領(lǐng)域常規(guī)方法合成。本實(shí)施例應(yīng)用的弓I物委托寶生物合成。
[0028]本發(fā)明實(shí)施例所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)使用的儀器為B1RAD S1000。
[0029]本實(shí)施例基于上述引物，提供一種JlOl品系特異性定性PCRR檢測(cè)方法，包括以下步驟:
51.提取DNA作為反應(yīng)的模板；
52.采用引物J101-1和JlO1-2進(jìn)行定性PCR檢測(cè)；
其中，S2所述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和 J101-2 各為 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0030]S2所述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，30個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
[0031]其中，SI提取DNA具體方法為:稱取100 mg左右研磨成干粉的樣品，使用天根植物基因組DNA提取試劑盒并按照其操作說明書提取基因組DNA。提取的基因組DNA用微量分光光度計(jì)nanOdrOp2000c測(cè)定濃度。提取的DNA溶液在_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0032]S2 所述定性 PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L =Takara Ex Taql2.5 μ L，J101-1/2 分別0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L ；
S2所述定性PCR反應(yīng)程序?yàn)?98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)
1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
[0033]實(shí)施例2 JlOl定性PCR的特異性試驗(yàn)
本發(fā)明采用多種農(nóng)作物進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，以下以7種農(nóng)作物作為舉例進(jìn)行說明。以轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系NK63、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿、(均來自常規(guī)隨機(jī)取樣后儲(chǔ)存，并不因此限定本發(fā)明范圍)和苜蓿草JlOI基因組DNA為模板，采用本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl品系特異性定性PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)本發(fā)明建立的定性PCR方法的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖2所示，經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳分析觀察有無170bp條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有JlOl有特征性擴(kuò)增170bp長(zhǎng)度的片段，其他作物均無條帶出現(xiàn)。表明本發(fā)明建立的JlOl品系特異性的定性PCR方法特異性良好。
[0034]定性PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L:Takara Ex Taql2.5 μ L, J101-1/2 分別 0.5 μ L, DNA模板 I μ L, ddH20 10.5μ L ；
定性PCR反應(yīng)程序?yàn)?98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
[0035]實(shí)施例3 JlOl定性PCR的靈敏度試驗(yàn)
采用本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl品系特異性定性PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，采用10ng/μ L、16ng/ μ L、0.16ng/ μ L、0.08ng/ μ L、0.016ng/ μ L 及 0.008ng/ μ L 的 JlOl 品系的基因組DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在模板量不少于0.08ng時(shí)，特異性201bp的片段能擴(kuò)增出來。表明其靈敏度為0.08ng基因組DNA，相當(dāng)于50拷貝的基因組DNA。
[0036]定性PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L:Takara Ex Taql2.5 μ L, J101-1/2 分別 0.5 μ L, DNA模板 I μ L, ddH20 10.5μ L ；
定性PCR反應(yīng)程序?yàn)?98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)用引物，其特征在于，其DNA序列分別如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
2.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)用引物在轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)方面的應(yīng)用。
3.—種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.提取DNA作為反應(yīng)的模板； 52.采用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行定性PCR檢測(cè)； 其中，S2所述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為25 μ L =Takara Ex Taql2.5 μ L，權(quán)利要求1所述的引物各為0.5 μ L，DNA模板I μ L，ddH20 10.5 μ L ； S2所述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 10s，60°C 30s, 72°C 30s, 30個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
4.權(quán)利要求3所述轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)方法在轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系與其他作物的檢測(cè)鑒別方面。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系與轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系NK63、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿的檢測(cè)鑒別方面。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104372088SQ201410631655
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】盧麗, 劉二龍, 呂英姿, 蔣湘, 唐婕, 樊武疆, 姚柏輝, 王定國(guó), 林惠嬌, 鄭高彬, 林學(xué)勤, 秦焯敏 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局