專利名稱：抗生素ge2270的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種命名為抗生素GE2270的新的抗生素物質(zhì)、其加成鹽、藥物組合物以及它們作為藥物的應(yīng)用，特別是在治療對它們敏感的微生物所引起的感染疾病的應(yīng)用。
本發(fā)明的化合物在動物中如家禽、豬、反芻動物等還具有生長促進(jìn)劑的活性。
本發(fā)明的另一目的是制備抗生素GE2270的方法，其中包括培養(yǎng)玫瑰游動雙孢菌(Planobisporarosea)ATCC53773或它的產(chǎn)生抗生素GE2270的變異體或突變體。并從菌絲體和/或發(fā)酵肉湯中分離出本發(fā)明的抗生素。
玫瑰游動雙孢菌ATCC53773是從土壤樣品中分離出來的，并且根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1988年6月14日寄存于美國典型菌種保藏中心(ATCC)(12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852Maryland，U.S.A)。
該菌株的保藏號為ATCC53773。
通過培養(yǎng)一個可產(chǎn)生抗生素GE2270的游動雙孢菌菌株即玫瑰游動雙孢菌ATCC53773或它的產(chǎn)生抗生素GE2270的變異體或突變體，可以得到抗生素GE2270的產(chǎn)物，培養(yǎng)在有氧條件下，在水性營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行，該培養(yǎng)基含有可同化碳源、氮源及無機(jī)鹽。在發(fā)酵技術(shù)中經(jīng)常使用的許多營養(yǎng)培養(yǎng)基都可以使用，但是某些培養(yǎng)基更好些。優(yōu)選的碳源為葡萄糖、甘露糖、半乳糖、淀粉、谷粉等。優(yōu)選的氮源為氨、硝酸鹽、大豆粉、胨、肉提取物、酵母膏、胰蛋白胨、氨基酸等。可用于培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽為通?？僧a(chǎn)生鈉、鉀、鐵、鋅、鈷、鎂、鈣、銨、氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽等離子的可溶性鹽。
通常將可產(chǎn)生抗生素的菌株在振蕩瓶中預(yù)培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)物接種于發(fā)酵罐中，從而產(chǎn)生大量的抗生素物質(zhì)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基可與大量發(fā)酵使用的相同，也可以用其他的培養(yǎng)基。產(chǎn)生抗生素GE2270的菌株可以在20～40℃生長，最好在24～35℃生長。
在發(fā)酵過程中，可通過例如生物鑒定或TLC或HPLC方法檢驗(yàn)培養(yǎng)液或菌絲體提取物樣品中抗生素的活性來監(jiān)測該抗生素的生產(chǎn)。
對于抗生素GE2270敏感的生物體如枯草桿菌和金黃色葡萄球菌都可以作為試驗(yàn)生物體。生物鑒定可以很方便地通過在瓊脂板上的瓊脂擴(kuò)散方法進(jìn)行。一般在發(fā)酵的第2天至第5天產(chǎn)生最大量的抗菌活性。
抗生素GE2270是通過培養(yǎng)菌株玫瑰游動雙孢菌ATCC53773或它的產(chǎn)生抗生素GE2270的突變體或變異體產(chǎn)生的。并且發(fā)現(xiàn)主要存在于菌絲體中。
在本申請中，當(dāng)論述本發(fā)明化合物的物理化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)時，術(shù)語“抗生素GE2270”一般被認(rèn)為是指發(fā)酵過程終止時回收的抗生素GE2270復(fù)合物(見例2)，也可以是它的主要成分抗生素GE2270因子A。
玫瑰游動雙孢菌ATCC53773的形態(tài)特征玫瑰游動雙孢菌ATCC53773可生長在大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中。植物菌絲體形成長的不規(guī)則分枝絲狀體(0.5至1.0微米)穿透瓊脂，并在其表面緊密的生長。無論生長在液體還是固體培養(yǎng)基中，菌絲體都不破碎。在大多數(shù)試驗(yàn)培養(yǎng)基中其顏色變化范圍從淺珊瑚色至粉紅珊瑚色。需氧菌絲體形成長的波狀的細(xì)長菌絲，側(cè)面很少分枝，并且與瓊脂表面基本平行地生長在空氣中。需氧菌絲體如果有的話呈白-粉紅色。孢子囊單獨(dú)地或成組地沿著需氧菌絲體的菌絲生長，其長約6.0～8.0微米，寬約1.0～1.2微米。它們通過短的孢子囊柄(1.2～2.0微米長)與菌絲相連。在每個孢子囊上形成一對縱向的棱形直的孢子(3.0至3.5×1.0至1.2微米)。在孢子囊中，孢子被橫向隔膜分開。在從孢子囊被膜中釋放出來以后，孢子靠其周圍的鞭毛活動。
玫瑰游動雙孢菌ATCC53773的培養(yǎng)特征為進(jìn)行培養(yǎng)特征的檢測，在含有幾種由Waksman所建議的培養(yǎng)基添加物(Waksman，S.A.1961-放線菌-TheWilliamsandWilkinsCo.Baltimore;Vol.2，328-334)的Shirling和Gottlieb所建議的各種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(ShirlingE.B和GottliebD.，1966-測定鏈球菌種特征的方法-Int.J.Syst.Bacteriol，16，313-340)。
需要時可通過Maerz和Paul的方法進(jìn)行顏色測定(MearzA.和M.ReaPaul，1950-顏色詞典-第2版McGraw-HillBookCompanyInc.NewYork)。
該生物體利用不同碳源的能力通過Shirling和Gottlieb所描述的方法測定。
培養(yǎng)特征、生理學(xué)特征及碳源的利用列于表Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中。
表Ⅰ是在28℃培養(yǎng)2周后的結(jié)果。
表Ⅰ菌株玫瑰游動雙孢菌ATCC53773的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)特征燕麥片瓊脂6%充分生長，具有光滑的表面，珊瑚粉紅色(2-H-10)，充分產(chǎn)生淺粉紅色需氧菌絲體(1-A-9)。
ISP2(酵母青充分生長，表面皺褶、淡粉紅色(2-E-9)，麥芽瓊脂)少量淡色需氧菌絲體。
ISP3(燕麥片適度生長，表面光滑，淡粉紅色(2-E-8)，瓊脂2%)少量帶粉紅色的白色需氧菌絲體。
ISP4(無機(jī)鹽適度生長，表面光滑，珊瑚粉紅色(2-E-淀粉瓊脂)10)。
ISPn5(甘油適度生長，表面光滑平坦，淡粉紅色(2-A-天門冬酰胺瓊脂)9)，豐富的白色需氧菌絲體產(chǎn)生。
ISP6(胨酵母適度生長，有細(xì)長的皺褶，淡珊瑚粉紅色(1-膏鐵瓊脂)A-10)。
ISP7(酪氨酸適度生長，表面光滑且薄，淡粉紅色(1-A-瓊脂)9)，產(chǎn)生豐富的淡粉色(1-C-9)需氧菌絲體。
Hichey與充分生長，表面厚且有皺褶，淡珊瑚粉紅色(1Tresner′s瓊脂-A-10)，中等量產(chǎn)生淡粉紅色需氧菌絲體Czapek葡萄糖生長不足，表面光滑且薄，中等量產(chǎn)生淡粉紅色瓊脂需氧菌絲體。
(接上)葡萄糖天門冬酰適度生長，表面光滑且薄，無色，不存在需氧菌胺瓊脂絲體。
營養(yǎng)瓊脂生長良好，表面光滑，帶粉紅色的淡橙色(9-A-7)。
Bennett′s適度生長，表面有細(xì)長的皺褶，淡琥珀粉紅色瓊脂(10-A-6)。
蘋果酸鈣瓊脂少量生長，表面光滑平坦，無色。
脫脂牛奶瓊脂適度生長，表面光滑，珊瑚粉紅色(2-F-9)。
雞蛋白蛋白瓊脂少量生長，表面光滑且薄，無色至淡粉紅色(2-A-8)。
右旋糖tryptose不生長瓊脂馬鈴薯瓊脂生長良好，表面光滑，帶粉紅色的淡橙色(9-A-7)。
所涉及到的顏色的字母和數(shù)據(jù)是根據(jù)Maerz和Paul的方法測定的(如上所提及的)。
玫瑰游動雙孢菌ATCC53773的生理學(xué)特征表Ⅱ試驗(yàn)結(jié)果淀粉水解陽性硫化氫的形成陰性
(接上)酪氨酸反應(yīng)陽性酪蛋白水解弱陽性蘋果酸鈣消化陰性明膠液化作用弱陽性牛奶凝結(jié)作用陰性牛奶胨化陰性硝酸鹽還原陽性表Ⅲ碳水化合物的利用碳源生長阿拉伯糖+木糖+核糖-果糖+/-半乳糖-葡萄糖+鼠李糖-乳糖-蔗糖-麥芽糖+蜜三糖-纖維素-
(接上)甘露糖醇-水楊苷+肌醇+纖維二糖-+適度生長+/-生長不足-不生長在本試驗(yàn)中使用第8號培養(yǎng)基，在28-30℃培養(yǎng)2周后對結(jié)果進(jìn)行評估。
對溫度的敏感性最適生長溫度范圍為28-37℃。在15℃和50℃不生長，在20℃適度生長。
化學(xué)分類特征細(xì)胞壁分析通過Becker等人描述的方法進(jìn)行細(xì)胞壁內(nèi)存在的氨基酸分析(“通過全細(xì)胞水解的紙層析法快速鑒別土壤絲菌屬與鏈霉菌屬”，Appl.Microbiol.12，421-423，1964)。
全細(xì)胞水解分析表明存在正-二氨基庚二酸。
對按照Kawamoto等人的方法獲得的純細(xì)胞壁制劑的分析，未發(fā)現(xiàn)甘氨酸存在(KawamotoI.，O.Tetsuo，和N.Takashi，“MicromonosporaOlivoasterosporia，Micromonosporasagamiensis及相關(guān)生物體的細(xì)胞壁組合物”，J.ofBacteriol.146，527-534，1981)。
全細(xì)胞糖模型根據(jù)LechevalierM.P.的方法進(jìn)行水解的全細(xì)胞糖含量的分析(“需氧放線菌的臨床重要性鑒定”J.Lab.Clin.Med.71，934-944，1968)，用StaneckJ.L.和G.D.Roberts描述的薄層色譜纖維紙(“通過薄層色譜法簡單測定需氧放線菌”，Appl.Microbiol.28，226-231，1974)采用如下的溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯-吡啶-水(100∶35∶25V/V)。
所得到的結(jié)果表明存在Madurose(3-氧-甲基-D-半乳糖)，不存在阿拉伯糖和半乳糖。
菌株玫瑰游動雙孢菌ATCC53773的歸屬由于下述形態(tài)和化學(xué)特征，將此菌株歸入游動雙孢菌屬(Planobispora)分類為玫瑰游動雙孢菌屬(Planobisporarosea)a)在細(xì)胞壁中存在正-二氨基庚二酸，缺乏甘氨酸(細(xì)胞壁化學(xué)類型Ⅲ)。
b)全細(xì)胞水解物中存在madurose(全細(xì)胞糖B型)。
c)在產(chǎn)生菌絲體的長園柱狀孢子囊上的形成物中含有一對能動的孢子。
d)植物菌絲體為粉紅色上面所述的PlanobisporaroseaATCC53773的形態(tài)學(xué)特征與J.E.Thieman等人在“放線菌”(TheJenaIntern.Symp.onTaxon，1968年9月，ed.H.Prauser，Jena.)中所描述的那些玫瑰游動雙孢菌菌株沒有本質(zhì)上的不同。該菌株寄存于美國典型菌種保藏中心(ATCC)，寄存號為23866。沒有該菌株的抗生素生產(chǎn)物被描述過。
如同其它微生物一樣，GE2270產(chǎn)生菌的特性也會發(fā)生變化。例如，通過用各種已知的誘變劑，如紫外線、X-射線、高頻波、放射線及化學(xué)劑如亞硝酸、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍及許多其它的化學(xué)藥品處理，可以獲得該菌株的人工變異體和突變體。所有屬于游動雙孢菌屬并產(chǎn)生抗生素GE2270的天然及人工變異體和突變體被認(rèn)為是適合于本發(fā)明目的的玫瑰游動雙孢菌ATCC53773菌株的等同物，并被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
如上所述，抗生素GE2270一般地主要在產(chǎn)生菌的菌絲體中發(fā)現(xiàn)，同時也有少量物質(zhì)在發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)。
從產(chǎn)生微生物的菌絲體或發(fā)酵液中回收抗生素GE2270是按照本身已知的技術(shù)完成的，如用溶劑萃取，通過加入非溶劑或改變?nèi)芤旱腜H值進(jìn)行沉淀，分配色譜法、反相分配色譜法、離子交換色譜、分子排阻色譜法等。
優(yōu)選的從菌絲體中回收本發(fā)明抗生素物質(zhì)的方法包括用與水互溶的有機(jī)溶劑萃取經(jīng)過濾或離心的菌絲體、濃縮萃取液以及選擇地加入沉淀劑，用沉淀法回收抗生素物質(zhì)粗品，用不與水互溶的有機(jī)溶劑萃取水相殘渣或用吸附色譜法、然后將所需的產(chǎn)物從吸附基質(zhì)上洗脫。
優(yōu)選的從發(fā)酵液中回收本發(fā)明的抗生素物質(zhì)的方法包括用不與水互溶的有機(jī)溶劑萃取，然后通過加入合理的沉淀劑從濃縮提取物中進(jìn)行沉淀，或用不與水互溶的溶劑對其水狀余留物進(jìn)一步萃取。也可以使發(fā)酵液與吸附基接觸，然后用極性洗脫混合物洗脫。也可將色譜分析方法不用于發(fā)酵液而用于從發(fā)酵液得到的濃縮提取物中。
本申請中所使用的術(shù)語“可與水互溶的溶劑”是指具有在該領(lǐng)域中此術(shù)語通常給定的含意并涉及這樣的溶劑，即在使用條件下，在適當(dāng)寬的濃度范圍中可與水互溶。
可用于從菌絲體團(tuán)中萃取本發(fā)明的抗生素物質(zhì)的可與水互溶的有機(jī)溶劑實(shí)例為低級烷醇，例如(C1-C3)烷醇如甲醇、乙醇和丙醇;苯基(C1-C3)鏈烷醇如芐基乙醇;低級酮，例如(C3-C4)酮如丙酮和乙基甲基酮;環(huán)醚如二氯六環(huán)和四氫呋喃;脂肪族二元醇類及其部分醚化產(chǎn)物，如1，2-亞乙基二醇、丙二醇和乙二醇單甲基醚;低級胺如二甲基甲酰胺和二乙基甲酰胺。
在本申請中所使用的術(shù)語“不與水互溶的溶劑”是指通常本領(lǐng)域中該術(shù)語的含意并涉及在使用條件下，在適當(dāng)寬的范圍內(nèi)適合于所需用途的微溶于水或幾乎不溶于水的溶劑。
可用于從發(fā)酵液中萃取本發(fā)明的抗生素物質(zhì)的不與水互溶的有機(jī)溶劑實(shí)例為通常的直鏈、支鏈或環(huán)狀碳水化合物溶劑，如己烷或環(huán)己烷、鹵代烴如氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氟溴乙烷、二溴乙烷、三氯丙烷、氯三氟辛烷等;芳香烴如苯、甲苯、二甲苯等;至少四個碳原子的酯，如乙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯等;至少四個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷醇，如丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、3，3-二甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、2，2-二甲基-3-戊醇，2，4-二甲基-3-戊醇、4，4-二甲基-2-戊醇、5-甲基-2-己醇、1-庚醇、2-庚醇、5-甲基-1-己醇、2-己基-1-己醇、2-甲基-3-己醇、1-辛醇、2-辛醇、環(huán)戊醇、2-環(huán)戊基乙醇、3-環(huán)戊基-1-丙醇、環(huán)己醇、環(huán)庚醇、環(huán)辛醇、2，3-二甲基環(huán)己醇、4-乙基環(huán)己醇、環(huán)辛基甲醇、6-甲基-5-庚-2-醇、1-壬醇、2-壬醇、1-癸醇、2-癸醇和3-癸醇;直鏈或支鏈烷基醚及其混合物，如石油醚、乙醚、丙醚、丁醚等;以及其混合物或其功能衍生物。
如同在本技術(shù)中已知的，相分離可通過鹽析改進(jìn)。
萃取時，回收含有大量有機(jī)溶劑的水相，對它進(jìn)行共沸，蒸餾出水是很方便的。一般需要加入可以與水形成最低共沸混合物的溶劑，然后如果需要的話加入沉淀劑沉淀出所需的產(chǎn)物。可與水形成最低共沸點(diǎn)混合物的有機(jī)溶劑的典型實(shí)例為n-丁醇、苯、甲苯、丁醚、四氯化碳、氯仿、環(huán)己烷、2，5-二甲基呋喃、己烷和間二甲苯;優(yōu)選的溶劑為正丁醇。
沉淀劑的實(shí)例為石油醚、低級烷醚如乙醚、丙醚和丁醚，以及低級烷酮如丙酮。
可方便地用于回收本發(fā)明抗生素物質(zhì)的層析系統(tǒng)實(shí)例為聚苯乙烯或混合的聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂如Amberlite XAD2或XAD4(Rohm和Haas)，S112(Dow Chemical Co.)和Piaion HP20(Mitsubishi);丙烯酸樹脂如XAD7或XAD8(Rohm和Haas);聚酰胺如聚己內(nèi)酰胺，尼龍和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，通常其孔體積的范圍是1-5ml/g，表面積為1-100m2/g，表觀密度為0.15-0.50g/ml，平均孔徑為100-3000埃單位以及粒度分布為至少40%的粒子大小低于300微米，如聚酰胺-CC6，聚酰胺-SC6，聚酰胺-CC6.6，聚酰胺-CC6AC和聚酰胺-SC6AC(Macherey-Nagel&Co.，西德)，聚乙烯吡咯烷酮樹脂PVP-Cl(AldrichChemieGmblt&Co.，KG，西德)，聚酰胺樹脂PA400(M.WoelmAG，西德);和碳。
對于聚苯乙烯或丙烯酸樹脂，優(yōu)選的洗脫劑為如上面所述的可與水互溶的極性溶劑混合物，對于聚酰胺樹脂，優(yōu)選的洗脫劑為如上面所說的可與水互溶溶劑的水的混合物，而對于碳，較好的洗脫劑為低級酮如丙酮或低級醇如甲醇。
抗生素GE2270粗制品的進(jìn)一步純化可以通過任何一種已知的技術(shù)完成，但是優(yōu)選的是用色譜法處理。
色譜法的實(shí)例是那些在上述有關(guān)回收步驟中所敘述的，并且也包括固定相色譜法，如硅膠、氧化鋁、硅酸鎂載體等、其有機(jī)洗脫相由混合溶劑制成，包括前面所提及的典型的鹵代烴、醚、高級酮，或在具有各種功能衍生作用的硅烷化硅膠上進(jìn)行的反相色譜法，其洗脫劑含有如上所說的可與水互溶溶劑的水的混合物。
也可以方便地使用稱為空間排阻色譜技術(shù)，它有良好的純化結(jié)果，特別是大部份羥基已被烷基化的可控孔交鏈葡聚糖，即SephadexLH-20(PharmaciaFineChemicals，Ab)用于本技術(shù)中是有益的。
通常在本技術(shù)中，生產(chǎn)回收與純化步驟可以通過各種分析方法，包括生物鑒定方法監(jiān)控，如對敏感微生物的紙盤或瓊脂擴(kuò)散分析或薄層層析法(TLC)或高壓液相色譜法(HPLC)，其中可以包括紫外(UV)或微生物滯留步驟。
優(yōu)選的HPLC技術(shù)是使用多孔球形粒狀硅烷化硅膠柱的反相HPLC，即具有相同直徑的用C-18烷基官能化的硅膠(如5微米UltrasphereODSAltex;BeckmanCo.)，預(yù)置柱為用C-18烷基官能化的硅膠(如PR18Brownleelabs)，洗脫劑為如上面所述之一的可與水互溶的極性溶劑的線性梯度混合物的緩沖水溶液。最好將該溶液PH調(diào)至5-7。最優(yōu)選的洗脫劑為在洗脫劑B中洗脫劑A從45%至70%的線性梯度洗脫劑，其中洗脫劑B為乙腈/水的緩沖液混合物10∶90，PH5-7洗脫劑A為乙腈/水的緩沖液混合物70∶30，PH5-7。
抗生素GE2270因子A的物理化學(xué)特征A)在附

圖1中的紫外吸收圖譜給出下列最大吸收值E1%1CMλmax(nm)0.1MHCl245(肩峰)3100.1MKoH245(肩峰)313磷酸鹽緩沖液，PH7.4245(肩峰)314甲醇244(肩峰)265310B)附圖2為石蠟糊中的紅外吸收圖譜，顯示下列最大吸收值(Cm-1)3700-3060;3060-2660(液體石蠟);1650;1590-1490;1490-1420(液體石蠟);1375(液體石蠟);1310;1245;1210;1165;1090;1060;1020;970;930;840;810;750;720(液體石蠟);700;
該圖譜的主要官能紅外吸收帶歸成為ν(Cm-1) 說明3600-3100νNH，νOH1650酰胺Ⅰ(νC＝0)1545雜環(huán)νC＝C和νC＝N1525，1495酰胺Ⅱ(δNH)1250，1205芳香族δCH870雜環(huán)γCH745，700芳香族γCHC)圖3給出的1H-NMR圖，以三甲基硅烷(TMS)作內(nèi)標(biāo)(0.00PPM)，在DMSO-d6(六氘二甲基亞砜)中，在500MHz記錄的各組信號(PPM)如下;每一信號的質(zhì)子數(shù)標(biāo)在括號內(nèi)9.02(1);8.68(1);8.70(1);8.57(1);8.50(1);8.43(1);8.37(1);8.26(1);8.25(1);7.4-7.20(9);6.96(2);6.02(1);5.30-5.18(3);5.01(1);4.97(2);4.80(1);4.56(1);4.30(1);4.26(1);3.98(1);3.81(1);3.79(1);3.38(3);2.72(1);2.58(3);2.48(3);2.16(1);2.13(1);1.96(2);1.88(1);1.34(1);0.87(3);0.84(3);
D)附圖4為13C-NMR圖譜，以TMS作內(nèi)標(biāo)(0.00PPM)，在DMSO-d6中，在125MHz的各組信號(PPM)如下，Q代表四價碳原子或C＝0基因;173.69，Q;171.10，Q;169.83，Q;169.51，Q;168.45，Q;168.26，Q;167.84，Q;165.68，Q;164.75，Q;161.40，Q;161.23，Q;160.46，Q;160.29，Q;159.35，Q;153.42，Q;150.31，Q;150.11，Q;149.41，Q;146.93，Q;144.73，Q;143.75，Q;142.10，Q;141.78，Q;141.33，CH;140.97，Q;139.53，Q;128.68，CH;127.99，
127.67，Q;127.67，CH;126.88，CH;126.76，
123.17，CH;118.66，CH;116.42，CH;73.81，CH;69.41，CH2;67.97，CH;67.36，CH2;60.12，CH;58.63，CH3;58.24，CH;55.41，CH;48.15，CH;47.03，CH2;41.19，CH2;37.60，CH2;34.06，CH;29.76，CH2;25.85，CH3;24.28，CH2;18.49，CH3;17.98，CH3;11.99，CH3;
E)在下述條件下進(jìn)行反相HPLC分析時，保留時間(Rt)為14.9分鐘柱UltrasphereODS(反相硅烷化硅膠，5微米)Altex(Beckman)4.6mm(i，d，)×250mm預(yù)置柱BrownleeLabsRP18(八癸基硅烷硅膠;5微米)洗脫劑A乙腈∶18mM磷酸鈉70∶30(V/V)，調(diào)至PH7.0洗脫劑B乙腈∶18mM磷酸鈉10∶90(V/V)，調(diào)至PH7.0洗脫方式在20分鐘內(nèi)，洗脫劑A在洗脫劑B中從45%至70%的線性梯度洗脫流速1.8ml/min紫外檢測器254nm內(nèi)標(biāo)氯霉素(Rt＝3.7分鐘)F)在惰性氣氛下，在約140℃將樣品預(yù)先干燥后進(jìn)行元素分析，結(jié)果表明有如下組成碳、氫、氮、硫;
G)在如下色譜系統(tǒng)中Rf值為0.37∶二氯甲烷∶甲醇＝9∶1(V/V)，使用硅膠板(硅膠60下254，Merck Co)顯色紫外線254nm，使用碘蒸氣或用在最低量Davis培養(yǎng)基中枯草桿菌ATCC 6633生物自柱法，呈黃色色斑;內(nèi)標(biāo)氯霉素(Rf0.56)。
H)FAB-MS分析在質(zhì)/荷比(m/z)1290.3±0.1道爾頓處顯示出該質(zhì)子化分子離子的最低質(zhì)量同位素。在下述實(shí)驗(yàn)條件下，用KratosMS-50雙焦質(zhì)譜儀分析，在圖譜中所有其它高于800m/z質(zhì)量單位的峰(同位素峰不計)比該分子離子低20%以6千伏(Kv)Xe快原子轟擊;甘油基質(zhì);陽離子化方式。
I)氨基酸的鹽酸水解分析表明有如下天然氨基酸存在甘氨酸、(L)脯氨酸和(L)絲氨酸，該分析的實(shí)驗(yàn)條件如下樣品在含1%苯酚的6NHcl存在下，在105℃水解20小時，然后按如下兩步衍生a)在無水丙酮中用2MHcl生成該羧酸官能團(tuán)的正丙酯，(90℃，1小時)，然后在氮?dú)夥障赂稍铩?br> b)用五氟丙酸酐/無水二氯甲烷(1∶9V/V)在室溫下1小時，將游離氨基轉(zhuǎn)化為酰胺，然后在氮?dú)夥障赂稍?如此獲得的衍生物溶解于二氯甲烷中，并在如下條件下，使用HP5985B系統(tǒng)進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析柱將手性n-丙酰-L-纈氨酸、叔丁酰胺、聚硅氧烷涂于溶凝的硅石毛細(xì)管柱上(25m×0.2mm直徑，毛細(xì)管氣相色譜法分析)，溫度為80℃保持4分鐘，然后每分鐘4℃。
L)離子化研究通過在甲基溶纖劑/水中的0.1N Hcl和0.1N NaoH滴定測檢不到離子官能團(tuán)，用在非水基質(zhì)(乙酸)中的0.1N HclO4滴定顯示出弱堿性官能團(tuán)。
M)旋光率〔α〕20D＝±140.8;無水乙醇，濃度約為5克/升。
本發(fā)明化合物的抗菌活動可以通過一系列標(biāo)準(zhǔn)試管內(nèi)試驗(yàn)得到證明。
對難辨棱狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)和脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)的最低抑制濃度(MIC)可以通過瓊脂稀釋法檢測(接種體104CFU)。對于其他生物體的MIC可以通過微量肉湯稀釋法測定(接種104至105CFU/ml)。Ureaplasma arealyticum接種體大約為104顏色變化單位/每毫升，除淋病奈氏球菌(N.gonorrhoeae)，Branhamella catarrhalis、流感嗜血桿菌(H.influenzae)、難辨棱狀芽孢桿菌、痤瘡丙酸桿菌和脆弱擬桿菌48小時外，培養(yǎng)時間為18-24小時，除白色念珠菌(Candida albicans)在30℃外，所有生物體均在約37℃培養(yǎng)。淋病奈氏球菌和流感嗜血桿菌在5%CO2氣氛中、厭氧菌在絕氧混合物中培養(yǎng)。所使用的培養(yǎng)基為等靈敏肉湯(Oxoid)、〔葡萄球菌(Staphylococci)，類鏈球菌(Streptococcus faecalis)，Streptococcus faecium，大腸桿菌、銅綠色極毛桿菌(Pseudomonas aeruginosa)，普通變形菌(Proteus vulgaris)，肺炎克氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)〕;Todd-Hewitt肉湯(Difco)(對其它鏈球菌);GC基肉湯(Difco)+1% Isovitalex BBL(對淋病奈氏球菌);腦心浸漬肉湯(Difco)+1%添加物C(Difco)(對流感嗜血桿菌);Mueller-Hinton肉湯(BBL)(對Branhamella catarrhalis);AC培養(yǎng)基(Difco)〔對產(chǎn)氣夾膜桿菌(C.Perfringens)〕;Wilkins-Chalgren瓊脂(oxoid)(對其他厭氧菌)(T.D.Wilkins和S.Chalgren，Antimicrob.Ag.Chemother.10，926，1976);含添加物的Evans和Taylor-Robinsou肉湯(Difco)(對于U.urealyticum)，酵母氮肉湯(Difco)(對白色念球菌)。
下面表Ⅳ中列出了對某些微生物的最低抑制濃度(MIC，微克/毫升)。
表Ⅳ抗生素GE2270因子A的菌株最小抑制濃度(微克/毫升)金黃色葡萄球菌(Staph.aureus)TourL1650.25金黃色葡萄球菌Tour L165(106cfu/ml) 0.25金黃色葡萄球菌TourL165+30%牛血清0.25表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis)L147ATCC122280.13溶血葡萄球菌L6020.5溶血葡萄球菌L602(106cfu/ml) 1釀膿鏈球菌(Streppyogenes)C2030.25肺炎鏈球菌(Streppneumoniae)UC410.13類鏈球菌ATCC70800.13和緩鏈球菌(Strep.mitis)L7960.13產(chǎn)氣夾膜桿菌ISS305430.03難辨棱狀芽孢桿菌ATCC96890.03痤瘡丙酸桿菌ATCC6919≤0.004脆弱擬桿菌ATCC237452淋病奈氏球菌ISM68/12632BranhamellaCatarrhalisATCC81761流感嗜血桿菌ATCC19418128UreaplasmaurealyticumL147932大腸桿菌SKF12140＞128普通變形菌ATCC881＞128
(接上)銅綠色極毛桿菌ATCC10145＞128肺炎克氏桿菌L142＞128白色念球菌SKF2270＞128抗生素GE2270的活性也可以被臨床分離腸球菌的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
表Ⅴ列出了這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表Ⅴ抗生素GE2270的抗腸球菌活性微克/毫升種菌株數(shù)MIC范圍 MIC50MIC90類鏈球菌 15＊0.03-0.25 0.06 0.25＊包括4個抗萬古霉素菌株類鏈球菌 15＊0.06-0.5 0.06 0.13＊包括5個抗萬古霉素菌株有關(guān)臨床分離凝固酶陰性的葡萄球菌的一些體外試驗(yàn)結(jié)果列于下面表Ⅵ中。
表Ⅵ抗生素GE2270對抗凝固酶陰性的葡萄球菌的活性GE2270的MIC(微克/毫升)表皮葡萄球菌L4080.5L4230.25L4100.5L3930.5L4250.25溶血葡萄球菌L3530.25L6020.25L3830.5L6260.5L3821L6201L3810.5抗生素GE2270的抗菌活性圖譜也包括厭氧菌，其體外試驗(yàn)結(jié)果列于下面表Ⅶ中。
表ⅦGE2270的抗厭氧菌活性GE2270的MIC(微克/毫升)脆弱擬桿菌L12362L12371L12261L12281L10102痤瘡丙酸桿菌L10140.004L15600.004L15630.03L15650.008抗痤瘡丙酸桿菌的活性在涉及到11個臨床分離菌株的體外實(shí)驗(yàn)中也被證實(shí)，結(jié)果如下抗生素GE2270的抗痤瘡丙酸桿菌活性微克/毫升菌株數(shù)MIC范圍 MIC50MIC90110.004-0.0080.0080.008抗類腸球菌的殺菌活性在100mlErlenmeyer瓶內(nèi)，10mlTodd-Hewitt肉湯中，不加攪拌下于37℃恒溫，畫出殺滅一時間曲線。類腸球菌L149對數(shù)生長培養(yǎng)物以1.4×107CFU/ml接種。
參照抗生素(teicoplanin，8mg/l)在48小時內(nèi)殺死99%的感染細(xì)菌，而抗生素GE2270因子A(0.13mg/l)在2小時內(nèi)殺死99.8%的這種細(xì)菌，以此劑量在48小時內(nèi)或以4mg/l在24小時內(nèi)殺死99.99%的細(xì)菌。
這種抗類腸球菌活性也可以推廣至對糖肽抗生素具有抗性的菌株。
抗Gardnerellavaginalis活性用5%兔血和0.15%溶化的兔血在Casman瓊脂上進(jìn)行13個G.vaginalis臨床分離體的試驗(yàn)(接種量約104CFU)?？股谿E2270因子A的最低抑制濃度范圍為2-4mg/l，MIC50為2mg/l，于37℃在絕氧混合物中保溫48小時。
小鼠敗血病實(shí)驗(yàn)本發(fā)明化合物的抗菌活性也可以被小鼠敗血病實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
用含黃色葡萄球菌ATCC19636使八只一組的雄性與雌性CD1小鼠(Charles River，平均重18-22克)腹膜內(nèi)感染，在0.5ml5%細(xì)菌粘蛋白(Difco)中懸浮，產(chǎn)生抗菌激發(fā)(106細(xì)胞/小鼠)。感染后，立即將試驗(yàn)化合物在含5%二甲基甲酰胺和10%Cremophor EL(聚乙氧基蓖麻油)的無菌水溶液中靜脈內(nèi)用藥。
ED50是根據(jù)Spearman和Kaerber方法的每個劑量，在第7天存活動物的百分?jǐn)?shù)計算的，所得結(jié)果為1.13mg/Kg。
大鼠心內(nèi)膜炎試驗(yàn)使重約200克的雄性CD大鼠(CharlesRiver)誘發(fā)心內(nèi)膜炎。將聚乙烯導(dǎo)管(PP.25Portex)穿過主動脈瓣膜經(jīng)右頸動脈插入左心室，并用絲線系牢。用一個帶有壓力轉(zhuǎn)換器的記錄放大器(Hewlett Packard Model 7782A)控制，矯正導(dǎo)管的位置。兩天后，通過靜脈內(nèi)注射含104CFU的金黃色葡萄球菌L1524的0.5ml鹽水使大鼠感染，感染16小時開始進(jìn)行5天的治療。將溶于丙二醇Cremophor EL5%葡萄糖(10∶20∶70)中的抗生素GE2270因子A按20mg/Kg的劑量每天兩次靜脈內(nèi)注射。從治療起的第六天將存活的大鼠殺死，取出心臟。每個在該治療結(jié)束前死去的動物進(jìn)行尸體解剖，取出心臟。將每只心臟稱重并打成勻漿;均漿連續(xù)稀釋并涂于Todd-Hewitt瓊脂上以測定細(xì)菌負(fù)荷，全心勻漿中存在的血液不影響結(jié)果，因?yàn)檠褐械募?xì)菌滴定度總是比心臟負(fù)荷至少低1000倍。通過Scheffe的多重比較試驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。在感染后40小時內(nèi)死亡的大鼠被排除在統(tǒng)計學(xué)分析之內(nèi)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下抗生素GE2270因子A對于大鼠葡萄球菌心內(nèi)膜炎的活性感染每天劑量 Log10CFU/g心臟生物體＊＊治療 mg/Kg 鼠號(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)＊＊＊途徑L1524無119.48±0.33賦形劑靜脈注射139.61±0.31GE2270(20×2)因子A 靜脈注射 12 4.89±1.29＊＊與對照組(未治療或用賦形劑治療)比較，P＜0.001。
＊＊＊ 治療開始時心臟細(xì)菌負(fù)荷7.36±0.31(5只動物的log10CFU/g心臟的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
＊＊抗生素GE2270因子A對于金黃色葡萄球菌L1524的最低抑制濃度0.25微克/毫升。
急性毒性小鼠的急性毒性試驗(yàn)表明，在這一動物種中，靜脈注射抗生素GE2270因子A的LD50高于100mg/Kg，腹膜內(nèi)注射LD50高于500mg/Kg。
根據(jù)其性質(zhì)，本發(fā)明化合物可以用作人或動物治療的藥物制劑的活性成份。
具體地說，抗生素GE2270因子A是一種主要對抗革蘭氏陽性細(xì)菌及革蘭氏陽性與革蘭氏陰性厭氧菌具有活性的抗菌劑。它似乎對葡萄球菌心內(nèi)膜炎有很大的活性，而與甲氧苯青霉素、氨基苷或糖肽抗生素沒有任何交叉抗性。
本發(fā)明抗生素物質(zhì)的主要治療適應(yīng)癥是治療由于對其敏感的微生物存在所涉及的感染。
術(shù)語“治療”意欲包括預(yù)防、治療和治愈。
接受這種治療的對象是任何需要治療的動物、包括靈長目，特別是人，以及其它哺乳動物如馬、牛、豬和羊;以及家禽和一般供玩賞動物。
本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)服用或與藥物可接受的載體混合使用，也可以與其他抗菌劑如青霉素、頭孢菌素、氨基苷和糖肽聯(lián)合使用。聯(lián)合治療包括連續(xù)、同時和單獨(dú)使用該活性化合物，施用方式是在首先施用的一種藥物療效未完全消失時，施用另一種。
優(yōu)選的藥物制劑為適于在未受損的或損傷的皮膚或粘膜上局部使用的制劑。這樣一些制劑的例子有粉劑、軟膏、乳膏和洗劑。在這些制劑中的賦形劑為通常藥物學(xué)上可接受的賦形劑如油狀軟膏基(例如十六烷基酯蠟、油酸、橄欖油、石蠟、鯨蠟、甘油淀粉)，吸收性軟膏基(例如無水羊毛脂、親水礦脂)，乳狀軟膏基(例如十六烷醇、單硬脂酸甘油酯、羊毛脂、硬酯酸)，可溶于水的軟膏基(例如乙二醇醚及其衍生物、包括聚乙二醇、聚(氧-1，2-乙二基(ethanediyl))-α-H-W-羥基-十八烷酸酯、多乙氧基醚以及聚乙二醇單硬脂酸酯)。
這些制劑可以含有其它已知的賦形劑，例如防腐劑，并且按照本領(lǐng)域已知的及參考手冊所敘述的方法制備，如Remington′sPharmaceuticalSciences，17版，1985年Mack出版公司。
按照本領(lǐng)域中本身是已知的方法及如上所述參考書中所報導(dǎo)的方法，本發(fā)明的化合物也可以制成適于非腸道使用的制劑。
例如，將本發(fā)明化合物配制成在注射用無菌水中含增溶劑如聚丙二醇或二甲基乙酰胺以及含表面活性劑如聚氧乙烯山梨糖醇-油酸或聚乙氧化蓖麻油的制劑。
一個典型的非腸胃道使用制劑的實(shí)例為每毫升最終制劑含10mg抗生素GE2270因子A、10-20%表面活性劑如聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物或聚氧乙烯氫化蓖麻油衍生物，以及0-20%，最好為10-20%的增溶劑如丙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、叔丁基-N-hydroxycarmabate、1，2-，1，3-或1，4-丁二醇、油酸乙酯、四氫糠基-聚乙二醇200、二甲基異山梨糖醇、芐基乙醇等。優(yōu)選的增溶劑為丙二醇。
聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯是市售的，其中一些以“Tween”商標(biāo)名銷售，其非專有名稱“多乙氧基醚”也是已知的，其實(shí)例為多乙氧基醚20，21，40，60，61，65，80，81和85。本發(fā)明制劑中優(yōu)選使用的是多乙氧基醚80(脫水山梨糖醇-單-9-十八烷酸酯、聚(氧-1，2-乙二基)衍生物)。
聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氫化蓖麻油也是市售的。其中一些以“Cremophor”商標(biāo)名出售。這些化合物的實(shí)例是那些已知的如CremophorEL(聚乙氧基化蓖麻油)、CremophorRH40(聚乙氧基化氫化蓖麻油)、CremophorRH60(PEG60氫化蓖麻油)或EmulphorEL-719(聚氧乙烯化植物油)。
注射制劑PH范圍最好在7±0.15，如果需要可以用合適的緩沖劑適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)制劑的PH值。TRIS(即三羥甲基氨基甲烷)或磷酸鹽可以很方便地用作緩沖劑。
優(yōu)選的非腸胃道使用的制劑含有如下的賦形劑20% Cremophor
EL(聚氧基35蓖麻油UPS/NF)，5-20%丙二醇，最好是10-20%丙二醇。
通常，可以通過將活性成分溶于有機(jī)溶劑，然后加入合適的表面活性成分，最后用注射用無菌水稀釋至所需體積，從而制成這些制劑。
在本領(lǐng)域已知的其它賦形劑如防腐劑或增溶劑也可加入。
非腸胃道制劑的實(shí)例如下抗生素GE2270因子A10mgPEG40蓖麻油(CremophorEL)0.2ml丙二醇0.2ml對羥基苯甲酸甲酯0.5mg
對羥基苯甲酸丙酯0.05mg注射用水加至1ml此外，活性成份可以制成凍干粉末，在使用前恢復(fù)。
如果這種凍干原料是由含活性成份與表面活性劑如聚乙二醇60氫化蓖麻油的混合物制成，那么只用水介質(zhì)而不加有機(jī)溶劑就可以很方便地使其恢復(fù)。
如果需要，可任意加入普通的凍干輔劑，從而獲得粉末狀凍干原料。
在治療任何涉及對本發(fā)明抗生素敏感的微生物感染中，所有這些制劑最好用于靜脈注射給藥。
在對假膜結(jié)腸炎或其他由胃腸道中存在厭氧菌而引起的疾病的治療中，可以口服有效劑量的本發(fā)明化合物，適合的藥物劑型如膠囊、片劑或水相懸浮劑。
活性成份的劑量由許多因素決定，其中包括患者的類型、年令及狀態(tài)，具體的活性成份及用藥配方的選擇、用藥安排等。
通常，有效抗菌劑量按照每一單位劑量劑型使用。
一般，最好是重復(fù)敷用/給藥，例如每天2-6次，一般有效劑量范圍在0.5-50mg/Kg體重/每天。
優(yōu)選的局部制劑是含1%至10%本發(fā)明化合物的軟膏。
無論如何，處方醫(yī)師可以對一定情況下的患者決定適合的劑量。
本發(fā)明化合物除了可用作人和獸治療藥物之外，還可以用作動物生長促進(jìn)劑。
為達(dá)到這一目的，將本發(fā)明化合物在合適的飼料中使用。所使用的正確濃度應(yīng)該是當(dāng)正常量飼料被消耗時，以生成促進(jìn)有效的量提供活性成份。
將本發(fā)明活性化合物加入動物飼料中的方法最好是制備適當(dāng)?shù)暮杏行Щ钚曰衔锏娘暳项A(yù)混物，并將預(yù)混物混合達(dá)到完全的定量。
另一種辦法可以在飼料中混入含活性成份的中間提濃物或飼料添加劑。制備和施用這種飼料預(yù)混物及完全定量的方法在一些參考書中已被描述(例如“應(yīng)用動物營養(yǎng)”，W.H.FreedmanandCo.，S.Francisco，U.S.A，1969或“家禽飼料與飼養(yǎng)”O(jiān)andB圖書公司，Corvallis，Oregon，USA，1977)。
附圖的簡要說明圖1為抗生素GE2270因子A的紫外圖譜。符號與所用溶劑的對應(yīng)關(guān)系如下-指在CH3OH中的分析●指在0.1NHCl中的分析■指在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中的分析▲指在0.1NKoH中的分析圖2為抗生素GE2270因子A在石蠟糊中的紅外吸收圖譜。
圖3為在DMSO-d6中抗生素GE2270因子A在500MHz下的1H-NMR圖譜。
圖4為在DMSO-d6中抗生素GE2270因子A在125MHz下的13C-NMR圖譜。
下面的實(shí)例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而絕不是對本發(fā)明的限制。
實(shí)例1抗生素GE2270的生產(chǎn)將玫瑰游動雙孢菌ATCC53773的培養(yǎng)物于28-30℃下在燕麥片瓊脂斜面上生長兩周，然后接種在含100ml具有以下成分的種子培養(yǎng)基的500ml長頸瓶中淀粉20g/l多蛋白胨5g/l酵母提取物3g/l牛肉提取物2g/l大豆粉2g/l碳酸鈣1g/l加蒸餾水至100ml(滅菌前將PH值調(diào)至7.0)該長頸瓶在旋轉(zhuǎn)振動器(200rpm)上于28-30℃下恒溫92小時。然后將所得到的培養(yǎng)物接種于含有4升相同培養(yǎng)基的發(fā)酵罐里，并在通氣(每體積每秒約1標(biāo)準(zhǔn)升空氣)攪拌(約900rpm)下于28-30℃保溫48小時。
將所得發(fā)酵液轉(zhuǎn)入含50升如下培養(yǎng)基的發(fā)酵器中淀粉20g/l胨2.5g/l水解酪朊2.5g/l酵母提取物3g/l牛肉提取物2g/l大豆粉2g/l碳酸鈣1g/l加蒸餾水至足量(滅菌前將PH值調(diào)至7.0)
并在28-30℃下保溫72小時。
抗生素生產(chǎn)可通過用枯草桿菌ATCC6633在最低量Davis培養(yǎng)基上生長的紙盤瓊脂分析法監(jiān)測。在35℃保溫過夜后評價其抑制作用區(qū)。
實(shí)例2抗生素GE2270的回收收集如上獲得的發(fā)酵物質(zhì)(50升)，并在有助濾劑(Clarcell)存在下過濾。
抗生素GE2270主要發(fā)現(xiàn)于菌絲體中，盡管也可以從濾液中回收一些。
a)將濾液PH值調(diào)至約7.0并用乙酸乙酯(50升)萃取。離心分離有機(jī)相并減壓濃縮至一個小的體積。然后用石油醚處理所得到的油狀物，沉淀得到粗抗生素GE2270。將其過濾收集并干燥。于是得到415mg粗抗生素GE2270復(fù)合物。
b)用20升甲醇萃取菌絲體兩次，合并提取液，減壓濃縮，從而得到水相殘渣。將此殘渣用乙酸乙酯萃取兩次。向濃縮的有機(jī)相中加入石油醚，沉淀出粗抗生素GE2270(6.06g)。
實(shí)例3抗生素GE2270因子A的純化將按照上述方法從菌絲體中得到的粗產(chǎn)品(3克)溶解于四氫呋喃中，并在硅膠(230-400目)存在下減壓濃縮。收集所得到的固體殘渣，裝到含300g在二氯甲烷(CH2Cl2)中制備的硅膠(230-400目)的色譜柱上。首先用2升二氯甲烷使柱顯色，然后加入1.5升比率為98/2、96/4、94/6、92/8、90/10和88/12(V/V)的二氯甲烷與乙醇的混合物。
收集各個組分，進(jìn)行TLC、HPLC或抗枯草桿菌微生物分析，并根據(jù)其抗生素含量合并組分。
將合并的含有純抗生素GE2270因子A(HPLC保溫時間14.9分鐘，見物理-化學(xué)數(shù)據(jù)，E項(xiàng))的組分減壓濃縮，從而產(chǎn)生一個油狀物，將此油狀物溶于四氫呋喃中。向該溶劑中加入石油醚，沉淀出抗生素GE2270因子A(600mg)。
實(shí)例4另一種得到抗生素GE2270因子A的來源是從上面所述色譜系統(tǒng)分離出的其它組分中獲得，但所含的抗生素GE2270因子A是不純的(HPLC)。還是將這些組分合并、濃縮和處理，從而獲得前面所述的固體。按照下面的過程，通過高壓液相色譜法(HPLC)純化抗生素GE2270因子A的粗制劑將一部分這種沉淀物(6mg)溶解在1∶1(V/V)的乙腈∶水中并注入配備有硅烷化硅膠柱(LichrosorbRP18，7微米，250×10mm，Merck，Darmstadt)的色譜系統(tǒng)中。
洗脫劑由流速約為4ml/分、在20分鐘內(nèi)溶液A在溶液B中從50%至85%的線性梯度的A與B的混合溶液組成。溶液A是乙腈與18mM磷酸鈉緩沖液70/30(V/V)的混合物，PH值調(diào)至6，而溶液B是乙腈與18mM磷酸鹽緩沖液10/90(V/V)的混合物，PH值調(diào)至6。
將色譜柱與PerkinElmerLC85紫外監(jiān)測器連接，于330nm處監(jiān)測。合并隨后的11個具有均勻含量的色譜操作的組分，并減壓濃縮除去乙腈，于是得到被分離的含抗生素GE2270因子A的殘留溶液。將這些溶液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，向濃縮的有機(jī)相中加入石油醚產(chǎn)生沉淀，得到抗生素產(chǎn)物。通過過濾回收和干燥，得到27mg抗生素GE2270因子A。
權(quán)利要求
1.具有如下特征的非鹽形式的抗生素GE2270因子AA)紫外吸譜呈現(xiàn)出如下的最大吸收值E1％1cmλmax(nm)0.1MHCl245(肩峰)3100.1MKOH245(肩峰)313PH7.4的磷酸鹽緩沖液245(肩峰)314甲醇244(肩峰)265310B)石蠟糊中的紅外吸收色譜呈現(xiàn)如下的最大吸收值(cm-1)3700-3060；3060-2660(液體石蠟)；1650；1590-1490；1490-1420(液體石蠟)；1375(液體石蠟)；1310；1245；1210；1165；1090；1060；1020；970；930；840；810；750；720(液體石蠟)；700；該圖譜的主要官能紅外吸收帶可歸成為V，(cm-1) 指定3600-3100VNH，VOH1650酰胺Ⅰ(VC=0)1545雜環(huán)VC=C和VC=N1524，1495酰胺Ⅱ(δNH)1250，1205芳香族δCH870雜環(huán)γCH745，700芳香族γCHC)以TMS作內(nèi)標(biāo)(0.00ppm)在DMSO-d6(六氘二甲基亞砜)中的1H-NMR圖譜在500MHz顯示出的各組信號(ppm)如下每一信號的質(zhì)子數(shù)標(biāo)在括號內(nèi)9.02(1)；8.68(1)；8.70(1)；8.57(1)；8.50(1)；8.43(1)；8.37(1)；8.26(1)；8.25(1)；7.4-7.20(9)；6.96(2)；6.02(1)；5.30-5.18(3)；5.01(1)；4.97(2)；4.80(1)；4.56(1)；4.30(1)；4.26(1)；3.98(1)；3.81(1)；3.79(1)；3.38(3)；2.72(1)；2.58(3)；2.48(3)；2.16(1)；2.13(1)；1.96(2)；1.88(1)；1.34(1)；0.87(3)；0.84(3)；D)以TMS作內(nèi)標(biāo)(0.00pm)在DMSO-d6中的13C-NMR圖譜在125MHz顯示出的各組信號(ppm)如下，Q代表四價碳原子或C=O基團(tuán)；173.69Q；171.10，Q；169.83，Q；169.51，Q；168.45，Q；168.26，Q；167.84，Q；165.68，Q；164.75，Q；161.40，Q；161.23，Q；160.46，Q；160.29，Q；159.35，Q；153.42,Q；150.31，Q；150.11，Q；149.41，Q；146.93，Q；144.73，Q；143.75，Q；142.10，Q；141.78，Q；141.33，CH；140.97，Q；139.53，Q；128.68，CH；127.99，2[CH]；127.67，Q；127.67，CH；126.88，CH；126.76，2[CH]；123.17，CH；118.66，CH；116.43，CH；73.81，CH；69.41，CH2；67.97，CH；67.36，CH2；60.12，CH；58.63，CH3；58.24，CH；55.41，CH；48.15，CH；47.03，CH2；41.19，CH2；37.60，CH2；34.06，CH；29.76，CH2；25.85，CH3；24.28，CH2；18.49，CH3；17.98，CH3；11.99，CH3；E)在下述條件下進(jìn)行反相HPLC分析時，保留時間(Rt)為14.9分鐘柱RltrasphereODS(反相硅烷化硅膠；5微米)Altex(Beckman)4.6mm(i.d)×250mm前置柱BrownleelabsRP18(八癸基硅烷硅膠；5微米)。洗脫劑A乙腈18mM磷酸鈉70∶30(V/V)，調(diào)至PH7.0洗脫劑B乙腈18mM磷酸鈉10∶90(V/V)，調(diào)至PH7.0洗脫方式在20分鐘內(nèi)洗脫劑A在洗脫劑B中從45%至70%的線性梯度洗脫流速1.8ml/min紫外檢測器254nm內(nèi)標(biāo)氯霉素(Rt=3.7分鐘)F)在惰性氣氛下，在約140℃將樣品預(yù)先干燥后進(jìn)行元素分析，結(jié)果表明有如下組成碳、氫、氮、硫；G)在如下色譜系統(tǒng)中Rf值為0.37∶二氯甲烷∶甲醇為9∶1(V/V)，使用硅膠板(硅膠60F254，Merck Co)。顯色紫外線254nm，使用碘蒸氣或用在最低量Davis培養(yǎng)基中枯草桿菌(B.subtilis)ATCC6633的生物自檢法，呈黃色色斑；內(nèi)標(biāo)氯霉素(Rf0.56)H)FAB-MS分析在質(zhì)/荷比(m/z)1290.3±0.1道爾頓顯示出質(zhì)子化分子離子的最低質(zhì)量同位素。在下述實(shí)驗(yàn)條件下，用KratosMS-50雙聚焦質(zhì)譜儀分析，在圖譜中所有具有高于800m/z質(zhì)量單位的峰(同位素峰不計)低于分子離子的20%；以6千伏Xe快原子轟擊，甘油基質(zhì)；陽離子化方式。I)鹽酸水解氨基酸分析表明有如下天然氨基酸存在甘氨酸、(L)脯氨酸和(L)絲氨酸，實(shí)驗(yàn)條件如下樣品在存在含1%苯酚的6NHCl下，在105℃水解20小時，然后按如下兩步衍生a)用在無水丙醇中的2MHCl使羧酸官能團(tuán)生成正丙酯(90℃，1小時)，然后在氮?dú)庀赂稍?；b)在室溫下用五氟丙酸酐/無水二氯甲烷(1/9，V/V)將游離氨基轉(zhuǎn)化為酰胺，進(jìn)行一小時，然后在氮?dú)夥障赂稍?；將如此獲得的衍生物溶解于二氯甲烷中，并在如下條件下，使用HP5985B系統(tǒng)進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析柱將手性正-丙酰-L-纈氨酸叔丁酰胺聚硅氧烷涂于熔凝的二氧化硅毛細(xì)管柱上(25m×0.2mm直徑；毛細(xì)管氣相色譜(C.G.C)法分析)；溫度方案，80℃4分鐘，然后每分鐘4℃。L)離子化研究通過在甲基溶纖劑/水中的0.1NHCl和0.1NNaOH滴定檢測不到離子基團(tuán)；在非水基質(zhì)(乙酸)中的0.1NHClO4滴定顯示出弱的堿性基團(tuán)；M)旋光率[a]20D=+140.8；無水乙醇，濃度約5克/升。
2.一種可以從玫瑰游動雙孢菌ATCC53773的菌絲體或其產(chǎn)生GE2270的變異體或突變體中回收得到的抗生素物質(zhì)-抗生素GE2270復(fù)合物。
3.一種制備權(quán)利要求1或2的化合物的方法，包括在可同化碳源、氮源及無機(jī)鹽存在下，在浸沒需氧條件下培養(yǎng)玫瑰游動雙孢菌ATCC53773或其產(chǎn)生GE2270的變異體或突變體，并從中回收所產(chǎn)生的抗生素。
4.一種藥物組合物，其中含有與一種藥物學(xué)上可接受的載體相混合的權(quán)利要求1或2的化合物。
5.一種作為藥物使用的權(quán)利要求1或2的化合物。
6.用權(quán)利要求1或2化合物制備的用作抗生素使用的藥物。
7.玫瑰游動雙孢菌ATCC53773。
8.一種在生物學(xué)上是純的玫瑰游動雙孢菌ATCC53773或產(chǎn)生GE2270的突變體或變異體，在排除玫瑰游動雙孢菌ATCC23866下，它能夠在有可同化碳源、氮源和無機(jī)鹽存在下的需氧發(fā)酵條件下產(chǎn)生抗生素GE2270因子A。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的命名為抗生素GE2270的抗生素物質(zhì)，其加成鹽、藥物組合物以及它們作為藥物的應(yīng)用，特別是用于治療涉及對其敏感微生物的感染的疾病。
文檔編號C12P1/06GK1041182SQ8910787
公開日1990年4月11日 申請日期1989年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1988年9月9日
發(fā)明者恩里科·塞娃, 格拉塞拉·貝里特, 尼古來特·蒙坦尼, 貝斯·P·高爾茨太, 莫里佐·迪納羅 申請人:格魯波萊佩蒂特公司