專利名稱：一種蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體反浮選分離純化生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別提供了一種蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體反浮選分 離純化生產(chǎn)工藝，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)背景蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt) 是一種革蘭陽性芽孢桿菌。Bt 的菌體為短桿狀，生鞭毛，單生或形成短鏈。當(dāng)菌體的營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)到一定的階段后，在 菌體的一端形成芽孢，另一端形成一種被稱為伴孢晶體的近菱形的蛋白質(zhì)晶體，菌體破 裂后可釋放出芽孢和伴孢晶體。在Bt的基因工程、毒理學(xué)研究、殺蟲機(jī)理、對(duì)人類的安全性等科學(xué)研究方面都對(duì)Bt 伴孢晶體純品提出了極大的需求。因此，萃取法(中國(guó)專利99122189.3)、梯度密度離 心法、液體雙相分離法、等電點(diǎn)沉淀法、堿裂解法、高速離心法和生物物理法等Bt伴孢 晶體的分離純化方法逐步得到了發(fā)展(左雅慧，蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)條件及晶體蛋白提 純方法初探，植物保護(hù)，1999， 25(4): 32-34;郭艾英，蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白的制 備方法，食品與發(fā)酵工業(yè)，2005， 31 (8): 8-10;朱仕房，雙水相體系分離蘇云金芽孢 桿菌伴孢晶體的研究，世界農(nóng)藥，2000， 22 (5): 39-42)。但是，萃取法使用了高毒性 的有機(jī)溶劑CCh，不利于環(huán)境保護(hù)；梯度密度離心法提取蛋白量少，而且超離心時(shí)間很 長(zhǎng)，約14h，成本高，操作復(fù)雜；液體雙相法體系復(fù)雜，影響因素多，難于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化； 等電點(diǎn)法容易破壞了伴孢晶體的形態(tài)；堿裂解法很容易出現(xiàn)伴孢晶體被自身產(chǎn)生的堿性 蛋白水解酶降解的現(xiàn)象；高速離心法提取的產(chǎn)品純度較低；生物物理法需要特種試劑， 條件苛刻，成本過高。因此，Bt伴孢晶體仍處于實(shí)驗(yàn)室自制自用階段，尚無商品出現(xiàn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種Bt伴孢晶體反浮選分離純化生產(chǎn)工藝，采用增加一種Bt伴孢晶體 反浮選分離純化方法，該方法的特點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)單、易于操作、產(chǎn)品純度在99.99%以上、 生產(chǎn)成本低、適合于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明采用浮選分離方法將Bt伴孢晶體與孢子、營(yíng)養(yǎng)體碎片等雜質(zhì)分離，獲得Bt 伴孢晶體純品，生產(chǎn)工藝(流程參見附圖)如下按重量百分比稱取牛肉膏0.2 0.4%，蛋白胨0.6 1.5%，氯化鈉0.3 0.6%，瓊脂 1.3 2. 5%，水95 98%，用NaOH調(diào)pH=7. 4 7. 6， 100 130。C滅菌20 40分鐘，在潔3凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入已滅過菌的大培養(yǎng)皿中，自然冷卻至室溫，液體凝固形 成瓊脂固體培養(yǎng)基；用接種環(huán)沾取Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面接種，之后在生化培養(yǎng)箱中26 36。C培養(yǎng)36 48小時(shí)，此時(shí)，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上形成一層菌苔； 用無菌純凈水將菌苔沖洗到容器中，得到無菌水菌苔懸濁液；用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理 菌苔懸濁液10 30分鐘后，將此菌苔懸濁液注入微泡浮選柱中浮選；在此反浮選過程中，芽孢和營(yíng)養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沫層而脫離體系，伴孢晶體則留在液漿中，之后以7000 9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心液漿10 20min，棄去上清液，得到伴孢晶體半成品；洗滌伴 孢晶體半成品，以7000 9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，在-20 -8(TC， 0. 1 1. 0Pa真空度條件下干燥3 4小時(shí)，得到伴孢晶體純品。 所述在瓊脂固體培養(yǎng)基表面接種，是按"之"字形接種。所述的浮選是將菌苔懸濁液逐步注入30 100L微泡浮選柱中，浮選的進(jìn)氣量為2 8L/min，浮選10 30分鐘。所述的洗滌伴孢晶體半成品是用0. 5 1. 5MNaCl生理鹽水洗滌伴孢晶體半成品3 5次，每次10 15L，再用無菌純凈水洗滌伴孢晶體半成品3 5次。得到的伴孢晶體純品于-20 -8(TC環(huán)境中保存。本發(fā)明的特點(diǎn)在于(1) 本工藝的核心步驟是反浮選分離伴孢晶體及雜質(zhì)。伴孢晶體是一種蛋白質(zhì)，分子 量在65 130KD左右，在水中的溶解度很小，以粒狀形態(tài)存在。伴孢晶體由氨基 酸組成，其表面存在大量的羧基和氨基，因此，伴孢晶體的潤(rùn)濕性良好，在反浮 選過程中留在漿液中；(2) 芽孢和營(yíng)養(yǎng)體碎片的表面潤(rùn)濕性差，在反浮選過程中與氣泡、水形成三相體系， 上升到泡沫層，能夠很好地與體系分離；(3) 在超聲波處理發(fā)酵物懸濁液的過程中，營(yíng)養(yǎng)體被擊碎，伴孢晶體從其中脫離出來， 同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)體中的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)入漿液中。這些營(yíng)養(yǎng)液含有小分子量的蛋白質(zhì)和糖類 物質(zhì)，是浮選過程中的發(fā)泡劑。因此，浮選過程中不需要外加發(fā)泡劑，這樣既降 低了成本，又避免了雜質(zhì)的引入；(4) 本工藝使用瓊脂固體培養(yǎng)基培養(yǎng)Bt菌苔。Bt菌種在瓊脂固體培養(yǎng)基的表面生長(zhǎng)， 培養(yǎng)完成后形成菌苔，用無菌純凈水沖洗培養(yǎng)基的表面，菌苔則與培養(yǎng)基脫離， 形成無菌水菌苔懸濁液，而瓊脂固體培養(yǎng)基的成分則不會(huì)進(jìn)入懸濁液，減少了雜 質(zhì)的引入，減輕了后續(xù)步驟的負(fù)擔(dān)(如果從Bt液體發(fā)酵物中分離伴孢晶體，由于液體培養(yǎng)基中的牛肉膏、蛋白胨等主要成分不可避免地與Bt孢子、伴孢晶體 混合在一起，后繼的伴孢晶體分離純化步驟將變得十分復(fù)雜)； (5)本工藝中由于使用了生理鹽水洗滌伴孢晶體，可以消除發(fā)酵過程中產(chǎn)生的內(nèi)生蛋 白酶吸附在伴孢晶體表面而對(duì)伴孢晶體產(chǎn)生的降解。 本發(fā)明在瓊脂固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)Bt菌種，用超聲波使伴孢晶體與母體脫離，采用 反浮選方法將伴孢晶體與孢子、營(yíng)養(yǎng)體碎片等雜質(zhì)分離，經(jīng)洗滌、冷凍干燥后獲得Bt 伴孢晶體純品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于工藝簡(jiǎn)單、易于操作、產(chǎn)品純度在99.99%以上、生 產(chǎn)成本低、適合于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體反浮選分離純化生產(chǎn)工藝流程圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:稱取牛肉膏2kg，蛋白胨6 kg，氯化鈉3 kg，瓊脂13 kg，水950 kg，用NaOH調(diào) pH=7.4， 10(TC滅菌20分鐘，在潔凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入20個(gè)已滅過菌的大 培養(yǎng)皿中(直徑0.5m)，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基。用接種環(huán)沾 取少量Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上"之"字形接種，之后在生化培養(yǎng)箱中26'C培 養(yǎng)36小時(shí)。此時(shí)，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上形成一層菌苔，用500L無菌純凈水將菌苔 沖洗到1000L的容器中，得到無菌水菌苔懸濁液。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理菌苔懸濁液10分鐘后，將此菌苔懸濁液逐步注入30L高 效微泡浮選柱中浮選，進(jìn)氣量為2L/min，浮選10分鐘。在此反浮選過程中，芽孢和營(yíng) 養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沫層而脫離體系，伴孢晶體則留在液漿中，之后以7000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心液漿10min，棄去上清液，得到伴孢晶體半成品。用0.5MNaCl生理鹽水洗滌伴孢晶體半成品3次，每次IOL，再用無菌純凈水伴孢 晶體半成品3次，以7000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，-20°C， O.lPa的 真空度干燥3小時(shí)，得到伴孢晶體純品l.Okg，于-2(TC環(huán)境中保存。實(shí)施例2:稱取牛肉膏4kg，蛋白胨15kg，氯化鈉6kg，瓊脂25kg，水980 kg，用NaOH調(diào) pH=7.6， 13(TC滅菌40分鐘，在潔凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入20個(gè)已滅過菌的大 培養(yǎng)皿中(直徑0.5m)，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基。用接種環(huán)沾 取少量Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上"之"字形接種，之后在生化培養(yǎng)箱中36。C培5養(yǎng)48小時(shí)。此時(shí)，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上形成一層菌苔，用600L無菌純凈水將菌苔 沖洗到2000L的容器中，得到無菌水菌苔懸濁液。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理菌苔懸濁液30分鐘后，將此菌苔懸濁液逐步注入100L高 效微泡浮選柱中浮選，進(jìn)氣量為8L/min，浮選30分鐘。在此反浮選過程中，芽孢和營(yíng) 養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沫層而脫離體系，伴孢晶體則留在液漿中，之后以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心液漿20min,棄去上清液，得到伴孢晶體半成品。用1.5MNaCl生理鹽水洗滌伴孢晶體半成品5次，每次15L，再用無菌純凈水伴孢 晶體半成品5次，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，-80°C， l.OPa的 真空度干燥4小時(shí)，得到伴孢晶體純品1.2kg，于-8(TC環(huán)境中保存。實(shí)施例3:稱取牛肉膏3kg，蛋白胨10kg，氯化鈉4.5kg，瓊脂19kg，水970 kg，用NaOH 調(diào)pH-7.5， 12(TC滅菌30分鐘，在潔凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入20個(gè)已滅過菌的 大培養(yǎng)皿中(直徑0.5m)，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基。用接種環(huán)沾取少量Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上"之"字形接種，之后在生化培養(yǎng)箱中3rc培養(yǎng)42小時(shí)。此時(shí)，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上形成一層菌苔，用550L無菌純凈水將菌 苔沖洗到1500L的容器中，得到無菌水菌苔懸濁液。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理菌苔懸濁液20分鐘后，將此菌苔懸濁液逐步注入70L高 效微泡浮選柱中浮選，進(jìn)氣量為5L/min，浮選20分鐘。在此反浮選過程中，芽孢和營(yíng) 養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沬層而脫離體系，伴孢晶體則留在液漿中，之后以8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心液漿15min，棄去上清液，得到伴孢晶體半成品。用1.0MNaCl生理鹽水洗滌伴孢晶體半成品4次，每次13L，再用無菌純凈水伴孢 晶體半成品4次，以8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，-50°C， 0.5Pa的 真空度干燥3.5小時(shí)，得到伴孢晶體純品l.lkg，于-5(TC環(huán)境中保存。實(shí)施例4:稱取牛肉膏2kg,蛋白胨7kg，氯化鈉4kg，瓊脂15kg，水970 kg，用NaOH調(diào) pH=7.5， 120。C滅菌25分鐘，在潔凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入20個(gè)己滅過菌的大 培養(yǎng)皿中(直徑0.5m)，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基。用接種環(huán)沾 取少量Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上"之"字形接種，之后在生化培養(yǎng)箱中28。C培 養(yǎng)38小時(shí)。此時(shí)，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上形成一層菌苔，用500L無菌純凈水將菌苔 沖洗到1000L的容器中，得到無菌水菌苔懸濁液。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理菌苔懸濁液30分鐘后，將此菌苔懸濁液逐步注入100L高 效微泡浮選柱中浮選，進(jìn)氣量為8L/min，浮選30分鐘。在此反浮選過程中，芽孢和營(yíng) 養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沫層而脫離體系，伴孢晶體則留在液槳中，之后以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心液槳20min，棄去上清液，得到伴孢晶體半成品。用1.0MNaCl生理鹽水洗滌伴孢晶體半成品4次，每次13L，再用無菌純凈水伴孢 晶體半成品4次，以8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，-50'C， 0.5Pa的 真空度干燥3.5小時(shí)，得到伴孢晶體純品1.1 kg，于-5(TC環(huán)境中保存。實(shí)施例5:稱取牛肉膏4kg，蛋白胨6kg，氯化鈉3kg，瓊脂25kg，水980 kg，用NaOH調(diào) pH=7.6， 13(TC滅菌40分鐘，在潔凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入20個(gè)已滅過菌的大 培養(yǎng)皿中(直徑0.5m)，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基。用接種環(huán)沾 取少量Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上"之"字形接種，之后在生化培養(yǎng)箱中36。C培 養(yǎng)48小時(shí)。此時(shí)，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上形成一層菌苔，用600L無菌純凈水將菌苔 沖洗到2000L的容器中，得到無菌水菌苔懸濁液。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理菌苔懸濁液20分鐘后，將此菌苔懸濁液逐步注入70L高 效微泡浮選柱中浮選，進(jìn)氣量為5L/min，浮選20分鐘。在此反浮選過程中，芽孢和營(yíng) 養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沫層而脫離體系，伴孢晶體則留在液漿中，之后以8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心液漿15min，棄去上清液，得到伴孢晶體半成品。用0.5MNaCl生理鹽水洗滌伴孢晶體半成品3次，每次IOL，再用無菌純凈水伴孢 晶體半成品3次，以7000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，-20°C， O.lPa的 真空度干燥3小時(shí)，得到伴孢晶體純品1.2kg，于-20'C環(huán)境中保存。實(shí)施例6:稱取牛肉膏3.1kg，蛋白胨12kg，氯化鈉5.5kg，瓊脂21kg，水970kg，用NaOH 調(diào)pH-7.5， 12(TC滅菌30分鐘，在潔凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入20個(gè)已滅過菌的 大培養(yǎng)皿中(直徑0.5m)，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基。用接種環(huán)沾取少量Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上"之"字形接種，之后在生化培養(yǎng)箱中3rc培養(yǎng)42小時(shí)。此時(shí)，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上形成一層菌苔，用550L無菌純凈水將菌 苔沖洗到1500L的容器中，得到無菌水菌苔懸濁液。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理菌苔懸濁液10分鐘后，將此菌苔懸濁液逐步注入30L高 效微泡浮選柱中浮選，進(jìn)氣量為2L/min，浮選10分鐘。在此反浮選過程中，芽孢和營(yíng)養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沫層而脫離體系，伴孢晶體則留在液漿中，之后以7000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心液漿10min，棄去上清液，得到伴孢晶體半成品。用1.5MNaCl生理鹽水洗滌伴孢晶體半成品5次，每次15L,再用無菌純凈水伴孢 晶體半成品5次，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，-SO'C， l.OPa的 真空度干燥4小時(shí)，得到伴孢晶體純品1.2kg,于-80。C環(huán)境中保存。實(shí)施例7:稱取牛肉膏2.5kg，蛋白胨6kg，氯化鈉5.5kg，瓊脂14kg，水960 kg，用NaOH 調(diào)pP^7.5， 11(TC滅菌22分鐘，在潔凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入20個(gè)已滅過菌的 大培養(yǎng)皿中(直徑0.5m)，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基。用接種環(huán)沾取少量Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上"之"字形接種，之后在生化培養(yǎng)箱中3rc培養(yǎng)40小時(shí)。此時(shí)，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上形成一層菌苔，用580L無菌純凈水將菌 苔沖洗到1200L的容器中，得到無菌水菌苔懸濁液。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理菌苔懸濁液15分鐘后，將此菌苔懸濁液逐步注入50L高 效微泡浮選柱中浮選，進(jìn)氣量為4L/min,浮選18分鐘。在此反浮選過程中，芽孢和營(yíng) 養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沫層而脫離體系，伴孢晶體則留在液漿中，之后以7800轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心液漿13min，棄去上清液，得到伴孢晶體半成品。用0.8MNaCl生理鹽水洗漆伴孢晶體半成品4次，每次IIL，再用無菌純凈水伴孢 晶體半成品5次，以8200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，-40'C， 0.3Pa的 真空度干燥3.3小時(shí)，得到伴孢晶體純品1.1 kg，于-6(TC環(huán)境中保存。實(shí)施例8:稱取牛肉膏3.6kg，蛋白胨9kg，氯化鈉6kg，瓊脂20kg，水980 kg，用NaOH調(diào) pH=7.6， 13(TC滅菌30分鐘，在潔凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入20個(gè)已滅過菌的大 培養(yǎng)皿中(直徑0.5m)，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基。用接種環(huán)沾 取少量Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上"之"字形接種，之后在生化培養(yǎng)箱中29。C培 養(yǎng)30小時(shí)。此時(shí)，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上形成一層菌苔，用520L無菌純凈水將菌苔 沖洗到1600L的容器中，得到無菌水菌苔懸濁液。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理菌苔懸濁液28分鐘后，將此菌苔懸濁液逐步注入90L高 效微泡浮選柱中浮選，進(jìn)氣量為8L/min，浮選10分鐘。在此反浮選過程中，芽孢和營(yíng) 養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沫層而脫離體系，伴孢晶體則留在液漿中，之后以7200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心液漿18min，棄去上清液，得到伴孢晶體半成品。用1.2MNaCl生理鹽水洗滌伴孢晶體半成品5次，每次14L，再用無菌純凈水伴孢 晶體半成品3次，以8800轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，-80°C， 0.8Pa的 真空度干燥3.5小時(shí)，得到伴孢晶體純品l.lkg，于-50'C環(huán)境中保存。
權(quán)利要求
1、一種蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體反浮選分離純化生產(chǎn)工藝，其特征在于按重量百分比稱取牛肉膏0.2～0.4％，蛋白胨0.6～1.5％，氯化鈉0.3～0.6％，瓊脂1.3～2.5％，水95～98％，用NaOH調(diào)pH＝7.4～7.6，100～130℃滅菌20～40分鐘，在潔凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入已滅過菌的大培養(yǎng)皿中，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基；用接種環(huán)沾取Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面接種，之后在生化培養(yǎng)箱中26～36℃培養(yǎng)36～48小時(shí)；用無菌純凈水將菌苔沖洗到容器中，得到無菌水菌苔懸濁液；用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理菌苔懸濁液10～30分鐘后，將此菌苔懸濁液注入微泡浮選柱中浮選；在此反浮選過程中，芽孢和營(yíng)養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沫層而脫離體系，伴孢晶體則留在液漿中，之后以7000～9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心液漿10～20min，棄去上清液，得到伴孢晶體半成品；洗滌伴孢晶體半成品，以7000～9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，在-20～-80℃，0.1～1.0Pa真空度條件下干燥3～4小時(shí)，得到伴孢晶體純品。
2、 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上按"之" 字形接種。
3、 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的浮選是將菌苔懸濁液逐步 注入30 100L微泡浮選柱中，浮選的進(jìn)氣量為2 8L/min，浮選10 30分鐘。
4、 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的洗滌伴孢晶體半成品是用 0.5 1.5M NaCl生理鹽水洗滌伴孢晶體半成品3 5次，每次10 15L,再用無菌純凈 水洗滌伴孢晶體半成品3 5次。
5、 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，得到的伴孢晶體純品于-20 -80'C 環(huán)境中保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體反浮選分離純化生產(chǎn)工藝，具體生產(chǎn)工藝為按重量百分比稱取牛肉膏0.2～0.4％，蛋白胨0.6～1.5％，氯化鈉0.3～0.6％，瓊脂1.3～2.5％，水95～98％，用NaOH調(diào)pH＝7.4～7.6，100～130℃滅菌20～40分鐘，倒入培養(yǎng)皿中，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基；在培養(yǎng)基表面上按“之”字形接種，之后在生化培養(yǎng)箱中26～36℃培養(yǎng)36～48小時(shí)，得到無菌水菌苔懸濁液，注入高效微泡浮選柱中浮選，離心液漿10～20min，得到伴孢晶體半成品；用生理鹽水和無菌純凈水洗滌伴孢晶體半成品，以7000～9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，經(jīng)真空干燥得到伴孢晶體純品，于-20～-80℃環(huán)境中保存。該方法工藝簡(jiǎn)單、易于操作、產(chǎn)品純度在99.99％以上、生產(chǎn)成本低、適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101260144SQ20081010471
公開日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者弓愛君, 曹艷秋, 李紅梅, 王子佳, 辰 蔣, 邱麗娜 申請(qǐng)人:北京科技大學(xué);中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院