黃瓜CsMADS23基因過表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃瓜B族基因CsMADS23過表達(dá)載體及其在果莢數(shù)量改造中的應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該載體為含有雙35S啟動(dòng)子和黃瓜B族基因CsMADS23植物表達(dá)載體。在擬南芥中過量表達(dá)CsMADS23，獲得的CsMADS23轉(zhuǎn)基因植株的果莢明顯增多，尤其是頂部果莢。以上結(jié)果表明CsMADS23在果莢發(fā)育方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。利用CsMADS23基因獲得的果莢數(shù)增加的特性可以有效地利用到其它物種上來增加產(chǎn)量。
【專利說明】黃瓜CsMADS23基因過表達(dá)載體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種黃瓜CsMADS23過表達(dá)載體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]MADS-box基因是一類序列特異的調(diào)節(jié)基因家族，它所編碼的MADS_box蛋白因子為轉(zhuǎn)錄因子，其主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。MADS名稱來源于MADS-box基因家族得名于最先鑒定出來的四個(gè)成員的首字母:酵母的MCM1基因、擬南芥的AGAM0US基因、金魚草的DEFICIENS基因和人的SRF基因。
[0003]已有的研究表明，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子是通過二聚體的形式以其保守結(jié)構(gòu)域與特定的DNA序列相結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子可以參與到一系列的植物發(fā)育過程的調(diào)控過程中，其中最重要的作用是參與花的發(fā)育調(diào)控，根據(jù)研究花的相關(guān)突變體分離出控制出花的各輪器官發(fā)育的A、B、C、D、E基因并提出了花發(fā)育的ABC和ABCDE模型，并將其指導(dǎo)到其它非模式生物花發(fā)育的研究上。此外，還在模式植物擬南芥中分離出了與開花早晚相關(guān)的AGL20、AGL24、C0SANS、S0C1、FLC、FLM、FRI和SVP等。在番茄中分離出一個(gè)與其成熟相關(guān)的MADS基因LeMADS-RIN，在香蕉中分離出一個(gè)在香蕉后熟過程中起重要作用的MuMADSl基因。同時(shí)，也有報(bào)道表明MADS-box基因可以參與植物的營養(yǎng)生長(zhǎng)發(fā)育過程，耬斗菜的FRUITFULL-like參與葉的發(fā)育，胡椒的CaJOINTLESS基因可以抑制莖的分生組織的生長(zhǎng)。MADS-box基因通常以基因家族的形式存在，目前僅對(duì)極少部分的成員進(jìn)行克隆的功能的鑒定分析，大多數(shù)的成員需要進(jìn)行深入的研究，這也暗示MADS-box可能還參與許多我們還不清楚的發(fā)育和調(diào)控過程。
[0004]黃瓜是重要的蔬菜作物，2009年黃瓜基因組測(cè)序的完成為進(jìn)一步進(jìn)行功能的研究提供了可能。目前，對(duì)黃瓜功能基因的解析還處于初級(jí)階段，僅對(duì)極少數(shù)的基因進(jìn)行克隆和分析，MADS-box作為植物中非常重要的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，對(duì)其進(jìn)行研究具有一定的理論和實(shí)踐意義。前面的研究表明，黃瓜中共存在著43個(gè)MADS-box基因，進(jìn)化樹的分析發(fā)現(xiàn)其與AP3-PI類基因具有較高的同源性，在擬南芥中的B功能基因主要在花瓣和雄蕊的決定和花的發(fā)育上起作用。黃瓜雖屬雙子葉植物，但不同于擬南芥，黃瓜有雄花、雌花及兩性花三種類型的花，而擬南芥僅為兩性花。AP3-PI類基因CsMADS23在黃瓜中的功能是否存在功能的保守性與分化性并不清楚，值得進(jìn)一步的研究。我們首先克隆出CsMADS23基因，連到含雙35S啟動(dòng)子的過表達(dá)載體PHB上獲得過表達(dá)載體PHB-CsMADS23，轉(zhuǎn)化擬南芥后發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)CsMADS23基因會(huì)使得植株的果莢數(shù)目增加，利用這一特性可以有效地利用到其它物種上來增加植物的產(chǎn)量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種黃瓜CsMADS23基因花特異表達(dá)載體及其在果莢數(shù)量改造中的應(yīng)用，該載體含有黃瓜CsMADS23基因，基因的上游連有雙35S啟動(dòng)子。
[0006]本發(fā)明的上述植物表達(dá)載體為PHB_CsMADS23，由下述方法構(gòu)建而成:
(1)根據(jù) CuGI (http://cucumber, genomics, org.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黃瓜 CsMADS23 序列(Csa011135)，設(shè)計(jì)兩端引物:CsMADS23_F:5’ -aaaaGGATCCATGGGAAGAGGGAAAATAG-3，(含 BamHI 位點(diǎn))CsMADS23_R: 5，-aaaaTCTAGATTATTCCCTTTCTTGTAGATTTG-3’(含Xbal位點(diǎn))。以黃瓜花蕾的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CsMADS23全長(zhǎng)。
[0007](2)回收CsMADS23的cDNA全長(zhǎng)，將其連接到pMD18載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD18-CsMADS23。
[0008](3)使用 BamHI 和 Xbal 酶切 pMD18_CsMADS23，回收 CsMADS23 片段，同時(shí)用 BamH I和Xbal酶切PHB，回收后連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得植物表達(dá)載體PHB-CsMADS23。
[0009]本發(fā)明的另一目的是公開黃瓜CsMADS23在果莢數(shù)量改造中的基因工程應(yīng)用，該基因?qū)霐M南芥后，植株的果莢明顯增多，尤其是頂部果莢。該基因可作為目的基因?qū)肫渌参铮淖冎参锏墓v數(shù)量，以用來提高作物的產(chǎn)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發(fā)明中CsMADS23全長(zhǎng)擴(kuò)增后的電泳示意圖；
圖2為本發(fā)明表達(dá)載體PHB-CsMADS23的BamHI和Xbal雙酶切電泳檢測(cè)圖；
圖3為轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定；
圖4為過量表達(dá)CsMADS23的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表達(dá)分析；
圖5為過量表達(dá)CsMADS23的轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析，其中(A)和(C)為野生型；(B)、(D)和(E)為轉(zhuǎn)基因植株。

【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，這些實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0012]實(shí)施例中所涉及的試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑、各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑購自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus購于Τ0Υ0Β0公司，DNase I購于天根生化科技(北京)有限公司，DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純；儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0013]實(shí)施例1:表達(dá)載體PHB_CsMADS23的構(gòu)建
(1)弓丨物設(shè)計(jì):根據(jù)CuGI (http://cucumber, genomics, org.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黃瓜CsMADS23序列(Csa011135),設(shè)計(jì)兩端引物:
CsMADS23-F:5，-aaaaGGATCCATGGGAAGAGGGAAAATAG-3，(含 BamHI 位點(diǎn))
CsMADS23-R:5> -aaaaTCTAGATTATTCCCTTTCTTGTAGATTTG-3，(含 Xbal 位點(diǎn))
(2)黃瓜花蕾總RNA的提取
所用的黃瓜品種為華北型黃瓜。取長(zhǎng)度約0.7 mm的花蕾1 mg，取材后立刻凍到液氨中，采用TRIzol (Invitrogen, USA)試劑法提取總RNA:加1.5 ml Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。12，000rpm離心5 min，棄沉淀。加200 ul氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min。4°C 12, 000g離心15 min。吸取上層水相，至另一離心管中。加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置30 min。4°C 12, 000g離心10 min，棄上清。用1 ml 75%乙醇洗滌2次沉淀。4°C 8, 000g 離心 5 min,棄上清。室溫晾干 10 min。用 50 uL H20 (Rnase free)溶解 RNA。
[0014](3)黃瓜花蕾總cDNA第一鏈的合成
黃瓜花蕾RNA用DNase I處理后用于以O(shè)ligo (dT) 18為引物的反轉(zhuǎn)錄:取RNA 15 uL，加01igo(dT)18 luL，混勻，70°C保溫5min，立即冰水浴，稍離心，依次加入10XM-MLV Buffer 2uL、dNTP (lOmM) 1 uL、RNasin (40U/uL) 1 uL、M-MLV (200U/uL) luL，總體積 20 uL，混勻，42°C保溫 60min，95°C lOmin 滅活 M-MLV 酶活性，_20°C保存。
[0015](4) CsMADS23 基因的擴(kuò)增
設(shè)計(jì)特異性引物:CsMADS23-F:5’-aaaaGGATCCATGGGAAGAGGGAAAATAG- 3’(含 BamHI位點(diǎn))CsMADS23-R:5’ -aaaaTCTAGATTATTCCCTTTCTTGTAGATTTG-3’(含 Xbal 位點(diǎn))，以第一鏈產(chǎn)物為模板，用長(zhǎng)片段、高保真酶KOD-Plus進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:94°C 5 min ；94°C 30 s ；56°C 30 s ；68°C 1.0 min，40 個(gè)循環(huán)；68°C 5 min。PCR 產(chǎn)物用 1.5% 瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期大小一致(圖1)。
[0016](5) CsMADS23片段的膠回收
對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，使用膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書對(duì)目的片段進(jìn)行回收。
[0017](6) CsMADS23 片段加尾
取1.5 ml滅菌的eppendorf管，依次加入回收的PCR產(chǎn)物14μ 1、10X Taq DNA聚合酶緩沖液 2yl、10mM dNTP 2 μ 1, Taq DNA 聚合酶 2 μ 1 ;72°C處理 45 min ;先加 0.18 mL無菌水，再加20 μ 1 3Μ醋酸鈉，混勻，最后加入2倍體積的無水乙醇，-20°C沉淀60 min,12，OOOrpm, 4°C離心lOmin。棄上清，75%乙醇洗滌沉淀2次。DNA晾干后加入20 μ L無菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0018](7)CsMADS23片段的T/A克隆和測(cè)序
將回收片段連接到PMD18載體上，其具體步驟為:向1.5 ml離心管中分別加入:CsMADS23 片段的 cDNA 5 μ l、pMD18 載體 0.5 μ 1、10XT4 DNA 連接酶緩沖液 1 μ 1，Τ4 DNA連接酶1μ 1，加無菌水至10μ 1，用封口膜封好；置于16°C連接4-6h。將100μ 1感受態(tài)腸桿菌E.coli DH5a加入連接體系中混勻；混合液冰浴30 min，42°C熱刺激90 s后，冰浴5min;加入800μ1 LB液體培養(yǎng)基，37 °C、200 rpm搖床培養(yǎng)45min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后，常規(guī)3，000 rpm離心2 min收集菌體；在超凈臺(tái)上吸去上清,剩余約0.1 ml時(shí)，使用移液槍混勻，接入帶有Amp抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒涂布均勻；37°C過夜培養(yǎng)；挑取菌落接種到帶有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，收集菌體，采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。通過酶切檢測(cè)獲得的重組質(zhì)粒pMD18-CsMADS23，具體方法為:向0.5 ml的離心管中分別加入:質(zhì)粒 DNA (50ng/y 1)2 μ 1,BamHI 0.5 μ l.Xbal 0.5 μ 1,10Xbuffer (Κ) 1 μ 1,使用無菌水補(bǔ)足20 μ 1 ;37°C反應(yīng)4h ;然后將酶切正確的重組質(zhì)粒pMD18-CsMADS23進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證插入基因的正確性。
[0019](8)表達(dá)載體PHB_CsMADS23的構(gòu)建
使用BamHI和Xbal對(duì)質(zhì)粒pMD18_CsMADS23和PHB載體進(jìn)行雙酶切，分別獲得5’端帶有BamHI和3’端帶有Xbal的CsMADS23片段和PHB載體，電泳后分別進(jìn)行膠回收，16°C連接4-6h ;將100 μ 1感受態(tài)腸桿菌E.coli DH5 α加入6 μ 1連接體系中混勻；混合液冰浴30min，42°C熱刺激90s后，冰浴5 min;加入800 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，37°C、200 rpm搖床培養(yǎng)45min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后，常規(guī)3，000 rpm離心1 min收集菌體；在超凈臺(tái)上吸去上清，剩余約0.1 ml時(shí)，使用移液槍混勻，接入帶有Kan抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒涂布均勻；37°C過夜培養(yǎng)；挑取菌落接種于LB液體+Kan的培養(yǎng)基，37°C、180rpm培養(yǎng)12h后，提取質(zhì)粒。通過酶切檢測(cè)獲得的重組質(zhì)粒PHB-CsMADS23，具體方法為:向0.5 ml的離心管中分別加入:質(zhì)粒 DNA (50ng/y 1)2 μ 1,BamHI 0.5 μ l.Xbal 0.5 μ 1,10Xbuffer(Κ)1 μ 1，使用無菌水補(bǔ)足20 μ 1 ;37°C反應(yīng)4h ;經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒PHB-CsMADS23可酶切出預(yù)期大小(576bp)的片段(圖2)。將酶切正確的重組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序進(jìn)行序列驗(yàn)證(其核苷酸序列如SEQ ID N01所示)，最后獲得表達(dá)載體PHB-CsMADS23。
[0020]實(shí)施例2:PHB-CsMADS23轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌 GV3101
(1)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
挑取農(nóng)桿菌GV3101單菌落接種于5ml YEB培養(yǎng)基中，28°C搖培過夜，按1:100的比例接種于50 ml YEB培養(yǎng)基中擴(kuò)培，28°C繼續(xù)培養(yǎng)約6_7h至0D600=0.4-0.6。將菌液置于冰上30min ；5, 000 rpm, 4°C離心 5min,棄上清，將菌體懸于 10 ml 0.15 M NaCl 中；5，000 rpm,4°C離心5min，棄上清，菌體用1 ml 20 mM CaCl2，4°C )輕輕懸浮，每管200μ1分裝，或加入終濃度為20%的無菌甘油，-70°C保存。
[0021](2)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定
將10 μ 1質(zhì)粒DNA加入200 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)中，混勻，冰浴30min，液氮冷凍3_5min，37°C水浴5min,加入1 mlYEB培養(yǎng)基，28°C搖培3_4h。10，OOOrpm,室溫離心30s,棄上清，加入200 μ 1 YEB培養(yǎng)基重懸菌體，涂于YEB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2天；堿裂解法提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA，酶切驗(yàn)證。質(zhì)粒再重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5 α )，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，再用酶切鑒定。
[0022]實(shí)施例3:含PHB_CsMADS23的農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化擬南芥
(1)擬南芥的種植
①所用的擬南芥為野生型擬南芥，為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。當(dāng)年收獲的種子種植后4度春化72 h，隔年種子種植后春化24 h。然后轉(zhuǎn)入人工培養(yǎng)室中在相對(duì)濕度80%，恒溫20-24°C，光照強(qiáng)度80-200 μ mol/M2/S,光照周期為8 h黑暗、16 h光照培養(yǎng)。所用的土為3份蛭石，1份珍珠巖和2份黑土混合而成。
[0023]②將營養(yǎng)土用塑料盆裝好，在托盤里加入營養(yǎng)液，待營養(yǎng)土吸水潮濕后，開始點(diǎn)種。
[0024]③將擬南芥的種子放在平鋪的紙上，用牙簽將擬南芥的種子點(diǎn)在土上。用保鮮膜蓋好，暗培養(yǎng)兩天，四天后揭掉保鮮膜正常培養(yǎng)。
[0025]④土稍干時(shí)可再澆一次營養(yǎng)液，以后澆水即可。若要做轉(zhuǎn)化，待抽薹2到3cm時(shí)，剪除頂花序，用營養(yǎng)液再澆灌一次。
[0026]⑤種子的收集:擬南芥完全成熟后，停止?jié)菜仓旮稍锖髮M南芥剪下放在一張干凈的光面紙上收集種子，盡量將雜物去干凈，便于篩選。
[0027](2)擬南芥的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的篩選
①制備好已轉(zhuǎn)化了相應(yīng)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液10 ml，在轉(zhuǎn)化前一天晚上，轉(zhuǎn)入大瓶培養(yǎng)過夜，第二天取出使用時(shí)農(nóng)桿菌液0D600當(dāng)在1.2到1.6之間。室溫5，000 rpm離心10min。棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基里，使0D600在0.8左右。
[0028]②先將植株上已長(zhǎng)出的果莢及開放的花剪掉，再將農(nóng)桿菌懸浮液直接噴灑至整個(gè)植株，主要噴灑在花序上。蓋上透明的塑料蓋子以保持濕度，移入恒溫室避光培養(yǎng)，第二天可開蓋，正常光照培養(yǎng)。
[0029]③一周后再噴灑一次，收種子，在相應(yīng)的抗性1/2 MS平板上篩選轉(zhuǎn)化子。
[0030]④轉(zhuǎn)化子的篩選:種子消毒，先用70%乙醇浸泡10 min，在上述處理時(shí)要不時(shí)地使種子懸浮，并換一次70%乙醇。最后用無菌水洗四次。
[0031]⑤處理后的種子用Top agar (0.1%瓊脂水溶液)均勻涂布在相應(yīng)的抗性固體篩選培養(yǎng)基表面，每塊150 mm直徑的平皿最多種1500棵。
[0032]⑥4°C春化2到3天，移入22°C恒溫室培養(yǎng)。將篩選得到的轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)到合適的大小后移栽到土壤中。
[0033]實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和分析
(1)擬南芥DNA的提取
將適量的經(jīng)篩選的擬南芥葉片放入1.5 ml的離心管中，加入400 μ 1的SDS抽提緩沖液，用藍(lán)色小棒研磨成漿狀，加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，猛烈搖勻，12，000rpm，離心10 min。取上清至新的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的3M醋酸鈉(PH5.2)，劇烈混勻使DNA成團(tuán)，放入_20°C沉淀2hr以上。隨后12，000 rpm,離心10 min。棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一次后室溫晾干，加適量的TE或超純水溶解。
(2)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的鑒定
以抽提的 DNA 為模板，使用引物 CsMADS23-Fl:GGATCCATGAATATTGCAGCC CTTCT 和CsMADS23-Rl:TCTAGATTTGGCTGAATAGGCTGAAC 擴(kuò)增 CsMADS23 片段，PCR 的 25 μ 1 體系為:PCR 緩沖液(10Χ) 2.5 μ 1, Taq 0.5 μ 1、cDNA 模板 2 μ 1、10mM dNTP 0.5μ1、10μΜCsMADS23-Fl引物1μ 1、10μΜ CsMADS23-Rl引物1 μ 1、使用無菌水補(bǔ)足25 μ 1。反應(yīng)條件為:94°C 5min, 35 個(gè)循環(huán)，94°C變性 30s, 55°C退火 30s, 72°C延伸 60s, 72°C反應(yīng) lOmin。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。抽提陽性植株花蕾的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA第一鏈，以CsMADS23_Fl和CsMADS23-Rl為引物進(jìn)行RT-PCR分析，反應(yīng)體系和程序同上。內(nèi)參為CsACTIN基因，弓丨物序列為:CsACTIN-F: GACATTCAATGTGCCTGCTATG, CsACTIN-R: CATACCGATGAGAGATGGCTG,PCR 的 25 μ 1 體系為:PCR 緩沖液(10 X ) 2.5 μ 1、Taq (λ 5 μ 1、cDNA 模板 2 μ 1、10mM dNTP0.5 μ 1、10μΜ CsACTIN-F 引物 1 μ 1、10μΜ CsACTIN-R 引物 1 μ 1、使用無菌水補(bǔ)足 25 μ 1。反應(yīng)條件為:94°C 5min，26個(gè)循環(huán)，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，72°C反應(yīng)lOmin。檢測(cè)結(jié)果見圖3所示。
[0034](3)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型分析
通過PCR和RT-PCR的結(jié)果，對(duì)獲得的陽性植物進(jìn)行觀察，檢測(cè)結(jié)果見圖4所示獲得的CsMADS23轉(zhuǎn)基因植株的果莢明顯增多，尤其是頂部果莢(圖5)。
【權(quán)利要求】
1.黃瓜CsMADS23基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N01所示。
2.—種黃瓜CsMADS23過表達(dá)載體，其特征在于，所述植物表達(dá)載體為PHB_CsMADS23，其含有黃瓜CsMADS23基因，黃瓜CsMADS23基因的上游連有雙35S啟動(dòng)子。
3.一種黃瓜CsMADS23過表達(dá)載體，其特征在于，由下述方法構(gòu)建而成: 根據(jù)CuGI上登錄號(hào)為Csa011135的CsMADS23序列設(shè)計(jì)兩端引物，其中MADS23-F引物引入了 BamHI 位點(diǎn)，MADS23-R 引物引入了 Xbal 位點(diǎn):MADS23_F:5’ -aaaaGGATCCATGGGAAGAGGGAAAATAG-3’，CsMADS23-R:5’ -aaaaTCTAGATTATTCCCTTTCTTGTAGAITTG-3’ ；以黃瓜花蕾的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CsMADS23全長(zhǎng)； 回收CsMADS23的cDNA全長(zhǎng)，將其連接到pMD18載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD18-CsMADS23 ； (3)使用 BamHI 和 Xbal酶切 pMD18_CsMADS23，回收 CsMADS23 片段，同時(shí)用 BamH I 和Xbal酶切PHB，回收后連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得植物表達(dá)載體PHB-CsMADS23。
4.如權(quán)利要求1所述黃瓜CsMADS23基因的應(yīng)用，其特征在于，黃瓜CsMADS23基因?qū)胫参铩?br> 5.如權(quán)利要求3所述黃瓜CsMADS23過表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，將獲得的植物表達(dá)載體PHB-CsMADS23轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，再轉(zhuǎn)入到擬南芥中，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR，RT-PCR驗(yàn)證后進(jìn)行植株的表型分析，獲得的CsMADS23轉(zhuǎn)基因植株。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK104480116SQ201410659394
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】胡麗芳, 劉世強(qiáng), 賀浩華, 楊寅桂, 蔣倫偉, 王義華 申請(qǐng)人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)