本發(fā)明涉及食品、功能性食品或特殊醫(yī)學用途食品開發(fā)領域，更具體涉及一種魚短肽及其在營養(yǎng)強化劑中的應用。

背景技術：

營養(yǎng)是生命物質(zhì)的基礎，也是治療疾病的保證。近年來國內(nèi)外學者報道住院患者普遍存在著蛋白質(zhì)一熱卡缺乏型營養(yǎng)不良。蛋白質(zhì)-熱量營養(yǎng)不良癥（protein energy malnutrition，PEM）是因疾病因素引起的一種營養(yǎng)缺乏病，臨床上表現(xiàn)為消瘦（marasmus）和惡性營養(yǎng)不良綜合征（kwashiorkor）。輕型的慢性蛋白質(zhì)-熱量營養(yǎng)不良癥常被忽視，它影響著患者的生長發(fā)育、免疫功能，病人不易康復。蛋白質(zhì)-熱量營養(yǎng)不良癥是臨床營養(yǎng)學上的一個重要問題。

營養(yǎng)與健康的關系非常密切，對住院患者尤為重要。眾所周知，外科手術會對患者造成較大的創(chuàng)傷，且術后的較長時間會影響進食及營養(yǎng)吸收，因而患者術后營養(yǎng)不良的發(fā)生率較高。有研究表明，術后營養(yǎng)不良可影響手術患者的手術效果、延長患者的住院時間、增加并發(fā)癥發(fā)生率及降低其生活質(zhì)量。但在臨床實際工作中，臨床醫(yī)師較少對手術患者的營養(yǎng)狀況進行綜合、系統(tǒng)的評價，對住院患者中存在營養(yǎng)不良狀況普遍地認識不足。

2009年版的《中國國家處方集》中將腸內(nèi)營養(yǎng)制劑按氮源分為3大類，即氨基酸型、短肽型 (前兩類也稱為要素型，elementaltype)、整蛋白型(也稱為非要素型non—elemental Iype)。前兩類制劑以蛋白水解物為氮源，經(jīng)少量消化過程便可吸收；整蛋白，適用于胃腸功能較好的患者。

短肽型腸內(nèi)營養(yǎng)制劑是隨著科學技術水平和醫(yī)療技術水平的發(fā)展提高而研究出一種新型腸內(nèi)營養(yǎng)劑，該營養(yǎng)劑中的營養(yǎng)成分是經(jīng)過水解處理預消化型營養(yǎng)制劑，其主要構成成分包括人體所需的多種糖類、蛋白、維生素等等，其脂肪源為中鏈甘油三脂和植物油，碳源主要包括蔗糖和麥芽糖糊精，氮源主要是乳清蛋白水解產(chǎn)物（短肽），同時在組成成分融入了適量的的微量元素、礦物質(zhì)以及維生素等等。常用的短肽型腸內(nèi)營養(yǎng)制劑最大的好處就是無需消化分解即可直接被腸上皮細胞吸收利用，在重癥監(jiān)護室得到了廣泛的應用，尤其是適用于胰液分泌不足、胃腸功能不全、吸收面積減少的患者；除此之外，預消化型短肽制劑的滲透壓也比較低，因此可以降低胃腸道副反應的發(fā)生率，提高患者的耐受性；在營養(yǎng)劑的配方過程中將低脂肪的含量適量降低，更適合脂肪代謝障礙以及消化道功能不全的患者。

許多研究證實，在手術之后，患者腸內(nèi)營養(yǎng)有助于維持腸黏膜細胞結構與功能的完整性，維護腸道黏膜屏障功能，刺激消化液和胃腸道激素的分泌，增加內(nèi)臟血流，使代謝更符合生理需求，減少中心靜脈置管、代謝、肝膽并發(fā)癥的發(fā)生。

2003 年，歐洲腸內(nèi)腸外營養(yǎng)學會（ESPEN）發(fā)表了一種新的營養(yǎng)評價方法——營養(yǎng)不良風險篩查方法（nutritional risk screening 2002，NRS2002），后被中華醫(yī)學會采用并大力推廣，NRS2002 是一種結合人體測量、疾病嚴重程度、近期體重變化和近期營養(yǎng)攝入的變化等四項指標，采用評分的方法，以NRS評分≥3分作為營養(yǎng)不良風險的標準。

臨床研究表明，胃腸道腫瘤術后第9天，供給短肽營養(yǎng)劑的試驗組病人營養(yǎng)不良風險的發(fā)生率明顯低于對照組，表明胃腸道腫瘤術后給予短肽制劑可增加肝蛋白質(zhì)的合成，減少術后應激期的負氮平衡，在促進蛋白質(zhì)合成和加快正氮平衡方面優(yōu)于TPN。腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)攝入后，可明顯增加腸道和門靜脈的血流量，促使胃腸蠕動和膽囊收縮、促進胃腸道激素的合成及釋放，調(diào)節(jié)胃液、膽汁和胰液的分泌，使營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用更合理，且能維護腸黏膜屏障功能。

營養(yǎng)與免疫是互為相關的。在臨床實驗研究中，試驗組病人未發(fā)生術后并發(fā)癥。這一結果提示，病人營養(yǎng)狀況的改善、免疫功能的恢復、食糜刺激以及術后通過腸道攝取營養(yǎng)素，穩(wěn)定了腸道內(nèi)微生物環(huán)境和腸粘膜屏障功能，從而減少了術后引發(fā)內(nèi)源性感染并發(fā)癥的機會，縮短了病人的住院時間。

重癥監(jiān)護室患者不同于普通患者，其應激系數(shù)一般都比較高，能量和營養(yǎng)的消耗主要用于維持重要內(nèi)臟器官的功能代謝，這樣就降低了消化道的消化吸收功能順應性，這時候給予患者實施短肽型腸內(nèi)營養(yǎng)劑可以有效的將消化道吸收負擔減輕，從而增加機體能量及蛋白的供給量；同時，短肽型腸內(nèi)營養(yǎng)劑可以有效的保護腸道正常菌群、防止腸黏膜萎縮、維持免疫活性以及降低創(chuàng)傷后的應激反應。

短肽類營養(yǎng)劑所含的蛋白質(zhì)為蛋白水解物，在小腸中也有運輸?shù)途垭牡捏w系，低聚肽經(jīng)小腸黏膜刷狀緣的肽酶水解后進入血液，容易被機體利用。除以上特點外，此類營養(yǎng)藥不含乳糖，避免了乳糖不耐受引起的腹瀉和脂代謝障礙等一系列問題。這類藥物幾乎完全吸收，低渣，需少量消化液吸收，排糞便量少。適用于有胃腸道功能或部分胃腸道功能的患者，如胰腺炎、腸道炎性疾病、放射性腸炎和化療、腸瘺、短腸綜合征、艾滋病病毒感染等；也可作為營養(yǎng)不足患者的手術前后喂養(yǎng)及腸道準備，能補充人體日常生理功能所需的能昔及營養(yǎng)成分。

國內(nèi)已有多種全蛋白質(zhì)類營養(yǎng)劑商品，多為各種植物蛋白粉。植物種子提取油之后剩下的渣子，如豆粕、玉米粕、花生餅等為原料制成的植物水解蛋白粉，由于其必需氨基酸比率的不平衡，難于體現(xiàn)其營養(yǎng)價值。

魚水解蛋白粉與人體需求蛋白組成比率相似，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。將魚蛋白經(jīng)酶水解到易溶于水的小分子短肽或游離氨基酸，將更有利于人體消化吸收。

本發(fā)明提供一種魚短肽作為制備營養(yǎng)強化劑的應用。采用魚為原料，是一種含2-8個氨基酸分子為主的短肽制劑。該魚短肽具有高安全性、高新鮮度和低組胺值的特點，分子量小于800Da的組分占80%以上，組胺值低于30mg/100g（干基計）。蛋白組成中含有10-25%的膠原蛋白短肽，有利于大傷口的康復。該產(chǎn)品可有效地提供全面的蛋白組分，有效改善病人的營養(yǎng)指標，降低手術應激誘導的免疫抑制，有利于機體免疫功能的恢復，更好地促進患者康復。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種魚短肽及其在營養(yǎng)強化劑中的應用。

所述魚短肽的制備方法為：魚絞碎后，脫脂處理1-3次，得到脫脂魚糜漿；加入水，魚與水的質(zhì)量體積比為1：2-20，調(diào)節(jié)pH至3-8；采用蛋白酶酶解工藝，酶的添加量為0.01-3wt.%，反應溫度為20-80℃，酶解時間1-12小時；酶解液經(jīng)SEC-HPLC檢測，蛋白質(zhì)分子量80%以上低于800Da，終止酶反應；酶解產(chǎn)物固液分離后收集上清液，采用納濾膜進行脫鹽和濃縮處理，至產(chǎn)品組胺含量低于30mg/100g（干基計），終止膜處理。

具體為：取小雜魚絞碎后，脫脂處理3次，得到脫脂魚糜漿；加入水，小雜魚與水的質(zhì)量體積比為1kg：4L，用10wt.%的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH，使最終pH為3.5；采用二步酶解工藝，第一步酶解采用木瓜蛋白酶，酶的添加量為0.8wt.%，調(diào)節(jié)pH值至3.0，反應溫度為40℃，酶解時間8小時；第二步酶解采用胰蛋白酶，酶的添加量為0.7wt.%，調(diào)節(jié)pH值至4.5，反應溫度為40℃，酶解時間12小時；酶解液經(jīng)SEC-HPLC檢測，蛋白質(zhì)分子量80%以上低于800Da，終止酶反應；酶解產(chǎn)物經(jīng)高速連續(xù)離心機離心分離，收集上清液，采用250Da膜膜分離裝置處理上述物料，RO水水洗，魚短肽溶液最終濃縮至200L用于噴霧干燥，收集的魚短肽胨粉。所述魚短肽是一種含2-8個氨基酸分子為主的短肽制劑，分子量小于800Da的組分占80%以上。該魚短肽具有高安全性、高新鮮度和低組胺值的特點，組胺值低于30mg/100g（干基計）。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點是：蛋白組成中含有10-25%的膠原蛋白短肽，有利于大傷口的康復。該產(chǎn)品可有效地提供全面的蛋白組分，有效改善病人的營養(yǎng)指標，降低手術應激誘導的免疫抑制，有利于機體免疫功能的恢復，更好地促進患者康復。

附圖說明

圖1 不同濃度魚短肽對HSF細胞增殖的影響。

圖2 魚短肽對HSF遷移的影響。其中a為常規(guī)營養(yǎng)組0h，b為0.5 mg/ml魚短肽強化組0h，c為常規(guī)營養(yǎng)組 24h，d為0.5 mg/ml魚短肽強化組 24h。

圖3小鼠實驗白蛋白的含量。

圖4魚短肽分子量分布（SEC-HPLC譜圖）。

具體實施方式

以下通過試驗例來進一步闡述具體實施方式，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

取小雜魚100公斤，用絞肉機進行絞碎，加入300升60號溶劑油脫脂處理3次，得到脫脂魚糜漿。加入400L水，用10wt.%的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH，使最終pH達到3.5。采用二步酶解工藝。第一步酶解采用木瓜蛋白酶，酶的添加量為0.8wt.%，調(diào)節(jié)pH值至3.0，反應溫度為40℃，酶解時間8小時；第二步酶解采用胰蛋白酶，酶的添加量為0.7wt.%，調(diào)節(jié)pH值至4.5，反應溫度為40℃，酶解時間12小時。酶解液經(jīng)SEC-HPLC檢測，蛋白質(zhì)分子量80%以上低于800Da，終止酶反應。酶解產(chǎn)物經(jīng)高速連續(xù)離心機離心分離，收集上清液，采用膜分離裝置（250Da膜）處理上述物料，RO水水洗800L，魚短肽溶液最終濃縮至200L用于噴霧干燥。收集的魚短肽粉進行分析，魚短肽分子量分布采用SEC-HPLC法檢測，蛋白質(zhì)分子量低于800Da占比達 91.6%，組胺含量14mg/100g（參照GB/T 5009.45-2003）。

表1魚短肽產(chǎn)品分子量分布數(shù)據(jù)

表2組胺含量檢測結果

實施例2

37℃、5% CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞。人皮膚成纖維細胞接種于96孔板中，細胞濃度為5000個/孔，魚短肽用培養(yǎng)基溶解分別配制成濃度為0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml和0.8mg/ml，培養(yǎng)24h后采用MTT法檢測魚短肽對細胞的增值情況，結果如圖1所示，魚短肽樣品隨濃度的增大增殖效果逐漸增強，濃度為0.6 mg/ml時，細胞增殖率為120%。

6孔細胞培養(yǎng)板中加入約5×10⁵個HSF細胞，細胞融合率達到100%后，做一條筆直的劃痕。空白對照組加入2ml無血清培養(yǎng)基，實驗組加入濃度為0.5 mg/ml的魚短肽無血清培養(yǎng)基。放入37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。0h和24h拍照比較細胞生長遷移效果，結果如圖2所示，添加0.5mg/ml魚短肽培養(yǎng)24h后，與常規(guī)營養(yǎng)組相比，細胞遷移顯著，說明在細胞培養(yǎng)中添加魚短肽有利于促進細胞生長。

取昆明小鼠40只，按體重分為4組，每組10只，分別設為魚短肽低劑量組，魚短肽高劑量組，營養(yǎng)缺陷組和正常營養(yǎng)組。正常營養(yǎng)組喂養(yǎng)含20%蛋白的飼料，其他各組喂養(yǎng)8%蛋白含量的飼料，自由采食和飲水。每天對小鼠進行灌胃，其中魚短肽低劑量組為200mg/ml魚短肽，高劑量魚短肽組為400mg/ml魚短肽，正常營養(yǎng)組和營養(yǎng)缺陷組為0.9%生理鹽水，灌胃體積均為0.5ml，四周后摘眼球取血液，進行血清中白蛋白含量的檢測。結果如圖3所示，營養(yǎng)缺陷組小鼠血清中白蛋白含量最低，僅為 30.42 g/L，正常營養(yǎng)組白蛋白含量為 33.65g/L，魚短肽低劑量組和魚短肽高劑量組的白蛋白含量分別為35.35g/L和39.31g/L，動物實驗結果表明，魚短肽具有營養(yǎng)強化作用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。