一類自組裝短肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一類自組裝短膚及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)使PCR技術(shù)變得簡(jiǎn)捷、同時(shí)也降低了成本，PCR技術(shù)得W廣 泛應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。但由于Taq酶在高溫下的半衰期的限制，使得PCR反應(yīng)時(shí)間有 所局限。而現(xiàn)下大部分的改造都集中于運(yùn)用基因工程技術(shù)合成性能優(yōu)越、更耐熱的酶。但 此方法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，而且凡是蛋白酶都容易在高溫下失活，因此無(wú)法從根本上解決此問(wèn) 題。
[0003] 自組裝短膚自問(wèn)世W來(lái)已有二十多年，近幾年更是得到快速發(fā)展，尤其是手性自 組裝短膚體系的提出使得短膚的設(shè)計(jì)思路更加廣泛，現(xiàn)已有多種不同體系的短膚成功應(yīng) 用于細(xì)胞工程、組織工程、藥物控釋、創(chuàng)傷快速修復(fù)W及穩(wěn)定膜蛋白等領(lǐng)域（見化ongli Luo,化uguang)。在穩(wěn)定蛋白質(zhì)領(lǐng)域中，已經(jīng)有報(bào)道一種類似磯脂結(jié)構(gòu)的自組裝短膚AeD可 W顯著延長(zhǎng)視紫紅質(zhì)在40°C下的半衰期（見Xiao化n化aoPNAs)。實(shí)驗(yàn)表明，該種類似磯 脂結(jié)構(gòu)，即一頭親水，一頭疏水在水中能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)包裹住，從而很好地保護(hù)了蛋白質(zhì)的結(jié) 構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一類自組裝短膚，增加自組裝短膚體系的多樣化W及自組裝短 膚的種類，W促進(jìn)自組裝短膚在分子生物學(xué)中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：一類自組裝短膚，該自組裝短膚的氨基酸序列為；XXlie lielielieXX，其中X為Arg或Lys，當(dāng)X為Arg時(shí)命名為R2I4R2,當(dāng)X為L(zhǎng)ys時(shí)命名為 馬1嚴(yán)。短膚氮端己酷化。
[0006]R2I4R2的氨基酸序列如沈QIDNO;1;ArgArglielielielieArgArg。
[0007]K2I4K2的氨基酸序列如SEQIDNO;2;LysLyslielielielieLysLys。
[000引本發(fā)明在手性自組裝短膚的設(shè)計(jì)原則下，采用全新理念設(shè)計(jì)兩條結(jié)構(gòu)相似的自組 裝短膚分別命名為R2I4R2和K21瓜，摩爾質(zhì)量為1136. 74g/mol和1027. 74g/mol，其氨基酸 序列分別為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。短膚的結(jié)構(gòu)特征為擁有親水的兩端和疏水的中 屯、，并能通過(guò)分子之間非共價(jià)鍵相互作用，形成結(jié)構(gòu)明確且穩(wěn)定，并具有某些理化性質(zhì)的超 分子結(jié)構(gòu)或分子聚集體。
[0009] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述自組裝短膚在鹽離子溶液中能自組裝形成納米支架結(jié)構(gòu)， 且離子濃度的高低對(duì)其結(jié)構(gòu)影響較大，在不同的離子環(huán)境下，儀離子對(duì)其結(jié)構(gòu)影響較大。
[0010] 實(shí)驗(yàn)表明，溫度的變化對(duì)本發(fā)明所述自組裝短膚的結(jié)構(gòu)影響不大，能夠在PCR的 溫度不斷變化過(guò)程中維持穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0011] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述自組裝短膚形成的支架結(jié)構(gòu)能夠在溶液中包裹住Taq酶， 穩(wěn)定酶的空間結(jié)構(gòu)，從而抵抗高溫，延長(zhǎng)其在高溫下的半衰期。
[0012] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的自組裝短膚能夠穩(wěn)定Taq酶的結(jié)構(gòu)而不影響其功能，從 而增加PCR的擴(kuò)增效率，大大增加PCR的擴(kuò)增產(chǎn)量。因此，此種短膚可W作為蛋白質(zhì)或酶的 保護(hù)材料，應(yīng)用到分子生物學(xué)領(lǐng)域。
[0013] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述短膚R2LR2在金屬鹽離子、細(xì)胞培養(yǎng)基等環(huán)境下，能進(jìn)行自 組裝形成納米纖維。
[0014] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述自組裝短膚R2I化形成的納米纖維，細(xì)胞能在其上進(jìn)行立維 黏附、生長(zhǎng)，所W，此自組裝短膚可用與動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞=維培養(yǎng)中。
[0015] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0016] 1、提供了 一類新型自組裝短膚，增加自組裝短膚類型。
[0017] 2、提供了一類新型的自組裝材料，該些材料能夠形成穩(wěn)定的納米纖維，該納米纖 維能夠應(yīng)用于細(xì)胞=維培養(yǎng)，模擬體內(nèi)細(xì)胞生存的微環(huán)境，黏附細(xì)胞生長(zhǎng)因子，提供細(xì)胞體 外生存=維微環(huán)境。
[0018] 3、提供了一類新型的自組裝材料，該類材料能夠穩(wěn)定Taq酶的結(jié)構(gòu)，提高PCR的擴(kuò) 增效率，為分子生物學(xué)領(lǐng)域提供一種新的研究工具。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是本發(fā)明所述類磯脂結(jié)構(gòu)的自組裝短膚R2I4R2和K2I瓜的分子結(jié)構(gòu)示意圖 (從N端到C端）。
[0020] 圖2是本發(fā)明所述類磯脂結(jié)構(gòu)的自組裝短膚R2I化和K2I4K2高效液相她LC)色譜 圖，
[002^ 圖3是本發(fā)明所述類磯脂結(jié)構(gòu)的自組裝短膚R2I4R2和K2I4K2的質(zhì)譜（M巧圖。
[00巧圖4是本發(fā)明所述類磯脂結(jié)構(gòu)的自組裝短膚R2I化和K2I4K2圓二色譜圖仰）。圖 中A和B顯示兩條短膚在195nm處有一強(qiáng)負(fù)峰，而在216處有一弱的負(fù)峰，峰形完好。
[002引圖5是本發(fā)明所述類自組裝短膚R2I4R2和K2I4K2的原子力顯微圖（AFM),圖中，C表示自組裝短膚R2I4R2自組裝2化后形成短的，交錯(cuò)的納米纖維；D表示自組裝短膚K2I4K2 自組裝2化后形成的納米支架結(jié)構(gòu)。
[0024] 圖6是本發(fā)明所述類磯脂結(jié)構(gòu)的自組裝短膚R2I化和K21嚴(yán)的剛果紅染 色圖片，圖中，A是R2I化在化，2h，化，她，2化，4她的剛果紅染色圖巧是K2I4K2在 化，2h，化，她，2化，4她的剛果紅染色圖。
[0025] 圖7則是用紫外可見光譜扣V)檢測(cè)本發(fā)明所述類磯脂結(jié)構(gòu)的自組裝短膚R2LR2和 K2I4K2延長(zhǎng)Taq酶在高溫下半衰期的過(guò)程圖。A是Taq酶在PCR體系緩沖液中的變化圖；B 和C則是分別加入R2I4R2和K2I4K2后的Taq酶含量變化圖。
[0026] 圖8則是Taq酶在高溫時(shí)，在不同保護(hù)材料中的半衰期變化圖。
[0027] 圖9是用qPCR驗(yàn)證本發(fā)明所述類磯脂結(jié)構(gòu)的自組裝短膚R2I4R2和K2I瓜能通過(guò)延 長(zhǎng)Taq酶半衰期來(lái)提高PCR的擴(kuò)增效率。A和B是自組裝短膚R2I4R2分別在Taq酶濃度為 2. 5U/ul和抓All時(shí)自組裝前（Oh)和自組裝后（2化）對(duì)PCR結(jié)果的影響；C和D是自組裝 短膚K2I4K2分別在Taq酶濃度為2.抓All和抓All時(shí)自組裝前（Oh)和自組裝后（2化）對(duì) PCR結(jié)果的影響。
[002引圖10是本發(fā)明所述類磯脂結(jié)構(gòu)的自組裝短膚R2LR2和K2I4K2加入PCR反應(yīng)體系后 反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0029] 圖11是本發(fā)明所述自組裝短膚R2I化用于煙草細(xì)胞的^維培養(yǎng)圖（100X)，培養(yǎng) 時(shí)間為7天。圖最后一排為高倍鏡（400X)下煙草細(xì)胞的分裂相。
[0030] 圖12是本發(fā)明所述自組裝短膚R2I4R2用于煙草細(xì)胞的立維培養(yǎng)的町晚澄/漠化 己錠（AO/EB)染色圖（40X物鏡）。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 實(shí)施例1 ;類脂狀結(jié)構(gòu)的自組裝短膚R2I化和K 21瓜的制備
[0032] 1、材料
[003引 FmocA-Arg(pbf)-OH(9-巧甲氧幾酷基精氨酸-丫-叔了氧幾酷基）、 Fmoc-Arg(pbf)-WangResin(9-巧甲氧幾酷基精氨酸-丫-叔了氧幾酷基-王樹 脂）、FmocA-Ile炬oc)-0H巧-巧甲氧幾酷基-k異亮氨酸-e-叔了氧幾酷基）， FmocA-LyS炬OC) -0H(9-巧甲氧幾酷基賴氨酸-e-叔了氧幾酷基）、TBTU(0-苯并S氮 挫-N，N，N'，N' -四甲基脈四氣棚酸醋）、皿TU(0-苯并S挫-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六 氣磯酸脂）和H0BT(1-哲基苯并S氮挫）、嗽晚、六氨化晚、醋酸酢、二氯甲燒；溶劑；DMF(N、 N-二甲基甲酯胺）、TFA(S氣己酸）、ACN(己膳）、冰己離。
[0034] 2、合成方法
[003引采用Fmoc (巧甲氧幾基）保護(hù)的固相合成法，具體步驟如下：
[0036] (1)第一個(gè)Arg的準(zhǔn)備；稱 0. 7mmol/g的Fmoc-Arg(pbf)-Wan濁esin30g，用 300ml 20%六氨化晚溶液脫FmoclOmin。抽濾后再用200mlDMF洗漆2次，每次時(shí)間2分鐘，甲醇 洗漆1次，二氯甲燒洗漆一次，再用200mlDMF洗漆2次，每次2分鐘，洗完后取少量樹脂做 巧S酬檢，結(jié)果呈陽(yáng)性。然后向反應(yīng)器中加入原料：
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一類自組裝短肽，其特征在于，該自組裝短肽的氨基酸序列為：XXlielielielie XX，其中X為Arg或Lys，當(dāng)X為Arg時(shí)命名為R2I4R2，當(dāng)X為L(zhǎng)ys時(shí)命名為K2I4K2，短肽氮端 乙?；?。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類自組裝短肽在穩(wěn)定Taq酶中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類自組裝短肽在增加PCR的擴(kuò)增效率中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類自組裝短肽中的R2I4R2在動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞三維培養(yǎng) 中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類自組裝短肽及其應(yīng)用，該自組裝短肽的氨基酸序列為：XX Ile Ile Ile Ile XX，其中X為Arg或Lys，當(dāng)X為Arg時(shí)命名為R2I4R2，當(dāng)X為L(zhǎng)ys時(shí)命名為K2I4K2。本發(fā)明提供了一類新型自組裝短肽，增加自組裝短肽類型。提供了一類新型的自組裝材料，這些材料能夠形成穩(wěn)定的納米纖維，該納米纖維能夠應(yīng)用于細(xì)胞三維培養(yǎng)，模擬體內(nèi)細(xì)胞生存的微環(huán)境，黏附細(xì)胞生長(zhǎng)因子，提供細(xì)胞體外生存三維微環(huán)境。提供了一類新型的自組裝材料，該類材料能夠穩(wěn)定Taq酶的結(jié)構(gòu)，提高PCR的擴(kuò)增效率，為分子生物學(xué)領(lǐng)域提供一種新的研究工具。
【IPC分類】C12N9-96, C12N5-04, C12N15-10, C07K7-06
【公開號(hào)】CN104725475
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510134719
【發(fā)明人】羅忠禮, 李萌萌, 于華婧, 劉運(yùn)成, 陳振銀, 徐曉帆, 李心遠(yuǎn), 譚卯, 譚焜月, 張姍姍, 張宇
【申請(qǐng)人】羅忠禮
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年3月26日