一種檢測(cè)大鼠支氣管敗血波氏桿菌的試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)大鼠支氣管敗血波氏桿菌的試劑盒，以及一種檢測(cè)大鼠支氣管敗血波氏桿菌的熒光定量PCR方法。該方法通過收集大鼠支氣管敗血波氏桿菌的基因組數(shù)據(jù)，對(duì)基因組中的細(xì)菌的特異性功能基因設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行熒光定量PCR診斷，根據(jù)片段大小及退火溫度等因素來判斷試驗(yàn)結(jié)果。該試劑盒提供的快速檢測(cè)技術(shù)無需要進(jìn)行微生物培養(yǎng)、擴(kuò)增與檢測(cè)同步進(jìn)行，具有操作簡便、快速、特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)，可以替代一直沿用的分離培養(yǎng)的傳統(tǒng)診斷方法，并適用于在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢質(zhì)量控制中推廣使用。
【專利說明】[0001] 一種檢測(cè)大鼠支氣管敗血波氏桿菌的試劑盒及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)大鼠支氣管敗血波氏桿菌的方法，尤其涉及一種檢測(cè)大鼠支 氣管敗血波氏桿菌的熒光定量PCR試劑盒及方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 早在二十世紀(jì)初人們就發(fā)現(xiàn)支氣管敗血波氏桿菌是廣泛感染家畜、野生動(dòng)物和實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物上皮呼吸道病原菌，能引起諸如豬、馬、貓、狗、兔、小鼠、豚鼠和雪貂、刺猬、狐貍等哺 乳動(dòng)物的呼吸道疾病。，但相關(guān)研究工作卻僅僅局限于同屬的百日咳波氏桿菌，或者是將支 氣管敗血波氏桿菌與百日咳波氏桿菌、副百日咳波氏桿菌進(jìn)行比較性研究。近年來，隨著人 們對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群中呼吸道疾病的病原學(xué)研究，特別是發(fā)現(xiàn)在免疫功能降低的動(dòng)物中分離到 支氣管敗血波氏桿菌，使得人們開始關(guān)注這種廣泛存生引起呼吸道隱性感染或是急、慢性 炎癥的病原菌--支氣管敗血波氏桿菌。研究人員先后從豚鼠、猴子和人的呼吸道中分離 出特征相一致的病原菌。系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，波氏桿菌基因組長度5. 3Mb，理論基因數(shù)達(dá)5000多 個(gè)，已知的基因數(shù)也達(dá)到2399個(gè)，除大家熟悉的粘附素、百日咳桿菌粘附素、菌毛腺苷環(huán)化 酶溶血素、氣管細(xì)胞毒素、皮膚壞死毒素III型分泌系統(tǒng)等外，支氣管敗血波氏桿菌特有的 基因大約有40余個(gè)?？蓮母腥緞?dòng)物的中耳炎性產(chǎn)物、生殖道、腹腔臟器、膿腫中可以出分離 本菌，充分說明本菌廣泛分布于感染機(jī)體的各臟器。由于支氣管敗血波氏桿菌是一種鼻腔 常在菌，從機(jī)體中根除是不大可能的，越來越多的證據(jù)表明支氣管敗血波氏桿菌和其他病 原體之間有協(xié)同作用，這樣的協(xié)同作用可增高呼吸道疾病的發(fā)病率并增加其嚴(yán)重程度，對(duì) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康和使用造成巨大影響。
[0004] 根據(jù)GB14926-2001，GB18448-2001對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量檢測(cè)采用的方法基本是直 接分離培養(yǎng)病原菌，或用ELISA (酶聯(lián)免疫)，IEA (免疫酶)、IFA (免疫熒光)、HAI (血凝抑 制)、HI (血凝)、IH (免疫組化法)等間接檢測(cè)方法[1]。傳統(tǒng)的方法雖然可靠，但檢測(cè)靈敏度 低，耗時(shí)長，往往需要幾天甚至幾周的時(shí)間才能獲得結(jié)果，且微生物的表型會(huì)易受環(huán)境的影 響，從而給鑒定帶來困難，通常一次只能檢測(cè)一類或少數(shù)幾類病原，且都要分?jǐn)U增（培養(yǎng)）與 檢測(cè)二個(gè)階段進(jìn)行，快速檢測(cè)的技術(shù)已成為我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)的瓶頸。近年利用熒光 定量PCR已成為快速檢測(cè)的重要手段，熒光定量PCR反應(yīng)的主要工作原理是，在反應(yīng)體系加 入過量的SYBR熒光染料，SYBR熒光染料可以特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而 不摻入鏈中的SYBR染料分子不發(fā)射熒光產(chǎn)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完 全同步。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] -種檢測(cè)大鼠支氣管敗血波氏桿菌的試劑盒，包括lOXTaqman PCR緩沖液、 50 ii mol ? I71的上游引物BVF的水溶液、50umol ? I71的下游引物BVR的水溶液、dNTP mixture、25mmol ? r1的MgCl2水溶液、5U ? r1的Taq DNA聚合酶水溶液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板、 20XSYRB Green熒光染料和無菌雙蒸水；所述上游引物BVF的序列如SEQ ID NO. 1所示， 下游引物BVR的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為支氣管敗血波氏桿菌DNA。 [0006] -種檢測(cè)大鼠支氣管敗血波氏桿菌的方法，該方法為用上述試劑盒對(duì)大鼠支氣管 敗血波氏桿菌進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。
[0007] 進(jìn)一步地，所述熒光定量PCR檢測(cè)方法的反應(yīng)體系為：2 ii L的10 X Taqman PCR緩 沖液；1 U L濃度為50 y mol噸4的上游引物BVF的水溶液；1 y L濃度為50umol噸4的下游 引物BVR的水溶液；0. 6 y L的dNTP mixture ; 1. 6 y L溶度為25mmol ? L 1的MgCl2水溶液； 0. 20 ii L濃度為5U噸4的Taq DNA聚合酶水溶液；1 ii L標(biāo)準(zhǔn)陽性模板或待測(cè)樣品；0. 4 ii L 的20X SYRB Green熒光染料；其余為無菌雙蒸水，體系的總體積為20 y L ;所述PCR反應(yīng) 程序如下：95°C變性5min，94°C預(yù)變性30s，60°C退火30s，72°C度延伸45s，循環(huán)35次，最后 72°C度延伸5min。
[0008] 與現(xiàn)存的技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：傳統(tǒng)的方法雖然可靠，但檢測(cè)靈敏度 低，耗時(shí)長，往往需要幾天甚至幾周的時(shí)間才能獲得結(jié)果，且微生物的表型會(huì)易受環(huán)境的影 響，從而給鑒定帶來困難，通常一次只能檢測(cè)一類或少數(shù)幾類病原，且都要分?jǐn)U增（培養(yǎng)）與 檢測(cè)二個(gè)階段進(jìn)行，本試劑盒提供的快速檢測(cè)技術(shù)無需要進(jìn)行微生物培養(yǎng)、擴(kuò)增與檢測(cè)同 步進(jìn)行，具有操作簡便、快速、特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)，可以替代一直沿用的分離培養(yǎng)的 傳統(tǒng)診斷方法，并適用于在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢質(zhì)量控制中推廣使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1為將本發(fā)明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)陽性模板梯度稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增所得的 動(dòng)力曲線圖，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表相對(duì)熒光強(qiáng)度，平行于橫坐標(biāo)的直線代表閾 值。
[0010] 圖2為將本發(fā)明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)陽性模板梯度稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增所得的 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，橫坐標(biāo)代表熒光閾值，縱坐標(biāo)代表不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的濃度。
[0011] 圖3為具體實(shí)施例中所述熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的融角曲線圖，橫坐標(biāo)代表融解 溫度，縱坐標(biāo)代表相對(duì)熒光強(qiáng)度，特異性波氏桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物的融解溫度是86度左右。
[0012] 圖4為利用本方法對(duì)陽性動(dòng)物樣品擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線 圖5為利用本方法對(duì)陽性動(dòng)物樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性產(chǎn)物的融解曲線，從圖中可以看 出，擴(kuò)增產(chǎn)物的只有一個(gè)主要產(chǎn)物，融解溫度86攝氏度。
[0013]

【具體實(shí)施方式】： 下面以實(shí)例來說明具體操作實(shí)施的方法。
[0014] ( 1)待檢樣品的準(zhǔn)備 按標(biāo)準(zhǔn)程序采集動(dòng)物的呼吸道分泌物，動(dòng)物麻醉，無菌操作解剖暴露氣管，將無菌接種 針插入氣管內(nèi)，由下朝上到達(dá)咽部輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)幾下，將粘有氣管分泌物的接種針在200 i! L生 理鹽水中充分振蕩，棄去吸頭，將洗脫液在98 °C中水浴5min備用。
[0015] (2)反應(yīng)物配制 lOXTaqman PCR緩沖液、50 ii mol ? I/1的上游引物BVF的水溶液、50umol ? I71的下游 引物BVR的水溶液、dNTP mixture、25mmol ? L 1的MgCl2水溶液、5U ? L 1的Taq DNA聚合酶 水溶液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板、20XSYRBGreen熒光染料和無菌雙蒸水；所述上游引物BVF的序列 如SEQIDNO. 1所示，下游引物BVR的序列如SEQIDNO. 2所示；所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為支氣 管敗血波氏桿菌DNA。
[0016] (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線及模板初始濃度的計(jì)算 將標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋（如1〇2、1〇3、1〇4、1〇 5、1〇6、1〇7)，形成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn) 模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，以減少誤差。得到不同稀釋倍數(shù)的動(dòng)力曲線圖， 如圖1所示。
[0017]PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2iiL的lOXTaqman PCR緩沖液；liiL濃度為50iimol七1 的上游引物BVF的水溶液；1 y L濃度為50umol ? I71的下游引物BVR的水溶液；0. 6 y L的 dNTP mixture ;1. 6 ii L 溶度為 25mmol .I71 的 MgCl2 水溶液；0? 20 ii L 濃度為 5U .I71 的 Taq DNA聚合酶水溶液；1 y L稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板；0. 4 y L的20 X SYRB Green熒光染料；其 余為無菌雙蒸水，體系的總體積為20 y L ;所述PCR反應(yīng)程序如下：95°C變性5min，94°C預(yù) 變性30s，60°C退火30s，72°C度延伸45s，循環(huán)35次，最后72°C度延伸5min。
[0018] 根據(jù)圖1中的熒光閾值和不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的濃度，得到稀釋倍數(shù)的對(duì) 數(shù)值和Ct值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系式Ct=-3. 362Xlog(x)+34. 78,R2=0. 984,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和 所得的C(t)值計(jì)算起始模板的濃度，其中x表示細(xì)菌濃度，如圖2所示。根據(jù)標(biāo)擴(kuò)增曲線 和標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，當(dāng)Ct值為11. 0-29. 0時(shí)呈陽性，也就細(xì)菌濃度大于5(Tl07CFU/mL時(shí) 擴(kuò)增結(jié)果才有意義。
[0019] 按步驟1準(zhǔn)備的動(dòng)物樣品，對(duì)36份細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)的陽性動(dòng)物樣品在本發(fā)明的 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，體系為：2iiL的lOXTaqman PCR緩沖液；liiL濃度為 50 y mol ? I71的上游引物BVF的水溶液；1 y L濃度為50umol ? I/1的下游引物BVR的水溶 液；0? 6 y L 的 dNTP mixture ; 1. 6 y L 溶度為 25mmol *L 1 的 MgCl2 水溶液；0? 20 y L 濃度為 5U .L-1的Taq DNA聚合酶水溶液；1 ii L待測(cè)樣品；0. 4 ii L的20 X SYRB Green熒光染料；其 余為無菌雙蒸水，體系的總體積為20 y L ;所述PCR反應(yīng)程序如下：95°C變性5min，94°C預(yù) 變性30s，60°C退火30s，72°C度延伸45s，循環(huán)35次，最后72°C度延伸5min。
[0020] 結(jié)果見表1，根據(jù)上述判斷標(biāo)準(zhǔn)，共檢出支氣管波氏桿菌33份，診斷敏感性約為 91%，檢出限達(dá)到SOCFU.mL'部分樣品的擴(kuò)增曲線見圖4,陽性產(chǎn)物的融解曲線見圖5,從圖 中可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物的只有一個(gè)主要產(chǎn)物，融解溫度86度。
[0021] 表1利用本方法對(duì)36份陽性動(dòng)物樣品的擴(kuò)增結(jié)果.

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)大鼠支氣管敗血波氏桿菌的試劑盒，其特征在于，包括lOXTaqman PCR緩 沖液、50 ii mol ? I71的上游引物BVF的水溶液、50umol ? I71的下游引物BVR的水溶液、dNTP mixture、25mmol ? I71的MgCl2水溶液、5U ? I71的Taq DNA聚合酶水溶液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板、 20XSYRB Green熒光染料和無菌雙蒸水；所述上游引物BVF的序列如SEQ ID NO. 1所示， 下游引物BVR的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為支氣管敗血波氏桿菌DNA。
2. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)大鼠支氣管敗血波氏桿菌的方法，其特征在 于，使用所述試劑盒對(duì)大鼠支氣管敗血波氏桿菌進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為： 2 ii L的10 X Taqman PCR緩沖液；1 ii L濃度為50 ii mol七1的上游引物BVF的水溶液；1 ii L 濃度為50umol ? I71的下游引物BVR的水溶液；0. 6 y L的dNTP mixture ;1. 6 y L溶度為 25mmol ? I71的MgCl2水溶液；0. 20 ii L濃度為5U ? I71的Taq DNA聚合酶水溶液；1 ii L標(biāo) 準(zhǔn)陽性模板或待測(cè)樣品；〇. 4 y L的20 XSYRB Green熒光染料；其余為無菌雙蒸水，體系的 總體積為20ii L ;所述PCR反應(yīng)程序如下：95°C變性5min，94°C預(yù)變性30s，60°C退火30s， 72°C度延伸45s，循環(huán)35次，最后72°C度延伸5min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104450894SQ201410672181
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月22日
【發(fā)明者】吳舊生 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)