專利名稱：一種產(chǎn)生超氧化物歧化酶的芽孢桿菌及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)的新菌株篩選及其生產(chǎn)工藝，是對申請?zhí)?1108549.1的改進和提高。
本發(fā)明專利申請人于91年9月2日申請的發(fā)明名稱為《利用芽孢桿菌生產(chǎn)超氧化物歧化酶的方法》，專利申請?zhí)?1108549.1。申請人在試驗研究過程中，發(fā)現(xiàn)該申請利用的芽孢桿菌CGMCC 0137菌株SOD含量低，且篩選方法陳舊，其生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)多，時間長，酶的損失大，產(chǎn)出率低。
本發(fā)明的目的是對芽孢桿菌進行誘變處理，從中篩選SOD酶含量高的新菌株，并且簡化提取分離生產(chǎn)工藝，從而達到降低成本、提高SOD酶產(chǎn)量的目的。
本發(fā)明的特征在于一種產(chǎn)生超氧化物歧化酶的芽孢桿菌菌株，該菌株分類為芽孢桿菌Bacilius cereus，菌種編號為M-22，保藏號為CGMCC No 0175。芽孢桿菌經(jīng)誘變處理獲得菌株(保藏號CGMCC 0175)，菌種擴大培養(yǎng)，發(fā)酵菌液，間歇通氣，滲透壓破碎，30%和90%硫酸銨沉淀，Sephadex G-25脫鹽，分離，提取工藝。
(一)高SOD含量菌株的篩選按91108549.1專利申請說明書第4頁所示方法篩選的菌株SOD含量不高，為此采用了誘變的方法篩選到SOD含量為0.420mg/g菌的新菌株(保藏號CGMCC 0175)。誘變方法如下①將中植物組織中分離得到的芽孢桿菌接種于牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基上，在超凈工作臺上，用15%紫外燈距離20cm照射5分鐘，于25 30℃培養(yǎng)18小時與對照相比僅5%菌存活，選擇存活菌株單獨培養(yǎng)，測定SOD的含量，選含量為0.420mg/g菌的菌株，保藏號為(CGMCC 0175)。
本發(fā)明菌株的生物學(xué)特性芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌體直桿狀，鏈生，一般大小為1.0-1.2X3.0-5.0μm，電鏡下測量為0.9-1.2X2.0-4.0μm。革蘭氏反應(yīng)陽性。芽孢橢圓形，中生或近中生，不膨大。原生質(zhì)中含量不著色顆粒。菌落圓形，稍隆起，無光澤，蠟質(zhì)?？蓞捬跎L，接觸酶陽性，V-P反應(yīng)陽性，V-P培養(yǎng)液PH為4.3-5.6。生長最高溫度35-45℃，最低溫度10-20℃，在溶菌酶0.001%中可生長，7%NaCl可生長，PH5.7生長，葡萄糖產(chǎn)酸，水解淀粉，利用檸檬酸，可還原NO3為NO2，可分解酪氨酸。
(二)發(fā)酵方法1、菌種活化將高SOD含量菌株劃線接種于牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基上，28 30℃下培養(yǎng)24小時，然后配成孢子懸浮液。培養(yǎng)的時間不能超過24小時，因為此時處于芽孢桿菌培養(yǎng)的對數(shù)生長期，菌活力最高。
2、發(fā)酵培養(yǎng)條件①發(fā)酵罐接種后培養(yǎng)時間不宜超過18～20小時，否則大量生成芽孢，難以破碎，使酶產(chǎn)量降低。
②發(fā)酵中，發(fā)酵通氣量為1-2Vol./Vol/min，改連續(xù)通氣為間歇通氣，每通氣2小時后，停止通氣40-60分鐘，從而誘導(dǎo)芽孢桿菌中SOD含量的提高。
③發(fā)酵液要求發(fā)酵菌液含量為60億/ml，培養(yǎng)18～20小時放罐，此時菌量達到最高而且很少芽孢生成。
(三)菌細胞的破碎由于所采用的菌株為蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其細胞壁具蠟質(zhì)，極難破碎，每升菌糊加入50mg溶菌酶，250W功率下超聲波處理10分鐘仍有30～40%菌未能破碎，因此，在經(jīng)溶菌酶和超聲波處理后，又采用滲透壓破碎法。具體方法為每克菌體加20ml 0.0005M EDTA、0.5M葡萄糖、0.03M pH8的Tris緩沖液于23℃下振蕩10分鐘?？墒蛊扑槁蔬_95%以上。用滲透壓破碎還可以減少溶菌酶的用量。
(四)粗酶生產(chǎn)工藝粗酶生產(chǎn)工藝包括30%硫酸銨沉淀，90%硫酸銨沉淀和Sephadex G-100柱層析三步。
1、30%硫酸銨沉淀91108549.1專利申請說明書中沉淀濃度為55%，經(jīng)反復(fù)試驗，55%硫酸銨沉淀后的沉淀中有大量的酶損失，選擇30%硫酸銨沉淀，SOD酶無損失。將粗提液加入30%硫酸銨后，攪拌時間為60分鐘，靜置2小時即可進行離心。
2、90%硫酸銨沉淀原專利中采用75%硫酸銨沉淀，上清液中仍有大量SOD酶活性，離心的上清液再加入90%硫酸銨沉淀SOD，則能使酶全部得以沉淀。
3、Sephadex G-25脫鹽原專利申請說明書中脫去沉淀中的鹽離子采用動態(tài)透析的方法，時間為24～48小時。現(xiàn)改為Sephadex G-25柱層析脫鹽，僅需2～3小時，大大節(jié)約了時間，具體方法是將經(jīng)90%硫酸銨沉淀的酶樣溶解在最小量的5mM pH7.8的磷酸緩沖液中，經(jīng)Sephadex G-25柱層析，部分收集。G-25柱預(yù)先用5mM pH7.8的磷酸緩沖液充分平衡。用奈氏試劑檢測收集脫鹽的SOD酶液。
4、Sephadex G-100柱層析預(yù)先用5mM pH7.8磷酸緩沖液平衡Sephadex G-100柱，將脫鹽后的粗酶液加到G-100柱中，全自動分步收集。將SOD活力好的部分收集。測SOD活力，同時用電泳檢測純度。
5、粗酶制劑質(zhì)量要求粗酶提取液經(jīng)Sephadex G-100以后，比活達1200以上，產(chǎn)率達65%。電泳檢測主要為SOD酶帶。
(五)精制酶的生產(chǎn)工藝參見91108549.1專利申請說明書第8-9頁。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其優(yōu)點在于(1)菌株SOD含量高通過誘變的方法得到的新菌株精制SOD含量高達0.42mg/g菌，比原專利所用菌株0137高57%。
(2)該菌株含有Cu、Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD，其中Cu、Zn-SOD占25%，Mn-SOD占40%，F(xiàn)e-SOD占55%。
(3)以該菌株提取的酶穩(wěn)定性很高。在90℃下5分鐘對活性沒有影響，90℃，50分鐘才完全失活;在pH在3-9范圍內(nèi)活性皆不受影響。
(4)本發(fā)明所創(chuàng)立的SOD提取工藝可以得到不同純度的酶制劑，既可用于醫(yī)藥、獸藥、作物抗逆增產(chǎn)，日用化妝品、保健飲料等，還可用于酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、氨基酸順序測定等研究，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景。
(5)該工藝流程簡化，減少了損耗，且節(jié)約能源，降低了成本。
(6)該菌株繁殖快，來源方便，低廉，適于工廠化生產(chǎn)。


圖1是高SOD含量的菌株選育2生產(chǎn)SOD的發(fā)酵工藝流程3SOD粗提液工藝流程4SOD粗酶制劑生產(chǎn)工藝流程5精制SOD制劑生產(chǎn)工藝流程圖實例用100公斤芽孢桿菌菌糊生產(chǎn)8.6克SOD為例。
1、從植物體組織中篩選出芽孢桿菌，在15W紫外光下，距20cm，誘變5分鐘，得到SOD含量為0.42mg/g的蠟制芽孢桿菌株(Bacillus cereus)編號為M-22，保藏號CGMCC NO0175。
2、用15噸發(fā)酵罐生產(chǎn)發(fā)酵菌液14噸。將發(fā)酵罐先滅菌，裝上培養(yǎng)液后在滅菌。滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在121℃、壓力0.5Kg/cm2條件下，滅菌30分鐘，發(fā)酵罐培養(yǎng)液滅菌攪拌速度250rpm。然后降溫至28℃，按2%的接種量將種子罐發(fā)酵菌液接入發(fā)酵罐。發(fā)酵罐接種后，在30℃條件下培養(yǎng)24小時。通氣量2Vols/Vol/min，氧氣含量40%，間隔60分鐘，通氣2小時。
發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方為牛肉汁0.5%，蛋白胨0.5%，NaCl0.5%，豆油0.5%，葡萄糖0.2%，淀粉0.4%，硫酸鎂0.008%，磷酸二氫鉀0.04%，碳酸鈣0.5%，800μM的Cu、Zn、Mn、Fe，攪拌。pH值消毒前7.6，消毒后7.4。
發(fā)酵菌液含菌量在每毫升60億以上，芽孢成熟前放罐，pH為值7.5，無雜菌污染。
3、將菌細胞離析。發(fā)酵罐菌液在控制流量400L/h注入離心機，離心機以4000rpm/min速度將菌細胞離析沉淀以菌糊自動流出，進入生理鹽水槽，經(jīng)三次洗滌，離心后收集到100公斤菌糊。
4、將菌細胞破碎。按菌糊與緩沖液以1∶3體積比例加入50mM、pH7.8的磷酸鉀緩沖液，攪拌成菌液。按每升菌糊加入50mg溶菌酶，在4℃低溫條件下攪拌30分鐘。用250W功率超聲波細胞粉碎機在0～4℃低溫條件下對菌液處理10分鐘，每處理1分鐘間隔50秒。超聲波處理后對菌液鏡檢細胞破碎情況。視破碎率用滲透壓法繼續(xù)破碎。破碎率達95%以上。然后將菌液以4000rpm離心。收集到130Kg上清液作為SOD的粗提液。
5、提取粗酶(1)30%硫酸銨沉淀。將粗提液加入硫酸銨，使粗提液中硫酸銨達到30%飽和度。在22℃下利用攪拌器攪拌60分鐘，采用膜過濾系統(tǒng)過濾得到濾液。
(2)90%硫酸銨沉淀。在30%硫酸銨沉淀后的濾液中，加入硫酸銨使其飽和度達到90%，在室溫下利用攪拌器攪拌60分鐘，離心13000rpm，將沉淀溶于最小量的5mM、pH7.8磷酸鉀緩沖液中(內(nèi)含2mM EDTA)，然后用上述緩沖液和Sephadex G-25脫鹽，得到108Kg粗酶提取液。
(3)Sephadex G-100柱層析。Sephadex G-100柱，預(yù)先用pH7.8、5mM的磷酸鉀緩沖液平衡;將脫鹽后的粗酶提取液80Kg加入到柱中，并用上述緩沖緩沖液洗脫。采用全自動分步收集系統(tǒng)收集洗脫液，合并SOD活力高的收集液部分。
6、不同種類SOD的精制酶的制備(1)Cu、Zn-SOD將經(jīng)Sephadex G-100柱層析后的粗酶液通過預(yù)先用pH7.8、5mM的磷酸鉀緩沖液平衡的DE-52柱，用上述0.005-0.3mM緩沖液梯度洗脫，將酶活力高的收集液合并，得到Cu、Zn-SOD純酶液。將Cu、Zn-SOD純酶液濃縮、冷凍干燥可得到Cu、Zn-SOD純酶粉劑1.30克;
(2)Mn-SOD將上述經(jīng)DE-52柱梯度洗脫前的淋洗液收集，加熱到65℃，5分鐘后置于低溫下迅速冷卻，依此重復(fù)3次，通過加壓過濾分離出濾液，將濾液濃縮。
將濃縮液通過用pH5.5、40mM的醋酸鉀緩沖液平衡的CM-52柱，并用pH5.5、0.04-0.20M的醋酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，同時進行收集，將酶活性高的收集液合并一起，得到Mn-SOD純酶液，再經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到Mn-SOD純酶粉3.44克。
(3)Fe-SOD將經(jīng)90%飽和度的硫酸銨沉淀、并已脫鹽的粗酶50Kg通過預(yù)先用pH5.5、0.01M醋酸鉀緩沖液平衡的CM-52柱，以上緩沖液洗脫，收集酶活力高的洗脫液，用pH7.8、50mM磷酸鉀緩沖液透析。將透析液通過預(yù)先用pH7.8、5mM的磷酸鉀緩沖液平衡的DE-52柱，用同樣緩沖液洗柱，并以5-50mM、pH7.8的磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，將符合純酶標準的收集液混合，加硫酸銨使達到80%飽和度，再經(jīng)過濾得到的為純Fe-SOD，將過濾物用pH7.8、50mM磷酸鉀緩沖液透析或通過加壓過濾得到Fe-SOD純酶液，再經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到Fe-SOD純酶粉劑3.87克。
共獲得SOD純酶粉劑8.6克。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生超氧化物歧化酶的芽孢桿菌，其特征在于該菌株是蠟質(zhì)芽孢桿菌Bacillus Cereus，菌種編號M-22，保藏號CGMCC NO 0175。
2.一種利用芽胞桿菌生產(chǎn)超氧化物歧化酶的方法，包括芽孢桿菌經(jīng)誘變處理獲得菌株(保藏號為CGMCC 0175)。菌種擴大培養(yǎng)，發(fā)酵菌液，分離，提取工藝，其特征是，還有間歇通氣，滲透壓破碎，30%和90%硫酸銨沉淀，SephadexG-25脫鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征是誘變處理為利用芽孢桿菌，在紫外燈15W，距離20cm，照射5分鐘，選擇存活菌株單獨配養(yǎng)，測定SOD的含量，選擇含量為0.420mg/g菌的菌株，保藏號為CGMCC 0175。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是間歇通氣為在發(fā)酵中，每通氣2小時后，停止通氣40 60分鐘，從而使SOD含量提高。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是滲透壓破碎為菌細孢經(jīng)溶細菌和超聲波處理后，每克菌體加20ml0.0005MEDTA、0.5M葡萄糖、0.03M PH8的Tris緩沖溶液，于23℃下振蕩10分鐘，可使菌細胞破碎率達到95%以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是30%和90%硫酸銨沉淀為將粗提液加入30%硫酸銨，攪拌60分鐘，進行離心，離心的上情液再加入90%硫酸銨沉淀SOD。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是Sephadex G 25脫鹽為將經(jīng)90%硫酸銨沉淀的酶樣溶解在最小量的5mM PH7.8的磷酸緩沖液中，經(jīng)Sepadex G-25柱層析，部分收集，用奈氏試劑檢測收集脫鹽的SOD酶液。
全文摘要
一種產(chǎn)生超氧化物歧化酶的芽孢桿菌及其生產(chǎn)方法，將芽孢桿菌經(jīng)誘變處理選擇含SOD高的新菌株，菌種擴大培養(yǎng)，發(fā)酵菌液，分離，提取工藝。本發(fā)明菌細胞除了經(jīng)溶菌酶和超聲波破碎外還用滲透壓破碎，并用30％和90％硫酸銨沉淀、SephadexG-25脫鹽獲得SOD產(chǎn)品。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有SOD含量高、酶穩(wěn)定性好、工藝流程簡化、減少了損耗、節(jié)省能源、降低成本等優(yōu)點。
文檔編號C12N1/20GK1082605SQ9310377
公開日1994年2月23日 申請日期1993年4月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月21日
發(fā)明者嚴志農(nóng), 計平生, 吳加志, 巴峰, 張守安, 馬序成, 梅汝鴻, 唐文華, 魯素蕓, 陳壁 申請人:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)