本發(fā)明公開了一種阻斷突觸長時程增強(LTP)的短肽及其應用，特別是在生物醫(yī)學領域方面的應用，屬于生物化學領域。
背景技術：
：神經(jīng)細胞的突觸前膜釋放神經(jīng)遞質，作用于神經(jīng)細胞的突觸后膜受體，形成神經(jīng)細胞之間的突觸信息傳遞。突觸信息傳遞存在可塑性，賦予大腦功能和結構的可塑性，是幾乎所有腦高級功能的根本基礎。根據(jù)神經(jīng)遞質可把突觸分為興奮性突觸和抑制性突觸。谷氨酸是興奮性神經(jīng)遞質，其離子型受體主要有NMDA(N-methyl-D-asparticacidreceptor，即N-甲基-D-天冬氨酸受體)和AMPA受體(α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體，AMPAR)。NMDA受體在調控突觸信息傳遞的可塑性中起著關鍵作用，最終表現(xiàn)為AMPA受體功能的長時程上調(long-termpotentiation,LTP)或下調(long-termdepression,LTD)，又統(tǒng)稱為突觸可塑性。突觸可塑性在許多腦高級功能中發(fā)揮著重要的作用，如學習和記憶。突觸可塑性的異常與谷氨酸過度興奮性毒性、許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病如創(chuàng)傷后應激綜合癥、毒品成癮、癲癇、老年癡呆及抑郁癥等密切相關。突觸可塑性可分為兩個階段：誘導和表達。突觸可塑性的誘導階段與NMDA受體功能密切相關。NMDA受體激活后可導致鈣離子內流，作為著名的第二信使觸發(fā)系列細胞內信號轉導，是突觸可塑性誘導的關鍵步驟。阻斷NMDA受體，不僅能阻斷突觸可塑性LTP和LTD，也潛在損傷許多類型的學習記憶和認知功能。NMDA受體激活后，最終可調節(jié)AMPA受體功能如通過磷酸化、或使AMPA受體在突觸后膜插入、或使AMPA受體在突觸后膜下膜，這些均會導致AMPA受體介導的興奮性突觸后膜電流長時程的增加(LTP)或減少(LTD)，是突觸可塑性表達的關鍵步驟。阻斷LTP或LTD的表達階段，由于不影響AMPA受體的基礎傳遞和NMDA受體功能，因而對許多類型的正常學習記憶和認知功能影響不大，不僅能避免谷氨酸過度興奮性毒性，也可避免異常記憶的鞏固。例如經(jīng)歷災難性事件或戰(zhàn)爭，可形成病理性突觸可塑性LTP，導致恐懼記憶的持久不消退，因而嚴重影響其生活質量。選擇性阻斷這種病理性LTP的表達，就能預防和治療創(chuàng)傷后應激綜合癥。迄今為止，還沒有選擇性阻斷突觸可塑性LTP表達，但同時又不影響NMDA受體功能及其信號轉導的藥理學手段的文獻報道。突觸可塑性LTP在許多病理情況下產(chǎn)生，如經(jīng)歷創(chuàng)傷性事件、缺氧缺血導致的谷氨酸過度興奮性、癲癇、攝取成癮性藥物等，可導致神經(jīng)系統(tǒng)持久的病理性改變如創(chuàng)傷或成癮記憶等。因此，發(fā)現(xiàn)選擇性阻斷突觸可塑性LTP的表達，對突觸可塑性LTD和NMDA受體功能及其信號轉導沒有影響的藥物或途徑的短肽，不僅可作為相關研究領域的新工具，也可作為新途徑應用于治療或預防病理條件下突觸可塑性LTP的表達所帶來的系列疾病或谷氨酸過度興奮性毒性。技術實現(xiàn)要素：：針對以上技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種能夠阻斷突觸可塑性LTP表達，而對突觸的長時程抑制(LTD)和NMDA受體功能沒有影響的短肽。本發(fā)明提供一種阻斷突觸長時程增強(LTP)的短肽，短肽的氨基酸序列為LysGluGlyTyrAspValTyrGlyIleGlu或LysGluGlyTyrAspValTyrGlyLeuGlu，該短肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。本發(fā)明的短肽可以通過本領域已知的方法人工合成，本發(fā)明短肽由GLBiochem(上海)有限責任公司合成。本發(fā)明的另一個目的是提供阻斷突觸長時程增強(LTP)短肽修飾肽。通過在短肽N端和C端通過添加化學基團、氨基酸、多肽、蛋白質、標記物等物質進行各種化學或生物修飾，形成短肽修飾肽，以優(yōu)化改善其穩(wěn)定性等理化性質、提高或增加其應用性和應用范圍。特別地，本發(fā)明公開了在不改變本發(fā)明短肽的空間結構和穩(wěn)定性的前提下，在短肽的N端和C端分別進行和穿透細胞膜功能和熒光標記修飾，以增加短肽的穿透細胞功能和熒光標記功能。進一步地，在短肽的N端或C端連接上具有穿透細胞膜功能的Tat序列形成具有穿透細胞膜功能的短肽。進一步地，在具有穿透細胞膜功能的短肽修飾肽的另一端——N端或C端連接上熒光標記物，形成被熒光標記并可穿透細胞膜的短肽。通過生物信息學技術，分析組成AMPA受體亞單位GluR2的人類同源序列在不同物種中的保守區(qū)域，其中針對GluR2保守區(qū)域中潛在與LTP表達相關的區(qū)域進行了分子生物學、神經(jīng)電生理和行為學實驗。其基本理論是如果這些保守區(qū)域有重要的功能，那么人工合成該片段短肽，加入到細胞內就能競爭性干擾其正常功能，最終阻斷LTP表達。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些保守區(qū)域中涉及的短肽具有選擇性阻斷LTP的功效。通過試驗證實，本發(fā)明的短肽及短肽修飾肽能阻斷谷氨酸AMPA受體亞基轉運上膜上來阻斷LTP，并且可劑量依賴的抑制恐懼記憶的提取。采用條件反射大鼠模型研究恐懼記憶，發(fā)現(xiàn)短肽對恐懼記憶的獲得沒有影響，但能特異抑制恐懼記憶的提取，從而減輕或消除恐懼記憶。這些發(fā)現(xiàn)表明短肽能選擇性阻斷LTP，應用于病理性LTP相關疾病的預防和治療中，具有良好的應用前景。因此，本發(fā)明還提供短肽或短肽修飾肽的應用，特別是短肽或短肽修飾肽在建立與谷氨酸過度興奮性疾病相關疾病或病理性突觸可塑性LTP相關疾病的實驗動物模型中應用，或者在制備用于治療或預防與谷氨酸過度興奮性疾病或病理性突觸可塑性LTP相關疾病藥物方面的應用。因此，本發(fā)明還提供所述阻斷突觸長時程增強(LTP)的短肽或短肽修飾肽的應用。進一步地，所述的阻斷突觸長時程增強(LTP)的短肽或短肽修飾肽在用于建立與谷氨酸過度興奮性疾病相關疾病或病理性突觸可塑性LTP相關疾病的實驗動物模型中的應用，或者在制備用于治療或預防與谷氨酸過度興奮性疾病或病理性突觸可塑性LTP相關疾病藥物方面的應用。進一步地，所述的阻斷突觸長時程增強(LTP)的短肽或短肽修飾肽在制備抑制恐懼記憶的提取藥物或研究恐懼記憶提取動物模型中的應用。本發(fā)明短肽的工作原理:AMPA受體功能如通過磷酸化、或使AMPA受體在突觸后膜插入從而轉運到突觸內，這些均會導致AMPA受體介導的興奮性突觸后膜電流長時程的增加(LTP)，是突觸可塑性表達的關鍵階段。短肽進入細胞后，可與AMPA受體的亞基胞內末端及其下游分子結合，阻止AMPA受體的亞基轉運到突觸膜上，以及促進突觸膜上的AMPA亞基轉運到細胞內，從而阻止LTP的表達。本發(fā)明的有益效果：1)本發(fā)明的短肽來自于運用生物信息學的方法把篩選出一種新型的短肽，能夠選擇性地阻斷突觸可塑性LTP表達，而對突觸可塑性LTD和NMDA受體功能沒有顯著影響。2)該短肽毒副作用低，特異性高。該短肽可以穿透血腦屏障及進入細胞內，因此，該領域研究人員可以最大限度的使用本發(fā)明來開展相關研究。3)可以在短肽N端和C端通過添加化學基團、氨基酸、多肽、蛋白質、標記物等物質進行各種化學或生物修飾，形成短肽修飾肽，以優(yōu)化改善其穩(wěn)定性等理化性質、提高或增加其應用性和應用范圍。4)利用本發(fā)明的短肽或短肽修飾肽在制備用于治療或預防與谷氨酸過度興奮性疾病或病理性突觸可塑性LTP相關疾病的藥物或在建立及研究與谷氨酸過度興奮性疾病相關疾病或病理性突觸可塑性LTP相關疾病的實驗動物模型中有廣泛的應用前景。附圖說明圖1為帶穿膜肽的短肽KE10短肽的高壓液相色譜圖；圖2為帶穿膜肽的對照肽SKE10短肽的高壓液相色譜圖；圖3為帶熒光和穿膜肽的KE10(Tat-KE10-FITC)短肽的高壓液相色譜圖；圖4為顯微鏡下，20倍放大所見下海馬CA1細胞內分布的Tat-KE10-FITC的分布圖。圖5為顯微鏡下，60倍放大所見下海馬CA1細胞內分布的Tat-KE10-FITC的分布圖。具體實施方式下面結合實施例進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件進行或配置，未注明來源的產(chǎn)品均可通過市場途徑獲得。實施例1本發(fā)明短肽的合成本發(fā)明短肽序列KEGYNVYGIE(KE10)或KEGYNVYGLE(KE10A)及其對照肽KGAEVGINEA(SKE10)或修飾肽的合成均通過本領域已知、成熟方法進行，由GLBiochem(上海)有限責任公司合成。如圖1、圖2和圖3中HPLC色譜圖所示，所有合成短肽產(chǎn)品經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)分析進行純度鑒定，純度均大于90％，符合設計要求。實施例2短肽修飾肽本發(fā)明公開了在不改變短肽的空間結構和穩(wěn)定性的前提下，在短肽的N端和C端分別進行和穿透細胞膜功能和熒光標記修飾，以增加短肽的穿透細胞膜的功能和熒光標記功能。將短肽KE10的C端或N端接上可穿透細胞膜的Tat序列(YGRKKRRQRRR),形成Tat-KE10，在此基礎上再連接上熒光基團FITC，形成帶綠色熒光的Tat-KE10-FITC，配制為3mM的溶液。選用250g雄性SD大鼠，按1ml/kg的體積給予大鼠腹腔注射。注射3小時后將動物用戊巴比妥鈉(80mg/kg)進行深麻醉后進行免疫組織熒光檢測，具體方法參見單麗麗等發(fā)表的論文，簡要敘述如下：動物深麻醉后按順序用生理鹽水和4％PFA灌流，再用4％PFA固定24小時。用30％蔗糖脫水24小時后，以40μm的厚度切片。PBS洗脫3次，0.3％Triton孵育30分鐘，PBS再次洗脫3次，5％BSA封閉30分鐘后表片，隨后進行confocol鏡檢。(1)實驗結果如圖4和圖5所示，腹腔注射短肽Tat-KE10-FITC確實進入了大鼠腦內，并可在海馬細胞中檢測到，在細胞胞體和樹突區(qū)域均有分布。實施例3短肽的活性：短肽KE10及KE10A可以阻斷突觸可塑性LTP的表達，而對突觸可塑性LTD無影響。(1)實驗方法本實驗選用短肽KEGYNVYGIE(KE10)、KEGYNVYGLE(KE10A)進行實驗；同時，以對照序列短肽KGAEVGINEA(SKE10)作為對照短肽作系列對照實驗。選擇使用19-21天SD雄性大鼠，采用離體腦片電生理技術，記錄海馬CA1區(qū)突觸可塑性，具體方法參見韓會麗等發(fā)表的論文，簡要敘述如下：動物乙醚麻醉至肌張力消失后快速斷頭。剝離顱骨暴露腦表面后將全腦取出，修成所需形狀后放入預先冷卻至冰水混合并連續(xù)充灌95％O2和5％CO2的人工腦脊液中切片(400μm)，在35±1℃下孵育20-60分鐘后，放置室溫(22-25℃)。使用人工腦脊液持續(xù)循環(huán)灌流，調節(jié)流速至4-5ml/min。記錄電極電阻值為3-4Ω。由于短肽本身無法進入細胞膜，因此短肽及對照肽均需使用細胞內給藥的方式進行，在此實驗條件下，短肽或其對照肽需配制于記錄電極內液，電極放置于海馬CA1區(qū)胞體層，并與細胞膜形成封接(電阻>GΩ)，隨后給予細胞負壓破膜，從而使電極內液中的短肽或其對照肽進入細胞內。在刺激電極上施加一定大小的刺激方波(波寬0.1ms)，在記錄電極上給予-70mV的穩(wěn)壓，并使用GABAA受體阻斷劑阻斷抑制性突觸電流，從而記錄興奮性突觸后膜電流(fieldexcitatorypostsynapticcurrent，EPSC)。以30秒/次的采樣頻率記錄穩(wěn)定基線10分鐘后，施加高頻(100Hz,100個刺激方波/串，3串，間隔20秒)刺激方波誘導LTP或施加低頻(1Hz，900個刺激方波)刺激方波誘導LTD。LTP或LTD取誘導后最后20分鐘平均值，所有數(shù)據(jù)以自身基線為100％作歸一化，表示為平均值±標準誤。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用One-wayANOVA統(tǒng)計差異顯著性，并用LSD法比較各加藥組與溶劑對照組的差異，顯著差異設置為P<0.05，以*標記。(2)實驗結果如表1所示，將短肽KE10、KE10A或SKE10配制于電極內液中，使其終濃度為5μM，發(fā)現(xiàn)短肽KE10、KE10A可以有效阻斷LTP，但隨機序列短肽SKE10無此功效。同時盡管KE10、KE10A功效類似，但在相同濃度下KE10的功效遠強于KE10A，因此在以下實施例中，均以KE10作為優(yōu)選短肽為例進行實驗。表1.短肽阻斷海馬突觸可塑性LTP分組給藥方法給藥劑量腦片數(shù)量LTP幅度P值電極內液電極內液-4159.45±29.84-電極內液+SKE10電極內液5μM4142.16±28.230.83電極內液+KE10電極內液5μM487.89±5.05<0.001*電極內液+KE10A電極內液5μM4107.98±9.670.03*如表2所示，將短肽KE10或SKE10配制于電極內液中，使其終濃度為5μM，發(fā)現(xiàn)與溶劑對照相比，短肽KE10及隨機對照短肽SKE10均對海馬突觸可塑性LTD無顯著影響。表2.短肽及其對照肽對海馬突觸可塑性LTD無顯著影響分組給藥時間給藥劑量腦片數(shù)量LTD幅度P值電極內液電極內液-547.86±5.65％電極內液+SKE10電極內液5μM543.14±12.06％0.85電極內液+KE10電極內液5μM553.34±9.40％0.88實施例4短肽修飾肽的活性：短肽KE10的修飾肽Tat-KE10也可以阻斷突觸可塑性LTP的表達(1)實驗方法本實驗選用短肽KEGYNVYGIE(KE10)接上具有穿透細胞膜能力的Tat短肽(YGRKKRRQRRR)，形成Tat-KE10進行，同時，以對照序列短肽KGAEVGINEA(SKE10)接上具有穿透細胞膜能力的Tat短肽，形成Tat-SKE10作為對照短肽做對照實驗。選擇18-22g雄性昆明小鼠，采用離體腦片電生理技術，記錄海馬CA1區(qū)突觸可塑性。腦片制備方法與實施例3的制備方法一致。由于多肽進行穿膜肽修飾后，可自由穿透細胞膜進入細胞內，因此給藥方式可以通過循環(huán)液給藥。在此實驗條件下，記錄電極放置于海馬CA1區(qū)樹突層，刺激電極放置于Schaffer側枝。在刺激電極上施加一定大小的刺激方波(波寬0.1ms)，記錄興奮性突觸后膜電位(fieldexcitatorypostsynapticpotential，fEPSP)。以30秒/次的采樣頻率記錄穩(wěn)定基線20分鐘后，施加高頻(100Hz,100個刺激方波/串，3串，間隔20秒)刺激方波誘導LTP或施加低頻(1Hz，900個刺激方波)刺激方波誘導LTD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用One-wayANOVA統(tǒng)計差異顯著性，并用LSD法比較各給藥組與溶劑對照組的差異。顯著差異設置為P<0.05，以*標記。(2)實驗結果如表3所示，以1:1000的體積比在腦片孵育液中給予Tat-KE10或Tat-SKE10，使其終濃度分別為1、3、6或12μM，發(fā)現(xiàn)Tat-KE10能劑量依賴性地阻斷LTP，但隨機序列短肽Tat-KE10對LTP沒有明顯作用。提示與未經(jīng)修飾的短肽KE10類似，經(jīng)穿膜肽修飾的短肽Tat-KE10也具有阻斷LTP的功效。表3.短肽劑量依賴性地阻斷海馬突觸可塑性LTP如表4所示，以1:1000的體積比在腦片孵育液中給予Tat-KE10或Tat-SKE10，達到終濃度6μM(為可以特異阻斷LTP的劑量)，發(fā)現(xiàn)無論Tat-KE10或隨機序列短肽Tat-SKE10均對LTD沒有明顯作用，提示與未修飾的短肽KE10類似，Tat-KE10只特異阻斷LTP而不干擾LTD。表4.短肽及其對照肽對海馬突觸可塑性LTD沒有顯著影響分組給藥時間給藥劑量腦片數(shù)量LTD幅度P值水提前3小時-587.88±3.61％Tat-SKE10提前孵育3小時6μM582.97±5.58％0.83Tat-KE10提前孵育3小時6μM585.97±2.58％0.95實施例5短肽對NMDA受體功能無影響由于帶穿膜肽的短肽Tat-KE10功效與未經(jīng)修飾的短肽KE10一致，且因具有可穿透細胞膜的功能而具有更加方便的給藥方式，因此在后續(xù)實施例中，用Tat-KE10為例進行實驗。(1)實驗方法選擇使用19-21天SD雄性大鼠，采用離體腦片電生理技術，記錄海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細胞的NMDA電流，具體方法參見董志芳等發(fā)表的論文。簡要敘述如下：腦片制備方法如實施例3。記錄時，刺激電極放置于CA1區(qū)樹突層，記錄電極放置于海馬CA1區(qū)胞體層，并與細胞膜形成封接(電阻>GΩ)，隨后給予細胞負壓破膜。在記錄電極上給予+40mV穩(wěn)壓并在循環(huán)液中加入AMPA/kinate受體阻斷劑CNQX和GABAA受體阻斷劑picrotocxin，以記錄NMDA電流，刺激電極給予2/3最大刺激量，記錄NMDA電流。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用One-wayANOVA統(tǒng)計差異顯著性，并用LSD法比較各給藥組與溶劑對照組的差異。顯著差異設置為P<0.05，以*標記。(2)實驗結果如表5所示，以1:1000的體積比在腦片孵育液中給予Tat-KE10或Tat-SKE10，使其終濃度分別為6μM，發(fā)現(xiàn)短肽及對照肽均對NMDA電流均無影響。表5.短肽及其對照肽對NMDA電流無顯著影響分組給藥時間給藥劑量細胞數(shù)量NMDA電流(pA)P值水提前3小時-10110.90±11.61Tat-SKE10提前孵育3小時6μM10118.36±13.180.67Tat-KE10提前孵育3小時6μM10119.79±12.450.61實施例6短肽阻斷谷氨酸AMPA受體亞基轉運上膜(1)實驗方法為了理解KE10短肽阻斷突觸可塑性LTP的分子機制，通過分子生物學技術研究了KE10短肽對AMPA受體亞單位GluR2的膜轉運影響。具體方法參見韓靜等發(fā)表的論文。簡要說明如下，如前所述制備動物海馬腦片，在孵育液(人工腦脊液)中以1:1000體積比加入溶劑對照(水)，Tat-KE10或Tat-SKE10，使藥物終濃度為6μM，孵育120分鐘后，在含有Glycine的人工腦脊液中孵育5分鐘，隨后用不含藥物也不含有Glycine的腦脊液洗脫3次，放回含溶劑對照或藥物的孵育液中繼續(xù)孵育30分鐘。之后放入含1mg/mLbiotin的腦脊液中冰上震蕩孵育30分鐘后用洗脫液洗脫3次，丟棄洗脫液，加入勻漿液冰上勻漿，1000rpm，10分鐘，4℃離心取上清，重復一次后取50μL保存為總蛋白。剩余上清10000rpm，30分鐘，4℃離心，棄上清，加裂解液冰上超聲，25000g，15分鐘，4℃離心，取上清作為突觸體蛋白。用Neutravidin珠子拉下細胞表面結合biotin的蛋白作為突觸膜表面的蛋白。以總蛋白中的內參蛋白Tubulin矯正上樣量，用western檢測蛋白方法檢測總蛋白和突觸膜表面蛋白中的GluR2。使用ImagineJ軟件分析條帶灰度。比較膜表面GluR2與總蛋白中GluR2的比值。將空白對照的比值作為100％進行歸一化，以mean±s.e.m.％表示。數(shù)據(jù)分析采用One-wayANOVA統(tǒng)計差異顯著性，并用LSD法比較各給藥組與溶劑對照組的差異以及與空白對照組的差異。顯著差異設置為P<0.05，以*標記。(2)實驗結果Glycine是已知可以誘導LTP并導致GluR2轉運到突觸膜上的工具藥。如表6所示，單獨使用Glycine可致使GluR2的膜轉運效率增加，實驗發(fā)現(xiàn)：Tat-KE10短肽可以阻止Glycine誘導的GluR2膜轉運效率增加，而對照序列無此效應。表6.短肽可阻斷Glycine誘導的GluR2上膜實施例7短肽的應用：短肽可劑量依賴的抑制恐懼記憶的提取突觸可塑性LTP的表達在記憶提取中起著重要作用。已有研究表明,從丘腦和皮層到外側杏仁核突觸的長時程增強(LTP)是編碼恐懼記憶的機制(McKernan&Shinnick–Gallagher,1997；Rogan,Staubli,&LeDoux,1997)。因此，采用行為學方法進一步探索了短肽通過阻斷突觸可塑性LTP的表達，在恐懼記憶中的作用。在條件反射箱中，經(jīng)歷足底電刺激的小鼠，在條件反射箱中會表現(xiàn)出僵立行為。48h后再次把動物暴露在條件反射箱中，小鼠的僵立行為用于評價恐懼記憶。(1)實驗方法環(huán)境條件恐懼測試用來檢測動物對應激事件的恐懼學習和記憶。裝置由一個特制可通電的箱子(長×寬×高：30.5厘米×24厘米×24厘米)嵌套在一個通風隔音箱(長×寬×高：63厘米×43厘米×63厘米)里(MEDAssociates，St.Albans，VT)。將大鼠放在盒中，讓其自由探索2分鐘，然后給予6次足部電刺激(0.8毫安，2秒)，電擊選用隨機間隔，平均間隔時間為90秒。經(jīng)過訓練形成關聯(lián)性條件化恐懼，最后一次電刺激后1分鐘將大鼠拿回到籠子。小鼠在足部電刺激后會出現(xiàn)暫時的僵立狀態(tài)，除了呼吸和緩慢的鐘擺式動作所有運動停止。記錄小鼠在每次足部電刺激后的僵立時間。在小鼠回籠48小時后，將其重新放回到裝置里11分鐘，不給足部電刺激，記錄前6分鐘內動物僵立時間，與6分鐘相比表示為mean±s.e.m.％，從而反映小鼠的關聯(lián)性條件化恐懼記憶的程度。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用One-wayANOVA統(tǒng)計差異顯著性，并用LSD法比較各給藥組與生理鹽水組的差異。顯著差異設置為P<0.05，以*標記。(2)實驗結果如表7所示，隨著足底電刺激次數(shù)的增加，動物表現(xiàn)出的僵立行為也逐漸增加，其中注射Tat-SKE10和Tat-KE10的動物在恐懼條件反射的建立過程中沒有顯著差異。該結果表明，Tat-KE10對記憶的獲取沒有顯著影響。表7.短肽對記憶的獲取沒有顯著影響如表8所示，恐懼記憶訓練結束后，48h后提取恐懼記憶前，給動物注射Tat-SKE10或Tat-KE10，注射時間點為提取前180min。實驗結果發(fā)現(xiàn)Tat-SKE10對記憶提取沒有顯著影響，但Tat-KE10能劑量依賴的抑制恐懼記憶的提取。表8.短肽可劑量依賴的抑制恐懼記憶的提取綜上實驗表明，本發(fā)明采用生物信息學方法分析不同物種AMPA受體亞單位GluR2的人類同源序列，發(fā)現(xiàn)GluR2的C端存在高度保守區(qū)域，并據(jù)此設計了短肽，其中還包括具有穿透細胞膜能力的和標記有熒光基團的短肽。上述實驗表明，短肽中的KEGYNVYGIE序列在系統(tǒng)進化中具有高度的GluR2專一性。采用電生理技術研究海馬突觸可塑性，發(fā)現(xiàn)短肽能選擇性阻斷突觸的長時程增強(LTP)，對突觸長時程抑制(LTD)沒有影響。通過對海馬細胞膜上的GluR2的檢測，發(fā)現(xiàn)短肽通過阻斷谷氨酸AMPA受體亞基GluR2轉運到突觸膜上來阻斷LTP。采用條件反射大鼠模型研究恐懼記憶，發(fā)現(xiàn)短肽對恐懼記憶的獲得沒有影響，但能特異抑制恐懼記憶的提取，從而減輕或消除恐懼記憶。這些發(fā)現(xiàn)表明利用本發(fā)明的短肽或短肽修飾肽在制備用于治療或預防與谷氨酸過度興奮性疾病或病理性突觸可塑性LTP相關疾病的藥物或在建立與谷氨酸過度興奮性疾病相關疾病或病理性突觸可塑性LTP相關疾病的實驗動物模型中有廣泛的應用前景。SEQUENCELISTING<110>中國科學院昆明動物研究所<120>一種阻斷突觸長時程增強（LTP）的短肽及其應用<130>2016<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<212>PRT<213>人工系列<400>1LysGluGlyTyrAspValTyrGlyIleGlu1510<210>2<212>PRT<213>人工系列<400>2LysGluGlyTyrAspValTyrGlyLeuGlu1510當前第1頁1 2 3