一種發(fā)酵菠蘿汁的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，包括：將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基胍誘變，然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，并在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌；將干酪乳桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌；將篩選出的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌共發(fā)酵菠蘿汁，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的菠蘿汁。本發(fā)明得到的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的菠蘿汁中，吡咯喹啉醌含量達(dá)到55-93ng/mL，納豆激酶活力達(dá)到420-765U/mL。
【專利說(shuō)明】一種發(fā)酵菠蘿汁的制作方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工程與發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵菠蘿汁的制作方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 納豆由大豆經(jīng)納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)發(fā)酵而成，具有多重生理功效：
[0003] ①納豆對(duì)心血管系統(tǒng)的作用：納豆中一種標(biāo)志性生理活性物質(zhì)納豆激酶 (Nattokinase，NK)是能夠溶解血栓的蛋白質(zhì)，由275個(gè)氨基酸殘基組成，分子量27KD左右， 無(wú)毒、無(wú)副作用，是一種絲氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超過(guò)溶栓制劑尿激酶。納豆激酶除 具有直接溶栓作用外，還具有促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活劑的能力，從而 間接表現(xiàn)其溶栓活性。納豆中亞油酸占全脂質(zhì)的50%，亞油酸能夠降低血漿中膽固醇含量， 有預(yù)防動(dòng)脈硬化、心臟病和高血壓的功效，具有血栓溶解作用；
[0004] ②納豆對(duì)消化系統(tǒng)的作用：大豆蛋白質(zhì)經(jīng)納豆酶的作用轉(zhuǎn)化成可溶性多肽和氨 基酸，有利于人體吸收。Ig納豆中含有10億個(gè)以上納豆菌，納豆菌繁殖快，能消耗腸道中 的氧，可以抑制引起腸內(nèi)異常發(fā)酵的痢疾桿菌等腐敗菌，促進(jìn)乳酸菌繁殖，調(diào)節(jié)腸內(nèi)細(xì)菌平 衡，預(yù)防痢疾、腸炎和便秘等。大豆經(jīng)過(guò)納豆菌發(fā)酵蓄積了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯 酶、纖維素酶和脲酶等酶群，這些生物酶在消化系統(tǒng)中能夠有效調(diào)理促進(jìn)消化吸收。納豆芽 孢桿菌在通過(guò)分解利用大豆蛋白進(jìn)行繁殖的過(guò)程中，可以產(chǎn)生大量酵素、維生素、多聚谷氨 酸和多聚果糖等粘性物質(zhì)，其被覆在胃腸粘膜表面起到保護(hù)作用，飲酒時(shí)可緩解酒醉。納豆 菌還能殺死腸道出血性大腸桿菌；
[0005] ③納豆對(duì)免疫系統(tǒng)的作用：通過(guò)接種納豆菌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納豆可以提高機(jī)體 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，還可以誘發(fā)機(jī)體干擾素生成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；納豆中含有 活性物質(zhì)如皂草甙、維生素B2、維生素E等，每天食用可除去體內(nèi)致癌物質(zhì)，預(yù)防癌癥發(fā)生， 并可軟化血管，促進(jìn)肌膚光滑；
[0006] ④促進(jìn)骨骼發(fā)育：維生素K2可促進(jìn)鈣與蛋白質(zhì)結(jié)合從而促進(jìn)骨骼形成，在骨骼形 成過(guò)程中起著重要作用，而納豆中維生素K2含量是其他發(fā)酵食品的數(shù)百倍，有預(yù)防骨質(zhì)疏 松、腰痛等老年病的功效。
[0007] 近年發(fā)現(xiàn)納豆還具有其它更豐富廣泛的生理功效，源于其另一種標(biāo)志性生理活性 物質(zhì)-批咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ)，它是繼黃素核苷酸和煙酰胺核苷 酸之后在細(xì)菌脫氫酶中發(fā)現(xiàn)的第三種輔基，化學(xué)名稱為4, 5-二氫-4, 5-二氧化-1-氫吡咯 (2, 3f)醌-2, 7, 9-三羧酸，又名Methaxatin。雖然自然條件下僅少數(shù)細(xì)菌如Methylovorus、 Deinococcus radiodurans>Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等會(huì)泛夠合成 PQQ，但在各種植物、動(dòng)物以及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)含有微量PQQ。日本科學(xué)家測(cè)定了 26種常見(jiàn)食 物中的PQQ含量，發(fā)現(xiàn)1克食物中PQQ含量在3. 65-61納克不等，例如，蔬菜中的歐芹、青椒， 水果中的奇異果、木瓜，飲品中的綠茶、烏龍茶，以及人們常吃的豆腐。值得注意的是，日本 傳統(tǒng)食物納豆當(dāng)中PQQ含量最高，達(dá)到61納克/克。
[0008] PQQ作為一種普遍存在于動(dòng)物和植物組織中的氧化還原酶輔基，雖然含量非常低， 但作用重要，不僅是一種新發(fā)現(xiàn)的線粒體呼吸鏈組分，參與催化生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，還 具有非常多樣的生物活性，缺乏時(shí)會(huì)引起哺乳動(dòng)物諸多代謝障礙，被認(rèn)為是一種新型維生 素。PQQ對(duì)哺乳動(dòng)物的主要生理作用有：
[0009] ①全面提高人體免疫功能：PQQ作為人類發(fā)育的必要因子，能刺激人體細(xì)胞生長(zhǎng)， 尤其是激活人體B細(xì)胞、T細(xì)胞，提高人體免疫功能；
[0010] ②防治肝損傷：PQQ能顯著降低血清膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，調(diào)理肝損傷，對(duì)肝 臟疾病有極好療效；
[0011] ③減少自由基對(duì)人體的傷害：PQQ是一種氧化還原酶輔基，參與生物體內(nèi)氧化還 原反應(yīng)，能有效清除體內(nèi)自由基，減少自由基對(duì)人體傷害所引發(fā)的各種疾病，如心臟病、癌 癥以及各類炎癥；
[0012] ④調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病：PQQ在體內(nèi)能促進(jìn)神經(jīng)因子合成，調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng) 疾??；
[0013] ⑤促進(jìn)氨基酸吸收：PQQ是醌蛋白酶的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，在人體內(nèi)能促 進(jìn)氨基酸吸收；
[0014] ⑥促進(jìn)生長(zhǎng)因子合成：生長(zhǎng)因子是人類生長(zhǎng)的激素，PQQ能刺激人體細(xì)胞生長(zhǎng)，增 加細(xì)胞密度，微量PQQ就能提高生物體組織的代謝能力和生長(zhǎng)機(jī)能；
[0015] ⑦防治老年癡呆癥：PQQ具有修復(fù)神經(jīng)纖維、活化神經(jīng)元、激活休眠神經(jīng)細(xì)胞的能 力，能有效防治老年癡呆癥和改善記憶力；
[0016] ⑧促進(jìn)谷胱甘肽合成：谷胱甘肽具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 進(jìn)機(jī)體谷胱甘肽合成，防止白內(nèi)障發(fā)生和肝臟膽紅素積累；
[0017] ⑨極強(qiáng)的抗癌功能：PQQ激活自然殺傷細(xì)胞（NK)細(xì)胞為ANK細(xì)胞，使其具有殺腫 瘤作用；使NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集，更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞；封閉腫瘤細(xì)胞載鐵蛋白受體， 阻斷其功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移；破壞腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)雙層，使腫瘤細(xì)胞溶解死亡；阻止腫 瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，促其凋亡。
[0018] 在天然食品中，納豆獨(dú)有NK，并且PQQ含量最豐富。納豆中的NK和PQQ由納豆芽 孢桿菌產(chǎn)生。納豆是日常健康食品，納豆芽孢桿菌是公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物（GRAS微生 物），對(duì)納豆芽孢桿菌進(jìn)行定向選育，然后與乳酸菌共發(fā)酵，制備富含NK和PQQ的食品，對(duì)于 人們?cè)谌粘ｏ嬍持醒a(bǔ)充NK和PQQ、充分發(fā)揮NK和PQQ的生理調(diào)理作用具有重要意義。 [0019] 菠蘿果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量果糖、葡萄糖、VB、Vc、磷、檸檬酸和蛋白酶 等物質(zhì)。每100克菠蘿含水分87. 1克，蛋白質(zhì)0.5克，脂肪0. 1克，纖維1.2克，尼克酸0. 1 毫克，鉀126毫克，鈉1. 2毫克，鋅0. 08毫克，碳水化合物8. 5克，鈣20毫克，磷6毫克，鐵 0. 2暈克，胡蘿卜素0. 08暈克，硫胺素0. 03暈克，核黃素0. 02暈克，維生素C8?30暈克， 灰分〇. 3克，另含多種有機(jī)酸及菠蘿酶等。
[0020] 菠蘿性平、味甘、微酸、微潘、性微寒，具有清暑解渴、消食止瀉、補(bǔ)脾胃、固元?dú)?、?氣血、消食、祛濕、養(yǎng)顏瘦身等功效，為夏令醫(yī)食兼優(yōu)的時(shí)令佳果；菠蘿含有一種叫"菠蘿朊 酶"的物質(zhì)，能分解蛋白質(zhì)，幫助消化，溶解阻塞于組織中的纖維蛋白和血凝塊，改善局部的 血液循環(huán)，稀釋血脂，消除炎癥和水腫，能夠促進(jìn)血循環(huán)，尤其是過(guò)食肉類及油膩食物之后， 吃些菠蘿更為適宜，可以預(yù)防脂肪沉積；菠蘿有一定利尿作用，對(duì)腎炎和高血壓者有益；菠 蘿對(duì)支氣管炎有輔助療效；菠蘿富含纖維素，對(duì)便秘治療有一定療效，當(dāng)出現(xiàn)消化不良時(shí)， 吃點(diǎn)菠蘿能開胃順氣、解油膩，起到助消化作用；菠蘿富含維生素B1，能促進(jìn)新陳代謝，消 除疲勞感；菠蘿汁有降溫作用，并能有效預(yù)防支氣管炎。菠蘿汁保留了菠蘿的營(yíng)養(yǎng)成分。菠 蘿汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，將進(jìn)一步形成乳酸菌素、活性脂肪酸、以乳酸為主的有機(jī)酸等諸多食 療物質(zhì)。
[0021] 乳酸菌發(fā)酵除能產(chǎn)生諸多食療成分外，還能賦予怡人的甜酸口感。納豆芽孢桿菌 發(fā)酵則能產(chǎn)生NK和PQQ。本發(fā)明通過(guò)選育納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌及其共發(fā)酵，開發(fā)出 富含NK和PQQ的食療發(fā)酵菠蘿汁。但如果干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌在同一體系中生長(zhǎng)不 平衡會(huì)導(dǎo)致一種菌在競(jìng)爭(zhēng)中排斥另一種，共發(fā)酵無(wú)法順利進(jìn)行。關(guān)于生理特性，即使在野生 狀態(tài)下，乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少數(shù)菌株具有且活力不高，分解蛋白質(zhì)獲得必需氨 基酸的能力不足，而納豆芽孢桿菌具有較強(qiáng)蛋白酶活力，其分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和肽可 滿足乳酸菌對(duì)氨基酸的需求。納豆芽孢桿菌兼性厭氧，通過(guò)消耗氧氣也促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)和 產(chǎn)酸。在本發(fā)明中，除了納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌兩者之間存在不嚴(yán)格偏利共生關(guān)系外， 更通過(guò)選育手段使干酪乳桿菌因形成甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（Met-)而與納豆芽孢桿菌形成嚴(yán) 格偏利共生關(guān)系，從而保證了干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌的共發(fā)酵順利進(jìn)行。
[0022] 納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的代謝途徑迄今尚未完全明了，從而無(wú)法通過(guò)理性優(yōu) 化手段提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率。而且由于糖、氨基酸、脂類、核苷酸四大有 機(jī)物代謝之間的相通和密切關(guān)聯(lián)，使得微生物細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)既顯示出剛性（Rigidity)又 顯示出柔性（Plasticity)，處于嚴(yán)格控制之中，剛性表現(xiàn)為牽一發(fā)而動(dòng)全身，從而在許多情 形下，即使明了代謝途徑，定點(diǎn)理性突變也并不能獲得理想表型，而柔性表現(xiàn)為對(duì)整個(gè)代謝 網(wǎng)絡(luò)中處于不同節(jié)點(diǎn)但又相關(guān)的途徑進(jìn)行協(xié)同突變后，會(huì)表現(xiàn)出新的代謝屬性。欲提高納 豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率，不明了其代謝途徑并不成為不可逾越的障礙，只要有合 適的非理性優(yōu)化手段（Unrational optimization technique),對(duì)所有可能與NK和PQQ合 成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變,并通過(guò)高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié) 同突變的表型從突變庫(kù)中凸顯，即可實(shí)現(xiàn)提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ產(chǎn)率的目標(biāo)。
[0023] 隨機(jī)突變是最常見(jiàn)的非理性優(yōu)化手段，雖然它能夠產(chǎn)生突變位點(diǎn)數(shù)量足夠大的突 變庫(kù)，但在突變庫(kù)中，各突變位點(diǎn)往往是分散獨(dú)立于單個(gè)細(xì)胞中，相互之間無(wú)法優(yōu)化組合， 而且大多不產(chǎn)生可見(jiàn)表型，從而使得絕大多數(shù)突變隱沒(méi)于突變庫(kù)中而不能得到篩選。
[0024] 基因組重排（Genome Shuffling)是在隨機(jī)突變的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型誘變育 種技術(shù)。它是在通過(guò)隨機(jī)突變產(chǎn)生突變位點(diǎn)數(shù)量足夠大的突變庫(kù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò) 細(xì)胞融合使各突變位點(diǎn)優(yōu)化組合，從而使突變指數(shù)級(jí)上升特別是增加大量表型可見(jiàn)突變。 基因組重排為利用微生物代謝網(wǎng)絡(luò)這種柔性進(jìn)行多點(diǎn)協(xié)同突變的菌種選育提供了技術(shù)支 撐。Zhang等（2002)首先以傳統(tǒng)誘變方法獲得一個(gè)突變庫(kù)，篩選出若干個(gè)正向突變株作為 出發(fā)株，然后通過(guò)多輪遞推原生質(zhì)體融合的方式使眾多基因隨機(jī)重組，實(shí)現(xiàn)基因組重排，最 終從突變庫(kù)中篩選出性狀被提升的目的菌株；St印hanopoulos (2002)通過(guò)基因組重排改 造了細(xì)菌表型；Patnaik等（2002)利用基因組產(chǎn)品技術(shù)實(shí)現(xiàn)了乳酸桿菌的一株工業(yè)菌株 的改良，令其在pH 4.0下乳酸產(chǎn)量為出發(fā)野生菌株的3倍；Gao等（2012)通過(guò)兩輪基因 組重排，使 Clostridium acetobutylicum CICC 8012 產(chǎn) Acetone-Butanol-Ethanol (ABE) 提高了 34.53% ;Ge 等（2012)通過(guò)基因組重排獲得 Saccharomyces cerevisiae GS3-10， 其對(duì)五碳糖和六碳糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到69. 48 %和100%，而出發(fā)菌株為14. 83 %和100%， 乙醇產(chǎn)率達(dá)到47.08g/L，而出發(fā)菌株為18. 12g/L;Kang等（2011)通過(guò)基因組重排，使 Aureobasidium pullulans產(chǎn)普魯藍(lán)多糖大幅度提高，并且遺傳穩(wěn)定；Zheng等（2010)通 過(guò)基因組重排提高了 Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538的D-乳酸產(chǎn)率和耐 酸性John等（2008)通過(guò)原生質(zhì)體融合式的基因組重排，獲得了以木薯-甘蔗渣為基質(zhì) 的乳酸商廣菌株；Yu等（2008)通過(guò)基因組重排獲得了糖耐度提商從而乳酸廣率增加的 Lactobacillus rhamnosus ;Wang等（2007)通過(guò)基因組重排獲得了耐酸度提高從而乳酸產(chǎn) 率增加的 Lactobacillus rhamnosus。
[0025] 基因組重排也為進(jìn)行微生物代謝組學(xué)分析提供了支撐。經(jīng)過(guò)基因組重排而代謝 優(yōu)化的目的菌其遺傳背景來(lái)源于出發(fā)菌，故通過(guò)比對(duì)目的菌與出發(fā)菌的蛋白表達(dá)譜差異， 輔以代謝流和代謝控制分析技術(shù)，即可解析導(dǎo)致代謝優(yōu)化的關(guān)鍵酶及有關(guān)途徑的調(diào)控機(jī) 制。Luo 等（2012)通過(guò)基因組重排使 Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的游霉素 (natamycin)產(chǎn)率明顯升高，Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的蛋白表達(dá)譜發(fā)生 明顯改變，34種蛋白表達(dá)上升而20種蛋白表達(dá)下降，提示與游霉素合成有關(guān)的牽涉廣泛的 代謝網(wǎng)絡(luò)得到優(yōu)化；Zhang等（2010)通過(guò)基因組重排，使Propionibacterium shermanii產(chǎn) Vb12大幅度提高，重排后菌株38種蛋白表達(dá)發(fā)生改變，其中22種蛋白表達(dá)上升而16種蛋白 表達(dá)下降，在表達(dá)上升的22種蛋白中，有6種是Vb12合成途徑中的酶，提示與Vb12合成有關(guān) 的牽涉廣泛的代謝網(wǎng)絡(luò)得到優(yōu)化。
[0026] 但目前基因組重排在策略上存在一定缺陷，主要是選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間 無(wú)關(guān)聯(lián)，使得選育到的菌株在發(fā)酵時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率遠(yuǎn)低于預(yù)期。針對(duì)此問(wèn)題，本發(fā)明在進(jìn)行 基因組重排選育時(shí)，選育平板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分，而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一 定比例的選育平板組分，使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高 產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時(shí)依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略。因此， 在對(duì)納豆芽孢桿菌高產(chǎn)NK兼PQQ表型進(jìn)行基因組重排選育時(shí)，在選育平板中添加一定比例 菠蘿汁，而在菠蘿汁發(fā)酵時(shí)則添加一定比例豆芽汁。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0027] 本發(fā)明提供了一種發(fā)酵菠蘿汁的制作方法。本發(fā)明在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一 步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，對(duì)納豆芽孢桿菌所有可能與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支 途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而通過(guò)高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié)同突變的表型從突 變庫(kù)中凸顯，獲得能夠在菠蘿汁發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-505。 同時(shí)，通過(guò)隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（Me〇干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota-Mef，LcS-MeO。LcS-Mef 在生長(zhǎng)速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-505,但前者對(duì)后者 營(yíng)養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā)酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的 菠蘿汁。
[0028] -種發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，包括以下步驟：
[0029] 1)、將產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進(jìn)行亞硝基 胍誘變；然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽 孢桿菌 BN-NKPQQ-RWX-505 ;
[0030] 細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽孢桿菌10261和10623所有誘變后 代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合。如有必要，可對(duì)融合后代進(jìn)行第二輪或者多輪誘變及融合，直 至選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生長(zhǎng)旺盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ納豆 芽孢桿菌。
[0031] 2)、將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選 出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Meif (Lactobacillus casei Shirota-Met-)；
[0032] 3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-505和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵菠蘿汁，得 至IJ富含NK和PQQ的菠蘿汁，得到的富含NK和PQQ的菠蘿汁即為發(fā)酵菠蘿汁。
[0033] 本發(fā)明在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，對(duì)納豆芽孢桿 菌所有可能與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而 通過(guò)高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié)同突變的表型從突變庫(kù)中凸顯，獲得能夠在菠蘿汁發(fā)酵中高產(chǎn) NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-505。同時(shí)，通過(guò)隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷 (Met )干釀乳桿菌LcS-Met。
[0034] 欲使干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌順利共發(fā)酵，兩者之間應(yīng)形成共生關(guān)系。本發(fā) 明的策略是使通常情況下競(jìng)爭(zhēng)占優(yōu)的干酪乳桿菌成為甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（LcS-MeO，從 而在代謝上對(duì)納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-505形成依賴，其所需要的甲硫氨酸（Met) 由納豆芽孢桿菌供給，即形成嚴(yán)格的偏利共生關(guān)系。雖然LcS-Mef在生長(zhǎng)速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-505,但前者對(duì)后者營(yíng)養(yǎng)依賴，兩菌之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā)酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的菠蘿汁。
[0035] 所用納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級(jí)安全微生物，共發(fā)酵得到的富含NK 和PQQ的菠蘿汁中，PQQ含量達(dá)到55-93ng/mL。NK活力達(dá)到420-765U/mL。所獲得的菠蘿 汁富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有菠蘿汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0036] 步驟1)中，納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆芽孢 桿菌10261來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中 路24號(hào)院6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10261 ;納豆芽孢桿菌10263來(lái)自中 國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓； 保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10263;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota) 來(lái)自養(yǎng)樂(lè)多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購(gòu)自嘉興元科 生物科技有限公司，商品號(hào)為YK-Ab-013。
[0037] 所述的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性基因組重排后的高通量篩選具體包括：①制備2個(gè)平板豆 芽汁菠蘿汁固體培養(yǎng)基（菠蘿汁占平板總量的10% -15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基 之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗 PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿 菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计渲幸粋€(gè)平板后，再用纖維素膜影印 至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠?周圍形成肉眼可見(jiàn)沉淀線，根據(jù)沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大??；④平板B中，高 產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低； ⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的 納豆芽孢桿菌。
[0038] 所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-505保藏于斜面豆芽汁菠 蘿汁固體培養(yǎng)基中。
[0039] 所述的平板豆芽汁菠蘿汁固體培養(yǎng)基和斜面豆芽汁菠蘿汁固體培養(yǎng)基以IL計(jì)， 由以下量的組分組成：
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 、將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進(jìn) 行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，高通量篩選得到高產(chǎn)納 豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-505 ; 2) 、將干酪乳桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌， 命名為干酪乳桿菌LcS-Met_ ; 3) 將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-505和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵菠蘿汁，得到富 含納豆激酶和吡咯喹啉醌的菠蘿汁。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，其特征在于，步驟1)中，所述的高 通量篩選具體包括：①制備2個(gè)平板豆芽汁菠蘿汁固體培養(yǎng)基，其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG 單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽 孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计渲幸粋€(gè)平板后，再用纖維素膜 影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌的誘變 融合后代菌落周圍形成肉眼可見(jiàn)沉淀圈，根據(jù)沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)吡咯喹啉醌量 大??；④平板B中，高產(chǎn)納豆激酶的誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明圈直徑大 小可肉眼判斷產(chǎn)納豆激酶活力高低；⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌菌落與高產(chǎn)納豆 激酶菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，其特征在于，步驟1)中，所述的平板 豆芽汁菠蘿汁固體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成：
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，其特征在于，步驟2)中，所述的從中 篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：①制備2個(gè)平板MRS固體培養(yǎng)基，其 中一個(gè)將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個(gè)為單純MRS固體培養(yǎng)基平板，為平板D ;②將誘變 后的干酪乳桿菌涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板C和平板D 互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或 平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，其特征在于，步驟2)中，所述的平板 MRS固體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成：
該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，其特征在于，步驟3)中，在共發(fā)酵之 前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-505和干酪乳桿菌LcS-Met_分別進(jìn)行活化培養(yǎng)，納豆芽 孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-505在豆芽汁菠蘿汁液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34? 36°C，干酪乳桿菌LcS-Met_在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36?38°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，其特征在于，步驟3)中，所述的豆芽 汁菠蘿汁液體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成： 菠蘿汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. Og ; 豆芽汁余量； 所述的MRS液體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成：

該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，其特征在于，步驟3)中，將納豆芽孢 桿菌BN-NKPQQ-RWX-505和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵菠蘿汁，具體包括：將活化后的納豆 芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-505和干酪乳桿菌LcS-Met_混合，形成混合菌液，將混合菌液接種 至含菠蘿汁的發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的菠蘿汁。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，其特征在于，步驟3)中，所述的含菠 蘿汁的發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成：
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菠蘿汁的制作方法，其特征在于，步驟3)中，所述的菠 蘿汁的制備包括：水中加菠蘿果肉，碾磨成漿汁。
【文檔編號(hào)】A23L2/04GK104382155SQ201410751741
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】阮子琦, 張哲滔, 莫凡, 鄧惟, 吳淵 申請(qǐng)人:杭州元佩特生物科技有限公司