腸道病毒ev71型vp1基因病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用，屬于免疫【技術(shù)領(lǐng)域】。為了實(shí)現(xiàn)此病毒樣顆粒的制備，本發(fā)明首先構(gòu)建了一種SIV GP41與EV71 VP1融合基因cVP1的真核表達(dá)載體，證實(shí)cVP1能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并能夠在細(xì)胞膜上表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建cVP1基因、gag基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體，制備桿狀病毒，以兩種桿狀病毒共感染細(xì)胞的方式成功制備cVP1病毒樣顆粒，此新型病毒樣顆粒制備過(guò)程簡(jiǎn)單，易純化，所獲病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)均一并在小鼠體內(nèi)發(fā)揮較強(qiáng)的免疫原性。本發(fā)明通過(guò)膜錨定型融合基因的設(shè)計(jì)，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了一種高效表達(dá)膜錨定VP1基因的病毒樣顆粒。
【專利說(shuō)明】腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種病毒樣顆粒及其制備方法，具體涉及腸道病 毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病（Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)是5歲以下嬰幼兒中的常見(jiàn) 傳染病，該病傳染性強(qiáng)，傳播途徑復(fù)雜，在短時(shí)間內(nèi)即可造成大流行。手足口病可由多種 腸道病毒引起，其中主要為腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71)和柯薩奇A組16型 (coxsackievirus A16，CoxA16)。手足口病近年來(lái)在我國(guó)持續(xù)爆發(fā)，嚴(yán)重危害公眾健康并 帶來(lái)巨大社會(huì)負(fù)擔(dān)。與CoxA16相比，EV71除可引起手足口病和皰疹性咽峽炎外，尚可引起 腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、無(wú)菌性腦膜炎、急性遲緩性麻痹等重癥病例，病死率高，且有后 遺癥，嚴(yán)重威脅患兒健康。加強(qiáng)對(duì)EV71感染的防控，應(yīng)用新的技術(shù)手段及策略，研發(fā)安全 性高、免疫保護(hù)性強(qiáng)并利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的新型手足口病疫苗具有重要的理論及實(shí)際應(yīng)用意 義。目前，雖然滅活疫苗已經(jīng)研發(fā)成功，但是尚無(wú)成熟地、特異地針對(duì)EV71的免疫和治療方 案。研究表明，EV71病毒抗原表位基本位于外殼蛋白VP1、VP2上，而VP1殼蛋白不僅直接 決定病毒的抗原性，還是病毒特異性中和表位所在區(qū)，因此成為研究的熱點(diǎn)。
[0003] 病毒樣顆粒（virus-like particles, VLPs)是指由某種病毒一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白 可在細(xì)胞內(nèi)自行裝配成的不含核酸成分的空心顆粒。病毒樣顆粒具有眾多優(yōu)點(diǎn)：①不具有 感染性及核酸整合致病性，相對(duì)滅活減毒疫苗其安全性得到了保障；②VLPs保持了病毒蛋 白空間結(jié)構(gòu)，可通過(guò)和病毒感染相似的途徑將抗原呈遞給免疫細(xì)胞，有效誘導(dǎo)機(jī)體免疫系 統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)應(yīng)答；③VLPs易規(guī)模化生產(chǎn)，可滿足臨床應(yīng)用需要，因而成為一種備受關(guān) 注的候選疫苗。
[0004]目前常用的病毒結(jié)構(gòu)蛋白有HBVs，HPV，SIV gag蛋白等。SIV gag基因編碼的蛋 白可被蛋白水解酶裂解成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為基質(zhì)（MA)、衣殼蛋白（CA)及核衣殼蛋白 (NC)，可自我裝配成核心顆粒，以出芽方式分泌到細(xì)胞外時(shí)獲得包膜及膜蛋白。研究表明， 可以利用gag的此特性將外源性的跨膜蛋白錨定在gag的包膜上獲得VLPs。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒及其制備方法 和應(yīng)用，本發(fā)明利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分別制備SIV gag與經(jīng)改造的重組腸道病毒EV71型 VP1的桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體，并進(jìn)一步通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，制備經(jīng)改造的VP1病毒樣顆 粒，檢測(cè)此病毒樣顆粒的特性及小鼠體內(nèi)免疫原性。本發(fā)明能夠獲得操作簡(jiǎn)易、純化簡(jiǎn)便、 純度高、形態(tài)均一的EV71型VP1基因的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒能夠有效應(yīng)用于手足口 病疫苗的制備。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0007] 該病毒樣顆粒是將cVPl融合基因克隆到真核表達(dá)載體及桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體中得 到cVPl融合基因重組轉(zhuǎn)座載體和cVPl融合基因真核表達(dá)載體；將gag基因克隆到桿狀病 毒轉(zhuǎn)座載體中，得到gag基因重組轉(zhuǎn)座載體；用cVPl融合基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳 動(dòng)物細(xì)胞，檢測(cè)其表達(dá)后，再用cVPl融合基因重組轉(zhuǎn)座載體和gag基因重組轉(zhuǎn)座載體制備 cVPl和gag的桿粒，將桿粒轉(zhuǎn)染TN5昆蟲(chóng)細(xì)胞，經(jīng)分泌表達(dá)制得；
[0008] 其中，所述cVPl融合基因是以重疊PCR法獲得的SIV GP41與EV71 VP1的融合基 因，且cVPl融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
[0009] 所述cVPl融合基因包括GP41的信號(hào)肽區(qū)域、EV71 VP1、GP41的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)； 其中，GP41的信號(hào)肽區(qū)域的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 2所示；EV71 VP1的核苷酸序列如 SEQ. ID. N0. 3所示；GP41跨膜區(qū)的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 4所示；GP41胞內(nèi)區(qū)的核苷酸 序列如SEQ. ID. N0. 5所示。
[0010] 所述真核表達(dá)載體為pCAGGs，cVPl融合基因克隆到pCAGGs載體所形成的的重組 質(zhì)粒為 cVPl-pCAGGs。
[0011] 所述的桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體為pFastBaC?l，cVPl融合基因克隆到pFastBacTMl所形 成的重組轉(zhuǎn)座載體為cVPl_pFastBac?l，gag基因克隆得pFastBac?l所形成的重組轉(zhuǎn)座載 體為gag-pFastBac?l。
[0012] 一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：
[0013] 1)采用重疊PCR法制得包括GP41的信號(hào)肽區(qū)域、EV71 VPUGP41的跨膜區(qū)和胞內(nèi) 區(qū)的cVPl融合基因，將cVPl融合基因克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacTMl中，得到重組 轉(zhuǎn)座載體 cVPl_pFastBac?l;
[0014] 2)采用PCR方法制得gag基因，將gag基因克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBac?l 中，得到重組轉(zhuǎn)座載體gag_pFastBac?l ;
[0015] 3)將重組轉(zhuǎn)座載體cVPl_pFastBac?l和gag_pFastBac?l按Bac-to-Bac桿狀病 毒表達(dá)系統(tǒng)的說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，然后與Bacmid進(jìn)行重組，經(jīng)鑒定，分別 得到重組桿粒gag-Bacmid和cVPl-Bacmid ;
[0016] 4)按照cel If ectin說(shuō)明書(shū)要求，將重組桿粒gag-Bacmid和cVPl-Bacmid分別轉(zhuǎn) 染TN5昆蟲(chóng)細(xì)胞，直至細(xì)胞病變率超過(guò)80%后，離心收集上清，得到P1代病毒，將P1代病毒 連續(xù)傳代2次后，得到重組桿狀病毒rBV gag和rBV cVPl ;
[0017] 5)將重組桿狀病毒rBV cVPl和rBVgag以（3?10) : 1的M0I比例接種TN5細(xì)胞， 經(jīng)懸浮培養(yǎng)后離心收集上清，經(jīng)純化制得腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒。
[0018] 步驟1)是將cVPl融合基因克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBac?l的EcoRI、 Notl酶切位點(diǎn)之間，得到重組轉(zhuǎn)座載體cVPl-pFastBac?l;步驟2)是將gag基因克隆 入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacTMlE C〇RI、HindllI酶切位點(diǎn)之間，得到重組轉(zhuǎn)座載體 gag_pFastBac?l〇
[0019] 步驟5)所述的重組桿狀病毒rBV cVPl和rBV gag的M0I比例為3:1、6:1或10:1。 步驟5)是在28°C下懸浮培養(yǎng)72h后離心收集上清。
[0020] 步驟5)所述的純化具體操作為：
[0021] 首先，將得到的上清經(jīng)GE Quixstand系統(tǒng)超濾純化，在4°C下進(jìn)行濃縮；
[0022] 然后，離心后收集上清，將上清經(jīng)15 %?50 %的不連續(xù)蔗糖密度梯度，再在 28000r/min、4°C的條件下超高速離心2h，收集不同濃度的組分；
[0023] 最后，用PBS洗滌，再經(jīng)28000r/min超高速離心30min，沉淀經(jīng)PBS重懸，得到純化 后的腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒。
[0024] 腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒在制備治療手足口病的疫苗中的應(yīng)用。
[0025] 所述的疫苗為抗EV71病毒感染的疫苗。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0027] 本發(fā)明利用重疊PCR的方法構(gòu)建帶有SIV膜蛋白GP41的信號(hào)肽區(qū)域、跨膜區(qū)和胞 內(nèi)區(qū)的腸道病毒EV71型VP1的融合基因，使此融合基因能夠在細(xì)胞膜上表達(dá)，并利用SIV gag結(jié)構(gòu)蛋白的特性，制備EV71型VP1病毒樣顆粒。
[0028] 本發(fā)明利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，分別獲得gag、經(jīng)改造的EV71型VP1基因的桿狀病 毒，兩種病毒以一定比例M0I共感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，制備含有EV71-VP1基因的病毒樣顆粒，并對(duì) 其特性做初步鑒定，此制備過(guò)程簡(jiǎn)便，易純化，有望為新型手足口病疫苗的研發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)室 基礎(chǔ)。
[0029] 本發(fā)明利用gag能夠自我組裝成病毒樣顆粒的特性，首次構(gòu)建膜錨定的EV71型 VP1基因cVPl，利用gag、cVPl桿狀病毒共感染昆蟲(chóng)細(xì)胞TN5制備EV71型VP1病毒樣顆粒。
[0030] 本發(fā)明所制備的病毒樣顆粒制備簡(jiǎn)便，易純化，結(jié)構(gòu)均一，并在小鼠體內(nèi)起到較好 的免疫效果。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為本發(fā)明的膜錨定EV71型VP1融合基因結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032] 圖2為EV71型VP1融合基因轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞檢測(cè)VP1表達(dá)結(jié)果圖；
[0033] 其中，（a)為Western Blot方法檢測(cè)VP1的表達(dá)的蛋白電泳圖；(b)為免疫細(xì)胞化 學(xué)方法檢測(cè)VP1基因在細(xì)胞膜上的表達(dá)結(jié)果免疫顯色照片；
[0034] 圖3為gag bacmid、VP1融合基因bacmid PCR鑒定結(jié)果圖；
[0035] 圖4為gag bacmid、VP1融合基因bacmid轉(zhuǎn)染TN5細(xì)胞后細(xì)胞病變圖；
[0036] 圖5為bacmid轉(zhuǎn)染TN5細(xì)胞后WB鑒定gag、VP1表達(dá)結(jié)果圖；
[0037] 其中，（a)為檢測(cè)gag表達(dá)結(jié)果圖；(b)為檢測(cè)VP1表達(dá)結(jié)果圖；
[0038] 圖6為rBV cVPl、gag不同M0I比例感染TN5細(xì)胞后WB鑒定gag、EV71VPl表達(dá)結(jié) 果對(duì)比圖；
[0039] 其中，（a)為檢測(cè)gag表達(dá)結(jié)果圖；(b)為檢測(cè)EV71 VP1表達(dá)結(jié)果圖；
[0040] 圖7為病毒樣顆粒電鏡結(jié)果圖；
[0041] 圖8為EV71型VP1病毒樣顆粒Western Blot鑒定結(jié)果圖；
[0042] 其中，（a)為鑒定gag表達(dá)；（b)為鑒定VP1表達(dá)；
[0043] 圖9為VP1病毒樣顆粒免疫分組及免疫流程圖；
[0044] 圖10為免疫后ELISA測(cè)定結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0046] -、膜錨定EV71型VP1融合基因、gag表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
[0047] 參見(jiàn)圖1，為本發(fā)明所設(shè)計(jì)的膜錨定EV71型VP1融合基因結(jié)構(gòu)。
[0048] 含EV71-P1基因的重組質(zhì)粒EV71-P1-TV由本室構(gòu)建并保存，env-sfl62-pCAGGs、 SIV-gag-pCAGGs由美國(guó)EMORY大學(xué)Chinglai Yang教授饋贈(zèng)。設(shè)計(jì)引物序列如表1所示： [0049]表1引物設(shè)計(jì)序列
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒，其特征在于，該病毒樣顆粒是將cVPl 融合基因克隆到真核表達(dá)載體及桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體中得到cVPl融合基因重組轉(zhuǎn)座載體和 cVPl融合基因真核表達(dá)載體；將gag基因克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體中，得到gag基因重組 轉(zhuǎn)座載體；用cVPl融合基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，檢測(cè)其表達(dá)后，再用cVPl 融合基因重組轉(zhuǎn)座載體和gag基因重組轉(zhuǎn)座載體制備cVPl和gag的桿粒，將桿粒轉(zhuǎn)染TN5 昆蟲(chóng)細(xì)胞，經(jīng)分泌表達(dá)制得； 其中，所述cVPl融合基因是以重疊 PCR法獲得的SIV GP41與EV71VP1的融合基因，且 cVPl融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒，其特征在于，所 述cVPl融合基因包括GP41的信號(hào)肽區(qū)域、EV71VP1、GP41的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)；其中，GP41 的信號(hào)肽區(qū)域的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；EV71VP1的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3 所示；GP41跨膜區(qū)的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示；GP41胞內(nèi)區(qū)的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5 所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒，其特征在于， 所述真核表達(dá)載體為pCAGGs，cVPl融合基因克隆到pCAGGs載體所形成的的重組質(zhì)粒為 cVPl-pCAGGs〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒，其特征在于， 所述的桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體為pFastBac?l，cVPl融合基因克隆到pFastBac?l所形成的重 組轉(zhuǎn)座載體為cVPl_pFastBac?l, gag基因克隆得pFastBac?l所形成的重組轉(zhuǎn)座載體為 gag_pFastBac?l〇
5. -種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 采用重疊 PCR法制得包括GP41的信號(hào)肽區(qū)域、EV71VPUGP41的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的 cVPl融合基因，將cVPl融合基因克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBac?l中，得到重組轉(zhuǎn)座 載體 cVPl_pFastBac?l ; 2) 采用PCR方法制得gag基因，將gag基因克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBac?l中， 得到重組轉(zhuǎn)座載體gag_pFastBac?l ; 3) 將重組轉(zhuǎn)座載體cVPl-pFastBac?l和gag-pFastBac?l分別轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì) 胞，然后與Bacmid進(jìn)行重組，經(jīng)鑒定，分別得到重組桿粒gag-Bacmid和cVPl-Bacmid ; 4) 將重組桿粒gag-Bacmid和cVPl-Bacmid分別轉(zhuǎn)染TN5昆蟲(chóng)細(xì)胞，直至細(xì)胞病變率超 過(guò)80 %后，離心收集上清，得到P1代病毒，將P1代病毒連續(xù)傳代2次后，得到重組桿狀病毒 rBV gag和 rBV cVPl ; 5) 將重組桿狀病毒rBV cVPl和rBV gag以（3?10) : 1的M0I比例接種TN5細(xì)胞，經(jīng) 懸浮培養(yǎng)后離心收集上清，經(jīng)純化制得腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒的制備方法，其特 征在于，步驟1)是將cVPl融合基因克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBac?l的EcoRI、NotI酶 切位點(diǎn)之間，得到重組轉(zhuǎn)座載體cVPl-pFastBac?l ;步驟2)是將gag基因克隆入桿狀病毒 轉(zhuǎn)座載體pFastBac?lEcoRI、HindllI酶切位點(diǎn)之間，得到重組轉(zhuǎn)座載體gag-pFastBac?l。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒的制備方法，其特 征在于，步驟5)所述的重組桿狀病毒rBV cVPl和rBV gag的MOI比例為3:1、6:1或10:1 ; 且是在28°C下懸浮培養(yǎng)72h后離心收集上清。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒的制備方法，其特 征在于，步驟5)所述的純化具體操作為： 首先，將得到的上清經(jīng)GE Quixstand系統(tǒng)超濾純化，在4°C下進(jìn)行濃縮； 然后，離心后收集上清，將上清經(jīng)15 %?50 %的不連續(xù)蔗糖密度梯度，再在28000r/ min、4°C的條件下超高速離心2h，收集不同濃度的組分； 最后，用PBS洗滌，再經(jīng)28000r/min超高速離心30min，沉淀經(jīng)PBS重懸，得到純化后的 腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒。
9. 權(quán)利要求1所述的腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒在制備治療手足口病的疫 苗中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的疫苗為抗EV71病毒感染的疫苗。
【文檔編號(hào)】C12N7/04GK104450631SQ201410632671
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】張惠中, 王希, 林芳, 高萍, 董軻 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)