基于微液滴的數(shù)字核酸擴增定量分析方法及系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種數(shù)字核酸擴增定量分析方法及系統(tǒng)，該方法配制待檢測核酸擴增反應液，其包含待檢測核酸模板、反應緩沖水溶液、脫氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和產(chǎn)物標記物質；將所述配制的待檢測核酸擴增反應液載入兩端均有開口的微管道，所述微管道位于開口容器上方，所述開口容器盛有含有表面活性劑的油性液體；將所述微管道一端開口在所述開口容器的液面表面上下往復振動，或在液面以下左右往復振動，生成多個液滴，平鋪在開口容器底部；將所述開口容器中的多個液滴進行核酸擴增反應；采集所述核酸擴增反應后的產(chǎn)物信號，對核酸模板進行定量分析。所述數(shù)字核酸擴增分析法能實現(xiàn)微體系中低濃度核酸物質定量檢測，操作簡便，效率高、成本低。
【專利說明】基于微液滴的數(shù)字核酸擴増定量分析方法及系統(tǒng)

【技術領域】
[0001]本申請涉及核酸定量分析【技術領域】，具體涉及一種基于微液滴的數(shù)字核酸擴增定量分析方法及系統(tǒng)。

【背景技術】
[0002]傳統(tǒng)的定量PCR(Polymerase Chain React1n，聚合酶鏈式反應)技術基于反應過程中核酸模板呈指數(shù)擴增，核酸模板的定量可以通過比較擴增循環(huán)數(shù)，以及分析擴增結束后PCR產(chǎn)物量來實現(xiàn)。然而，有多種因素導致傳統(tǒng)的定量PCR方法有一定的局限性和不精確性，例如，擴增起始時不呈指數(shù)形式而會影響分析方法的精確性；過低濃度核酸模板擴增以后難以檢測或者只有擴增存在兩倍或兩倍以上才能被檢測出來等。
[0003]以數(shù)字PCR為代表的數(shù)字核酸擴增技術是新型的核酸模板定量技術，它將待測核酸模板樣品分隔成為大量的微反應體系，且核酸模板在這些微體系中的分布符合泊松分布，即絕大多數(shù)微體系中只有一個或沒有核酸模板，每一個微體系中都可以進行獨立的核酸擴增反應，擴增結束以后，可以通過計算陽性微體系的數(shù)目而對起始核酸模板進行絕對定量。該方法對于研宄基因序列上的變異，如拷貝數(shù)變異以及點突變的檢測等尤為適用。
[0004]數(shù)字核酸擴增技術主要采用微流控或微滴化方法形成微反應體系，目前微流控芯片上的液滴的生成需要滿足特定的流速、油水界面張力以及通道構型和通道表面修飾等條件，液滴體積調節(jié)的范圍也受到以上因素的制約。另外，液滴在微流控芯片通道內生成后，需要特定的步驟和裝置轉移到儲存容器中，難以對單個液滴的條件進行定制，液滴的定位、提取和分析等操作較為不便。
[0005]通過毛細管等微通道注射或噴射微量液體，并將液體注入微坑或點樣在基片，這在原理上是一種簡便的液滴生成策略。然而，在實際操作中，液滴在脫離毛細管時，存在液滴與管內連續(xù)液體分離的表面張力，以及液滴與管口表面的附著力，使液滴體積的精確定量受到影響。通常，現(xiàn)有技術采用壓電陶瓷、熱激膨脹、高壓電噴和超聲等特殊的噴射或液滴激發(fā)方式，增加液滴脫離微通道出口的動能，以克服表面張力的影響(Tekin E, et al.1nkjet printing as a deposit1n and patterning tool forpolymers and inorganic particles.Soft Matter 2008，4 (4):703-713;Meacham JM, etal.Droplet format1n and eject1n from a micromachined ultrasonic dropletgenerator: Visualizat1n and scaling.Physics of Fluids 2005, 17 (10):100605 ；Ferraro P，et al.Dispensing nano—pico droplets and liquid patterning bypyroelectrodynamic shooting.Nature Nanotechnology 2010,5:429-435)，通過微通道出口的特殊構型以及硅烷化或涂層處理，降低液滴在管口的附著力(Tavana H，etal.Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially definedreagent delivery to mammalian cells.Nature Materials 2009，8 (9): 736-741) 0 然而，上述這些方式依賴于較為復雜的流體驅動裝置等，成本較高，不利于數(shù)字核酸擴增的應用。


【發(fā)明內容】

[0006]有鑒于此，本申請?zhí)峁┮环N基于微液滴的數(shù)字核酸擴增定量分析方法及系統(tǒng)，本申請?zhí)峁┑臄?shù)字核酸擴增能實現(xiàn)微體系中低濃度核酸物質的定量檢測，操作簡便，效率高、成本低。
[0007]本申請?zhí)峁┮环N基于微液滴的數(shù)字核酸擴增定量分析方法，包括以下步驟:
[0008]a)配制待檢測核酸擴增反應液，所述待檢測核酸擴增反應液包含待檢測核酸模板、反應緩沖水溶液、脫氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和產(chǎn)物標記物質；
[0009]b)將所述步驟a)配制的待檢測核酸擴增反應液載入兩端均有開口的微管道，所述微管道位于開口容器上方，所述開口容器盛有含有表面活性劑的油性液體；
[0010]c)將所述步驟b)中微管道一端開口在所述開口容器的液面表面上下往復振動，或在液面以下左右往復振動，生成多個液滴，平鋪在開口容器底部；
[0011]d)將所述步驟c)中開口容器中的多個液滴進行核酸擴增反應；
[0012]e)采集所述步驟d)核酸擴增反應后的產(chǎn)物信號，對核酸模板進行定量分析。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟a)中，所述待檢測核酸擴增反應液為以脫氧核糖核酸為模板的核酸擴增反應液、以核糖核酸為模板的逆轉錄核酸擴增反應液或環(huán)介導等溫擴增反應液。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟c)中，所述上下往復振動或者左右往復振動的振幅為0.1毫米?10毫米。
[0015]本申請?zhí)峁┮环N基于微液滴的數(shù)字核酸擴增定量分析系統(tǒng)，包括:
[0016]液滴生成裝置；
[0017]核酸擴增控溫裝置，使所述液滴生成裝置生成的多個液滴進行核酸擴增反應；和
[0018]產(chǎn)物信號采集裝置，用于采集所述核酸擴增反應后的產(chǎn)物信號；
[0019]所述液滴生成裝置包括:
[0020]開口容器，用于儲存生成的多個液滴并提供進行核酸擴增反應的場所；
[0021]位于所述開口容器上方的微管道，所述微管道用于載入待檢測核酸擴增反應液，其兩端均有開口 ；和
[0022]用于驅動所述微管道往復振動的振動設備。
[0023]優(yōu)選的，所述開口容器為一維或二維的儲液池陣列。
[0024]優(yōu)選的，所述微管道具有圓柱管開口或錐形開口 ；所述微管道內徑為5微米至250微米，且外徑為10微米至500微米。
[0025]優(yōu)選的，所述微管道為I根加樣微管道、8根加樣微管道、12根加樣微管道或者96根加樣微管道陣列。
[0026]優(yōu)選的，所述振動設備為電磁鐵式、壓電陶瓷式或偏心輪式電機振動設備。
[0027]優(yōu)選的，所述核酸擴增控溫裝置為水浴鍋、金屬浴設備、溫箱或核酸擴增儀。
[0028]優(yōu)選的，所述熒光信號采集裝置為光學顯微成像系統(tǒng)、熒光掃描儀或集成化圖像傳感器。
[0029]與現(xiàn)有技術相比，本申請實施例提供的數(shù)字核酸擴增定量分析方法首先在位于開口容器上方的微管道中裝載待檢測核酸擴增反應液，所述開口容器盛有含有表面活性劑的油性液體；由振動設備驅動控制所述微管道管口的運動，在所述開口容器的液面表面上下往復振動，或者在液面以下左右往復振動，生成多個液滴，單層平鋪鋪滿開口容器底部；在核酸擴增控溫裝置的作用下，所述開口容器內生成的大小均一的液滴陣列進行數(shù)字核酸擴增；通過采集核酸擴增反應后的產(chǎn)物信號，對核酸模板進行定量分析。在本申請中，基于振動的液滴自動生成技術具有精確液滴大小可控和方法簡便的優(yōu)越性，通入溶液的微管道通過在氣-油界面的上下振動，或者在油相中的左右振動，依靠液面張力等作用，實現(xiàn)均一大小油包水微液滴的生成；依靠重力的沉降作用，生成的液滴會沉入開口容器底部并自動平鋪為液滴陣列。對于生成的均一大小液滴，本申請進行核酸擴增反應并采集產(chǎn)物信號，如熒光、紫外吸收、濁度等信號，在滿足液滴數(shù)量多于核酸分子數(shù)量的前提下，利用擴增與非擴增液滴在組成上的差異，對獲得目標序列擴增的液滴數(shù)量進行分析，最終實現(xiàn)對核酸分子的定量分析。本申請將所述液滴自動生成方法與數(shù)字核酸擴增技術兩者結合，利用了數(shù)字核酸擴增的特點，實現(xiàn)了在微體系中低濃度核酸物質的定量檢測；同時不需要任何芯片結構就可以快速高效地完成數(shù)字核酸擴增功能，避免了繁雜的芯片制作和微流控液路的集成工藝。因此，本申請?zhí)峁┑暮怂釘U增定量分析方法操作簡便，效率高，成本低，將成為最為簡易便捷的核酸物質定量分析方法，具有無可估量的科研價值和市場前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。
[0031]圖1為本發(fā)明實施例提供的數(shù)字核酸擴增方法的流程圖；
[0032]圖2為本發(fā)明實施例提供的液滴生成裝置的結構示意圖；
[0033]圖3為本發(fā)明實施例1?4中流速與生成液滴體積的關系圖；
[0034]圖4為本發(fā)明實施例1生成的液滴平鋪于96孔板其中一孔底部的顯微視圖；
[0035]圖5為本發(fā)明實施例1擴增之后的液滴在GFP通道中的熒光圖；
[0036]圖6為本發(fā)明實施例2生成的液滴的顯微視圖；
[0037]圖7為本發(fā)明實施例2?4不同體積的液滴反應后的示意圖；
[0038]圖8為本發(fā)明實施例3生成的液滴的顯微視圖；
[0039]圖9為本發(fā)明實施例4生成的液滴的顯微視圖；
[0040]圖10為本發(fā)明實施例5毛細管在礦物油液面以下水平振動生成液滴的示意圖；
[0041]圖11為本發(fā)明實施例5生成的液滴的顯微視圖；
[0042]圖12為本發(fā)明實施例6生成的液滴的顯微視圖；
[0043]圖13為本發(fā)明實施例7生成的液滴的顯微視圖；
[0044]圖14為本發(fā)明實施例8所采用的一種可快速裝卸的一次性或多次使用帶儲液倉式微管道的正視圖；
[0045]圖15為本發(fā)明實施例8所采用的一種可快速裝卸的一次性或多次使用帶儲液倉式微管道的剖視圖；
[0046]圖16為本發(fā)明實施例9提供的液滴生成裝置的結構示意圖；
[0047]圖17為本發(fā)明實施例10提供的液滴生成裝置的結構示意圖；
[0048]圖18為本發(fā)明實施例11提供的二維陣列式液滴大批量同時生成裝置的結構示意圖；
[0049]圖19為本發(fā)明實施例11提供的二維陣列式液滴大批量同時生成裝置的剖面示意圖；
[0050]圖20為本發(fā)明實施例12提供的二維陣列式液滴大批量同時生成裝置的結構示意圖。

【具體實施方式】
[0051]下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0052]本申請?zhí)峁┝艘环N基于微液滴的數(shù)字核酸擴增定量分析方法，包括以下步驟:
[0053]a)配制待檢測核酸擴增反應液，所述待檢測核酸擴增反應液包含待檢測核酸模板、反應緩沖水溶液、脫氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和產(chǎn)物標記物質；
[0054]b)將所述步驟a)配制的待檢測核酸擴增反應液載入兩端均有開口的微管道，所述微管道位于開口容器上方，所述開口容器盛有含有表面活性劑的油性液體；
[0055]c)將所述步驟b)中微管道一端開口在所述開口容器的液面表面上下往復振動，或者在液面以下左右往復振動，生成多個液滴，平鋪在開口容器底部；
[0056]d)將所述步驟c)中開口容器中的多個液滴進行核酸擴增反應；
[0057]e)采集所述步驟d)核酸擴增反應后的產(chǎn)物信號，對核酸模板進行定量分析。
[0058]本發(fā)明涉及的領域為利用自動生成的液滴進行核酸定量分析的領域，具體涉及一種利用振動微管道生成大小可控液滴、并在其中進行核酸擴增反應及定量分析的方法。本申請?zhí)峁┑幕谡駝由晌⒁旱芜M行核酸物質數(shù)字定量分析的方法，具有操作簡易快捷、能精確控制液滴體積、可檢測范圍廣以及成本低等優(yōu)點。
[0059]參見圖1，圖1為本發(fā)明實施例提供的數(shù)字核酸擴增方法的流程圖，本申請實施例的方法依次包括:樣品溶液制備、樣品載入微管道、相界面振動制備液滴、液滴在儲液池內反應和液滴在儲液池內檢測。
[0060]首先，本申請實施例配制待檢測核酸擴增反應液，其包含待檢測核酸模板、反應緩沖水溶液、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物、聚合酶和產(chǎn)物標記物質如熒光物質。同時，可配制陰性對照反應液，其中不加入模板。
[0061]在本申請中，所述待檢測核酸擴增反應液即進行核酸分析的溶液，其是本領域技術人員常用的核酸擴增反應液，可以是以脫氧核糖核酸(DNA)為模板的核酸擴增反應液(可稱為DNA擴增反應液)，也可以是以核糖核酸(RNA)為模板的逆轉錄核酸擴增反應液(可稱為RNA反轉錄反應液)，還可以是其它核酸擴增反應液，如環(huán)介導等溫擴增(LAMP)反應液。其中，所述DNA擴增反應液的特點是含有DNA擴增所需要的dNTP、緩沖液、無機鹽離子、聚合酶、引物、待檢測的DNA模板以及熒光染料或熒光探針等。所述RNA反轉錄反應液的特點是含有RNA反轉錄所需要的反轉錄酶、RNA抑制劑、緩沖液、無機鹽離子、引物以及RNA模板等。反應液中的熒光染料或熒光探針能指示核酸擴增擴增，可以是SYBR Green等與DNA結合的熒光染料，也可以是同時含有熒光基團和淬滅基團的寡糖核苷酸探針，如TaqMan熒光探針等。
[0062]本申請優(yōu)選將配制的核酸分析溶液如能夠進行DNA擴增的反應液或RNA反轉錄的反應液，預先在離心管或其他容器中混合，以使反應液更均勻，并在反應液中加入熒光染料或焚光探針等。
[0063]制備好待檢測核酸擴增反應液后，本申請實施例將其以一定流速通入或吸入兩端均有開口的微管道中。本申請實施例可將裝載反應液的微管道固定在振動設備上，并且一端管口懸于裝有油相及一定濃度表面活性劑的開口容器正上方。或者，本申請實施例先將微管道固定于所述開口容器上方，再通過導管連接裝載待分析目標分子與擴增引物、擴增酶等試劑的混合溶液即待檢測核酸擴增反應液的注射泵，進行樣品溶液的載入。
[0064]在本申請中，所述微管道可為注射開口微管道，能以固定流速注射一定體積的液體，如采用上端帶儲液倉、下端為垂直微管道的可裝卸型微管道；也可以通過導管通入液體，如采用毛細管通過導管連接注射泵。所述微管道兩端均有開口，一端開口用于載入反應液，另一端開口(即管口或管道出口)使所述反應液流出。所述微管道的優(yōu)選構型為圓柱管開口或錐形開口，更優(yōu)選為拉尖的錐形構型。在本申請的實施例中，所述微管道內徑為5微米至250微米、優(yōu)選40微米至200微米、更優(yōu)選25微米至150微米、最優(yōu)選10微米至100微米，且外徑為10微米至500微米。為提高液滴產(chǎn)生的效率，本申請實施例可以采用I根加樣微管道、8根加樣微管道為一行，或者12根加樣微管道為一列或者96根加樣微管道陣列形式的微管道，通過同步振動同時生成液滴。
[0065]為了使生成的液滴更加均一，本申請可以對微管道出口的表面進行低表面能處理，即所述微管道優(yōu)選為開口處經(jīng)低表面能處理的微管道。所述低表面能處理可為低表面能涂層處理，或娃燒化處理，本申請優(yōu)選采用全氟娃燒(如1H, I H, 2H, 2H-perf Iuorooctyltrichlorosilane, Fluorochem Ltd.，Derbyshire, UK)，對微管道如毛細管的外壁進行娃燒化處理；所述硅烷化處理為本領域技術人員熟知的技術手段。
[0066]本申請所述微管道內載入反應液，并能夠連續(xù)或間歇地注射反應液。在本申請實施例中，微管道注射液體可以是伴隨微管道口的運動連續(xù)注射，也可以是在微管道運動到任一特定位置點開始，按照設定流速和時間注射核酸擴增反應液。
[0067]在本申請中，作為優(yōu)選，所述微管道的另一端連接有流體驅動設備；所述流體驅動設備為任意可能產(chǎn)生連續(xù)或間歇性核酸擴增反應液液流的流體驅動設備。本申請可以使用蠕動泵、注射泵、壓力驅動泵、氣壓驅動泵或電滲驅動泵等，優(yōu)選微量注射泵，精度較高且可設定注射體積至納升級。本申請對微管道和流體驅動設備的連接方式?jīng)]有特殊限制，如可以通過特氟龍(Teflon)毛細管連接，并保證密閉性。
[0068]本申請?zhí)峁╅_口容器，其內預先裝入比重低于水溶液的不互溶的油相，并能接受和儲存微管道中注入的核酸擴增反應液的液滴。所述開口容器為任意能夠存儲微升至毫升體積液體的開口容器，可稱為儲液池。在本申請中，所述開口容器優(yōu)選為一維或二維排列的儲液池陣列，更優(yōu)選為標準的平底24孔、96孔或384孔板。本申請可以利用多個儲液池，分別存儲一種特定大小的液滴，避免不同大小液滴的混合，從而實現(xiàn)對液滴大小的控制。
[0069]在本申請中，所述油相的特點是比重小于水溶液，以保證生成的水溶液液滴能夠下沉；不能與儲液池發(fā)生反應、化學性質穩(wěn)定、不易揮發(fā)、沒有熒光干擾等；需要加入一定的表面活性劑，以避免液滴之間的融合；也需要進行無菌處理。本申請對開口容器中的油性液體和表面活性劑沒有特殊限制，采用本領域常用的即可。在本申請中，所述微管道位于開口容器的液面上方，所述微管道的開口端朝向開口容器的液面。
[0070]本申請將所述微管道一端開口在所述開口容器的液面表面有規(guī)律地上下往復運動，或者在液面以下左右往復振動，生成多個液滴，單層平鋪鋪滿開口容器底部。具體的，本申請實施例通入核酸分析溶液的微管道朝開口容器運動，管道出口接觸并進入開口容器中的油相載液液面，此時，微管道注射的溶液進入油相；隨即微管道遠離開口容器運動，管道出口脫離開口容器中的油相載液，此時，微管道口外的溶液被留在油相中，形成油相包裹水溶液的液滴，多次重復而形成大量大小均一的液滴，平鋪于開口容器底部。并且，生成的液滴在開口容器底部之間單層排列，達到鋪滿底部的效果。
[0071]在本申請的一個實施例中，可以使用加樣微管道上下往復振動或者96孔板上下往復振動的方式，這種往復式振動是為了使水相油相有序的接觸和分離，從而完成油相對水相的切割。在本申請的另一個實施例中，還可以采用微管道相對于96孔板作水平往復運動，通過控制水平抖動的速度實現(xiàn)油相對水相的切割。本申請實施所述振動時，可以是開口容器位置固定，微管道做振動運動；也可以是微管道位置固定，開口容器做振動運動；還可以是兩者相對振動。本申請實施例微管道出口在液滴收集儲液池中的不互溶油相表面上下振動或者液面下左右振動，生成大小均一液滴，平鋪于儲液池底部。
[0072]本申請能夠持續(xù)的以固定的頻率和速率進行上下振動或左右振動，且振幅可調；本申請對所述振動的控制優(yōu)選采用自動移動臺操作的方式，所述上下往復振動或者左右往復振動的振幅優(yōu)選為0.1毫米?10毫米，更優(yōu)選為0.5毫米?5毫米。在本申請中，通過調整水相溶液的流動速度以及振動的頻率，對生成液滴的大小、速度以及通量進行控制，液滴大小可以達到納升甚至皮升級別，進而對樣品中的低濃度至高濃度的核酸物質進行絕對定量分析。
[0073]生成液滴后，本申請實施例將裝有液滴的開口容器進行大量液滴的同步核酸擴增反應。所述核酸擴增反應的條件等為本領域技術人員熟知的，本申請并無特殊限制。
[0074]核酸擴增反應結束以后，本申請實施例將所述開口容器取出，采集產(chǎn)物信號如熒光、紫外吸收、濁度等信號，進行核酸物質的定量分析。本申請實施例之前可根據(jù)液滴直徑以及儲液池底部的面積計算鋪滿底部所需要的液滴總體積，在信號讀取和分析時，計算陽性液滴的數(shù)目，從而分析得到核酸模板的定量結果。
[0075]相應的，本申請?zhí)峁┝艘环N基于微液滴的數(shù)字核酸擴增定量分析系統(tǒng)，包括:
[0076]液滴生成裝置；
[0077]核酸擴增控溫裝置，使所述液滴生成裝置生成的多個液滴進行核酸擴增反應；和
[0078]產(chǎn)物信號采集裝置，用于采集所述核酸擴增反應后的產(chǎn)物信號；
[0079]所述液滴生成裝置包括:
[0080]開口容器，用于儲存生成的多個液滴并提供進行核酸擴增反應的場所；
[0081]位于所述開口容器上方的微管道，所述微管道用于載入待檢測核酸擴增反應液，其兩端均有開口 ；和
[0082]用于驅動所述微管道往復振動的振動設備。
[0083]本申請?zhí)峁┑臄?shù)字核酸擴增定量分析系統(tǒng)主要包括基于振動的液滴生成裝置、核酸擴增控溫裝置和產(chǎn)物信號采集裝置，其中的液滴生成裝置包括開口微管道、用于液滴收集存儲的開口容器和振動設備等，以實現(xiàn)上述數(shù)字核酸擴增定量分析方法。
[0084]本申請?zhí)峁┑臄?shù)字核酸擴增定量分析系統(tǒng)包括液滴生成裝置，參見圖2，圖2為本發(fā)明實施例提供的液滴生成裝置的結構示意圖。圖2中，I為微管道，2為開口容器，3為振動設備，4為注射泵，5為核酸擴增反應后的開口容器。
[0085]在本申請中，所述液滴生成裝置包括開口容器2，用于儲存生成的多個液滴并提供進行核酸擴增反應的場所。所述開口容器與上文所述的開口容器一致，在此不再贅述。
[0086]所述液滴生成裝置包括微管道1，位于開口容器2上方；所述微管道用于按照一定體積和流速載入待檢測核酸擴增反應液，其兩端均有開口。所述微管道與上文所述的微管道一致，在此不再贅述。
[0087]在本申請中，作為優(yōu)選，所述微管道的另一端連接有流體驅動設備；所述流體驅動設備為任意可能產(chǎn)生連續(xù)或間歇性核酸擴增反應液液流的流體驅動設備。本申請可以使用蠕動泵、注射泵、壓力驅動泵、氣壓驅動泵或電滲驅動泵等，優(yōu)選微量注射泵，如圖2中的注射泵4，精度較高且可設定注射體積至納升級。本申請對微管道和流體驅動設備的連接方式?jīng)]有特殊限制，如可以通過特氟龍(Teflon)毛細管連接，并保證密閉性。
[0088]所述液滴生成裝置包括振動設備3，用于驅動微管道I往復振動。所述振動設備能夠實現(xiàn)短行程高速往復振動，本申請可以使用電磁鐵式、壓電陶瓷式或機械偏心輪式振動設備。本申請所述振動設備的振動頻率固定，可以通過調節(jié)輸入電壓控制其振幅，對輸入電壓的控制可選用電磁振動器、直線電機、伺服電機或步進電機。
[0089]本申請實施例所述液滴生成裝置的操作流程為:微管道I固定于開口容器2的上方，通過導管連接裝載核酸擴增反應液的注射泵4，由振動設備3控制微管道I管口的運動；啟動注射泵4，并使微管道I出口在振動設備3的驅動下有規(guī)律的在油相液面上下往復運動或者在液面下左右往復運動，實現(xiàn)均一大小油包水微液滴的生成，再依靠重力的沉降作用，生成的液滴沉入開口容器2底部，并自動平鋪為液滴陣列。
[0090]在本申請中，所述數(shù)字核酸擴增定量分析系統(tǒng)包括核酸擴增控溫裝置，能夠精確控制并保持核酸擴增反應所需要的溫度，使所述液滴生成裝置生成的多個液滴進行核酸擴增反應。在本申請中，所述核酸擴增控溫裝置可以是水浴鍋、金屬浴設備、溫箱或核酸擴增儀，優(yōu)選為PCR儀。本申請實施例可將裝有液滴的開口容器4置于PCR控溫裝置，進行大量液滴的同步核酸擴增反應，得到核酸擴增反應后的開口容器5。
[0091]所述數(shù)字核酸擴增定量分析系統(tǒng)包括產(chǎn)物信號采集裝置，用于采集所述核酸擴增反應后的產(chǎn)物信號。所述產(chǎn)物信號采集裝置可以僅采集液滴的熒光、紫外吸收、濁度等信號，也可以既采集信號又讀取分析信號。在本申請中，所述產(chǎn)物信號采集裝置可以是光學顯微成像系統(tǒng)、熒光掃描儀或集成化圖像傳感器如集成化高靈敏度圖像傳感器等本領域技術人員熟知的信號采集裝置，優(yōu)選為熒光顯微成像系統(tǒng)，可觀察液滴發(fā)熒光的現(xiàn)象，并通過統(tǒng)計熒光液滴的總數(shù)而反映起始核酸擴增反應液中模板DNA的數(shù)量。本申請實施例可以直接采用圖像傳感器成像，一次性獲得所有液滴的信號，再進行液滴信號的分析，檢測分析方法比較簡便。
[0092]本申請將無需微流控芯片的可自動化的液滴生成裝置與數(shù)字核酸擴增反應巧妙結合，使數(shù)字核酸擴增操作簡易快捷，無需任何復雜芯片結構和微流控液滴生成液路，極大地降低了成本?；谡駝由梢旱蔚难b置和方法可以通過調節(jié)流體的注射流速和微管道的運動而精確控制所生成的液滴的體積和數(shù)量，液滴大小可以方便調控，可生成納升甚至皮升級均一液滴，本申請應用于核酸擴增檢測的范圍很大。因此，本申請既綜合了液滴生成裝置的高效率、高通量和可控性強的優(yōu)勢，又兼具數(shù)字核酸擴增低濃度定量檢測的特點，為低濃度、稀有樣品如DNA定量檢測及其后續(xù)全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、拷貝數(shù)變異、基因點突變、多重基因表達分析等提供良好的操作平臺。
[0093]為了進一步說明本申請，下面結合實施例對本申請?zhí)峁┑囊环N基于微液滴的數(shù)字核酸擴增定量分析方法及系統(tǒng)進行具體地描述，但不能將它們理解為對本申請保護范圍的限定。
[0094]實施例1
[0095]振動設備為一電磁打點計時器，由電壓6V、頻率為50Hz的交流電源供電。接通電源后，電磁打點計時器的振動片以每秒50次的頻率振動。振動的幅度4_。所使用的微管道為長5cm、內徑為75 μπκ外徑為150 μπι的拉尖的石英毛細管，拉尖處的內徑為30微米、外徑為60 μπι。石英毛細管的一端通過內徑300 ym的Teflon管連接充滿礦物油的50 μ L微量注射器(上海高鴿)，毛細管和Teflon管連接處用環(huán)氧樹脂膠密封。微量注射器固定在微量注射泵(哈佛儀器，美國)上，按設定流速抽拉或注射固定體積樣品。所采用的儲液池為透明聚苯乙稀平底96孔板，每個儲液池的體積為200 yL，內徑為8_ ;并在儲液池內加Λ 150 μ L礦物油作為液滴覆蓋相。
[0096]利用微量注射泵將微量注射器內的礦物油注入Teflon管和石英毛細管，排出氣泡。將300ng/ μ L的λ -DNA進行16倍稀釋，在PCR儀(Mastercycler，艾本德公司，德國)中進行變性，程序設置為95°C、10分鐘，程序結束后迅速將模板取出置于冰上保存。
[0097]按以下比例配制LAMP反應液:2 X反應緩沖液12.5 μ L，引物FIP和BIP各40pmol，Loop-F 和 Loop-B 各 20pmol，F(xiàn)3 和 B3 各 5pmol，酶溶液 I μ L，Calcein I μ L，預變性的λ -DNA I μ L，10mg/mL的BSA溶液3 μ L，用滅菌水補足25 μ L。在96孔板的孔中加入300 yL含有3% ABIL EM90 (贏創(chuàng)德固賽公司，德國)的礦物油。
[0098]添加的六種LAMP 擴增引物序列為:FIP:CAGCA TCCCT TTCGG CATAC CAGGTGGCAA GGGTA ATGAGG ；BIP:GGAGG TTGAA GAACT GCGGC AGTCG ATGGC GTTCG TACTC ；F3:GMTG CCCGT TCTGC GAG；B3:TTCAG TTCCT GTGCG TCG ;Loop-F:GGCGG CAGAG TCATAAAGCA；Loop-B:GGCAG ATCTC CAGCC AGGAA CTA。
[0099]將如上配制的25 μ L的LAMP反應液通過微量注射泵吸入石英毛細管及與石英毛細管相連的300 μπι內徑的尖端，使石英毛細管頭和連接石英毛細管的尖端垂直固定在振動器的振片上，并懸于平底96孔培養(yǎng)板的一個儲液池內礦物油液面的正上方。
[0100]上下調節(jié)石英毛細管尖端，使其距礦物油液面上方I毫米。將振動器接通電源，振片攜帶石英毛細管以50ΗΖ的頻率上下振動，振動幅度為2毫米，石英毛細管口在礦物油液面上下振動。調節(jié)裝有注射器的注射泵流速為100nL/S，加注總體積為4yL，開啟注射泵后，液滴開始在礦物油中生成，在加注4 μ L以后，生成的液滴能鋪滿整個孔的底部的90%。液滴體積參見圖3，圖3為本發(fā)明實施例1?4中流速與生成液滴體積的關系圖。
[0101 ] 停止注射泵和頻率發(fā)生器，將96孔板平放于PCR儀中，調節(jié)溫度至63°C，進行大量液滴的同步核酸擴增反應，反應I小時后取出。
[0102] 將96孔板放于倒置光學顯微成像系統(tǒng)(型號為Eclipse，尼康公司，日本)上，用2倍物鏡在明場下觀察孔中液滴的狀態(tài)，結果如圖4所示，圖4為本發(fā)明實施例1生成的液滴平鋪于96孔板其中一孔底部的顯微視圖。切換至綠色熒光通道再次觀察孔中液滴的狀態(tài)，結果如圖5所示，圖5為本發(fā)明實施例1擴增之后的液滴在GFP通道中的熒光圖。觀察液滴發(fā)熒光的現(xiàn)象并統(tǒng)計熒光液滴的總數(shù)，總數(shù)為306，該數(shù)目反映了起始模板DNA的數(shù)量。
[0103]實施例2
[0104]按照實施例1的方法，獲得體積為4nL的液滴并進行核酸擴增反應；區(qū)別在于，注射泵的流速為200nL/s。
[0105]生成的液滴參見圖6，圖6為本發(fā)明實施例2生成的液滴的顯微視圖；液滴體積參見圖3。產(chǎn)生熒光信號的液滴參見圖7，圖7為本發(fā)明實施例2?4不同體積的液滴反應后的示意圖。
[0106]實施例3
[0107]按照實施例2的方法，獲得體積為1.7nL的液滴并進行核酸擴增反應；區(qū)別在于，注射泵的流速為80nL/s，加注體積為2.5 μ L。
[0108]生成的液滴參見圖8，圖8為本發(fā)明實施例3生成的液滴的顯微視圖；液滴體積參見圖3。產(chǎn)生熒光信號的液滴參見圖7。
[0109]實施例4
[0110]按照實施例2的方法，獲得體積為0.25nL的液滴并進行核酸擴增反應；區(qū)別在于，注射泵流速為10nL/s，加注體積為I yL。
[0111]生成的液滴參見圖9，圖9為本發(fā)明實施例4生成的液滴的顯微視圖；液滴體積參見圖3。產(chǎn)生熒光信號的液滴參見圖7。
[0112]由以上實施例可知，對于相同模板濃度的樣品，在含不同體積的液滴的微坑內，產(chǎn)生熒光信號的液滴的數(shù)量和比例不同，如圖7所示。本申請通過多種體積液滴的分別生成，并統(tǒng)計液滴的體積和數(shù)量，可以提高數(shù)字核酸擴增線性范圍，從而能得到更加精確、檢測線性范圍更廣的數(shù)字核酸擴增核酸絕對定量分析結果，有利于在臨床病毒載量分析、突變檢測和拷貝數(shù)差異等方面的應用。
[0113]實施例5
[0114]采用實施例1中的設備，在礦物油液面以下水平振動生成水的液滴，具體操作為:
[0115]將Teflon管內充滿水，一端連接充滿礦物油的50 μ L微量注射器，另一端連接拉尖的毛細管。將毛細管垂直扎入礦物油中，接通電源，調節(jié)電源頻率為固定50Hz，調節(jié)電壓為3V，使毛細管在礦物油中水平振動，液滴的生成參見圖10，圖10為本發(fā)明實施例5毛細管在礦物油液面以下水平振動生成液滴的示意圖。圖10中，I為毛細管，2為儲液池。在此電壓下振幅為2mm，開啟注射泵，以50nL/s的流速注入水，此條件下生成的液滴如圖11所示，圖11為本發(fā)明實施例5生成的液滴的顯微視圖。
[0116]實施例6
[0117]按照實施例5的方法，獲得純水液滴。區(qū)別在于，調節(jié)電壓為5V，振幅為3_。
[0118]此條件下生成的液滴如圖12所示，圖12為本發(fā)明實施例6生成的液滴的顯微視圖。
[0119]實施例7
[0120]按照實施例5的方法，獲得純水液滴。區(qū)別在于，調節(jié)電壓為7V，振幅為4_。
[0121]此條件下生成的液滴如圖13所示，圖13為本發(fā)明實施例7生成的液滴的顯微視圖。
[0122]實施例8
[0123]圖14為本發(fā)明實施例8所采用的一種可快速裝卸的一次性或多次使用帶儲液倉式微管道的正視圖，圖15為本發(fā)明實施例8所采用的一種可快速裝卸的一次性或多次使用帶儲液倉式微管道的剖視圖。圖14和圖15中，I為微管道，2為樣品存儲倉，3為待測樣品，4為礦物油。微管道的構造與一次性注射器針頭相似。微管道材質為不銹鋼，內徑為60微米，外徑為200微米，管長2厘米。微管道I上方為樣品存儲倉2，其內徑為4毫米，體積為150微升；腔體底部為錐形，以保證存儲倉不存在樣品殘留死角，所有樣品都能形成液滴并進入液滴儲液池。
[0124]使用時，微管道儲液倉2內先加入50微升樣品溶液3，再在樣品3上方加入100微升礦物油4。由于礦物油比重比水輕，微管道內的樣品溶液位于底部，并充滿微管道。在加樣時，只需將儲液倉固定在4毫米直徑的流體驅動輸出口上，即可開始注射樣品，生成液滴。
[0125]本實施例由于采用了錐形構造的樣品存儲倉，樣品溶液能夠完全從微管道向外注射，不存在樣品殘留和死體積。
[0126]實施例9
[0127]微管道振動驅動采用電磁振動臂，振動頻率為50Hz，振動幅度為5mm。振動臂上固定一維陣列式微管道，加樣器具有I個管狀入口、I個長方形的連通腔體和8個管狀出口，間距為9mm，每個管狀出口接一個液滴生成微管道，如圖16所示，圖16為本發(fā)明實施例9提供的液滴生成裝置的結構示意圖。圖16中，I為微管道陣列，2為標準96孔板，3為振動臂。其中，微管道出口齊平，規(guī)格如實施例8所采用的帶樣品存儲倉式微管道；存儲倉內加入20微升液滴相樣品。微管道I在振動臂3上的排列是8個一排，與下方孔內預先加入100微升礦物油的96孔板的8個豎排孔一一對齊。即，在微管道陣列I下方為一水平放置的標準96孔板2，孔內徑為8mm，孔體積為200微升，每個小孔內加入100微升輕質礦物油。陣列微管道的出口對準一排孔，并使微管道靠近孔內礦物油液面2mm;振動臂中充滿礦物油。
[0128]開始操作，入口與氣壓驅動裝置(為氮氣鋼瓶帶調壓閥，未在圖16中顯示)連接，驅動一維陣列注射，振動臂帶動8根針振動；在振動臂以50赫茲的頻率振動，8個微管道在礦物油和空氣的界面上上下振動，分別以每秒50個的速度同時生成液滴，即在96孔板的一個豎排孔內產(chǎn)生液滴。完成以后，振動臂抬起，向96孔板的下一個8孔豎排方向移動并與孔一一對齊，并使微管道距離礦物油液面2_，重復前面的振動生成液滴的操作，完成以后繼續(xù)向下一排移動，一共生成12排，就可以完成一個96孔板液滴的生成。
[0129]實施例10
[0130]振動設備為電磁振動臂，振動頻率為50Hz，振動幅度為5mm。振動臂上固定一維陣列式微管道，加樣器具有I個管狀入口、I個長方形的連通腔體和12個管狀出口，間距為9mm，每個管狀出口接一個液滴生成微管道，如圖17所示，圖17為本發(fā)明實施例10提供的液滴生成裝置的結構示意圖。圖17中，I為微管道，2為標準96孔板，3為振動臂。其中，微管道出口齊平，規(guī)格如實施例8所采用的帶儲液倉的微管道；儲液倉內加入20微升液滴相樣品。微管道I在振動臂3上的排列是一排12個，與下方孔內預先加入100微升礦物油的96孔板的12個橫排孔對齊。即，在加樣器I下方為一水平放置的標準96孔板2，孔內徑為8mm，孔體積為200微升，每個小孔內加入100微升輕質礦物油。陣列微管道的出口對準一排孔，并使微管道靠近孔內礦物油液面2mm ;振動臂中充滿礦物油。
[0131]開始操作，入口與氣壓驅動裝置(為氮氣鋼瓶帶調壓閥，未在圖17中顯示)連接，驅動一維陣列注射，振動臂帶動12根微管道振動；在振動臂以50赫茲的頻率振動，8個微管道在礦物油和空氣的界面上上下振動，分別以每秒50個的速度同時生成液滴，即在96孔板的一個橫排孔內產(chǎn)生液滴。完成以后，振動臂抬起，向96孔板的下一個12孔橫排方向移動并與孔一一對齊，并使微管道距離礦物油液面2mm，重復前面的振動生成液滴的操作，完成以后繼續(xù)向下一排移動，一共生成8排，就可以完成一個96孔板液滴的生成。
[0132]以上兩個實施例通過一維陣列化設計，使多根微管道組成的注射針頭等間距排列，同時向陣列微坑中生成液滴，利用同步制備提高液滴生成的通量，實現(xiàn)多樣品同時分析，降低系統(tǒng)的成本。
[0133]實施例11
[0134]參見圖18和19，圖18為本發(fā)明實施例11提供的二維陣列式液滴大批量同時生成裝置的結構示意圖；圖19為本發(fā)明實施例11提供的二維陣列式液滴大批量同時生成裝置的剖面示意圖。圖18和19中，I為加樣微管道，2為96孔板，3為振動臂。加樣器為8X12的二維陣列式微管道；96根微管道的構造同實施例8。加樣器的外部尺寸為12cmX8cm，厚5mm,內部為一矩形的中空腔體。加樣器下方為與腔體相連的微管道固定管，間距為9_，陣列大小為12X8，內徑為4mm，外徑為6mm。每個固定管上固定一個加樣針頭，微管道規(guī)格如實施例8，末端齊平；微管道排列與標準96孔板相對應。每一根微管道與下方孔內預先加入100微升礦物油的96孔板的96個孔一一對齊，并使微管道距離礦物油液面2mm。
[0135]使用時，振動臂帶動96根微管道以50Hz的速度振動，在96孔板的每一個孔內同時以每秒50個的速度廣生液滴。完成以后，振動臂抬起，下面可以換另外一塊裝有100微升礦物油的96孔板，重復上面的液滴生成操作。
[0136]實施例12
[0137]本實施例的裝置與實施例11相同，如圖20所示，圖20為本發(fā)明實施例12提供的二維陣列式液滴大批量同時生成裝置的結構示意圖。圖20中，I為加樣微管道，2為96孔板，3為振動臂。
[0138]本實施例與實施例11的區(qū)別在于，陣列式微管道保持不動，使其下面的裝有100微升礦物油的96孔板進行上下振動而生成液滴。
[0139]由以上實施例可知，本申請將所述液滴自動生成方法或裝置與數(shù)字核酸擴增技術兩者結合，利用了數(shù)字核酸擴增的特點，實現(xiàn)了在微體系中低濃度核酸物質的定量檢測；同時利用相界面振動，快速將微升體積的待測樣品分割成皮升至納升體積的均一液滴，不需要任何芯片結構就可以快速高效地完成數(shù)字核酸擴增功能，避免了繁雜的芯片制作和微流控液路的集成工藝。因此，本申請?zhí)峁┑暮怂釘U增定量分析方法操作簡便，效率高，成本低，是一種簡易便捷、高靈敏度的核酸物質數(shù)字定量分析方法，具有無可估量的科研價值和市場前景。
【權利要求】
1.一種基于微液滴的數(shù)字核酸擴增定量分析方法，包括以下步驟: &)配制待檢測核酸擴增反應液，所述待檢測核酸擴增反應液包含待檢測核酸模板、反應緩沖水溶液、脫氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和產(chǎn)物標記物質； 幻將所述步驟4配制的待檢測核酸擴增反應液載入兩端均有開口的微管道，所述微管道位于開口容器上方，所述開口容器盛有含有表面活性劑的油性液體； 0)將所述步驟4中微管道一端開口在所述開口容器的液面表面上下往復振動，或在液面以下左右往復振動，生成多個液滴，平鋪在開口容器底部； (1)將所述步驟0中開口容器中的多個液滴進行核酸擴增反應； 6)采集所述步驟(1)核酸擴增反應后的產(chǎn)物信號，對核酸模板進行定量分析。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4中，所述待檢測核酸擴增反應液為以脫氧核糖核酸為模板的核酸擴增反應液、以核糖核酸為模板的逆轉錄核酸擴增反應液或環(huán)介導等溫擴增反應液。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟0中，所述上下往復振動或者左右往復振動的振幅為0.1毫米?10毫米。
4.一種基于微液滴的數(shù)字核酸擴增定量分析系統(tǒng)，包括: 液滴生成裝置； 核酸擴增控溫裝置，使所述液滴生成裝置生成的多個液滴進行核酸擴增反應；和 產(chǎn)物信號采集裝置，用于采集所述核酸擴增反應后的產(chǎn)物信號； 所述液滴生成裝置包括: 開口容器，用于儲存生成的多個液滴并提供進行核酸擴增反應的場所； 位于所述開口容器上方的微管道，所述微管道用于載入待檢測核酸擴增反應液，其兩端均有開口 ；和 用于驅動所述微管道往復振動的振動設備。
5.根據(jù)權利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述開口容器為一維或二維的儲液池陣列。
6.根據(jù)權利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述微管道具有圓柱管開口或錐形開口；所述微管道內徑為5微米至250微米，且外徑為10微米至500微米。
7.根據(jù)權利要求5所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述微管道為1根加樣微管道、8根加樣微管道、12根加樣微管道或者96根加樣微管道陣列。
8.根據(jù)權利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述振動設備為電磁鐵式、壓電陶瓷式或偏心輪式電機振動設備。
9.根據(jù)權利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸擴增控溫裝置為水浴鍋、金屬浴設備、溫箱或核酸擴增儀。
10.根據(jù)權利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述產(chǎn)物信號采集裝置為光學顯微成像系統(tǒng)、熒光掃描儀或集成化圖像傳感器。
【文檔編號】C12M1/38GK104450891SQ201410655309
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權日:2014年11月17日
【發(fā)明者】杜文斌, 李昂, 徐鵬, 盛廣濟 申請人:中國科學院微生物研究所