本發(fā)明屬于食品保健技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種增強(qiáng)免疫力的口服液及其制備方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，免疫是指機(jī)體識(shí)別自我與非我的作用，通過免疫應(yīng)答反應(yīng)來排斥非我的異物，以維護(hù)自身穩(wěn)定性的生物學(xué)功能。機(jī)體的免疫功能包括天然免疫(非特異性免疫)和獲得性免疫(特異性免疫)兩部分。特異性免疫又包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩類。這兩類特異性免疫功能相互協(xié)同、相互配合，在機(jī)體免疫功能中發(fā)揮著重要作用。

免疫一詞，在祖國醫(yī)籍中最早見于十八世紀(jì)的《免疫類方》一書，意思是免除“疫病”的危害。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“正氣”具有免疫系統(tǒng)的正常功能和結(jié)構(gòu)。而“正氣”與肺、脾、腎關(guān)系最為密切。肺主氣，司呼吸，通調(diào)營(yíng)衛(wèi)，護(hù)肌表；脾為后天之本，氣血生化之源；腎為先天之本，生命活動(dòng)的原動(dòng)力。中醫(yī)免疫學(xué)主要通過調(diào)節(jié)肺、脾、腎三臟的功能，來維持機(jī)體內(nèi)的陰陽平衡，從而使臟腑、經(jīng)絡(luò)、營(yíng)血、衛(wèi)氣保持正常的生理功能，使機(jī)體保持氣血平和，陰平陽秘的穩(wěn)定狀態(tài)。

現(xiàn)代社會(huì)，由于競(jìng)爭(zhēng)激烈，壓力增大，生活節(jié)奏越來越快，對(duì)于飲食，人們往往顧不上合理搭配，均衡營(yíng)養(yǎng)，造成免疫力下降。在面臨外界病毒流行的時(shí)期，此類人群最易受到感染。體弱多病人群的一大特征就是免疫力低，工作壓力大的上班族尤其明顯。這種生活狀態(tài)主要與學(xué)習(xí)、工作過于疲勞、精神壓力、職業(yè)應(yīng)激等誘因有關(guān)。通常從事研究工作的腦力勞動(dòng)者、商人等最易進(jìn)入這種狀態(tài)?，F(xiàn)代社會(huì)激烈競(jìng)爭(zhēng)、快節(jié)奏、高壓力，加重了人們的身心負(fù)擔(dān)；環(huán)境污染、不良的生活習(xí)慣和飲酒習(xí)慣等，從另一方面降低了人們的身體素質(zhì)，這些都是導(dǎo)致亞健康狀態(tài)出現(xiàn)的誘因。

“第三屆世界養(yǎng)生大會(huì)”新聞發(fā)布會(huì)上，世界衛(wèi)生組織將“生活方式病”及其前奏——“亞健康”，列為21世紀(jì)威脅人類的“頭號(hào)殺手”；而根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的健康標(biāo)準(zhǔn)，目前在中國只有15％的成年人是完全健康的，其他85％都是亞健康狀態(tài)人群。

國家體改委最近的一項(xiàng)調(diào)查顯示，我國知識(shí)分子的平均壽命只有58歲，而同期我國國民期望壽命將近75歲。另一項(xiàng)數(shù)據(jù)顯示，在北京，知識(shí)分子平均壽命從10年前的58～59歲降至53～54歲，比北京市民平均壽命78.5歲低了20多歲。由此不難看出，現(xiàn)代年輕上班族的健康狀況十分堪憂。

中年人的亞健康問題最為突出。尤其是城市中35歲以上的人群，他們的事業(yè)和家庭都處在重要的發(fā)展時(shí)期，肩負(fù)工作、生活雙重負(fù)荷，但生理功能開始下降，代謝異常，加上睡眠不足，生活不規(guī)律，缺少運(yùn)動(dòng)，極易出現(xiàn)慢性疲勞、情緒不穩(wěn)、記憶力減退和失眠、腰腿痛等亞健康癥狀。

綜上，隨著人們對(duì)增強(qiáng)免疫力保健食品消費(fèi)需求的增長(zhǎng)和對(duì)真菌類產(chǎn)品的進(jìn)一步了解，本產(chǎn)品市場(chǎng)需求會(huì)逐漸增多，市場(chǎng)前景廣闊。目前，國內(nèi)市場(chǎng)上的保健食品以增強(qiáng)免疫力功能為最多，保健食品主要有如下幾類：補(bǔ)益中藥類(如含人參、枸杞等產(chǎn)品)、營(yíng)養(yǎng)素類(如含維生素C、蛋白質(zhì)等產(chǎn)品)、其他類。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能夠增強(qiáng)免疫力的口服液。

本發(fā)明的另一目的是提供該口服液的制備方法。

為達(dá)到上述目的之一，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種增強(qiáng)免疫力的口服液，其原料包括以下重量份的組分：

蝙蝠蛾擬青霉菌粉 5～10份

靈芝 20～30份

香菇 15～25份。

進(jìn)一步地，其原料包括以下重量份的組分：

蝙蝠蛾擬青霉菌粉 8份

靈芝 25份

香菇 20份。

進(jìn)一步地，還包括0.5～1.5重量份瓊脂、5～15重量份蔗糖及0.1～0.2重量份檸檬酸。

進(jìn)一步地還包括1.05重量份瓊脂、9重量份蔗糖及0.15重量份檸檬酸。

一種制備權(quán)利要求3所述的口服液的方法，包括以下步驟：

S1、原料預(yù)處理：取靈芝、香菇，粉碎，過篩，備用；

S2、提取、過濾：按配方稱取蝙蝠蛾擬青霉菌粉、靈芝粉、香菇粉，加水提取，得濾液A：

S3、濃縮：濾液A減壓濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.08；

S4、靜置：濃縮液靜置冷藏；

S5、過濾：靜置后的濃縮液進(jìn)行過濾，得濾液B；

S6、調(diào)配：按配方稱取瓊脂、蔗糖和檸檬酸，將瓊脂中加入純化水，加熱至85～95℃，攪拌溶解，備用；取蔗糖制成糖漿；將瓊脂液和糖漿加入至濾液B中攪拌混合，再加入檸檬酸，加水調(diào)配，測(cè)定pH值；

S7、精濾：對(duì)上述料液進(jìn)行精濾；

S8、灌裝：口服液所用瓶體和瓶蓋洗凈后，瓶體經(jīng)滅菌，瓶蓋經(jīng)消毒，晾干，然后將調(diào)配好的料液灌裝。

進(jìn)一步地，所述步驟S2具體為：按配方稱取蝙蝠蛾擬青霉菌粉、靈芝粉、香菇粉，加10倍量水浸泡30min后，提取2h，過濾，濾液備用，濾渣中加入8倍量水提取1.5h，過濾，與第一次濾液合并，得濾液A。

進(jìn)一步地，所述灌裝的規(guī)格為30mL/支。

進(jìn)一步地，所述灌裝之后經(jīng)滅菌、燈檢、包裝、檢驗(yàn)入庫，得到產(chǎn)品。

進(jìn)一步地，所述步驟S1過20目篩；所述步驟S5濃縮液120目進(jìn)行過濾；所述步驟S7料液120目進(jìn)行精濾。

進(jìn)一步地，所述步驟S8中，瓶體經(jīng)165℃，90min干燥滅菌，瓶蓋經(jīng)75％乙醇浸泡30min。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明根據(jù)中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，選用蝙蝠蛾擬青霉菌粉、靈芝配伍香菇為原料，采用科學(xué)合理的生產(chǎn)工藝加工而成，達(dá)到增強(qiáng)免疫力的保健功能，產(chǎn)品功能明確，質(zhì)量可控，服用安全。本發(fā)明的配伍和用量都兼顧了產(chǎn)品的功能性和安全性，配方科學(xué)合理，無毒副作用，可長(zhǎng)期服用。本發(fā)明產(chǎn)品的推廣使用，將會(huì)改善免疫力低下人群的身體素質(zhì)，減少社會(huì)對(duì)免疫力低下導(dǎo)致的各類疾病的治療消費(fèi)，并有望推動(dòng)國內(nèi)真菌類產(chǎn)品的行業(yè)的發(fā)展，帶來良好的社會(huì)效益。

本發(fā)明采用了口服液型，制成口味獨(dú)特的產(chǎn)品，可滿足不同人群的需要?？诜菏侵杆幬锶芙庥谶m宜溶劑中制成供口服的液體制劑，是在以湯劑、糖漿劑為基礎(chǔ)，參照注射劑的生產(chǎn)工藝開發(fā)出的新劑型。已有十余年的生產(chǎn)歷史，它糾正了湯劑服用體積大、易污染等不足而保持了湯劑的用藥特色；口服液與固體制劑相比吸收快，作用迅速，療效好；采用單劑量包裝，故服用攜帶方便，劑量準(zhǔn)確；呈無菌或半無菌狀態(tài)密封于瓶中，貯存期長(zhǎng)，不易霉敗、變質(zhì)；與固體制劑相比，可降低易溶藥物的刺激性，避免因局部濃度過高對(duì)胃腸產(chǎn)生刺激作用；其服用量小，較適口，易被服用者所接收；由于口服液服用方便、外觀新穎，療效顯著等優(yōu)點(diǎn)，已成為保健食品劑型開發(fā)中深受重視的一種新劑型。

本發(fā)明以蝙蝠蛾擬青霉菌粉、靈芝與香菇為主要原料的口服液。蝙蝠蛾擬青霉菌粉和靈芝是我國傳統(tǒng)的滋補(bǔ)的中藥材。蝙蝠蛾擬青霉性味甘，平；歸肺、腎經(jīng)。有補(bǔ)腎益肺，止血化痰之功效。靈芝性味甘，平。歸心、肺、肝、腎經(jīng)。有補(bǔ)氣安神，止咳平喘之功效。用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食。香菇性味甘，平。歸肝，胃經(jīng)。有扶正補(bǔ)虛，健脾開胃，祛風(fēng)透疹，化痰理氣，解毒，抗癌之功效。三者同用能從多方面增強(qiáng)整個(gè)機(jī)體的免疫。蝙蝠蛾擬青霉菌粉、靈芝與香菇都屬于真菌類，都含有真菌多糖，都具有增強(qiáng)免疫力的功能。真菌多糖對(duì)機(jī)體特異性免疫與非特異性免疫，細(xì)胞免疫與體液免疫均有影響。蝙蝠蛾擬青霉菌粉與靈芝的配伍在臨床經(jīng)常使用，在SFDA批過的產(chǎn)品中也有應(yīng)用。香菇是免疫增強(qiáng)劑。

輔料中，蔗糖和檸檬酸起到矯味劑作用；瓊脂一方面可以保證產(chǎn)品均一性，防止大量沉淀產(chǎn)生，另一方面還可以起到矯味劑的作用。

中草藥口服液的生產(chǎn)關(guān)鍵在提取方法的選擇，提取方法選擇不當(dāng)，在生產(chǎn)和貯存過程中，易發(fā)生混濁、沉淀、絮凝、變色等現(xiàn)象。對(duì)于大多數(shù)有效成分尚未明確的或藥味較多的復(fù)方制劑，采用何種提取方法是至關(guān)重要的。本發(fā)明結(jié)合原料自身特點(diǎn)，采用水提取。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明：

以下實(shí)施例中，蝙蝠蛾擬青霉菌粉來源于浙江萬豐企業(yè)集團(tuán)制藥有限公司，根據(jù)《真菌類保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定(試行)》(國食藥監(jiān)注[2005]202號(hào))使用；靈芝來源于上?？抵壅婢嗵怯邢薰荆鶕?jù)《真菌類保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定(試行)》(國食藥監(jiān)注[2005]202號(hào))使用；香菇來源于上?？抵壅婢嗵怯邢薰?，香菇屬于普通食品；蔗糖來源于湖南九典制藥有限公司，蔗糖屬于常用的藥用輔料；瓊脂來源于福建明福瓊脂有限公司，依據(jù)GB2760《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》使用；檸檬酸來源于濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司，依據(jù)GB2760《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》使用。

實(shí)施例1

口服液的配方為：

原料

蝙蝠蛾擬青霉菌粉 800g

靈芝 2500g

香菇 2000g

輔料

共30000mL，制成1000支。

按照以下生成工藝制備：

S1、原料預(yù)處理：取靈芝、香菇，粉碎，過20目篩，備用；

S2、提取、過濾：按配方稱取蝙蝠蛾擬青霉菌粉、靈芝粉、香菇粉，加10倍量水浸泡30min后，提取2h，過濾，濾液備用，濾渣中加入8倍量水提取1.5h，過濾，與第一次濾液合并，得濾液A；

S3、濃縮：濾液A減壓濃縮(0.07MPa)至相對(duì)密度為1.05～1.08(60℃)；

S4、靜置：濃縮液靜置冷藏24h；

S5、過濾：靜置后的濃縮液120目進(jìn)行過濾，得濾液B；

S6、調(diào)配：按配方稱取瓊脂、蔗糖和檸檬酸，將瓊脂中加入純化水，加熱至85～95℃，攪拌溶解，備用；取蔗糖制成糖漿；將瓊脂液和糖漿加入至濾液B中攪拌混合，再加入檸檬酸，加水調(diào)配，測(cè)定pH值；

S7、精濾：對(duì)上述料液120目進(jìn)行精濾；

S8、灌裝：口服液所用瓶體和瓶蓋洗凈后，瓶體經(jīng)165℃，90min高溫干燥滅菌，瓶蓋經(jīng)75％乙醇浸泡30min，晾干，然后將調(diào)配好的料液灌裝，規(guī)格為30mL/支；

S9、滅菌：高壓滅菌121℃，30min；

S10、燈檢：檢驗(yàn)裝量，撿出不合格產(chǎn)品；

S11、包裝：貼標(biāo)簽，裝盒，4支/盒；

S12、檢驗(yàn)入庫：按企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)產(chǎn)品，合格成品入庫保存。

使用方法：每日1次，每次1支。

所有原輔料經(jīng)檢驗(yàn)合格，方可用于生產(chǎn)。特別是原輔料都需達(dá)到各自標(biāo)準(zhǔn)的微生物要求和GB16740-1997對(duì)微生物的要求方可進(jìn)入潔凈區(qū)用于生產(chǎn)。靜置至灌裝的生產(chǎn)工序都在10萬級(jí)潔凈區(qū)進(jìn)行，所有生產(chǎn)過程嚴(yán)格按照GMP進(jìn)行，以確保產(chǎn)品微生物指標(biāo)能達(dá)到企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(依據(jù)GB16740-1997制定)的要求。

所有原輔料皆符合本產(chǎn)品企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。純化水應(yīng)符合《中華人民共和國藥典》(2010年版)的規(guī)定?？诜后w瓶應(yīng)符合YBB00032004《鈉鈣玻璃管制口服液體瓶》的要求，口服液瓶用易刺鋁蓋應(yīng)符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，瓦楞紙箱應(yīng)符合GB/T 6543-2008《運(yùn)輸包裝用單瓦楞紙箱和雙瓦楞紙箱》的要求。

生產(chǎn)所用儀器設(shè)備名稱及型號(hào)的說明

實(shí)施例2

口服液的配方為：

原料

蝙蝠蛾擬青霉菌粉 500g

靈芝 2000g

香菇 1500g

輔料

共30000mL，制成1000支。

生產(chǎn)工藝參照實(shí)施例1進(jìn)行。

實(shí)施例3

口服液的配方為：

原料

蝙蝠蛾擬青霉菌粉 1000g

靈芝 3000g

香菇 2500g

輔料

共30000mL，制成1000支。

生產(chǎn)工藝參照實(shí)施例1進(jìn)行。

實(shí)施例4

動(dòng)物試驗(yàn)

1、材料和方法

(1)樣品為實(shí)施例1所制備的口服液。

(2)試驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康SPF昆明種小鼠。選用體重18～22g雌性、雄性小鼠各80只，共160只，分為4個(gè)免疫大組，每大組40只，每免疫大組小鼠分為水對(duì)照組和低、中、高劑量組，各10只。免疫一組(雄性小鼠40只)用于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)實(shí)驗(yàn)、血清溶血素的測(cè)定、抗體生成細(xì)胞數(shù)的測(cè)定；免疫二組(雌性小鼠40只)用于小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)；免疫三組(雌性小鼠40只)用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；免疫四組(雄性小鼠40只)用于小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度22土2℃，相對(duì)濕度50±10％。

(3)劑量選擇與受試物給予方式

本發(fā)明口服液的人體推薦量為每人每日30mL，每人按60kg體重計(jì)，相當(dāng)于0.5mL/日/kg.BW，按相當(dāng)于人體推薦量的5倍、10倍、30倍確定小鼠的低、中、高劑量，即各組小鼠每日食用量分別為2.5mL/kg.BW、5mL/kg.BW、15mL/kg.BW，灌胃體積按20mL/kg.BW，將樣品用蒸餾水分別稀釋8倍，4倍，1.3倍，即向燒杯中分別加入樣品7.5mL，15.0mL，45.0mL，然后定容至60mL。經(jīng)口每日一次灌胃給予小鼠受試物。對(duì)照組以等體積的蒸餾水代替受試物，連續(xù)給予30d后測(cè)各項(xiàng)免疫指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)小鼠以遠(yuǎn)交系小鼠專用飼料喂飼。

(4)主要儀器與試劑

動(dòng)物天平、分析天平、潔凈工作臺(tái)、游標(biāo)卡尺(精密度0.01mm)、微量注射器(25μL)、CO₂培養(yǎng)箱、恒溫水浴、離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、光學(xué)顯微鏡等、微量加樣器。

無菌手術(shù)器械、200目篩網(wǎng)、玻璃平皿、紗布、試管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、24孔和96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔U型底細(xì)胞培養(yǎng)板。計(jì)時(shí)器、血色素吸管、玻片架、綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、生理鹽水、刀豆蛋白A(ConA)、補(bǔ)體(豚鼠血清)、Hank’s液(pH7.2～7.4)、青鏈霉素、SA緩沖液、瓊脂糖、MTT、小牛血清、PRMI1640培養(yǎng)液、PBS緩沖液(pH7.2～7.4)、乳酸鈉、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯磷酸鹽、氧化型輔酶I、1％冰醋酸、1mol/L HCl、0.1％NP40(v/v)、酸性異丙醇(96ml異丙醇加4mL 1mol/L的HCl、YAC-1細(xì)胞、0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.2)、印度墨汁、1g/L Na₂CO₃、雞紅細(xì)胞、甲醇、丙酮、Giemsa染液等。

(5)實(shí)驗(yàn)方法

A臟器體重比值測(cè)定

小鼠稱重后頸椎脫臼處死小鼠，取其胸腺、脾臟，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污并稱重，計(jì)算胸腺體重比值與脾臟體重比值。所得數(shù)據(jù)，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

B遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足跖增厚法)

取脫纖維羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射2％(v/v，用生理鹽水配制)壓積SRBC(2000r/min，10min)0.2mL，致敏后4天，測(cè)量左后足跖部厚度，同一部位測(cè)量3次，取平均值。然后在測(cè)量部位皮下注射20％(V/V，用生理鹽水配制)壓積SRBC 20μL，于注射后24h測(cè)量左后足跖部厚度，以攻擊前后足跖厚度之差值(足跖腫脹度)來表示DTH的程度。

所得數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，若受試物組攻擊前后足跖厚度的差值高于對(duì)照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，可判定該受試物有提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力的作用。

C ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法)

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，過200目銅網(wǎng)及無菌紗布，制成細(xì)胞懸液。用Hank’s液洗2次，每次1000r/min離心10min。然后將細(xì)胞懸浮于1mL RPMI 1640的完全培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3*10⁶個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，在其中一孔加75μL ConA液(相當(dāng)于7.5μg/mL)，另一孔作為對(duì)照，置5％CO₂、37℃孵箱培養(yǎng)68h后，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，同時(shí)每孔加入50μL MTT(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，然后將液體移入96孔板中，每孔加3個(gè)平行樣，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值(A值)。計(jì)算試驗(yàn)孔A值與對(duì)照孔A值之差，以此表示淋巴細(xì)胞的增殖能力。

所得數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，若受試物組淋巴細(xì)胞的增殖能力高于對(duì)照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，可判定該受試物有提高ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的作用。

D抗體生成細(xì)胞測(cè)定(Jerne改良玻片法)

取脫纖維羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射2％(v/v，用生理鹽水配制)壓積SRBC(2000r/min，10min)0.2mL，將SRBC免疫5天后的小鼠處死，取脾，制成細(xì)胞懸液。將10g/L瓊脂糖加熱溶解后，與等量雙倍Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5mL，再向管內(nèi)加10％(v/v，用SA液配制)壓積SRBC 50μL、脾細(xì)胞懸液20μL，迅速混勻后，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上。待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入CO₂培養(yǎng)箱孵育1.5h，然后將補(bǔ)體(用SA緩沖液按1∶8稀釋)加入玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5h后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。

所得數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，若受試物組溶血空斑數(shù)高于對(duì)照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，可判定該受試物有增加小鼠抗體細(xì)胞數(shù)的作用。

E小鼠血清溶血素的測(cè)定

取脫脂羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射2％(v/v，用生理鹽水配制)壓積SRBC(2000r/min，10min)0.2mL，免疫5天后，摘除小鼠眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，離心(2000r/min，10min)，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度血清分別置于微量血凝試驗(yàn)板內(nèi)，每孔100μL，再加入0.5％(用生理鹽水配制)SRBC懸液100μL，混勻，置濕盒內(nèi)，于37℃溫箱孵育3h，記錄血球凝集程度。計(jì)算抗體積數(shù)(血清對(duì)倍稀釋指數(shù)與凝集度乘積之和)。

血清凝集度分為5級(jí)(0～I(xiàn)V)，按以下標(biāo)準(zhǔn)判定。0級(jí)：SRBC全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀，四周液體清晰；I級(jí)：SRBC大部分沉集在孔底成圓點(diǎn)狀，四周有少量凝集的SRBC；II級(jí)：凝集的SRBC在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個(gè)疏松的紅點(diǎn)；III級(jí)：凝集的SRBC均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個(gè)小紅點(diǎn)；IV級(jí)：凝集的SRBC均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時(shí)成卷折狀。

所得數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，若受試物組血清溶血素抗體積數(shù)高于對(duì)照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，可判定該受試物有提高小鼠血清溶血素水平的作用。

F小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

小鼠尾靜脈注射1∶5稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)，注入墨汁后2min、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，并將其加入2mL 1％Na₂CO₃溶液中。用紫外分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值(A)，以Na₂CO₃溶液作空白對(duì)照。將小鼠處死，取其肝臟和脾臟稱重，計(jì)算吞噬指數(shù)。

所得數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，若受試物組的吞噬指數(shù)高于對(duì)照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，可判定該受試物有提高小鼠單核-巨嗤細(xì)胞的碳廓清能力的作用。

G小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(半體內(nèi)法)

小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理鹽水配制)壓積雞紅細(xì)胞懸液1mL，間隔30min，頸椎脫臼處死，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2～2.5mL，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1min，取腹腔巨噬細(xì)胞洗液1mL，滴于載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃孵箱溫育30min。孵畢，于生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細(xì)胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸緩沖液染色，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計(jì)數(shù)，每片計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，按下式計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)

吞噬率(％)＝吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)*100

吞噬指數(shù)＝被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)

所得數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，吞噬百分率需按X＝Sin^-1√P進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，式中P為吞噬百分率，用小數(shù)表示，若受試物組的吞噬率或吞噬指數(shù)明顯高于對(duì)照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，可判定該受試物有提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的作用。

H小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定(乳酸脫氫酶LDH測(cè)定法)

試驗(yàn)前24h將YAC-1細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用前以Hank’s液洗3次，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4*10⁵個(gè)/mL。將小鼠脫臼處死，無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，用Hank’s液洗3次，每次1000rpm離心10min。再用1mL含10％小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)(活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95％以上)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2*10⁷個(gè)/mL，使效靶比為50∶1。

取靶細(xì)胞和脾細(xì)胞各100μL，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板，靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1％NP40各100μL，上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)平行孔，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，將96孔板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清液100μL置酶標(biāo)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100μL，反應(yīng)10min，然后每孔加入1mol/L的HCl 30μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)定A值。按下式

NK細(xì)胞活性％＝(反應(yīng)孔A-自然釋放孔A)/(最大釋放孔A-自然釋放孔A)*100

計(jì)算NK細(xì)胞活性。

LDH基質(zhì)液的配制：乳酸鈉5*10^-2mol/L，

硝基氯化四氮唑6.6*10^-4mol/L

吩嗪二甲酯硫酸鹽2.8*10^-4mol/L

氧化型輔酶I1.3*10^-3mol/L

將上述試劑溶于0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液中(pH8.2)

所得數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，NK細(xì)胞活性需按X＝Sin^-1√P進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，式中P為NK細(xì)胞活性，用小數(shù)表示，若受試物組的NK細(xì)胞活性高于對(duì)照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，可判定該受試物有提高小鼠NK細(xì)胞活性的能力。

(6)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足“方差齊”要求的數(shù)據(jù)資料用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；對(duì)方差不齊的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足“方差齊”要求后，用轉(zhuǎn)換所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

(7)結(jié)果判定

增強(qiáng)免疫力功能判定：在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性四個(gè)方面任兩個(gè)方面結(jié)果陽性，可判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力功能作用。

其中細(xì)胞免疫功能測(cè)定項(xiàng)目中的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性，或任一實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性，可判定細(xì)胞免疫功能測(cè)定結(jié)果陽性。體液免疫功能測(cè)定項(xiàng)目中的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性，或任一實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性，可判定體液免疫功能測(cè)定結(jié)果陽性。單核-巨噬細(xì)胞功能測(cè)定項(xiàng)目中的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性，或任一實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性，可判定單核一巨噬細(xì)胞功能測(cè)定結(jié)果陽性。NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的一個(gè)以上劑量組結(jié)果陽性，可判定NK細(xì)胞活性結(jié)果陽性。

2、結(jié)果

(1)對(duì)小鼠體重的影響，見表1。

表1

免疫一組

免疫二組

免疫三組

免疫四組

小鼠體重原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果見表1。小鼠初始體重均數(shù)在各組間差異無顯著性(P＞0.05)，即小鼠的初始體重在各組間較為均衡。經(jīng)口給予小鼠不同劑量的實(shí)施例1口服液30天，體重增長(zhǎng)值均數(shù)在各組間差異均無顯著性(P＞0.05)，即本發(fā)明的口服液對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無影響。

(2)對(duì)小鼠臟器體重比值的影響：見表2、表3。

表2對(duì)小鼠脾臟體重比值的影響

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，對(duì)小鼠脾臟體重比值原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果見表2。小鼠脾臟體重比值均數(shù)在各組間比較，差異均無顯著性(P＞0.05)，即本發(fā)明的口服液對(duì)小鼠的脾臟體重比值無影響。

表3對(duì)小鼠胸腺體重比值的影響

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，對(duì)小鼠胸腺體重比值原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果見表3。小鼠胸腺體重比值均數(shù)在各組間比較，差異均無顯著性(P＞0.05)，即本發(fā)明的口服液對(duì)小鼠的胸腺體重比值無影響。

(3)口服液對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

A口服液對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響，見表4。

表4

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，小鼠足趾腫脹度原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果見表4。小鼠足跖腫脹度均數(shù)在各組間比較，差異有顯著性(P＜0.05)，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，小鼠足跖腫脹度均數(shù)在低劑量組與水對(duì)照組之間比較，差異無顯著性(P＞0.05)，在中、高劑量組與水對(duì)照組之間比較，差異均有顯著性(P＜0.05)。即本發(fā)明服液能增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力。

B對(duì)CoA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的影響，見表5。

表5

*P＜0.05

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見表5，水對(duì)照組和3個(gè)劑量組的淋巴細(xì)胞增殖能力均數(shù)在各組間差異有顯著性(P＜0.05)。用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力在低劑量組與水對(duì)照組間比較，差異無顯著性(P＞0.05)，在中、高劑量組與水對(duì)照組間比較，差異均有顯著性(P＜0.05)，即本發(fā)明的口服液能增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力。

(4)口服液對(duì)小鼠體液免疫的影響

A對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響，見表6。

表6

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果見表6。小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)均數(shù)在各組間比較，差異均無顯著性(P＞0.05)，即本發(fā)明的口服液對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)無影響。

B對(duì)小鼠血清溶血素的影響，見表7。

表7

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，小鼠血清抗體積數(shù)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果見表7。水對(duì)照組和3個(gè)劑量組的抗體積數(shù)均數(shù)在各組間差異無顯著性(P＞0.05)。即本發(fā)明的口服液對(duì)小鼠血清溶血素水平無影響。

(5)口服液對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

A對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力的影響，見表8。

表8

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，小鼠單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果見表8，對(duì)照組和3個(gè)劑量組吞噬指數(shù)均數(shù)在各組間無顯著性差異(P＞0.05)，即本發(fā)明的口服液對(duì)小鼠單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞碳廓清能力無影響。

B對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響，見表9、表10。

表9對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞吞噬率的影響

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞吞噬率平方根反正弦轉(zhuǎn)換值原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果見表9，對(duì)照組和3個(gè)劑量組吞噬率平方根反正弦轉(zhuǎn)換值均數(shù)在各組間無顯著性差異(P＞0.05)，即本發(fā)明的口服液對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬能力無影響。

表10對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞吞噬指數(shù)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見表10，對(duì)照組與3個(gè)劑量組吞噬指數(shù)均數(shù)在各組間無顯著性差異(P＞0.05)，即本發(fā)明的口服液對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬能力無影響。

(6)口服液對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響，見表11。

表11

^*P＜0.05

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性平方根反正弦轉(zhuǎn)換值原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，符合方差齊的要求，用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果見表11。小鼠NK細(xì)胞活性平方根反正弦轉(zhuǎn)換值均數(shù)在各組間比較，差異有顯著性(P＜0.05)，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，小鼠NK細(xì)胞活性在低劑量組與水對(duì)照組間比較，差異無顯著性(P＞0.05)，在中、高劑量組與水對(duì)照組間比較，差異均有顯著性(P＜0.05)，即本發(fā)明的口服液能增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性。

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的口服液30天，對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無不良影響，對(duì)小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值無影響，小鼠的細(xì)胞免疫功能、NK細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果均為陽性，體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定結(jié)果均為陰性。以上結(jié)果表明，本發(fā)明的口服液具有增強(qiáng)免疫力功能的作用。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。