一種三明治樣多細胞片層的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三明治樣多細胞片層的制備方法，包括如下步驟：電紡液配制步驟，向三氟乙醇溶劑中加入殼聚糖和膠原，所述殼聚糖和膠原的質量比范圍是1:4～4:1，攪拌得到電紡液；靜電紡絲步驟，將所述電紡液高壓靜電紡絲得到殼聚糖-膠原電紡生物膜；細胞-膜-細胞多細胞片層構建步驟，將兩個細胞片層分別附著在所述殼聚糖-膠原電紡生物膜兩面生長，最終得到細胞-膜-細胞多細胞片層。本方法制備工藝簡單可控，以電紡生物膜作為支撐膜，讓兩個細胞片層貼附在生物膜上生長，既增加了細胞的增殖空間，增加了兩個細胞片層間營養(yǎng)物質的流通，又保證了細胞片層在轉移過程中的完整性，從而給臨床多細胞片層移植治療提供了一個簡便易行的操作方法。
【專利說明】—種三明治樣多細胞片層的制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學組織工程領域，尤其是關于一種多細胞片層的制備方法。

【背景技術】
[0002]隨著生命科學的發(fā)展，機體由于損傷和病變造成的組織缺損由組織工程的方法進行替代與再生已成為現(xiàn)代醫(yī)學的熱點。組織工程技術的基本要素包括有良好應答特性的組織細胞、起支撐作用的細胞外基質以及促進細胞和組織再生的生物活性因子。組織工程的最重要要素是種子細胞、支架，其關鍵技術是將種子細胞接種于塑形的可降解生物材料植入體內，生長以形成所需組織。傳統(tǒng)組織工程修復缺損的方式一般有兩種:一是細胞或細胞團直接注射或放置在缺損局部；二是將細胞接種于可降解的生物支架上，這種方法在組織工程中應用最廣，然而，支架中心部位細胞量少，細胞存活率低是組織工程有待解決的難題。
[0003]由于現(xiàn)有組織工程方法的局限，日本科學家提出了一種全新的組織工程構建方法:細胞片層工程。在組織發(fā)生過程中，多種細胞層相互作用，相互協(xié)調，共同行使功能。如果在組織工程中也能通過細胞一層一層相互結合，共同作用，就可以克服單個細胞及支架的弊端，模擬正常組織的發(fā)生過程。經(jīng)細胞片層技術收獲細胞無需胰蛋白酶的消化作用便可自動從培養(yǎng)皿表面分離。收獲的細胞是含有細胞外基質的一層完整的片狀結構，含有離子通道、生長因子受體和連接蛋白等重要的細胞表面蛋白。因此，應用細胞片層技術構建的組織結構更接近于正常組織。
[0004]細胞片層技術雖然可以克服傳統(tǒng)組織工程方法的種種不足，但該方法仍有些問題亟待解決。與其他組織工程方法一樣，應用細胞片層技術進行組織重建時，種子細胞的獲取比較困難；疊加的細胞片層超過一定厚度時，常導致內部細胞的壞死；應用細胞片層技術構建大的功能性組織結構仍是細胞片層技術面臨的一大難題。支架技術和細胞片層技術的結合將有助于大塊組織的重建。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供一種新的三明治樣多細胞片層的制備方法。
[0006]本發(fā)明提供一種三明治樣多細胞片層的制備方法，包括如下步驟:
[0007]電紡液配制步驟，向三氟乙醇溶劑中加入殼聚糖和膠原，所述殼聚糖和膠原的質量比范圍是1:4?4:1,攪拌得到電紡液；
[0008]靜電紡絲步驟，將所述電紡液高壓靜電紡絲得到殼聚糖-膠原電紡生物膜；
[0009]細胞-膜-細胞多細胞片層構建步驟，將兩個細胞片層分別附著在所述殼聚糖-膠原電紡生物膜兩面生長，最終得到細胞-膜-細胞多細胞片層。
[0010]制備三氟乙醇溶劑時，可以按1:1體積比配制好2，2，2-三氟乙醇和蒸餾水作為溶齊U，即溶劑可以為50%濃度的三氟乙醇。
[0011]所述殼聚糖為蟹殼殼聚糖，其脫乙酰度為98% ;膠原為I型鼠尾膠原，分子量在1-30萬之間。
[0012]所述殼聚糖和膠原的質量比選自2:8、3:7、5:5、7:3和8:2。
[0013]所述殼聚糖和膠原的質量比為7:3。
[0014]所述電紡液的濃度為15%。該濃度是指殼聚糖和膠原在三氟乙醇溶劑中的濃度。
[0015]所述攪拌的速度是500?100rpm,所述攪拌的時間是2?5h。
[0016]所述靜電紡絲步驟中，通過高壓靜電紡絲裝置進行高壓靜電紡絲，所述高壓靜電紡絲裝置包括高壓電源、噴射裝置和接收裝置，所述高壓電源提供的電壓是8?15kv，所述噴射裝置所需針頭型號為5?9號，所述針頭與接收裝置的距離為9?15cm，所述噴射裝置送液速度為0.5?1.5ml/h。高壓靜電紡絲裝置可以包括溶液存儲裝置。靜電紡絲的溫度可以是25°C。
[0017]所述細胞-膜-細胞多細胞片層構建步驟中，將滅菌后的所述殼聚糖-膠原電紡生物膜置于在第一溫敏培養(yǎng)皿表面已生長融合的第一細胞片層上；降低溫敏培養(yǎng)表面的溫度至20-25°C，10-30min后將所述第一細胞片層從邊緣剝離；上下顛倒附著有所述第一細胞片層的殼聚糖-膠原電紡膜，并將其置于第二溫敏培養(yǎng)皿的第二細胞片層上，形成的多細胞片層在溫敏培養(yǎng)表面生長后，降低溫敏培養(yǎng)表面的溫度至20-25°C，10-30min后剝離得到所述細胞-膜-細胞多細胞片層。
[0018]細胞片層可以是單細胞片層，如脂肪干細胞片層。
[0019]降低溫敏培養(yǎng)表面的溫度至20°C，1min后剝離細胞片層。該剝離細胞片層包括剝離第一細胞片層和剝離整個多細胞片層。
[0020]形成的所述多細胞片層在溫敏培養(yǎng)表面生長的時間為3天。
[0021]較佳的，電紡液的攪拌時間為4h,攪拌速度為500rpm。
[0022]較佳的，所述的噴射裝置中所需針頭型號為6號。
[0023]較佳的，所述針頭與接收裝置的距離為14cm。
[0024]較佳的，所述噴射裝置送液速度為lml/h。
[0025]較佳的，進行高壓靜電紡絲的電壓為12.5kv。
[0026]本發(fā)明的有益效果是:1)制備工藝簡單可控；2)殼聚糖-膠原電紡生物膜孔隙率較高，空隙分布均勻，且能夠根據(jù)需要進行調節(jié)；該生物膜的成分接近細胞外基質的主要固相成分，具有高度仿生性，生物相容性好，無細胞毒性，細胞很容易在電紡生物膜上粘附增殖；3)以電紡生物膜作為支撐膜，讓兩個細胞片層貼附在生物膜上生長，既增加了細胞的增殖空間，增加了兩個細胞片層間營養(yǎng)物質的流通，又保證了細胞片層在轉移過程中的完整性，從而給臨床多細胞片層移植治療提供了一個簡便易行的操作方法。

【具體實施方式】
[0027]實施例1:
[0028]取0.12g殼聚糖溶于4ml 50%三氟乙醇溶劑，磁力攪拌過程中逐漸加入0.48g膠原，攪拌2h至完全溶解，得到15%的混合紡絲液4ml。將混合液吸入注射器中，控制微量注射泵推進速度為0.5ml/h，選用9號不銹鋼針頭并與9.5kv高壓相連，用已接地的鋁箔在距針尖9cm處接收纖維絲。8小時后鋁箔上形成平均直徑約170nm的無序納米纖維薄膜，機械強度差，很脆易破。將制備好的電紡生物膜經(jīng)UV照射15min除菌消毒。將滅菌后的生物膜置于在溫敏培養(yǎng)皿表面已生長融合的脂肪干細胞片層上，降低培養(yǎng)表面的溫度至25°C，30min后將整個細胞片層從邊緣剝離，然后上下顛倒將附著在膜上的細胞片層置于另一溫敏培養(yǎng)皿的細胞片層上，構建的細胞-膜-細胞多細胞片層在溫敏培養(yǎng)表面生長5天后，降低培養(yǎng)表面的溫度至25°C，30min后剝離整個三明治樣多細胞片層。
[0029]實施例2:
[0030]取0.18g殼聚糖溶于4ml 50%三氟乙醇溶劑，磁力攪拌過程中逐漸加入0.42g膠原，攪拌2h至完全溶解，得到15%的混合紡絲液4ml。將混合液吸入注射器中，控制微量注射泵推進速度為0.5ml/h，選用8號不銹鋼針頭并與1kv高壓相連，用已接地的鋁箔在距針尖1cm處接收纖維絲。8小時后鋁箔上形成平均直徑約200nm的無序納米纖維薄膜，機械強度差，很脆易破。將制備好的電紡生物膜經(jīng)UV照射15min除菌消毒。將滅菌后的生物膜置于在溫敏培養(yǎng)皿表面已生長融合的脂肪干細胞片層上，降低培養(yǎng)表面的溫度至25°C，30min后將整個細胞片層從邊緣剝離，然后上下顛倒將附著在膜上的細胞片層置于另一溫敏培養(yǎng)皿的細胞片層上，構建的細胞-膜-細胞多細胞片層在溫敏培養(yǎng)表面生長5天后，降低培養(yǎng)表面的溫度至25°C，30min后剝離整個三明治樣多細胞片層。
[0031]實施例3:
[0032]取0.3g殼聚糖溶于4ml 50%三氟乙醇溶劑，磁力攪拌過程中逐漸加入0.3g膠原，攪拌3h至完全溶解，得到15%的混合紡絲液4ml。將混合液吸入注射器中，控制微量注射泵推進速度為0.8ml/h,選用7號不銹鋼針頭并與I Ikv高壓相連，用已接地的鋁箔在距針尖12cm處接收纖維絲。5小時后鋁箔上形成平均直徑約300nm的無序納米纖維薄膜。將制備好的電紡生物膜經(jīng)UV照射15min除菌消毒。將滅菌后的生物膜置于在溫敏培養(yǎng)皿表面已生長融合的脂肪干細胞片層上，降低培養(yǎng)表面的溫度至22°C，20min后將整個細胞片層從邊緣剝離，然后上下顛倒將附著在膜上的細胞片層置于另一溫敏培養(yǎng)皿的細胞片層上，構建的細胞-膜-細胞多細胞片層在溫敏培養(yǎng)表面生長4天后，降低培養(yǎng)表面的溫度至22°C，20min后剝離整個三明治樣多細胞片層。
[0033]實施例4:
[0034]取0.42g殼聚糖溶于4ml 50%三氟乙醇溶劑，磁力攪拌過程中逐漸加入0.18g膠原，攪拌4h至完全溶解，得到15%的混合紡絲液4ml。將混合液吸入注射器中，控制微量注射泵推進速度為lml/h，選用6號不銹鋼針頭并與12.5kv高壓相連，用已接地的鋁箔在距針尖14cm處接收纖維絲。4小時后鋁箔上形成平均直徑約450nm的無序納米纖維薄膜。將制備好的電紡生物膜經(jīng)UV照射15min除菌消毒。將滅菌后的生物膜置于在溫敏培養(yǎng)皿表面已生長融合的脂肪干細胞片層上，降低培養(yǎng)表面的溫度至20°C，1min后將整個細胞片層從邊緣剝離，然后上下顛倒將附著在膜上的細胞片層置于另一溫敏培養(yǎng)皿的細胞片層上，構建的細胞-膜-細胞多細胞片層在溫敏培養(yǎng)表面生長3天后，降低培養(yǎng)表面的溫度至20°C, 1min后剝離整個三明治樣多細胞片層。
[0035]實施例5:
[0036]取0.48g殼聚糖溶于4ml 50%三氟乙醇溶劑，磁力攪拌過程中逐漸加入0.12g膠原，攪拌5h至完全溶解，得到15%的混合紡絲液4ml。將混合液吸入注射器中，控制微量注射泵推進速度為1.5ml/h，選用5號不銹鋼針頭并與14kv高壓相連，用已接地的鋁箔在距針尖15cm處接收纖維絲。2.5小時后鋁箔上形成平均直徑約700nm的無序納米纖維薄膜。將制備好的電紡生物膜經(jīng)UV照射15min除菌消毒。將滅菌后的生物膜置于在溫敏培養(yǎng)皿表面已生長融合的脂肪干細胞片層上，降低培養(yǎng)表面的溫度至20°C，1min后將整個細胞片層從邊緣剝離，然后上下顛倒將附著在膜上的細胞片層置于另一溫敏培養(yǎng)皿的細胞片層上，構建的細胞-膜-細胞多細胞片層在溫敏培養(yǎng)表面生長3天后，降低培養(yǎng)表面的溫度至20°C，1min后剝離整個三明治樣多細胞片層。
[0037]本發(fā)明中，2，2，2-三氟乙醇能夠使在常溫中性條件下不溶于水的膠原和殼聚糖共溶于該溶劑。本發(fā)明制備的電紡生物膜不僅具有三維多孔結構，同時還具有大小形狀可控的特點，孔隙率和納米纖維的直徑在一定范圍內也能控制。人體組織大多數(shù)細胞外基質是由膠原、多聚糖和水等構成的網(wǎng)絡，因此殼聚糖-膠原電紡生物膜具有細胞外基質高度仿生的性質。
[0038]本發(fā)明采用電紡生物膜作為支撐膜來構建多細胞片層。先在溫敏培養(yǎng)表面接種脂肪干細胞貼壁生長，待脂肪干細胞在37°C生長至融合時，降溫至20°C，培養(yǎng)表面由疏水性轉變?yōu)橛H水性，從而將貼壁的細胞連同細胞下層細胞外基質(ECM) —同釋放出來。被完整保留的細胞下層ECM確保收獲到的連續(xù)細胞層具有完整的細胞連接，以及細胞層與移植點之間的連接(無需纖維蛋白膠或縫合)。將脫離的單細胞片層由電紡生物膜作為載體，連同細胞片層一起轉移到另一細胞片層上，構成細胞-膜-細胞的三明治樣多細胞片層結構。
[0039]本發(fā)明利用殼聚糖-膠原電紡生物膜作為支撐膜，在轉移單細胞片層的同時維持細胞片層的完整性，避免了現(xiàn)有的用塑料膜或PVDF膜轉運中細胞片層的破碎。同時，殼聚糖-膠原電紡生物膜又提供給細胞一定的三維生長空間和營養(yǎng)物質在細胞片層間流通的通道，避免現(xiàn)有疊加的多細胞片層中間細胞壞死的現(xiàn)象。利用所制備的電紡生物膜作為支撐膜，增加了轉移細胞片層的可操作性和簡易性，提高了多細胞片層中間部分細胞存活率。該方法所構建的多細胞片層可用于同型或異型多細胞片層的移植，重構心肌、平滑肌、肝小葉等三維結構組織。
[0040]以上內容是結合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。
【權利要求】
1.一種三明治樣多細胞片層的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 電紡液配制步驟，向三氟乙醇溶劑中加入殼聚糖和膠原，所述殼聚糖和膠原的質量比范圍是1:4?4:1,攪拌得到電紡液； 靜電紡絲步驟，將所述電紡液高壓靜電紡絲得到殼聚糖-膠原電紡生物膜； 細胞-膜-細胞多細胞片層構建步驟，將兩個細胞片層分別附著在所述殼聚糖-膠原電紡生物膜兩面生長，最終得到細胞-膜-細胞多細胞片層。
2.如權利要求1所述的一種三明治樣多細胞片層的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖為蟹殼殼聚糖，其脫乙酰度為98% ;膠原為I型鼠尾膠原，分子量在1-30萬之間。
3.如權利要求1或2所述的一種三明治樣多細胞片層的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖和膠原的質量比選自2:8、3:7、5:5、7:3和8:2。
4.如權利要求3所述的一種三明治樣多細胞片層的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖和膠原的質量比為7:3。
5.如權利要求3所述的一種三明治樣多細胞片層的制備方法，其特征在于，所述電紡液的濃度為15%。
6.如權利要求1所述的一種三明治樣多細胞片層的制備方法，其特征在于，所述攪拌的速度是500?lOOOrpm，所述攪拌的時間是2?5h。
7.如權利要求1所述的一種三明治樣多細胞片層的制備方法，其特征在于，所述靜電紡絲步驟中，通過高壓靜電紡絲裝置進行高壓靜電紡絲，所述高壓靜電紡絲裝置包括高壓電源、噴射裝置和接收裝置，所述高壓電源提供的電壓是8?15kv，所述噴射裝置所需針頭型號為5?9號，所述針頭與接收裝置的距離為9?15cm，所述噴射裝置送液速度為0.5?1.5ml/h。
8.如權利要求1所述的一種三明治樣多細胞片層的制備方法，其特征在于，所述細胞-膜-細胞多細胞片層構建步驟中，將滅菌后的所述殼聚糖-膠原電紡生物膜置于在第一溫敏培養(yǎng)皿表面已生長融合的第一細胞片層上；降低溫敏培養(yǎng)表面的溫度至20-25°C,10-30min后將所述第一細胞片層從邊緣剝離；上下顛倒附著有所述第一細胞片層的殼聚糖-膠原電紡膜，并將其置于第二溫敏培養(yǎng)皿的第二細胞片層上，形成的多細胞片層在溫敏培養(yǎng)表面生長后，降低溫敏培養(yǎng)表面的溫度至20-25°C，10-30min后剝離得到所述細胞-膜-細胞多細胞片層。
9.如權利要求8所述的一種三明治樣多細胞片層的制備方法，其特征在于，降低溫敏培養(yǎng)表面的溫度至20°C，1min后剝離細胞片層。
10.如權利要求8或9所述的一種三明治樣多細胞片層的制備方法，其特征在于，形成的所述多細胞片層在溫敏培養(yǎng)表面生長的時間為3天。
【文檔編號】C12N5/0775GK104436299SQ201410632650
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權日:2014年11月11日
【發(fā)明者】朱艷霞, 余小平 申請人:深圳市第二人民醫(yī)院