專利名稱:一種中性植酸酶、編碼該酶的基因以及含有該酶的飼料的制作方法
本發(fā)明涉及一種植酸酶，編碼這種植酸酶的基因和含有這種酶的飼料。
磷是一種所有動(dòng)物生長(zhǎng)都需要的重要礦物質(zhì)。磷占動(dòng)物機(jī)體礦物質(zhì)總量的四分之一還多，其中80％的磷以羥磷灰石的形式存在于骨胳中。骨骼不僅作為身體的骨架，而且也是鈣、磷和其他礦物質(zhì)的貯存庫(kù)，當(dāng)需要時(shí)它們能動(dòng)員到其它組織中。另外的20％的磷存在于肌肉、血液和其它軟骨組織中，它們作為許多有機(jī)化合物的組成成分，參與體內(nèi)幾乎每一種生命所需的生理生化反應(yīng)。由于磷有如此重要的生物學(xué)功能，所以在動(dòng)物日糧中提供充足的磷是非常重要的。否則，組織的生長(zhǎng)受到抑制、骨骼變軟變脆，長(zhǎng)期磷缺乏會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)動(dòng)物的佝僂病和成年動(dòng)物的骨質(zhì)疏松癥，從而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。
目前在單胃動(dòng)物如雞、豬等飼料和魚(yú)類飼料中是添加無(wú)機(jī)磷如磷酸氫鈣、磷酸二氫鈣來(lái)滿足動(dòng)物對(duì)磷的需求。但是在主要以植物性飼料為主的動(dòng)物日糧中本身就含有豐富的磷，只不過(guò)是因?yàn)樗鼈冎饕詣?dòng)物不能利用的植酸磷的形式存在而已。
植酸磷是谷物、豆類和油料等作物籽實(shí)中磷和肌醇的基本貯存形式，含量高達(dá)1-5％(Lolas M.Et a1.Food Sci.421094-1097，1977).它占植物中總磷的60-80％(Nelson T.S.Poultry Sci.47862-871，1967).但是以植酸磷形式存在的磷卻因單胃動(dòng)物體內(nèi)缺乏能分解植酸的酶而難以被利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the Feed Industry，Lyons T.P.ed.AlltechTechnical Publication，Nicholasville，KY，133-145)，其利用率僅在0-40％。
植酸磷不能被單胃動(dòng)物和魚(yú)類有效利用，從而在飼喂過(guò)程中造成了許多問(wèn)題，第一、造成磷源浪費(fèi)。一方面飼料中的磷源不能得到有效利用，另一方面為了滿足動(dòng)物對(duì)磷的需求，又必須在飼料中額外添加無(wú)機(jī)磷，提高了飼料成本。在實(shí)際生產(chǎn)中，添加無(wú)機(jī)磷時(shí)還常因無(wú)機(jī)磷中殘留有氟、重金屬等元素而造成動(dòng)物中毒。第二、形成高磷糞便而污染環(huán)境。飼料中85％左右的植酸磷會(huì)被動(dòng)物直接排出體外，糞便中大量的磷使水和土壤受到嚴(yán)重污染。目前許多歐洲國(guó)家如荷蘭等已因此問(wèn)題開(kāi)始限制畜禽的養(yǎng)殖數(shù)量。我國(guó)是畜牧生產(chǎn)大國(guó)，單胃動(dòng)物占畜禽總數(shù)的比例遠(yuǎn)高于西方國(guó)家，因此，防止磷對(duì)環(huán)境的污染在我國(guó)更具有特殊的意義。第三、植酸磷還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它在動(dòng)物腸胃道的消化吸收過(guò)程中會(huì)與多種金屬離子Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白質(zhì)螯合成相應(yīng)的不溶性復(fù)合物，從而降低了動(dòng)物對(duì)這些營(yíng)養(yǎng)元素的有效利用(Sharma C.B.et al.，Phytochemistry.17201-204，1978)。
植酸酶(EC.3.1.3.8)是一種能水解植酸的酶類。它能將植酸磷降解為肌醇和磷酸。植酸酶廣泛存在于微生物中，如假單孢桿菌(Cosgrove D.J.，Austral.J.Biol.Sci.231207-1220，1970)，乳酸桿菌(Shirai K.，LettersAppl.Biol.Sci.19366-369，1994)，大腸桿菌(Greiner R.，Arch Biochem.Biophys.303107-113，1993)，酵母(Nayini N.R.et al.Lebensm Wiss.Technol.1724-26，1984)，曲霉(Yamada K.et al.Agric.Biol.Chem.321275-1282，1986；Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)。其中來(lái)源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)具有較好的耐熱性，在酸性條件下有較高的酶活性，被認(rèn)為是目前最有應(yīng)用前景的飼用植酸酶，它的最適pH值為2.5和5.5，最適溫度為55℃，特異比酶活性為1×105U/mg酶蛋白。
植酸酶對(duì)單胃動(dòng)物的飼喂效果已在世界范圍內(nèi)得到了確證(Ware J.H.et al.，US Patent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition 1011289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.471842-1848，1968)。它可使植物性飼料中磷的利用率提高60％，糞便中磷排泄量減少40％，還可降低植酸磷的抗?fàn)I養(yǎng)作用。因此對(duì)提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益及降低植酸磷對(duì)環(huán)境的污染有重要意義。
以往的研究都集中在用于單胃畜禽動(dòng)物飼料中的酸性植酸酶，多種微生物來(lái)源的酸性植酸酶的編碼基因已被分離克隆，如來(lái)源于酵母Saccharomyces cerevisiae(Bajwa et al.，1984；Meyhack et al.，1982)、Aspergillus niger(MacRae，1988)、A.terreus和Myceliophthora thermophila(Van Loon，1995)、A.niger(ficuum)(Van Hartimgsveldt et al.，1993；Ehlich etal.，1993；Bin Y et al.，1998)、A.niger var.awamori(Piddington et al.，1993)、Talaromyces thermophilus(Pasamontes L et al.，1997)、Talaromyceslanuginosus(Berka R M et al.，1998)、Emericella nidulans(Pasamontes L et al.1997)、Schwanniomyces occidentalis(Mochizuki，1998)等的植酸酶。這些植酸酶的最適pH都在6.0以下，在pH6.5以上基本沒(méi)有酶活性。
但這些植酸酶卻不能用于無(wú)胃的魚(yú)類飼料中。絕大多數(shù)淡水魚(yú)類如清魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)、鯉魚(yú)、鯽魚(yú)、魴魚(yú)等和部分海水養(yǎng)殖魚(yú)類均是無(wú)胃魚(yú)類。對(duì)單胃畜禽而言，植酸酶的主要作用場(chǎng)所是單胃動(dòng)物酸性的胃中，因而要求植酸酶在酸性條件下要有較高的酶活性，即酶反應(yīng)的最適pH值為酸性的植酸酶，如國(guó)外目前商品化生產(chǎn)的來(lái)源于A.ficuumNRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom et al.，1995)，它的最適pH值為2.5和5.5。我國(guó)用基因工程酵母生產(chǎn)的植酸酶PHYA2最適pH值為1.8和5.5(姚斌等，中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN1184156A)。
而對(duì)于淡水養(yǎng)殖的主要魚(yú)類來(lái)說(shuō)，它無(wú)胃，只有pH值呈中性(pH6.5～8.0)的腸道，因而在魚(yú)類飼料中必需使用在中性pH值條件下有高活性的植酸酶。目前商品化生產(chǎn)的用于單胃畜禽的植酸酶在中性pH值環(huán)境下基本沒(méi)有酶活性，因而不能用于這些魚(yú)類飼料。本發(fā)明所述的具有中性植酸酶活性的植酸酶是指最適pH在6-9的植酸酶。
本發(fā)明的一個(gè)目的是篩選一種反應(yīng)最適pH在中性的、能用于無(wú)胃魚(yú)類的中性植酸酶并克隆中性植酸酶的編碼基因，為進(jìn)一步通過(guò)基因工程的方法，利用重組生物反應(yīng)器來(lái)工業(yè)化廉價(jià)生產(chǎn)中性植酸酶提供基因資源。
本發(fā)明人提出了一種新思路，即在如淡水鯉科魚(yú)類等無(wú)胃魚(yú)類飼料中應(yīng)用中性植酸酶，從而提高魚(yú)類飼料中磷的利用率、降低飼料成本、提高魚(yú)類的生產(chǎn)性能、減輕水域的磷污染。目前，國(guó)內(nèi)外還未有人提出在魚(yú)類飼料中應(yīng)用中性植酸酶的思路，也未有中性植酸酶的生產(chǎn)及在魚(yú)類飼料中的實(shí)際應(yīng)用。
本發(fā)明篩選到一種天然菌株，它所產(chǎn)生的植酸酶適合于在魚(yú)類飼料中使用。這種植酸酶必須在中性pH范圍內(nèi)具有高的酶活性。本發(fā)明篩選到的枯草芽胞桿菌酸Bacillus subtilis 98所產(chǎn)生的植酸酶的最適pH值為7.5，在中性的范圍內(nèi)。這種性質(zhì)使其具備了優(yōu)良的特性，適合應(yīng)用于淡水魚(yú)類飼料，在魚(yú)的腸道中起作用。這種性質(zhì)的植酸酶還未曾有過(guò)報(bào)道，例如，國(guó)外目前商品化生產(chǎn)的來(lái)源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom et al.，1995)的最適pH為5.5和2.5，在pH6以上基本沒(méi)有活性，只能應(yīng)用于單胃動(dòng)物飼料中而不能用于淡水魚(yú)類飼料中。
本發(fā)明的篩選到的天然菌株所產(chǎn)生的植酸酶在常溫下具有高活性，即中溫型植酸酶，因?yàn)檫@種植酸酶在魚(yú)類飼料中應(yīng)用時(shí)，它的作用場(chǎng)所是魚(yú)類的腸道中，而魚(yú)腸道的溫度在15～30℃。本發(fā)明篩選到的Bacillussubtilis 98中性植酸酶最適溫度為55℃，為中溫型植酸酶，在15～30℃的范圍內(nèi)具有較高活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，這種中性植酸酶具有良好的飼喂效果，一方面添加中性植酸酶可以顯著提高鯉魚(yú)對(duì)飼料中磷的表觀消化率，減少單位增重的磷排出量，可以減輕磷污染。另一方面每kg飼料中添加1000U的中性植酸酶可以滿足鯉魚(yú)正常生長(zhǎng)對(duì)磷的需要，其生長(zhǎng)效果與添加1.3％的磷酸二氫鈣相同，無(wú)需額外添加無(wú)機(jī)磷。這是首次證明了中性植酸酶適合于在無(wú)胃魚(yú)類飼料應(yīng)用并有良好的飼喂效果。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的中性植酸酶的基因，為此基因的改造并在各種外源基因表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)提供優(yōu)良的基因材料。通過(guò)PCR的方法分離克隆了這一植酸酶基因nphyA，DNA全序列分析結(jié)果表明，此基因全長(zhǎng)1152個(gè)核苷酸，編碼383個(gè)氨基酸，根據(jù)信號(hào)肽序列的結(jié)構(gòu)規(guī)則推斷，N-端的26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+26位的Ala之后，這一結(jié)果與成熟酶的N端氨基酸序列測(cè)定結(jié)果一致。此中性植酸酶的基因序列與以往大量報(bào)道的來(lái)源于絲狀真菌和植物的植酸酶基因均無(wú)同源性，也不含有絲狀真菌和植物來(lái)源的植酸酶蛋白中均存在的高度保守序列RHGARYPT。
本發(fā)明還提供了一種使它能在各種表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)的方法，包括植酸酶基因改造和表達(dá)系統(tǒng)的選擇?；虻母脑炜衫肞CR技術(shù)、定點(diǎn)突變技術(shù)、基因設(shè)計(jì)后化學(xué)合成等技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。可選擇的表達(dá)系統(tǒng)包括低等真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母、絲狀真菌等；原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌、桿狀病毒等；高等真核表達(dá)系統(tǒng)如玉米、大豆、水稻、豬、雞、鴨及各種魚(yú)類和昆蟲(chóng)等。本發(fā)明中，我們通過(guò)PCR的方法將植酸酶基因nphyA原有的信號(hào)肽序列除掉，改造后的植酸酶基因以正確的閱讀框架插入到大腸桿菌高效表達(dá)載體pTYB40上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，得到重組菌株，重組菌株均培養(yǎng)后表達(dá)中性植酸酶蛋白。結(jié)果表明，中性植酸酶在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，表達(dá)的中性植酸酶蛋白約40Kda，與根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)出來(lái)的理論分子量相一致，其表達(dá)量達(dá)到大腸桿菌可溶性蛋白的40％左右，并具有正常的生物學(xué)活性。表達(dá)的中性植酸酶蛋白與天然菌株Bacillus subtilis 98中的植酸酶相比，在酶學(xué)性質(zhì)上無(wú)顯著差異。
本發(fā)明分離了一種酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良、適合于在淡水魚(yú)類飼料中使用的新的植酸酶，并進(jìn)一步克隆了其編碼基因。提供了一種在表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)植酸酶基因的方法。
菌株篩選按常規(guī)方法(Cosgrove，D.J.et al.Aust.J.Biol.Sci.23339-343，1970)從土壤中篩選分泌植酸酶的天然菌株，進(jìn)一步對(duì)所產(chǎn)植酸酶進(jìn)行生理生化性質(zhì)研究(Vallah A.H.J.Prep.Biochem.，18459-471，1988)，篩選出具有高活性并且適于在無(wú)胃魚(yú)類飼料中使用的中性植酸酶產(chǎn)生菌株Bacillus subtilis 98。此菌株作為進(jìn)一步研究的供體材料。同樣的篩選方法也可用來(lái)篩選各種各樣特定性質(zhì)的植酸酶產(chǎn)生菌。
植酸酶基因克隆從Bacillus subtilis 98中提取基因組DNA，通過(guò)PCR方法(Maniatis T.，et al.Molecular cloning.New YorkCold Spring harborlaboratory，1982)釣出植酸酶基因nphyA，然后克隆到大腸桿菌的質(zhì)粒克隆載體如pPUC18、pPGEM等上，并進(jìn)一步對(duì)此基因進(jìn)行全序列分析。類似的方法也適用于從別的菌株中克隆不同的植酸酶基因。
植酸酶基因改造通過(guò)PCR、突變等DNA體外操作的方法，去掉或改造植酸酶基因中的影響其在大腸桿菌表達(dá)體系中高效表達(dá)的因素，提供其在重組大腸桿菌中的表達(dá)量。類似思路也同樣可用來(lái)改造植酸酶基因使它在別的表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，如借助桿狀病毒的昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)、霉菌表達(dá)系統(tǒng)、植物表達(dá)系統(tǒng)等。植酸酶基因改造的具體方法可選用PCR方法、定點(diǎn)突變、基因人工設(shè)計(jì)合成等。
重組高效表達(dá)體系的構(gòu)建 選擇高效表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌作為表達(dá)nphyA的生物反應(yīng)器。通過(guò)轉(zhuǎn)化將含有nphyA的重組表達(dá)質(zhì)粒體進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞中，篩選出陽(yáng)性重組子。別的真核表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒的昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)、霉菌表達(dá)系統(tǒng)、植物表達(dá)系統(tǒng)等也適應(yīng)與此植酸酶基因的高效表達(dá)。
動(dòng)物飼喂實(shí)驗(yàn) 使用不同劑量的中性植酸酶代替鯉魚(yú)飼料中所添加的磷酸二氫鈣，測(cè)定日增重和料肉比等生產(chǎn)指標(biāo)，各指標(biāo)均以重復(fù)組為數(shù)據(jù)單位。分別在飼喂的第5天、15天、35天以處理組為單位收集糞便，測(cè)定糞樣中磷含量，計(jì)算飼料磷、單位增重磷排出量。各種無(wú)胃魚(yú)類的飼喂實(shí)驗(yàn)均可用類似的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證中性植酸酶的飼喂效果及確定中性植酸酶的使用劑量和方法。
由于Bacillus subtilis 98產(chǎn)生的植酸酶在鯉魚(yú)等無(wú)胃魚(yú)類中有良好的飼喂效果，使之在飼料工業(yè)中極具應(yīng)用潛力，它的編碼基因是構(gòu)建各種生產(chǎn)中性植酸酶的基因工程生物反應(yīng)器的優(yōu)良材料。它能夠在各種真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母、曲霉、桿狀病毒、動(dòng)物、植物等生物反應(yīng)器中應(yīng)用。

圖1 Bacillus subtilis 98在含植酸鈣平板上形成的透明水解圈圖2中性植酸酶的SDS-PAGE分析1.培養(yǎng)基上清液；2.85％(NH4)2SO4沉淀；3，4.HPLC純化；5.標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量圖3中性植酸酶的最適pH圖4.中性植酸酶的pH穩(wěn)定性圖5中性植酸酶的最適反應(yīng)溫度圖6.中性植酸酶的熱穩(wěn)定性圖7.來(lái)源于Bacillus subtilis 98的中性植酸酶結(jié)構(gòu)基因序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列圖8.重組表達(dá)制粒pTYB41的物理圖譜圖9.在大腸桿菌中表達(dá)的中性植酸酶的SDS-PAGE1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；2，3.分別為兩個(gè)含重組質(zhì)粒pTYB41的大腸桿菌重組子表達(dá)的植酸酶4.含質(zhì)粒pTYB40的大腸桿菌四、實(shí)施例實(shí)驗(yàn)一1.菌株與載體 大腸桿菌菌株E.coli DH5a、質(zhì)粒pUC19等購(gòu)自Promega公司，表達(dá)質(zhì)粒pTYB40由BioLabs inc.的pTYB4 C-末端融合載體去除Intein融合蛋白編碼序列后得到，為本實(shí)驗(yàn)室保存。。
2.酶與試劑盒 限制性內(nèi)切酶、連接酶、Taq酶、Mung bean酶為Boehringer公司產(chǎn)品。T7DNA sequence kit購(gòu)于Pharmacia公司。
3.生化試劑 DNA合成試劑為Milipore公司產(chǎn)品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成儀。IPTG、X-Gal、SDS及植酸鈉為Sigma公司產(chǎn)品。TEMED、過(guò)硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。
4.培養(yǎng)基 細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)肉汁平板1％蛋白胨、0.3％牛肉膏、0.5％NaCl、1.5％瓊脂，pH7.0；篩選平板2％葡萄糖、0.2％CaCl2、0.5％NH4NO3、0.05％KCl、0.05％MgSO4·7H2O、0.001％FeSO4·7H2O、0.001％MnSO4·H2O、0.1％植酸鈣、1.5％瓊脂，pH7.0；產(chǎn)酶培養(yǎng)基WBE100g麩皮加到900mL水中，121℃處理60min，8層紗布過(guò)濾，濾液定溶到1L，在其中加入0.4g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.05g KH2PO4、0.04g K2HPO4、2g CaCl2、10g Casitone、，pH6.5；LB培養(yǎng)基1％蛋白胨、1％NaCl、0.5％酵母提取物。
實(shí)驗(yàn)二本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明產(chǎn)生中性植酸酶的天然菌株的篩選程序。
土樣按常規(guī)稀釋后涂布于細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)肉汁平板上，28℃培養(yǎng)2～3d，挑取菌落轉(zhuǎn)接到含植酸鈣的篩選平板上，30℃培養(yǎng)3d，挑取產(chǎn)生透明消解圈的菌株(圖1)。根據(jù)在含有植酸鈣的篩選平板上形成的透明消解圈粗篩到分泌植酸酶的菌株8株，并對(duì)這些菌株進(jìn)行了進(jìn)一步分離純化。所得到的菌株(枯草芽孢桿菌，Bacillus subtilis 98)于2000年11月29日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國(guó)，北京，中關(guān)村)進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.0515。
為了從中篩選到在中性條件下具有高植酸酶活性的產(chǎn)生菌株，這些菌株在液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后在pH值為7.5(Tris-HCl緩沖液)的酶促反應(yīng)體系條件下測(cè)定其酶活性。酶活性標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法如下0.2mL的酶稀釋液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸鈉[用含1mmol/L CaCl2的0.25mmol/LTris-HCl(pH7.5)配制]，37℃保溫30min，加入1mL 10％TCA終止酶活反應(yīng)，然后加入2mL硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，700nm測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量。對(duì)照為先在0.2mL的酶稀釋液中加入1mLTCA使酶失活，再加入同體積的底物保溫。酶活性單位(U)定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1μmol無(wú)機(jī)磷所需的酶量為一個(gè)酶活性單位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3株在此條件下有可檢測(cè)的酶活性，其酶活性單位分別為0.8、1.1和2.0U/mL培養(yǎng)液。經(jīng)生理生化鑒定，此3株菌均為枯草芽孢桿菌，分別定名為Bacillussubtilis 981，Bacillus subtilis 982和Bacillus subtilis 983。因Bacillus subtilis983分泌植酸酶較穩(wěn)定且分泌量相對(duì)較大，被選為進(jìn)一步研究的材料。
實(shí)驗(yàn)三本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明中性植酸酶NPHYA的純化程序。
挑取菌株接種于細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，30℃搖振培養(yǎng)過(guò)夜，按10％接種量接種于1L產(chǎn)酶培養(yǎng)基WBE中，于30℃下300r/min搖振培養(yǎng)4天。
中性植酸酶的純化在4℃下完成。培養(yǎng)4天后的培養(yǎng)液，10000r/min離心20min去菌體，上清液中加入CaCl2至終濃度1mmol/L，加入3倍體積無(wú)水乙醇，混勻后-20℃過(guò)夜，1800g離心20min，沉淀用-20℃乙醇洗兩次，冷凍干燥后重新溶解在100mL含1mmol/LCaCl2的Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中，緩慢加入硫酸銨至飽和度65％，4℃過(guò)夜，9000g離心60min，取上清液，加硫酸銨至飽和度達(dá)到85％，4℃過(guò)夜，9000g離心60min，棄上清液，沉淀溶于1mL含1mmol/LCaCl2的Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中。植酸酶蛋白進(jìn)一步用HPLC純化(KTA FPLC，Pharmacia公司)純化。含酶的濃縮液首先用HiPrep-26/10-Desalting柱脫鹽，緩沖液為20mmol/LTris-HCl(pH7.0)，流速為5mL/min，收集洗脫峰，接著用離子交換柱Hitrip-SP-Sepharose-XL(5mL)分離，A泵為20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)，B泵為1mol/LNaCl、20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)高鹽緩沖液，流速為2mL/min，高鹽緩沖液從0～100％梯度洗脫10個(gè)柱床，分部收集洗脫峰，通過(guò)酶活性測(cè)定后的洗脫峰進(jìn)一步用凝膠柱Superdex-75-HR-10/30純化，緩沖液同樣為20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)，流速為0.5mL/min，收集洗脫峰得到純蛋白。
在純化過(guò)程中的乙醇沉淀、65％硫酸銨沉淀、85％硫酸銨沉淀、HPLC純化等各步驟中進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果表明(表1)植酸酶蛋白的回收率分別為95％、60％、29％和18％。純化完成后植酸酶蛋白的含量為362U/mL，比活性為150.8U/mg。SDS-PAGE結(jié)果表明(圖2)，純化后的植酸酶蛋白僅有一條單一的條帶，中性植酸酶的分子量約為45KD。
表1 純化植酸酶的比活性
實(shí)驗(yàn)四本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明中性植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定方法。
中性植酸酶的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定方法如下經(jīng)純化的植酸酶在不同的pH值下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。底物植酸鈉用不同pH的含1mmol/L CaCl2的0.2mmol/L緩沖液配制(pH1.0、pH2.0為HCl-KCl緩沖液；pH3.0為HCl-甘氨酸；pH4.0、5.0、5.6為HAc-NaAc緩沖液；pH6.0、6.4、6.8為T(mén)ris-Maleate緩沖液；pH7.2、7.5、8.0、8.6、9.0為T(mén)ris-HCl緩沖液；pH10為甘氨酸-NaOH緩沖液)，37℃和55℃測(cè)定酶活性。中性植酸酶于上述各種不同pH的緩沖液中37℃處理30min，再在Tris-HCl(pH7.5)緩沖液體系中37℃下測(cè)定酶活性，以研究酶的pH耐性。純化的植酸酶在不同pH的緩沖體系、37℃和55℃下測(cè)定的pH適性結(jié)果(圖3)表明，37℃時(shí)酶最適pH為7.5，在pH6.5～8.5這一較寬的范圍內(nèi)，酶活性均在95％以上。55℃時(shí)最適pH變?yōu)?.0，相對(duì)37℃下測(cè)定的結(jié)果，在pH7.0～7.5這一范圍以外，酶活性下降較快。無(wú)論是37℃還是55℃，pH在4.0以下和10.0以上，均檢測(cè)不到酶活性。植酸酶在一系列不同pH緩沖液中37℃處理30min后，再在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定其酶活性，結(jié)果表明(圖4)，在pH6～12的范圍內(nèi)，剩余酶活性維持在90％以上，而pH低于6.0時(shí)，酶活性迅速下降，到pH3.0以下，已無(wú)酶活性，這說(shuō)明此酶具有很好的耐堿性，但不耐酸。
中性植酸酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定方法如下中性植酸酶的最適溫度的測(cè)定為在Tris-HCl(pH7.5)緩沖液體系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測(cè)定為中性植酸酶在不同溫度下處理60min和120min，再在37℃下進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果(圖5)表明，其最適溫度為55℃。酶的熱穩(wěn)定性性試驗(yàn)表明(圖6)，55℃處理60min和120min后，剩余酶活僅有50％左右，60℃下處理60min后，酶活性喪失了近90％，處理120min后酶活性基本上完全喪失。
中性植酸酶的Km值測(cè)定方法如下用不同的植酸鈉底物濃度，在Tris-HCl(pH7.5)緩沖液體系中，37℃下測(cè)定酶活性，計(jì)算出其在37℃下的km值。經(jīng)測(cè)定，此植酸酶在37℃下以植酸鈉為底物的km之為0.19mmol/L。
中性植酸酶的底物特異性測(cè)定如下以不同的磷酸化合物作為底物，測(cè)定其酶活性。以植酸鈉作為底物時(shí)的酶活性為100％，其它的磷化合物作為底物時(shí)的酶活性見(jiàn)表2，結(jié)果表明，以ATP和ADP為底物時(shí)酶的相對(duì)活性分別為52％和74％，別的5種底物均未有可檢測(cè)的酶活性，這說(shuō)明，此酶的底物特異性很強(qiáng)，植酸是它的特異性底物，這也證明了我們分離到的這種酶是植酸酶。
表2 中性植酸酶的底物特異性
陽(yáng)離子對(duì)中性植酸酶活性的影響測(cè)定方法為在酶促反應(yīng)體系中加入不同的陽(yáng)離子，研究不同陽(yáng)離子對(duì)酶活性的影響。酶反應(yīng)體系中加入不同濃度的Ca2+，結(jié)果表明，反應(yīng)體系中無(wú)Ca2+時(shí)，檢測(cè)不到酶活性，隨著Ca2+濃度的提高，植酸酶活性逐步提高，Ca2+濃度達(dá)到1mmol/L時(shí)，酶活性達(dá)到最高值，再增加Ca2+濃度，酶活性無(wú)顯著變化。這一結(jié)果說(shuō)明來(lái)源于枯草芽胞桿菌的這種中性植酸酶的生物學(xué)活性依賴Ca2+存在。
Fe2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+等金屬離子對(duì)酶活性均有不同程度的抑制作用，其中1mmol的Co2+、Cu2+和Zn2+抑制作用較為強(qiáng)烈，其剩余酶活性均在60％以下。
中性植酸酶蛋白的N端氨基酸序列經(jīng)氨基酸序列測(cè)定，純化后的植酸酶蛋白的N端氨基酸序列為L(zhǎng)ys-His-Lys-Leu-Ser-Asp-Pro-Tyr-His-Phe-Thr。從這一部分氨基酸序列來(lái)看，與目前分離的來(lái)源于曲霉、酵母等真菌的植酸酶蛋白的N端氨基酸序列均無(wú)同源性，綜合其分子量比真菌來(lái)源的植酸酶蛋白小得多這一事實(shí)，這說(shuō)明它可能是另一類新的植酸酶。
實(shí)驗(yàn)五本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明中性植酸酶編碼基因nphyA的分離克隆程序Bacillus sbutilis 983菌株在LB培養(yǎng)基中28℃搖床培養(yǎng)24h，取5mL培養(yǎng)液離心沉淀菌體，沉淀重懸于25mL 1.0mol/L的NaCl中，4℃下劇烈振蕩1h，離心后沉淀用25mL預(yù)冷的TES緩沖液(0.01mol/L Tris，pH8.0；0.025mol/L EDTA；0.15mol/L NaCl)洗一次，沉淀再懸浮于5mL TE緩沖液(不含NaCl的TES)中，加入0.5mL 2mg/mL的溶菌酶，37℃保溫15min，再加入0.6mL的肌氨酰-蛋白酶溶液(10％肌氨酰和5mg/mL的蛋白酶溶于TE中)，37℃保溫1h，細(xì)胞裂解液用苯酚、苯酚-氯仿、氯仿依次抽提，酒精沉淀DNA后溶于pH8.0的TE中備用。
根據(jù)測(cè)定的此中性植酸酶N端氨基酸序列合成簡(jiǎn)并引物，分別與20個(gè)隨機(jī)引物組對(duì)PCR擴(kuò)增中性植酸酶成熟蛋白的編碼序列。含有成熟酶編碼序列的PCR片段電泳回收后分別克隆到PGEM-T載體上，進(jìn)行序列分析。根據(jù)序列分析的結(jié)果，再合成反向PCR引物，分別與隨機(jī)引物組對(duì)后擴(kuò)增基因5′端信號(hào)肽編碼序列。
根據(jù)此成熟植酸酶N端氨基酸序列Lys-His-Lys-Leu-Ser-Asp-Pro-Tyr-His-Phe-Thr，合成簡(jiǎn)并引物，考慮到序列中第4和第5個(gè)氨基酸是由6個(gè)密碼子編碼的氨基酸，因而合成的引物從第6個(gè)，即Asp的密碼子開(kāi)始，設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物為P1 5′GA(T/C)CC(A/T/G/C)TA(T/C)CA(T/C)TT(T/C)AC 3′另一端的引物采用20個(gè)隨機(jī)引物，分別與引物P1組對(duì)，以枯草芽孢桿菌總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃變性1min、50℃退火45sec、72℃延伸1min；循環(huán)30輪后72℃保溫10min。其中一組引物擴(kuò)增到了約1.4kb的PCR片段。根據(jù)測(cè)定的此蛋白的分子量，推斷此酶蛋白氨基酸個(gè)數(shù)在400個(gè)以下，相應(yīng)的基因長(zhǎng)度不超過(guò)1.2kb，如果此PCR片段為中性植酸酶編碼基因，應(yīng)該包括完整的結(jié)構(gòu)基因3′端。挑取此1.4kb的PCR片段，將它克隆到pGEM-T載體上，進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明，在此片段有一個(gè)長(zhǎng)1059bp的閱讀框架，5′端編碼的6個(gè)氨基酸與氨基酸序列測(cè)定結(jié)果相一致，初步判斷為我們擬克隆的目的基因。
為了克隆酶蛋白N-端的信號(hào)肽編碼序列，我們根據(jù)上述測(cè)定的序列結(jié)果，設(shè)計(jì)合成一段反向PCR引物P25′CAAGGCTGTAAACGAC 3′，此引物序列與成熟酶基因的+162-+178序列配對(duì)。同樣與隨機(jī)引物組對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一約600bp的PCR片段，將它克隆到pGEM-T質(zhì)粒上，進(jìn)行序列分析。
綜合這兩段序列的結(jié)果，得到完整的中性植酸酶的結(jié)構(gòu)編碼基因nphy(圖7)，此基因全長(zhǎng)1152個(gè)核苷酸，編碼383個(gè)氨基酸，根據(jù)信號(hào)肽序列的結(jié)構(gòu)規(guī)則推斷，N-端的26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+26位的Ala之后，這一結(jié)果與成熟酶的N端氨基酸序列測(cè)定結(jié)果一致。此中性植酸酶的基因序列與以往大量報(bào)道的來(lái)源于絲狀真菌和植物的植酸酶基因均無(wú)同源性，也不含有絲狀真菌和植物來(lái)源的植酸酶蛋白中均存在的高度保守序列RHGARYPT。
實(shí)驗(yàn)六本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在大腸桿菌中表達(dá)中性植酸酶的程序?yàn)榱肆私獯嘶蚴欠袷侵行灾菜崦富?，我們將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)研究。
重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖8.我們將去除了信號(hào)肽編碼序列的中性植酸酶結(jié)構(gòu)基因以正確的閱讀框架克隆到載體pTYB40上緊接起始密碼子ATG之后的NdeI位點(diǎn)上，得到重組質(zhì)粒pTYB41，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。由于pTYB40上已去除了融合蛋白Intein的編碼序列，這樣表達(dá)的中性植酸酶蛋白不帶融合蛋白。
大腸桿菌重組子于5mL LB培養(yǎng)液(含100μg/mL Ap)中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按0.1％接種到20mL LB培養(yǎng)液(含100μg/mL Ap)中，37℃、300rpm培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.6～0.8，加入IPTG終濃度為1mmol/L，30℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)3h。
取1mL誘導(dǎo)培養(yǎng)物離心收集菌體，菌體用雙蒸水洗2遍后重懸于100μL雙蒸水中，加入等體積的2×SDS加樣緩沖液(100mmol/L Tris-HCl，pH6.8、200mmol/L DTT、4％SDS、0.2％溴酚蘭、20％甘油)，100℃煮3分鐘，取5μL上12％的聚丙烯酰胺凝膠。在大腸桿菌中表達(dá)的中性植酸酶蛋白的SDS-PAGE見(jiàn)圖9。結(jié)果表明，中性植酸酶在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)。在約40Kda處有一特異蛋白帶，與根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)出來(lái)的理論分子量相一致，其表達(dá)量達(dá)到大腸桿菌可溶性蛋白的40％左右。
用超聲波破碎誘導(dǎo)后的菌體，15000rpm離心去除細(xì)胞碎片，上清液用來(lái)檢測(cè)植酸酶活性。表達(dá)的中性植酸酶在不同的pH值下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。底物植酸鈉用不同pH的含1mmol/L CaCl2的0.2mmol/L緩沖液配制(pH1.0、pH2.0為HCl-KCl緩沖液；pH3.0為HCl-甘氨酸；pH4.0、5.0、5.6為HAc-NaAc緩沖液；pH6.0、6.4、6.8為T(mén)ris-Maleate緩沖液；pH7.2、7.5、8.0、8.6、9.0為T(mén)ris-HCl緩沖液；pH10為甘氨酸-NaOH緩沖液)，37℃和55℃測(cè)定酶活性。表達(dá)的中性植酸酶的最適溫度測(cè)定為在Tris-HCl(pH7.5)緩沖液體系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。取包含表達(dá)產(chǎn)物的菌體破碎液，稀釋后進(jìn)行酶活性的生物學(xué)測(cè)定，結(jié)果表明，在含空載體的菌株中檢測(cè)不到植酸酶酶活性，而在陽(yáng)性克隆子的細(xì)胞破碎液中檢測(cè)到植酸酶活性，酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，在37℃下其酶反應(yīng)的最適pH值為7.5，55℃下為7.0；最適溫度55℃；37℃下以植酸鈉為底物的km值為0.2mmol/L。表達(dá)的中性植酸酶在pH特性、溫度特性等酶學(xué)性質(zhì)與來(lái)源于枯草芽孢桿菌的中性植酸酶基本一致，這證明我們克隆到的這一基因是中性植酸酶的編碼基因。
實(shí)驗(yàn)七本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明這種中性植酸酶NPHYA對(duì)鯉魚(yú)的動(dòng)物飼喂實(shí)驗(yàn)的程序。
試驗(yàn)用鯉魚(yú)魚(yú)體重39g左右。試驗(yàn)在水族箱內(nèi)進(jìn)行，水族箱容積100升，流動(dòng)循環(huán)水，流量為2.4l/min，曝氣，水溫25℃～28℃。飼料原料為市售商品原料，預(yù)混料自行配制，加入0.5％的Cr2O3作為指示劑?；A(chǔ)飼料中分別加入500U、1000U的NPHYA后制成植酸酶試驗(yàn)飼料，基礎(chǔ)飼料中分別加入無(wú)機(jī)磷和肌醇做為對(duì)照。飼料用電動(dòng)攪肉機(jī)壓成顆粒，風(fēng)干備用。
試驗(yàn)為單因子試驗(yàn)，共設(shè)6個(gè)處理，分別投喂試驗(yàn)飼料和對(duì)照飼料。每處理5個(gè)重復(fù)，共30個(gè)試驗(yàn)單元。每個(gè)水族箱內(nèi)放鯉魚(yú)25尾，隨機(jī)分入各試驗(yàn)單元。
每日手工投喂3次，定期更換部分循環(huán)水以保證水質(zhì)清潔，每日記錄水溫及魚(yú)的狀況。
生產(chǎn)指標(biāo)為日增重和料肉比，各指標(biāo)均以重復(fù)組為數(shù)據(jù)單位。分別在第5天、15天、35天以處理為單位收集糞便，測(cè)定糞樣中磷含量，計(jì)算飼料磷、單位增重磷排出量。數(shù)據(jù)用SAS軟件進(jìn)行Duncan新復(fù)極差檢驗(yàn)，P≤0.05為差異顯著。
試驗(yàn)的飼料配方和試驗(yàn)分組見(jiàn)表3、表4。表3 植酸酶飼喂試驗(yàn)飼料配方(％)F1 F2 F3 F4 F5 F6魚(yú)粉 14.5 14.5 14.5 14.5 14.5 14.5菜籽粕 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0棉仁粕 13.0 13.0 13.0 13.0 13.0 13.0豆粕 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0面粉 16.5 16.5 16.5 16.5 16.5 16.5磷酸二氫鈣 添加1.3％的磷酸二氫鈣時(shí)飼料的有效磷為0.6％，已經(jīng)達(dá)到鯉魚(yú)飼料中磷的推薦量。而添加1000U/kg NPHYA的生長(zhǎng)指標(biāo)與添加1.3％的磷酸二氫鈣相同，說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下添加1000U/kg NPHYA從植酸中降解出的磷已經(jīng)能夠滿足鯉魚(yú)正常生長(zhǎng)對(duì)磷的需要，可以不再額外添加無(wú)機(jī)磷。
表5.鯉魚(yú)的日增重(g/日/尾)和料肉比(風(fēng)干樣)組別 日增重 料肉比F1 0.15b 3.94aF2 0.20ab 3.06bcF3 0.24a 2.53cF4 0.17b 3.56abF5 0.16b 3.84aF6 0.24a 2.75c同列中肩號(hào)有相同字母的值差異不顯著。
磷利用率的比較在F1、F4、F5和F6之間進(jìn)行(表6)。結(jié)果顯示添加磷酸二氫鈣和NPHYA都可以顯著提高磷的表觀消化率，隨著NPHYA添加量由500U/kg上升到1000U/kg，磷表觀消化率也從32％上升到34％，與基礎(chǔ)料F1組相比，磷表觀消化率提高了28.8％和37.3％。降低單位增重的磷排出，每千克增重的磷排出從25g降到17g。添加磷酸二氫鈣和500U/kg NPHYA，雖然有降低單位增重的磷排出量的趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)上不顯著；而1000U/kg的NPHYA可顯著降低單位增重的磷排出量，與基礎(chǔ)料F1組和添加0.65％磷酸二氫鈣的F4組相比，單位增重的磷排出量分別降低40％和35％。表6 植酸酶對(duì)磷的表觀消化率、磷排出的影響(干基)組別 P表觀消化率 P排出，g/kg增重F1 24.84b 28.02aF4 35.01a 26.33aF5 32.01a 25.22aF6 34.11a 17.05b同列中肩號(hào)有相同字母的值差異不顯著。表7 不同階段的磷表觀消化率P表觀消化率，％組別 5d 15d 35dF1 22.5 24.4 27.6F4 33.8 35.6 35.6F5 32.1 31.5 32.5F6 32.4 37.0 32.9本次試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，基礎(chǔ)料F1組磷表觀消化率逐漸提高，而添加植酸酶的F5和F6組磷表觀消化率一直比較穩(wěn)定(表7)。我們推測(cè)這種現(xiàn)象是由于F1組的魚(yú)長(zhǎng)期攝食缺磷飼料，體內(nèi)磷供應(yīng)不足，機(jī)體采取適應(yīng)性調(diào)節(jié)，提高磷的吸收，降低內(nèi)源糞磷的排出所致。因此應(yīng)當(dāng)對(duì)磷的真消化率做進(jìn)一步的研究。
總體而言，一方面添加中性植酸酶可以顯著提高鯉魚(yú)對(duì)飼料磷的表觀消化率，減少單位增重的磷排出量，可以減輕磷污染。另一方面添加1000U/kg的NPHYA可以滿足鯉魚(yú)正常生長(zhǎng)對(duì)磷的需要，其生長(zhǎng)效果與添加1.3％的磷酸二氫鈣相同，無(wú)需額外添加無(wú)機(jī)磷。
權(quán)利要求
1.一種能夠表達(dá)中性植酸酶枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)98，其保藏號(hào)為CGMCC No.0515。
2.一種從權(quán)利要求
1所述的微生物分離的中性植酸酶。
3.按照權(quán)利要求
2所述的中性植酸酶，它具有如下所示的氨基酸序列，或者如下所示的氨基酸序列通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、缺失、加入，而同時(shí)具有中性植酸酶活性的的序列K H K L S D P Y H F 36T V N A A A Q T D P V D T A G D A A 54D D P A I W P D P K T P Q N S K L I 72T T N K K S G L V D L T L D G K M L 90H S Y N T G K L N N V D I R Y D F L 108L N G K K V E I A A A S N R S E G K 126N T I E I Y D I D G K N G T L Q K M 144T I P D H P I G T A I N A V Y G F T 162L Y H S K K T G K Y Y A T V T G K E 180E P L Q K E E L K A D N N G Y I S G 198K K V A A F S E N S Q T A G M E K G 216D E V G R L Y I A E E D E A I W K F 234S A E L D G G S A A T V I D R A D G 252R H L T R D I E G L T I Y Y A A D G 270K G Y L M L S Q Q G N S S Y A I Y I 288I Q G K N K Y V A D F R I M D G P E 306T D G T S D T D G I D V L G F G L G 324P E Y P F G I F V A Q D G E N I D H 342G Q K A N Q N F N I V K W E R I A D 360Q I G F R P L A F D Q V D P R K L T 378D R K G K 383
4.一種編碼權(quán)利要求
2或3所述的中性植酸酶的基因。
5.按照權(quán)利要求
4所述的基因，它具有如下所示的核苷酸序列AAG CAT AAG CTT TCC GAT CCT TAT CAC TTT 108ACC GTG AAT GCG GCG GCG CAA ACG GAT CCG GTT GAC ACG GCC GGT GAC GCT GCT 162GAT GAT CCT GCT ATT TGG CCG GAC CCC AAG ACT CCT CAG AAC AGC AAA TTG ATT 216ACG ACC AAT AAA AAA TCA GGT TTA GTC GAT CTT ACG CTT GAT GGT AAG ATG CTT 270CAT TCC TAT AAT ACC GGT AAG TTA AAC AAC GTC GAT ATC CGT TAT GAC TTT CTT 324TTG AAC GGC AAA AAG GTC GAA ATC GCA GCA GCG TCC AAT CGG TAA GAA GGA AAG 378AAC ACC ATA GAG ATT TAC GAT ATT GAT GGA AAA AAC GGC ACA CTT CAA AAG ATG 432ACA ATT CCA GAT CAT CCG ATT GGA ACA GCA ATT AAC GCG GTA TAC CGA TTT ACC 486CTC TAC CAC AGT AAG AAA ACA GGA AAG TAC TAC GCG ACA GTG ACA CGA AAA GAG 540GAA CCA TTA CAA AAA GAA GAA TTA AAA GCG GAC AAT AAT GGA TAC ATA AGC GGC 594AAG AAA GTA GCG GCG TTT TCC GAA AAT AGC CAA ACG GCA GGG ATG GAG AAA GGC 648GAT GAA GTG GGC AGA TTG TAT ATC GCA GAA GAA GAT GAG GCG ATA TGG AAG TTT 702TCC GCT GAG TTG GAC CGC CGC AGT GCA GCG ACG GTT ATC GAC CGT GCG GAC GGC 756AGG CAT TTA ACT CGT GAT ATT GAA GGA TTG ACG ATT TAC TAC GCT GCT GAC GGG 810AAG GGG TAT CTG ATG CTG TCA CAG CAG GGA AAC TCC TCC TAC GCC ATT TAT ATA 864ATT CAA GGA AAA AAC AAA TAT GTT GCG GAT TTT CGC ATA ATG GAC GGT CCT GAA 918ACA GAC GGG ACA AGC GAT ACA GAC GGA ATT GAC GTT CTG GGT TTC GGA CTG GGG 972CCT GAA TAT CCG TTC GGT ATT TTT GTC GCA CAG GAC GGT GAA AAT ATA GAT CAC 1026GGC CAA AAG GCC AAT CAA AAT TTT AAT ATC GTG AAA TGG GAA AGA ATT GCT GAT 1080CAA ATC GGT TTC CGC CCG CTG GCA TTC GAC CAG GTT GAC CCG AGA AAA CTG ACC 1134GAT AGA AAG GGA AAA TAA 1152
6.一種魚(yú)類飼料，它含有權(quán)利要求
2或3所述的中性植酸酶。
7.按照權(quán)利要求
6所述的飼料，其中，所述的魚(yú)類是鯉魚(yú)、鯽魚(yú)、魴魚(yú)、鯖魚(yú)、或鰱魚(yú)。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種能夠表達(dá)中性植酸酶的枯草芽孢桿菌,保藏號(hào)為CGMCC No.0515。本發(fā)明還提供了一種中性植酸酶,它具有如說(shuō)明書(shū)所述的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的中性植酸酶的基因和含有本發(fā)明中心植酸酶的飼料。本發(fā)明的中性植酸酶可廣泛用于鯉魚(yú)、鯽魚(yú)、魴魚(yú)、鯖魚(yú)、鰱魚(yú)等所有無(wú)胃的魚(yú)類飼料中。
文檔編號(hào)C12N15/75GKCN1358845SQ00134591
公開(kāi)日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2000年12月12日
發(fā)明者姚斌, 范云六, 王亞茹, 史秀云, 操時(shí)樹(shù), 袁鐵錚 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan