一種水稻源抗蟲相關(guān)基因OsHR1及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻源抗蟲相關(guān)基因 OsHR1 及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用。 OsHR1 具有SEQIDNo.1的DNA序列，長度為1019bp；該基因的完整編碼框由SEQIDNo.1中第81-875位的核苷酸組成，編碼264個(gè)氨基酸殘基的小分子量蛋白。研究發(fā)現(xiàn) OsHR1 與水稻的抗蟲性密切相關(guān)，該基因的表達(dá)產(chǎn)物能增強(qiáng)水稻對二化螟和褐飛虱的抗性。本發(fā)明將在作物育種，特別是在水稻抗蟲育種中得到廣泛應(yīng)用。
【專利說明】 一種水稻源抗蟲相關(guān)基因OsHRI及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種水稻源抗蟲相關(guān)基因OsHRl及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國乃至世界重要的糧食作物，其生產(chǎn)的豐欠盈余直接關(guān)系到我國的糧食安全。進(jìn)入本世紀(jì)以來，水稻害蟲，特別是稻飛虱的日益猖獗，對我國的水稻生產(chǎn)造成了極大破壞。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2005年浙江省褐飛風(fēng)lugens, brownplant hopper, BPH)發(fā)生量在每畝30萬頭以上的占水稻總種植面積的86%，每畝在100萬頭以上的占42%,最聞田塊發(fā)生量達(dá)到每由1000萬頭以上,造成直接廣量損失120萬噸。而另一水稻“勁敵二化螟(suppressalis, striped stem borer, SSB),近幾年的發(fā)生面積及危害程度也日益加大，輕時(shí)造成減產(chǎn)約5-10%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)35-40%，甚至絕收。截至目前，農(nóng)藥防治仍是控制稻田有害生物最為常用的手段之一。然而，事實(shí)證明，農(nóng)藥的大量使用非但沒有有效地遏制害蟲危害，反而引發(fā)了更為嚴(yán)重的環(huán)境污染，并且加速了害蟲的抗藥性演變。因此，發(fā)掘水稻抗蟲相關(guān)基因，培育抗性水稻品種成為我國有害生物可持續(xù)治理的迫切需求；另一方面，水稻基因組測序的完成及功能基因組研究的推進(jìn)，以及遺傳學(xué)、功能基因組學(xué)、反向遺傳學(xué)等相關(guān)技術(shù)的日益完善，特別是植物誘導(dǎo)抗性研究領(lǐng)域取得的突破性進(jìn)展，為加速水稻抗性品種的培育提供了有力的理論與技術(shù)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種水稻源抗蟲相關(guān)基因OsHRl及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種水稻源抗蟲相關(guān)基因fls/SV，具有SEQ ID N0.1的DNA序列。
[0005]一種抗蟲相關(guān)基因編碼的蛋白，它包含SEQ ID N0.2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID N0.2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與SEQ ID N0.2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID N0.2衍生的蛋白質(zhì)。
[0006]一種水稻源抗蟲相關(guān)基因OsHRl在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0007]一種水稻源抗蟲相關(guān)基因OsHRl在作物育種中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的有益效果是，利用抑制消減雜交(SSH)并結(jié)合RACE和RT-PCR技術(shù)，克隆得到了 OsHRl基因；利用熒光定量PCR (QPCR)明確了 OsHRl基因在二化螟和褐飛虱為害后的表達(dá)情況；通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了 OsHRl基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻植株，并進(jìn)一步揭示了 OsHRl基因在水稻防御二化螟和褐飛虱中的重要作用。該基因的分離克隆，對于抗蟲水稻品種的培育，具有十分重要的促進(jìn)作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是OsHRl基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。1_2泳道為1019 bp的OsHRl基因片段。
[0010]圖2是二化螟(SSB)和褐飛虱(BPH)為害后OsHRl基因的表達(dá)情況(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤，n=5)。Con:對照；Non_infested,水稻莖桿套入空玻璃罩；星號表示處理與對照間存在顯著差異(*，P〈 0.05; **，P〈 0.01,學(xué)生氏?-檢驗(yàn))。
[0011]圖3是OsHRl基因的過量表達(dá)轉(zhuǎn)化載體示意圖。
[0012]圖4是轉(zhuǎn)基因品系和野生型植株(WT)的DNA印跡分析?；蚪MDNA分別用EcoRI化)和油<3 I (X)酶切，以^浴基因片段作為探針進(jìn)行檢測。
[0013]圖5是轉(zhuǎn)基因品系和野生型植株中OsHRl基因的表達(dá)量(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤，η=5)。星號表示轉(zhuǎn)基因品系與WT存在顯著差異(**，Ρ〈 0.01,學(xué)生氏?-檢驗(yàn))。
[0014]圖6是轉(zhuǎn)基因品系增強(qiáng)了水稻對SSB的抗性。SSB幼蟲取食轉(zhuǎn)基因品系及WT 12d后的生長量(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤，n=60);星號表示轉(zhuǎn)基因品系與WT存在顯著差異(**，P〈0.01,學(xué)生氏?-檢驗(yàn))。
[0015]圖7是轉(zhuǎn)基因品系降低了褐飛虱雌成蟲的取食和產(chǎn)卵嗜好性。褐飛虱懷卵雌成蟲在轉(zhuǎn)基因品系及WT上的取食頭數(shù)和產(chǎn)卵率(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤，η=10);星號表示轉(zhuǎn)基因品系與WT存在顯著差異(*，Ρ〈 0.05; #，Ρ〈 0.01,學(xué)生氏?-檢驗(yàn))。

【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明利用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)，獲得了 OsHRl基因的部分片段，進(jìn)一步通過RACE和RT-PCR技術(shù)，克隆得到了包含5’和3’非編碼區(qū)的AsMV基因全長片段；利用熒光定量PCR (QPCR)技術(shù)，證實(shí)了二化螟和褐飛虱為害均能誘導(dǎo)OsHRl基因表達(dá)；通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了 OsHRl過量表達(dá)的水稻突變體植株；生物學(xué)測定結(jié)果表明過表達(dá)《sMV能夠增強(qiáng)水稻對二化螟和褐飛虱的抗性。綜上所述，基因的分離克隆及生物學(xué)功能分析，對于作物的抗蟲育種，特別是水稻抗蟲育種將具有重要的促進(jìn)作用。
[0017]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下:
(I)OsHRl基因的分離及克隆。利用抑制消減雜交(SSH)方法構(gòu)建了 SSB為害后水稻差異表達(dá)基因文庫，從中分離獲得了 OsHRl基因的部分片段；利用5’ -RACE和3’ -RACE，分別擴(kuò)增得到了該基因5’端和3’端的片段，通過DNAStar軟件拼接得到含有5’和3’非編碼區(qū)的OsHRl的全長序列；進(jìn)一步地，以二化螟為害后的水稻莖桿cDNA為模板，重新設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到OsHRl基因。
[0018](2) OsHRl基因的表達(dá)特征分析。分別對水稻進(jìn)行二化螟和褐飛虱為害處理，剪取二化螟為害后的莖桿和褐飛虱為害后的葉鞘，以及相應(yīng)的對照植株莖桿(葉鞘)進(jìn)行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ;利用QPCR技術(shù)，以水稻OsACTIN為內(nèi)參基因，測定OsHRl基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況。
[0019](3) OsHRl過表達(dá)水稻突變體的獲得。將OsHRl的全長ORF插入到pCAMBIA1301的35S啟動(dòng)子后，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了 OsHRl過表達(dá)的突變體水稻，并進(jìn)一步結(jié)合GUS染色、Southern blot及QPCR分析，最終篩選得到了 2個(gè)單拷貝插入的T2代純合品系HRl-1和 HR1-2。
[0020](4) OsHRl基因的生物學(xué)功能研究。二化螟生長量測定:將二化螟初孵幼蟲分別接入野生型和突變體水稻中進(jìn)行取食，12 d后剝出進(jìn)行稱重；褐飛虱雌成蟲取食和產(chǎn)卵選擇性測定:在小塑料杯中分別放入I株野生型和I株突變體水稻，2株水稻莖桿基部固定一個(gè)圓筒形玻璃罩，在玻璃罩內(nèi)接入15頭褐飛虱懷卵雌成蟲，觀察并記錄兩株苗的著蟲數(shù)，48h后統(tǒng)計(jì)每株苗上的產(chǎn)卵量。
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0022]實(shí)施例1、OsHRl基因的克隆和序列分析 (I)水稻莖桿總RNA的提取及cDNA合成
稱取10mg研磨后的水稻莖桿(經(jīng)SSB為害),利用SV Total RNA Isolat1n System(Promega)提取總RNA并進(jìn)行濃度及純度檢測；1 μ g總RNA用于cDNA合成(PrimeScript ?RT-PCR Kit, TaKaRa)，具體操作參照產(chǎn)品說明書。
[0023](2 ) OsHRl 基因克隆
以上述cDNA為模板，擴(kuò)增含5’和3’非編碼區(qū)的fls/SV片段，反應(yīng)體系及程序參照PrimeSTAR? HS DNA Polymerase (TaKaRa)說明書。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后(圖1 )，利用AxyPrep ? DNA Gel Extract1n Kit (Axygen)進(jìn)行回收純化；純化后的片段連入 pMD19_T載體(TaKaRa)并轉(zhuǎn)入大腸桿菌TGl細(xì)胞；挑選陽性克隆保存、測序。引物序列如下:HRl-Fl (SEQ ID N0.3):5’-ACGATGGAGATGGTGCTG-3’
HRl-Rl (SEQ ID N0.4):5’-TCAGGGATCGAAAGAGGC-3’
(3)OsMl基因序列分析
測序結(jié)果見SEQ ID N0.1。根據(jù)該序列的開放閱讀框(0RF)，推算出該基因編碼蛋白的氨基酸序列，見SEQ ID N0.2。
[0024]實(shí)施例2、二化螟和褐飛虱為害后的OsHRl表達(dá)特征分析
(I)二化螟處理:將I頭3齡SSB幼蟲接入水稻莖桿基部，待SSB鉆蛀后開始計(jì)時(shí)，取食后0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h剪取為害部位2_3 cm的莖桿，立即浸入液氮，-80°C保存?zhèn)溆茫灰晕唇尤隨SB的健康水稻莖桿作為對照。
[0025](2)褐飛風(fēng)處理:在水稻的莖桿基部固定一個(gè)圓筒形玻璃罩(直徑4 cm,高8 cm,筒壁均勻分布48個(gè)直徑為0.8 mm的透氣小孔)，玻璃罩內(nèi)接入15頭BPH懷卵雌成蟲，頂部以海綿密封；處理后0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h剪取為害部位的外層葉鞘，立即浸入液氮，_80°C保存?zhèn)溆?；以套入空玻璃罩的健康水稻葉鞘作為對照。
[0026](3) QPCR 分析:RNA 提取 cDNA 合成方法同前。QPCR 使用 SsoFast? probessupermix 試劑盒(B1-RAD)，以水稻 6MC77}V基因(TIGR ID:0s03g50885)作為內(nèi)參基因，通過CFX96? Real-Time system (B1-RAD)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測；反應(yīng)體系及程序參照產(chǎn)品說明書。引物及探針信息如下:
HRl-F (SEQ ID N0.5):5’ -GGCATGGATGCGCTCGGCTT-3’
HRl-R (SEQ ID N0.6):5’ -ATGACTACAGCAAGAGGTGGT-3’
HRl-P (SEQ ID N0.7):5’ -GAGGCCTCCATAGGTACCCCATGG-3’
ACT-F (SEQ ID N0.8):5’ -TGGACAGGTTATCACCATTGGT-3’
ACT -R (SEQ ID N0.9):5’ -CCGCAGCTTCCATTCCTATG-3’
ACT-P (SEQ ID N0.10):5’ -CGTTTCCGCTGCCCTGAGGTCC-3’
如圖2所示，二化螟取食能夠迅速誘導(dǎo)OsHRl基因表達(dá)，其中為害I h后表達(dá)量達(dá)到最高；褐飛虱為害4 h后OsHRl顯著上調(diào)，且隨著為害時(shí)間的延長表達(dá)量持續(xù)增加。
[0027]實(shí)施例3、OsHRl基因過表達(dá)水稻品系的獲得
(1)載體構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物HR1-F3和HR1-R3擴(kuò)增OsHRl的ORF片段，產(chǎn)物經(jīng)Cla I和BamH I雙酶切后，插入表達(dá)載體PCAMBIA1301的CaMV35S啟動(dòng)子后(圖3)，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株中保存、測序。引物信息如下:
HR1-F3 (SEQ ID N0.11):5’ -CCATCGATATGACTATAGAACTTCTT-3，
HR1-R3 (SEQ ID N0.12):5，-CGGGATCCTCACGGCGAGGCCGCTG-3，
(2)植物轉(zhuǎn)化
水稻種子去殼消毒后，置于NBD培養(yǎng)基中，280C，避光培養(yǎng)；10 d后，剝離生成的愈傷組織，與上述農(nóng)桿菌置于NBDC上進(jìn)行共培養(yǎng)；3 d后，洗去多余農(nóng)桿菌，將共侵染后的愈傷放在含有潮霉素的NBDS培養(yǎng)基上篩選；約28 d后，將新生成的抗性愈傷從母體上剝離，經(jīng)GUS染色鑒定后，轉(zhuǎn)入MS-RG培養(yǎng)基中進(jìn)行分化，30°C，光照14 h;分化幼苗長至8_10 cm后(約25 d)，切去基部愈傷，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS-RT中，30°C，光照14 h，培養(yǎng)15 d ;洗去培養(yǎng)基，煉苗3 d后，移入土中栽培，所得植株即為Ttl代突變體。
[0028](3)純合子篩選及鑒定
Ttl代自交產(chǎn)生的種子催芽7 d后，剪取根尖進(jìn)行GUS染色，選擇分離比接近3:1的品系，同時(shí)提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，陽性植株初步判斷為T1代單拷貝插入突變體。T1代自交產(chǎn)生的T2代種子同樣進(jìn)行⑶S染色和PCR鑒定，全部為陽性的即為純合突變體；利用QPCR分析純合品系中fts/SV的表達(dá)水平；同時(shí)利用Southern_blot(DIG DNA Labeling andDetect1n Starter Kit II，Roche)方法，以 0.7 kb 的 G浴基因片段(NCB1: AF234297)作為探針，檢測純合品系中的插入拷貝數(shù)，具體操作依照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。最終篩選得到了2個(gè)單拷貝插入的T2代純合品系HRl-1和HR1-2 (圖4，圖5)。
[0029]實(shí)施例4、OsHRl轉(zhuǎn)基因品系的抗蟲功能研究
(I)二化螟生長量測定
每株水稻接入3頭SSB初孵幼蟲，生長12 d后，剝出SSB幼蟲稱重。每品系重復(fù)20次(60頭蟲)。結(jié)果顯示，與WT相比，取食HRl-1和HR1-2的SSB幼蟲生長量則減少了 50%左右(圖6)。
[0030](2)褐飛虱雌成蟲取食選擇性及產(chǎn)卵選擇性測定
在小塑料杯中分別放入I株野生型和I株突變體水稻，苗間距I Cm，2株水稻莖桿基部固定一個(gè)圓筒形玻璃罩，在玻璃罩內(nèi)接入15頭褐飛虱懷卵雌成蟲后，頂部以海綿密封；接蟲后觀察并記錄兩株苗的著蟲數(shù)；48 h后，去除所有褐飛虱，統(tǒng)計(jì)每株苗上的產(chǎn)卵量；本試驗(yàn)重復(fù)10次。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)基因品系相比，BPH雌成蟲更喜歡WT上取食和產(chǎn)卵:HR1-1和HR1-2的產(chǎn)卵率僅為WT的41.5%和7.1% (圖7)。
【權(quán)利要求】
1.一種水稻源抗蟲相關(guān)基因也貓7，其特征在于，具有SEQ ID N0.1的DNA序列。
2.—種權(quán)利要求1所述的抗蟲相關(guān)基因編碼的蛋白，其特征在于，它可以包含SEQ IDN0.2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID N0.2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與SEQ ID N0.2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ IDN0.2衍生的蛋白質(zhì)。
3.一種權(quán)利要求1所述水稻源抗蟲相關(guān)基因OsHRl在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
4.一種權(quán)利要求1所述水稻源抗蟲相關(guān)基因OsHRl在作物育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/29GK104450739SQ201410672184
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月22日
【發(fā)明者】呂靜, 周書行, 鞠紅平, 婁永根 申請人:浙江大學(xué)