一種纖維素酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種纖維素酶突變體及其應(yīng)用。該纖維素酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO：3，最適作用溫度為65℃，在70℃條件下能保持96％的酶活，在80℃條件下，仍能保持48％以上的酶活；而野生型的最適作用溫度為60℃，在70℃時(shí)僅能保持51％的酶活，在80℃條件下，僅剩11％的酶活。本發(fā)明的纖維素酶突變體的最適作用pH為5.5，且在pH4.5-8.0范圍內(nèi)均能保持60％以上的酶活水平，而野生型僅在pH4.5-7.0范圍內(nèi)維持60％以上的酶活，至pH8.0時(shí)，酶活降為30％，從而說(shuō)明本發(fā)明提供的纖維素酶突變體在堿性條件下的適用范圍更加寬泛，比野生型更適合應(yīng)用于紡織工業(yè)領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】一種纖維素酶突變體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種纖維素酶突變體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶是由多種水解酶組成的一個(gè)復(fù)雜酶系，主要來(lái)源于真菌和細(xì)菌，如絲狀 真菌Trichoderma reesei等可大量合成和分泌胞外纖維素酶。其中根據(jù)其催化反應(yīng)的功 能不同，主要分為：外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶，纖維素酶對(duì)纖 維素的降解，是在多種酶組分的協(xié)同作用下完成的。纖維素酶是在工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的酶 之一，一般應(yīng)用于紡織工業(yè)、去污劑工業(yè)、紙漿和造紙工業(yè)、飼料和食品工業(yè)、在采油、醫(yī)藥 等方面也有巨大的潛在市場(chǎng)。
[0003] 纖維素酶可以按照其一級(jí)序列分類成各種糖基水解酶家族，這得到了家族一些成 員的三維結(jié)構(gòu)分析的支持（Henrissat 1991，Henrissat和Bairoch 1993,1996)。例如，糖 基水解酶家族5、7、12和45含有內(nèi)切葡聚糖酶。大多數(shù)紡織用酸性纖維素酶屬于家族5,而 大多數(shù)紡織用中性纖維素酶為家族12或45。
[0004] 目前，利用纖維素酶對(duì)纖維素織物進(jìn)行生物整理即酶降解整理，由于其環(huán)保、節(jié)能 和高效的效果而得到廣泛應(yīng)用?？椢锝?jīng)整理蓬松、豐滿、柔軟、滑爽、布面清晰、懸垂性好、吸 濕性強(qiáng)，并具有一定的"絲光"效果，纖維素酶的用量在0. 5%-3%，即可達(dá)到滿意的整理 效果。酸性纖維素酶在處理纖維織物時(shí)，在較短的時(shí)間內(nèi)就產(chǎn)生有效的化學(xué)磨損效果，但它 對(duì)織物的剝蝕作用強(qiáng)，返沾染效果差，中性纖維素酶對(duì)織物的剝蝕作用比酸性纖維素酶弱， 需要較長(zhǎng)的作用時(shí)間，但沾色較少，處理后可獲得更加豐滿的手感，因此在紡織工業(yè)應(yīng)用廣 泛，需求更為迫切，為了降低成本，節(jié)約能源，急需提高纖維素酶在中性偏堿性條件下的酶 活力水平。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種纖維素酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)對(duì)纖維素酶進(jìn) 行蛋白質(zhì)工程改造，獲得了突變體蛋白，在堿性條件下的酶活力得到顯著提高，且耐熱性更 強(qiáng)，更適合應(yīng)用于紡織工業(yè)領(lǐng)域。
[0006] 本發(fā)明一方面提供了一種纖維素酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID N0 :1的纖維 素酶第10位氨基酸由Cys變?yōu)門rp，第29位氨基酸由Ala變?yōu)锳rg，第61位氨基酸由Thr 變?yōu)镾er，第141位氨基酸由Asp變?yōu)長(zhǎng)ys，第216位氨基酸由Val變?yōu)镠is。
[0007] 上述纖維素酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :3,其一種編碼基因的核酸序列 為 SEQ ID N0 :4。
[0008] 本發(fā)明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :3的纖維素酶突變體基因的 質(zhì)粒。
[0009] 將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入里氏木霉中進(jìn)行重組表達(dá)。
[0010] 本發(fā)明還提供了上述纖維素酶突變體在紡織領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明所述纖維素酶突變體的最適作用溫度為65°c，在70°C條件下能保持96% 的酶活，在80°C條件下，仍能保持48%以上的酶活；而野生型的最適作用溫度為60°C，在 70°C時(shí)僅能保持51 %的酶活，在80°C條件下，僅剩11 %的酶活；從而說(shuō)明纖維素酶突變體 的耐熱性明顯高于野生型。所述纖維素酶突變體的最適作用pH為5. 5,且在pH4. 5-8. 0范 圍內(nèi)均能保持60%以上的酶活水平，而野生型僅在pH4. 5-7. 0范圍內(nèi)維持60%以上的酶 活，至pH8. 0時(shí)，酶活降為30%，從而說(shuō)明本發(fā)明提供的纖維素酶突變體在堿性條件下的適 用范圍更加寬泛，比野生型更適合應(yīng)用于紡織工業(yè)領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，
[0013] 其中M所示為蛋白Marker ;泳道1所示為里氏木霉工程菌McE發(fā)酵上清液中蛋白 表達(dá)情況；泳道2所示為里氏木霉工程菌McE5發(fā)酵上清液中蛋白表達(dá)情況；泳道3所示為 宿主菌里氏木霉SCHD4發(fā)酵上清液中蛋白表達(dá)情況；箭頭所指處為分子量為48KDa的蛋白 條帶；
[0014] 圖2為纖維素酶突變體與野生型相對(duì)酶活-溫度曲線圖；
[0015] 圖3為纖維素酶突變體與野生型相對(duì)酶活-pH曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如 MOLECULARCL0NING:ALABORATORYMANUAL, 3ndEd. (Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn) 提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是本發(fā)明不限定于所述的任何具體方法、實(shí) 驗(yàn)方案和試劑。
[0017] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0018] 實(shí)施例1 :纖維素酶突變體基因的合成
[0019] 為了提高纖維素酶（野生型氨基酸序列為SEQIDN0:1，編碼核苷酸序列為SEQ IDN0 :2,由上海生工生物工程股份有限公司合成）在中性偏堿性條件下的酶活力，通過(guò)定 向進(jìn)化技術(shù)對(duì)該酶進(jìn)行了大量突變的篩選，設(shè)計(jì)PCR引物McE-Fl、McE-Rl如下：
[0020] McE-Fl:GGCGAATTCGCCAGCTGCTCCTCCGTCTA(下劃線為限制件內(nèi)切酶 EcoRI 識(shí)別位 點(diǎn)）
[0021] McE-Rl:ATAGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGATACCAG(下劃線為限制件內(nèi)切酶 Notl 識(shí) 別位點(diǎn)）
[0022] 以SEQ ID N0:2基因?yàn)槟０澹陨鲜鲆镉肎eneMorph II隨機(jī)突變PCR試劑盒 (Stratagene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoRI、Notl進(jìn)行酶切處理后與經(jīng)同樣酶 切后的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培 養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個(gè)挑至96孔板，每個(gè)孔中加入150iiL含有0. ImM IPTG的 LB+Amp培養(yǎng)基，37°C 220rpm培養(yǎng)6h左右，離心棄上清，菌體用緩沖液重懸，反復(fù)凍融破壁， 獲得含有纖維素酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。
[0023]分別取出50 ii L裂解液至兩塊新的96孔板，分別在pH 6. 0和pH 8. 0的條件下測(cè) 定其纖維素酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有些突變子在堿性條件的酶活力沒(méi)有變化，有些突變甚至使其 堿性耐受性降低了，對(duì)在pH 8. 0條件下依然保持高活性的突變子進(jìn)行DNA測(cè)序，最終獲得 了能顯著提高纖維素酶堿性耐受性的突變位點(diǎn)組合C10W、A29R、T61S、D141K和V216H。
[0024] 含C10W、A29R、T61S、D141K和V216H五點(diǎn)突變的纖維素酶突變體，其氨基酸序列 為SEQ ID N0 :3,編碼核苷酸序列為SEQ ID N0 :4, SEQ ID N0 :4由上海生工生物工程股份 有限公司合成完成，并且在合成序列5'和3'兩端分別加上Kpnl和Xbal兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0025] 合成后的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Xbal (Fermentas)進(jìn)行酶切；同時(shí)，用限制 性內(nèi)切酶Kpnl和Xbal對(duì)載體pTG進(jìn)行酶切；凝膠回收目的基因片段和載體；并用T4DNA連 接酶將上述兩片段連接，轉(zhuǎn)化Trans5 a大腸桿菌，用氨芐青霉素進(jìn)行篩選。為確保準(zhǔn)確，對(duì) 若干克隆進(jìn)行測(cè)序（Invitrogen)。
[0026] 使用質(zhì)粒中量制備試劑盒（Axygen)從測(cè)序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì) 粒，纖維素酶重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pTG_McE5。
[0027] 實(shí)施例2 :纖維素酶突變體木霉重組菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證
[0028] (1)原生質(zhì)體制備
[0029] 取纖維素酶基因缺陷型的宿主菌里氏木霉SCHD4孢子懸液，接種于PDA平板上， 30°〇培養(yǎng)6天；待其產(chǎn)孢豐富后，切取約1〇1^1〇11的菌落置于含1201^￥￡6+以0.5%酵母 粉、1%葡萄糖、0. 1%尿苷）的液體培養(yǎng)基中，30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)14?16h;
[0030] 用無(wú)菌紗布過(guò)濾收集菌絲體，并用無(wú)菌水清洗一次；將菌絲體置于含有20mL 10mg/mL裂解酶液（Sigma L1412)的三角瓶中，30°C，90rpm作用l-2h;用顯微鏡觀察檢測(cè) 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化進(jìn)展；
[0031] 將預(yù)冷的20mL 1. 2M山梨醇（1. 2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)加入上述 三角瓶中，輕輕搖勻，用無(wú)菌Miracloth濾布過(guò)濾收集濾液，3000rpm，4°C離心10min ;棄上 清，加入預(yù)冷的5mL 1. 2M山梨醇溶液懸浮菌體，3000rpm，4°C離心10min ;棄上清，加入適量 預(yù)冷的1. 2M山梨醇懸浮分裝（200 ii L/管，原生質(zhì)體濃度為108個(gè)/mL)。
[0032] (2)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化與菌株驗(yàn)證
[0033] 以下操作均在冰上進(jìn)行，取10 U g重組質(zhì)粒加入到含有200 ii L原生質(zhì)體溶液的 無(wú)菌 7mL 離心管中，然后加入 50iiL 25%PEG(25%PEG，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)，輕彈 管底混勻，冰上放置20min ;加入2mL 25% PEG，混勻后室溫放置5min ;加入4mL 1. 2M山 梨醇，輕輕混勻后倒入熔化并保持在55°C的上層培養(yǎng)基中（0. 1 % MgS04, 1 % KH2P04, 0. 6% (NH4)2S04, 1%葡萄糖，18. 3%山梨醇，0. 35%瓊脂糖）；輕輕混勻后鋪在制備好的下層培養(yǎng) 基平板上（2%葡萄糖，0.5%(順4)2504，1.5%腿 2卩04,0.06%]\%504,0.06%〇3(：12，1.5%瓊 脂），30°C培養(yǎng)5?7d至有轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。
[0034] 挑取轉(zhuǎn)化子至下層培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)2d;取適量菌絲體置于2mL離心管中，力口 入 100mg無(wú)菌石英砂和 400ii L抽提緩沖液（100mM Tris-HCl, 100mM EDTA, 250mM NaCl, 1% SDS);用珠打儀劇烈振蕩2min ;65°C水浴20min后，加入200 ii L 10M NH4AC，冰浴lOmin ; 13000rpm離心lOmin ;取上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20°C放置30min ;13000rpm離心 10min，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加水溶解，于-20°C保存。
[0035] 以上述提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，利用引物McE-F和McE-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增目 的基因進(jìn)行驗(yàn)證。
[0036] McE-F：GCCAGCTGCTCCTCCGTCTA
[0037] McE-R ：CTACAGGCACTGATGATACCAG ；
[0038] PCR 擴(kuò)增條件為 94°C 4min ;94°C 40s ;58°C 40s，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min， 16°C;利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序分析，構(gòu)建得到了含纖維素酶突變 體基因的里氏木霉工程菌，將其命名為里氏木霉McE5(Trichoderma reesei McE5)。
[0039] 采用上述同樣的方法構(gòu)建得到重組表達(dá)野生型纖維素酶的里氏木霉工程菌，命名 為里氏木霉McE(TrichodermareeseiMcE)。
[0040] 實(shí)施例3發(fā)酵驗(yàn)證和酶活檢測(cè)
[0041] 將上述里氏木霉工程菌McE與里氏木霉工程菌McE5接種于PDA平板，30°C培養(yǎng) 6d，待孢子豐富后，取兩塊直徑lcm的菌絲塊接種于含有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角 瓶中（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米漿，0.44%(順4)2504,0 . 09%]\%504,2%腿2?04， 0.04%0&(：1 2,0.018%吐溫-80,0.018%微量元素），301：培養(yǎng)48小時(shí)，然后251：培養(yǎng)48小 時(shí)，將發(fā)酵液離心，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，泳道1，2所述里氏 木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5發(fā)酵上清液在48KDa處均有一明顯蛋白條帶，與本 發(fā)明重組表達(dá)的纖維素酶的理論分子量大小一致，而泳道3所述宿主菌里氏木霉SCHD4發(fā) 酵上清液在48KDa處無(wú)明顯蛋白條帶，從而說(shuō)明本發(fā)明構(gòu)建得到的里氏木霉工程菌McE能 有效重組表達(dá)野生型纖維素酶，里氏木霉工程菌McE5能有效重組表達(dá)纖維素酶突變體。 [0042] (1)酶活測(cè)定方法
[0043] 在50°C、pH值為4. 8(中性為pH6. 0)的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的輕甲基 纖維素鈉溶液中降解釋放1 U mol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位U，還原糖以葡萄 糖等量。
[0044] 取三支試管各加入0. 5mL CMC底物，與待測(cè)酶液一起50°C水浴預(yù)熱5min。在第 一、二試管中各加入0. 5mL待測(cè)液，并計(jì)時(shí)，50°C水浴中反應(yīng)15min。反應(yīng)完后在三支試管 中各加入1. 5mLDNS試劑，并在第三支試管總補(bǔ)加0. 5mL的待測(cè)酶液。取出并搖勻三支試管 后，在沸水浴中反應(yīng)5min。迅速冷卻至室溫，用水定到5. OmL。以第三支試管試液為對(duì)照在 540nm波長(zhǎng)條件下測(cè)第一、二試管試液的吸光度，吸光度在0. 25-0. 35之間為宜。待測(cè)酶液 反應(yīng)液的吸光度與水平控制酶液反應(yīng)液吸光度之差的絕對(duì)值不超過(guò)0. 015。
[0045] 酶活X =(葡萄糖等量值/180/15/0. 5) X n
[0046] 其中：X-酶活力單位，IU/g(mL);
[0047] 180--葡萄糖從微克換算成微摩爾；
[0048] 15--待測(cè)液與底物的反應(yīng)時(shí)間；
[0049] 0. 5-加入反應(yīng)的待測(cè)酶液量；
[0050] n--稀釋倍數(shù)；
[0051] (2)酶活測(cè)定結(jié)果
[0052] 采用上述方法檢測(cè)上述發(fā)酵上清液的酶活，結(jié)果顯示：宿主菌里氏木霉SCHD4發(fā) 酵上清液中幾乎檢測(cè)不出纖維素酶酶活，重組表達(dá)野生型纖維素酶的里氏木霉工程菌McE 發(fā)酵上清液酶活為115U/mL，而重組表達(dá)纖維素酶突變體的里氏木霉工程菌McE5發(fā)酵上清 液酶活為140U/mL。酶活檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，本發(fā)明所選用的宿主菌本身不產(chǎn)纖維素酶， 而本發(fā)明構(gòu)建的里氏木霉工程菌McE能高效表達(dá)野生型纖維素酶，里氏木霉工程菌McE5能 高效表達(dá)纖維素酶突變體。
[0053] 實(shí)施例4酶學(xué)性質(zhì)分析
[0054] 1、最適作用溫度
[0055] 分別在 2(TC、3(TC、35t：、4(rC、45t：、5(rC、55t：、6(rC、65t：、7(rC、8(rC，pH6. 0 條 件下測(cè)定里氏木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5的發(fā)酵上清液酶活，以最高酶活為 100 %，計(jì)算相對(duì)酶活，做溫度-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明所述纖維素酶突變 體的最適作用溫度為65°C ;在70°C條件下能保持96%的纖維素酶酶活，在80°C條件下，仍 能保持48%以上的纖維素酶酶活；而野生型纖維素酶的最適作用溫度為60°C，在70°C時(shí)僅 能保持51 %的酶活，在80°C條件下，僅剩11 %的纖維素酶酶活。與野生型相比，本發(fā)明所述 纖維素酶突變體具有更高的耐熱性。
[0056] 2、最適作用pH值
[0057] 分別用 pH 值為 3. 0、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0 的緩沖液稀釋里氏 木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5的發(fā)酵上清液，在50°C條件下測(cè)定其酶活，以最高 酶活為1〇〇%，計(jì)算相對(duì)酶活，做pH-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果如圖3所示，纖維素酶突變體的 最適作用pH為5. 5,在pH4. 5-8. 0范圍內(nèi)，均能保持60%以上的酶活水平，且在pH6. 0-8. 0 范圍內(nèi)，酶活水平保持穩(wěn)定；而野生型纖維素酶的最適作用pH為6. 0,僅在pH4. 5-7. 0范圍 內(nèi)能維持60%以上的酶活，且在pH6. 0-8. 0范圍內(nèi)，酶活下降明顯，至pH8. 0時(shí)，酶活僅剩 30%。與野生型相比，本發(fā)明所述纖維素酶突變體在堿性條件下的適用范圍更加寬泛，具有 更大的應(yīng)用空間。
[0058] 綜上所述，本發(fā)明突變后的纖維素酶具有更強(qiáng)的耐熱性，且在堿性條件下的適用 范圍更加寬泛，因此更適合其在紡織工業(yè)中的應(yīng)用，前景廣闊。
【權(quán)利要求】
1. 一種纖維素酶，其特征在于，所述纖維素酶氨基酸序列為SEQ ID NO :3。
2. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求1所述的纖維素酶。
3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列為SEQ ID NO :4。
4. 一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒為攜帶有權(quán)利要求2所述的基因的質(zhì) 粒。
5. -種重組菌株，其特征在于，所述的重組菌株為轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求4所述的重組 質(zhì)粒的菌株。
6. 如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述的菌株為里氏木霉。
7. 權(quán)利要求1所述的纖維素酶在紡織領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK104450653SQ201410783788
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】張青, 李賓, 曹體爽, 董計(jì)巧, 唐波, 黃亦鈞, 王華明 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 濰坊康地恩生物科技有限公司