三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量自動化立體圖像分析平臺及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量自動化立體圖像分析平臺及采用該平臺篩選如抗腫瘤等藥物的方法，該平臺可用于三維組織器官或類器官的培養(yǎng)系統(tǒng)，三維掃描采樣系統(tǒng)和高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)。本發(fā)明提供的平臺可同時處理大量臨床標本和篩選多種抗腫瘤藥物，大幅度減低成本，最大程度縮短檢測時間，從而廣泛應用于臨床治療藥物方案選擇和劑量優(yōu)化、新藥開發(fā)、針對組織器官和生物大分子以及其它小分子的相互作用的基礎(chǔ)研究等。
【專利說明】
三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量自動化立體圖像分析平臺及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】的高通量分析平臺，具體涉及一種用于三維組織器官(包括類器官)培養(yǎng)模型及其高通量自動化立體圖像分析平臺，可廣泛應用于個體化臨床藥物篩選、新藥研發(fā)以及生物學研究。

【背景技術(shù)】
[0002]化學治療是腫瘤重要的治療手段，但腫瘤病人對抗癌療法，如化療的臨床反應有很大的個體差異，表現(xiàn)在抗腫瘤藥物往往只對某部分患者有效，其原因被認為是由遺傳差異以及機體和腫瘤之間形成的微環(huán)境(microenvironment)而驅(qū)動。許多患者遭受不必要的和損害性大的治療，因為無法在治療前判斷不同腫瘤個體對藥物的敏感性和耐藥性。在許多患者，暫時的反應往往伴隨隨后耐藥性的發(fā)生。因此，目前迫切需要研發(fā)可以被用來預測癌癥患者對藥物反應(敏感性或抗藥性)的新方法和新技術(shù)?，F(xiàn)有技術(shù)中的研究描述了腫瘤細胞系中的基因表達圖譜與藥物反應之間的相關(guān)性。然而，越來越多的證據(jù)表明腫瘤發(fā)展和對治療的反應是由腫瘤微環(huán)境進行調(diào)控的。在此領(lǐng)域中有不少文獻顯示細胞外基質(zhì)(RCM)可作為人類癌癥臨床結(jié)果的預測。因此，在含高水平血清的兩維培養(yǎng)平皿中長期生長傳代并永生化的細胞系，代表著一種過度簡單化和脫離機體的生物學系統(tǒng)。雖然應用裸鼠異種移植人細胞株進行抗癌藥物的試驗已有報道，但此法不僅周期長和成本昂貴、缺少關(guān)鍵的免疫因素影響、不能復制或模仿人體內(nèi)的微環(huán)境，而且很難測試所有的抗癌藥物。
[0003]三維培養(yǎng)模型，包括類器官(organoid)培養(yǎng)，近年來得到了醫(yī)藥行業(yè)的關(guān)注。但是目前現(xiàn)有技術(shù)中尚缺兼容高通量的三維模型培養(yǎng)和定量的自動化平臺，影響了預測各種不同類型腫瘤組織對藥物治療和研發(fā)新藥的敏感性或反應性，無法進行臨床上和新藥篩選的大樣本操作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過大量實驗篩選，用最優(yōu)化的培養(yǎng)條件建立3D組織器官培養(yǎng)的模型；并解決在此領(lǐng)域內(nèi)尚缺乏智能型高通量三維定量分析的技術(shù)，提供一種結(jié)構(gòu)設計模塊化，具有高通量、自動化、高精度、低成本等優(yōu)點的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量自動化立體圖像分析平臺。該平臺可用于抗腫瘤等藥物篩選的評估，也包括對非腫瘤性疾病的和基礎(chǔ)生物學的研究。
[0005]技術(shù)方案:為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，它包括三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)，與三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)相連的三維掃描采樣系統(tǒng)和與三維掃描采樣系統(tǒng)相連的高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)。
[0006]作為優(yōu)選方案，以上所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，所述的三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)包括培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱內(nèi)設有多孔培養(yǎng)板(如6、12、24、48和96孔培養(yǎng)板或多板并用，達到靈活性和高通量目的)，培養(yǎng)板上設有matrigel基質(zhì)膠和膠原構(gòu)成的組織器官培養(yǎng)支架。本發(fā)明通過大量實驗篩選出最佳的3D組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)，研究規(guī)程中證明，Matrigel基質(zhì)膠作為載體對不同類型組織的效應并不一樣，有的效果不盡滿意，很難進行樣品間對比分析，實驗結(jié)果不準確。并且單獨采用膠原類產(chǎn)品作為載體，也存在類似的問題。本發(fā)明通過大量實驗篩選，聯(lián)合應用Matrigel和膠原，并進行優(yōu)化比例混合，可對不同的腫瘤類型提供最佳的培養(yǎng)條件，可使培養(yǎng)成功率增加50%以上，更適合高通量自動化定量分析?？煽朔F(xiàn)有技術(shù)給藥前生長不佳導致體積過小，很難在隨后進行對照和比較，導致檢測結(jié)果的不準確的不足，取得了很好的技術(shù)進步。
[0007]作為優(yōu)選方案，以上所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，，所述的三維掃描米樣系統(tǒng)包括相襯照明光源，位于相襯照明光源下方的全自動X掃描移動平臺和Y掃描移動平臺，位于X掃描移動平臺和Y掃描移動平臺下方的自動Z軸自動聚焦/圖像拼接平臺，CCD數(shù)碼相機(配有圖像采集卡)，所述的CCD數(shù)碼相機上方依次設有管透鏡，帶通孔過濾輪盤和雙色/分束鏡，所述的雙色/分束鏡的上方為自動z軸自動聚焦/圖像拼接平臺，自動z軸自動聚焦/圖像拼接平臺上安裝有物鏡，所述的雙色/分束鏡的一側(cè)設有熒光照明光源和透鏡，所述的多孔細胞培養(yǎng)板放置于X掃描移動平臺和Y掃描移動平臺上。
[0008]作為更優(yōu)選方案，倒置熒光顯微鏡和三維自動掃描攝影裝置放置在一恒溫箱內(nèi)，而計算機和屏幕則在室溫下。掃描裝置放置在恒溫系統(tǒng)中可以避免因溫度變化而改變培養(yǎng)組織的狀態(tài)。
[0009]作為優(yōu)選方案，以上所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，所述的高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)的圖像處理軟件可采用美國MolecularDevices公司的MetaMorph顯微自動圖像分析軟件(版本:MetaMorph Premium Plus),將三維掃描采樣系統(tǒng)掃描得到的多層2D圖像數(shù)據(jù)建立腫瘤組織器官3D圖像模型；所述的高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)圖像處理軟件包括三維模型的尺寸，大小和體積測定程序。
作為優(yōu)選方案，本發(fā)明在三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)和三維掃描采樣系統(tǒng)之間增設有自動化機械手，自動化機械手可將培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)板從恒溫培養(yǎng)箱中取出并輸送上顯微鏡載物臺，在掃描完成后將其送回培養(yǎng)箱。也可選擇平臺外的培養(yǎng)箱和手工操作，增加應用的靈活性。作為優(yōu)選方案，以上所述的平臺應用3D掃描和圖像處理。現(xiàn)有技術(shù)2維平面處理不能準確反應腫瘤的實際大小。本發(fā)明采用三維掃描技術(shù)和成像軟件準確構(gòu)建腫瘤組織在培養(yǎng)中的三維模型。三維掃描系統(tǒng)中，三維掃描檢測裝置由可沿X、Y和Z軸方向移動，對培養(yǎng)板孔內(nèi)Matrigel及膠原上生長的腫瘤組織進行快速和高精度的三維采樣后，將數(shù)據(jù)傳輸給計算機。例如，用20倍的物鏡，顯微鏡就能觀察到0.75mm2視野區(qū)域，因此對于Imm2的培養(yǎng)組織，僅需要4-9圖像就可達到完全覆蓋，這可以通過每次移動X、Y平臺0.5_并在每個位置上獲取圖像來實現(xiàn)。圖像處理軟件將能這些圖像拼聯(lián)在一起，產(chǎn)生一個大的單一圖像。為了獲得組織器官培養(yǎng)的3D圖像，物鏡將通過自動沿Z軸方向移動，每次聚焦在某一層面的培養(yǎng)組織，在獲得整個2D圖像后，移動幾微米自動對焦至下一層。
[0010]重復此過程數(shù)次，直到整個培養(yǎng)組織被覆蓋在3D圖像掃描中。最后，圖像處理軟件將利用多層2D圖像數(shù)據(jù)來建立3D腫瘤組織器官圖像模型，并能獲得3D腫瘤組織器官的三維模型的特征，比如它的尺寸，大小和體積等。
[0011]本發(fā)明所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，其包括以下步驟:
(1)將Matrigel基質(zhì)膠和膠原按優(yōu)化比例充分混合，然后注入培養(yǎng)箱內(nèi)的多孔培養(yǎng)板中；
(2)將通過活檢取得的腫瘤組織切成Immxlmm大小的細塊狀或者收集的血液中循環(huán)腫瘤細胞，然后植入培養(yǎng)板孔中的Matrigel基質(zhì)膠和膠原構(gòu)成的支架上,然后在Matrigel基質(zhì)膠和膠原構(gòu)成的支架表面加上細胞培養(yǎng)基；
(3)將以上腫瘤組織或腫瘤細胞放入低氧、5%C02和攝氏37度條件下培養(yǎng)I周；
(4)I周后將培養(yǎng)板移至三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)中的倒置熒光顯微鏡下，進行3D分層掃描取樣，高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)利用多層2D圖像數(shù)據(jù)建立3D腫瘤組織器官圖像模型，獲得給藥前腫瘤組織器官三維模型的特征，包括尺寸，大小和體積的基線值；
(5)然后在細胞培養(yǎng)板孔中加入待測抗腫瘤藥物，(包括現(xiàn)有的化學治療藥物和靶向藥物。以目前常用的臨床劑量作為試驗標準。如果有效可以在以后利用本系統(tǒng)進一步進行其劑量優(yōu)化試驗)，繼續(xù)在低氧、5%C02和攝氏37度條件下培養(yǎng)I周，每天進行觀察，并對組織進行3D分層掃描取樣，并利用多層2D圖像數(shù)據(jù)建立3D腫瘤組織器官圖像模型，獲得給藥后腫瘤組織器官三維模型的特征，包括尺寸，大小和體積的基線值；
(6)—周后終止實驗，同時進行腫瘤細胞生存率測定；
(7)并通過高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)進行立體圖像模型的定量分析.包括根據(jù)腫瘤尺寸，大小和體積隨時間和給藥的改變，篩選出各抗腫瘤藥物的藥效，并可提供抗腫瘤藥物效能的實時動力學曲線。
[0012]作為優(yōu)選方案，以上所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，步驟(I)中Matrigel基質(zhì)膠和膠原的重量配比為1:10-10:1。本發(fā)明通過大量實驗篩選，聯(lián)合應用Matrigel和膠原，并進行優(yōu)化比例混合，可對不同的腫瘤類型提供最佳的培養(yǎng)條件，可使培養(yǎng)成功率增加50%以上，更適合高通量自動化定量分析。可克服現(xiàn)有技術(shù)給藥前生長不佳導致體積過小，很難在隨后進行對照和比較，導致檢測結(jié)果的不準確的不足，取得了很好的技術(shù)進步。
[0013]作為優(yōu)選方案，以上所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，步驟(2)中，腫瘤組織塊的培養(yǎng)基為DMHM培養(yǎng)基和病人自身的血清；腫瘤細胞的培養(yǎng)基為病人自身的血清。本發(fā)明從患者自身采集的血清以提供腫瘤組織生長的因子，應用患者血清可以保證培養(yǎng)液中有相關(guān)的藥物代謝因子，加上患者血清中的免疫因子，從而更接近患者本人的體液環(huán)境和腫瘤的微環(huán)境，培育出個體化的腫瘤組織模型。
[0014]作為優(yōu)選方案，以上三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，步驟(4)中三維掃描檢測裝置3D分層掃描取樣時，可沿X/Y和Z軸方向移動，對培養(yǎng)板孔內(nèi)生長的腫瘤組織進行快速和高精度的自動分層二維采樣，并將數(shù)據(jù)傳輸給計算機處理。
[0015]作為優(yōu)選方案，以上所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，所述的抗腫瘤藥物包括化學治療和靶向治療藥物，抗腫瘤先導化合物，腫瘤細胞與基質(zhì)微環(huán)境的基礎(chǔ)研究。并且對于那些對新葯有反應的腫瘤病人，通過進一步對腫瘤組織進行腫瘤基因突変的檢測，可發(fā)現(xiàn)新藥療效與特定腫瘤基因突變的相關(guān)性。對于已在應用中的抗腫瘤藥物，通過此路徑可以確認與己知的腫瘤生物標志物的相關(guān)性或發(fā)現(xiàn)新型的生物標志物。
[0016]作為優(yōu)選方案，以上所述的平臺可應用于除腫瘤組織細胞外的3D培養(yǎng)組織體積或容積測量，如心血管、泌尿、呼吸和皮膚系統(tǒng)的3D細胞培養(yǎng)，供研究細胞微環(huán)境和細胞與外環(huán)境的相互作用以及發(fā)育類疾病和退化性疾病。這些疾病都可有明顯的組織容積或體積的改變。
[0017]作為優(yōu)選方案，以上所述的平臺可以提供檢測腫瘤標本對不同抗腫瘤藥物的反應程度，即腫瘤縮小的程度，包括完全反應、部分反應和無反應，并可以進一步進行給藥劑量的優(yōu)化，達到節(jié)省時間和減少藥物副作用?？蓮V泛應用于各類不同的腫瘤，包括乳腺癌、皮膚癌、肝癌、胃癌、腸癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、腦癌等。
[0018]有益效果:本發(fā)明提供的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺和現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點:
(I)與二維細胞培養(yǎng)的方法相比，本發(fā)明應用的三維組織器官(包括類器官)培養(yǎng)更接近機體的狀態(tài)，尤其是在提供腫瘤微環(huán)境方面，因此可以更加準確的篩選抗腫瘤等疾病的藥物。
[0019](2)與動物實驗相比，本發(fā)明應用的三維組織器官培養(yǎng)平臺速度快、高通量，而動物實驗周期長、費用昂貴，另外檢測結(jié)果無物種差異的考量，檢測效率更高。
[0020](3)與己有的發(fā)表的三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)相比，本發(fā)明的三維組織器官培養(yǎng)平臺有以下幾個優(yōu)勢:通過大量實驗篩選出最佳的Matrigel基質(zhì)膠和膠原的重量，優(yōu)化組織或細胞的培養(yǎng)生長條件，并且本發(fā)明采用患者自身血清而創(chuàng)造的個體化的腫瘤組織模型、高通量以及從質(zhì)化到量化的技術(shù)路線。
[0021](4)在社會效率方面，對于腫瘤患者，本發(fā)明有助于快速篩選出有效抗腫瘤藥物，減少病人毒性反應，增加治愈率和生活品質(zhì)。對于醫(yī)院或醫(yī)生，可以一次性獲得準確的信息，從而可避免分批單個試驗抗腫瘤藥物，減少開支費用。
[0022]本發(fā)明提供的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，將不同類型細胞在體外和具三維結(jié)構(gòu)的材料Matrigel和膠原一起培養(yǎng)，因其在形態(tài)上和功能上類似于天然起源組織，故可以改善體外基于細胞的生物學測定方法。因此，對于新的治療藥物的篩選，如抗癌藥物，應用3D組織器官培養(yǎng)平臺可以比二維細胞培養(yǎng)更好地模擬體內(nèi)的條件。此類三維培養(yǎng)系統(tǒng)能夠培育出多細胞腫瘤類器官組織,可以彌合體外和體內(nèi)抗癌藥物評價系統(tǒng)的鴻溝。各種抗腫瘤藥物一般是通過殺傷分裂期腫瘤細胞而起作用的，因此對腫瘤組織大小的定量可用來評估藥物的藥效。
[0023]

【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為本發(fā)明所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024]圖2為三維掃描采樣系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025]圖3是本發(fā)明采用三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選藥物的流程示意圖。
[0026]圖4顯示在Matrigel基質(zhì)膠和膠原構(gòu)成的支架上生長的正常人體乳腺小葉導管組織。右邊為放大成像。
[0027]

【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合附圖和具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0029]實施例1
如圖1所示，一種三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，它包括三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)，與三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)相連的三維掃描采樣系統(tǒng)和與三維掃描采樣系統(tǒng)相連的高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)。所述的三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)包括培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱內(nèi)設有多孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)板上設有matrigel基質(zhì)膠和膠原構(gòu)成的組織器官培養(yǎng)支架。
[0030]如圖2所示，所述的三維掃描采樣系統(tǒng)包括倒置熒光顯微鏡和三維自動掃描攝影裝置，所述的三維掃描采樣系統(tǒng)包括相襯照明光源(I)和位于相襯照明光源(I)下方的全自動X掃描移動平臺(2)、γ掃描移動平臺(3)、位于X掃描移動平臺(2)和Y掃描移動平臺
(3)下方的自動ζ軸自動聚焦/圖像拼接平臺(3)，CXD數(shù)碼相機(4)，所述的CXD數(shù)碼相機
(4)上方依次設有管透鏡(5)，帶通孔過濾輪盤(6)和雙色/分束鏡(7)，所述的雙色/分束鏡(7)的上方為自動ζ軸自動聚焦/圖像拼接平臺(3)，自動ζ軸自動聚焦/圖像拼接平臺
(3)上安裝有物鏡(相位/落射熒光)(8)，所述的雙色/分束鏡(7)的一側(cè)設有熒光照明光源(9)和透鏡(10)。所述的多孔細胞培養(yǎng)板(12)放置于X掃描移動平臺(2)和Y掃描移動平臺(3)上。
[0031]以上所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，所述的高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)配備的圖像處理軟件可采用美國Molecular Devices公司的MetaMorph顯微自動圖像分析軟件(版本:MetaMorph Premium Plus),計算機分析系統(tǒng)可將三維掃描采樣系統(tǒng)掃描得到的多層2D圖像數(shù)據(jù)建立腫瘤組織器官3D圖像模型；所述的高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)圖像處理軟件包括三維模型的尺寸，大小和體積測定程序。
[0032]實施例2
現(xiàn)以臨床抗腫瘤藥物篩選為實施例，說明本發(fā)明平臺的工作原理和操作步驟。目前正在應用中的化療藥物至少有十幾個，靶向治療藥物有6、7個。進行多個病人、多個樣品、多個藥物的高通量篩選是很多大型綜合性醫(yī)院和腫瘤醫(yī)院的迫切需要。如果在較短時間內(nèi)能夠得到藥物的藥效信息，則大大有助于腫瘤治療效益的提高。
[0033]本發(fā)明所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，其包括以下步驟:如圖3所示:
(1)將Matrigel和膠原按優(yōu)化比例充分混合，然后注入培養(yǎng)板的多孔中；
(2)將通過活檢取得的腫瘤組織切成Immxlmm大小的細塊狀或者收集的血液中循環(huán)腫瘤細胞，然后植入培養(yǎng)板孔中的Matrigel基質(zhì)膠和膠原構(gòu)成的支架上,然后在Matrigel基質(zhì)膠和膠原構(gòu)成的支架表面加上培養(yǎng)基；所述的腫瘤組織塊的培養(yǎng)基為DMEM和病人自身的血清,所述的腫瘤細胞的培養(yǎng)基為血清成分；
(3)將以上腫瘤組織或細胞放入低氧、5%C02和攝氏37度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為I
周;
(4)I周后將培養(yǎng)板移至倒置熒光顯微鏡進行3D分層掃描取樣，圖像處理軟件利用多層2D圖像數(shù)據(jù)來建立3D腫瘤組織器官圖像模型。獲得給藥前腫瘤組織器官三維模型的特征,如尺寸，大小和體積的基線值。
[0034](5)在細胞培養(yǎng)板孔中加入待測抗腫瘤藥物，繼續(xù)在以上所述相同條件下培養(yǎng)一周，每天進行觀察，包括對組織進行3D體積掃描測定，數(shù)據(jù)存儲；
(6)一周后終止實驗，同時進行腫瘤細胞生存率(survival)測定實驗；
(7)并通過高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)進行立體圖像模型的定量分析.包括根據(jù)腫瘤尺寸，大小和體積隨時間和給藥的改變，篩選出各抗腫瘤藥物的藥效，并可提供抗腫瘤藥物效能的實時動力學曲線。
[0035]實施例3
現(xiàn)以抗腫瘤新藥研究為實施例，說明此平臺的工作原理和操作步驟。尋找和篩選新的藥物，特別是以特異基因產(chǎn)物或通路為靶點，是當前腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域中的重點課題。本發(fā)明可應用于處于臨床前期和臨床試驗期的藥物。
[0036]挑選一組腫瘤細胞或組織，可來自現(xiàn)有的細胞系或臨床腫瘤病人。在Matrigel和膠原表面培養(yǎng)I周；加進不同濃度的新抗腫瘤藥物，繼續(xù)培養(yǎng)一周，每天對組織進行3D體積掃描測定；最后對腫瘤反應或新藥效能進行定量評估。對于有效藥物可進行相關(guān)腫瘤細胞的基因突變研究，因此此方法可用于新的腫瘤生物標志物的開發(fā)，聯(lián)結(jié)基因突變和抗腫瘤新藥的藥效藥理。
[0037]實施例4
采用本發(fā)明的提供三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，應用于乳腺正常組織和乳癌發(fā)生機制的研究。采用本發(fā)明平臺培養(yǎng)立體結(jié)構(gòu)的乳腺正常組織和乳癌組織，按實施例2同樣方法，通過三維掃描采樣系統(tǒng)3D掃描，并用高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)，對正常組織和癌性組織在器官形態(tài)進行分析檢測，如圖4所示，可用于研究外部小分子或生物大分子的相互作用。
[0038]實施例5
采用本發(fā)明的提供三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺與相應的毒理學研究結(jié)合，按實施例2同樣方法，3D系統(tǒng)可以很好地起到檢測環(huán)境污染物對健康影響，可彌補單層細胞測試的不足和動物試驗的繁瑣。
[0039]實施例6
其它類型疾病的研究:采用本發(fā)明的提供三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，重建動物心血管或腦組織3D模型，按實施例2方法研究其對相應藥物的反應或毒性。
[0040]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，其特征在于，它包括三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)，與三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)相連的三維掃描采樣系統(tǒng)和與三維掃描采樣系統(tǒng)相連的高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，其特征在于，所述的三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)包括培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱內(nèi)設有多孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)板上設有matrigel基質(zhì)膠和膠原構(gòu)成的組織器官培養(yǎng)支架。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，其特征在于，所述的三維自動掃描采樣系統(tǒng)包括相襯照明光源(1)，位于相襯照明光源(I)下方的全自動X掃描移動平臺(2)和Y掃描移動平臺(3)，位于X掃描移動平臺(2)和Y掃描移動平臺(3)下方的自動z軸自動聚焦/圖像拼接平臺(3)，(XD數(shù)碼相機(4)，所述的C⑶數(shù)碼相機(4)上方依次設有管透鏡(5)，帶通孔過濾輪盤(6)和雙色/分束鏡(7)，所述的雙色/分束鏡(7)的上方為自動z軸自動聚焦/圖像拼接平臺(3)，自動z軸自動聚焦/圖像拼接平臺(3)上安裝有物鏡(8)，所述的雙色/分束鏡(7)的一側(cè)設有熒光照明光源(9)和透鏡(10)，所述的多孔細胞培養(yǎng)板(12)放置于X掃描移動平臺(2)和Y掃描移動平臺(3)上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺，其特征在于，所述的高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)將三維掃描采樣系統(tǒng)掃描得到的多層2D圖像數(shù)據(jù)建立腫瘤組織器官3D圖像模型；所述的高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)圖像處理軟件包括三維模型的尺寸，大小和體積測定程序。
5.一種用權(quán)利要求1至4任一項所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將Matrigel基質(zhì)膠和膠原按優(yōu)化比例充分混合，然后注入培養(yǎng)箱內(nèi)的多孔培養(yǎng)板中； (2)將通過活檢取得的腫瘤組織切成IMMXlMM大小的細塊狀或者收集的血液中循環(huán)腫瘤細胞，然后植入培養(yǎng)板孔中的Matrigel基質(zhì)膠和膠原構(gòu)成的支架上,然后在Matrigel基質(zhì)膠和膠原構(gòu)成的支架表面加上細胞培養(yǎng)基； 將以上腫瘤組織或腫瘤細胞放入低氧、5%C02和攝氏37度條件下培養(yǎng)I周； I周后將培養(yǎng)板移至三維組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)中的倒置熒光顯微鏡下，進行3D分層掃描取樣，高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)利用多層2D圖像數(shù)據(jù)建立3D腫瘤組織器官圖像模型，獲得給藥前腫瘤組織器官三維模型的特征，包括尺寸，大小和體積的基線值； (5)然后在細胞培養(yǎng)板孔中加入待測抗腫瘤藥物，繼續(xù)在低氧、5%C02和攝氏37度條件下培養(yǎng)I周，每天進行觀察，并對組織進行3D分層掃描取樣，并利用多層2D圖像數(shù)據(jù)建立3D腫瘤組織器官圖像模型，獲得給藥后腫瘤組織器官三維模型的特征，包括尺寸，大小和體積的基線值； (6)—周后終止實驗，同時進行腫瘤細胞生存率測定； (7)并通過高容量數(shù)據(jù)儲存和計算機分析系統(tǒng)進行立體圖像模型的定量分析.包括根據(jù)腫瘤尺寸，大小和體積隨時間和給藥的改變，篩選出各抗腫瘤藥物的藥效，并可提供抗腫瘤藥物效能的實時動力學曲線。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，其特征在于，步驟(I)中Matrigel基質(zhì)膠和膠原的重量配比為1:10?10:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，其特征在于，步驟(2)中，腫瘤組織塊的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基和病人自身的血清；腫瘤細胞的培養(yǎng)基為病人自身的血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，其特征在于，步驟(4)中，三維掃描檢測裝置3D分層掃描取樣時，可沿X/Y和Z軸方向移動，對培養(yǎng)板孔內(nèi)生長的腫瘤組織進行快速和高精度的自動分層二維采樣。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物包括化學治療和靶向治療藥物，抗腫瘤先導化合物或基因藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺篩選抗腫瘤藥物的方法，其特征在于，所述的篩選的抗腫瘤藥物為抗乳腺癌、皮膚癌、肝癌、胃癌、腸癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌或腦癌的藥物。
11.權(quán)利要求1至4任一項所述的三維組織器官培養(yǎng)模型及其高通量立體圖像分析平臺在心血管、泌尿、呼吸和皮膚系統(tǒng)的3D細胞培養(yǎng)及研究細胞微環(huán)境和細胞與外環(huán)境的相互作用以及發(fā)育類疾病和退化性疾病中的應用。
【文檔編號】C12Q1/06GK104403923SQ201410632977
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】杭渤, 毛建華, 金鍵 申請人:南京卡迪奧密生物技術(shù)有限公司