專利名稱：能提供植物對(duì)病毒抗性的多核酶和產(chǎn)生這種多核酶的抗性植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種稱為“多核酶”(“Polyribozyme”)能夠?yàn)橹参锾峁?duì)病毒抗性的核苷酸序列，以及使植物具有抗性的方法。本發(fā)明還涉及表達(dá)多核酶的植物。
現(xiàn)已發(fā)展了幾種為栽培植物提供對(duì)病毒抗性的途徑，即向植物病毒核酸序列基因組中整合入衣殼蛋白基團(tuán)、非結(jié)構(gòu)蛋白基因、反義病毒RNA序列和衛(wèi)星病毒RNA(見(jiàn)，例如，Cuozzo等，1988，Bio/Technology6,549－557；Rezaian等，1988，Plant，Mol.Biol.11,463－471；Harrison等，1987，Nature 328,797－802)。
這些出版物報(bào)道了部分抗性或耐性的產(chǎn)生。但是，多數(shù)情況下只是延緩癥狀或減輕癥狀，而無(wú)完全抗性。
還有，這些方法中的一些－例如使用衛(wèi)星病毒RNA的方法－可能引起新的問(wèn)題。例如，在一種植物中減輕癥狀的衛(wèi)星病毒可能對(duì)另一種植物就是致命的。況且，引入植物中的衛(wèi)星病毒核苷酸序列中的突變可能增加感染的嚴(yán)重性而不是減小它。
與此相似，使用衣殼蛋白提供抗性也有缺點(diǎn)。例如，某病毒的某一特殊毒株的衣殼蛋白不一定保護(hù)植物抵抗此病毒另一毒株的感染。用不同病毒間或不同毒株間的衣殼蛋白氨基酸的同源性程度難以預(yù)測(cè)該蛋白表達(dá)所提供的耐性程度。再者，通過(guò)衣殼蛋白的表達(dá)抗病毒感染保護(hù)植物，帶來(lái)誘導(dǎo)植物中表達(dá)的衣殼蛋白與感染轉(zhuǎn)基因植物其它病毒之間的異體衣殼化的危險(xiǎn)。雖然這還沒(méi)有在轉(zhuǎn)基因植物因植物中得到證實(shí)，但這已在兩株BYDV間和ZYMY和PRSV間觀察到。
使用核酶(ribozyme)也被認(rèn)為可提供植物對(duì)病毒的抗性。核是一些象酶一樣能特異性催化靶RNA裂解的RNA分子。在專利申請(qǐng)EP－A－321021中描述了用核酶在植物細(xì)胞中的第一批實(shí)驗(yàn)。從那以后，幾位作者曾試圖優(yōu)化核酶的結(jié)構(gòu)和操作條件，以有效地裂解病毒RNA。
例如，Lamb和Hay(J.Gen，Virol.1990，712257－2264)已證實(shí)單核酶在體外對(duì)馬鈴薯卷葉病毒的RNA聚合酶及衣殼蛋的基因的編碼區(qū)RNA有裂解作用。但是，此體外裂解反應(yīng)僅在40℃發(fā)生；迄今還不可能在0℃觀察到任何反應(yīng)。根據(jù)不同的種類，植物一般在10到30℃間載培。而在體內(nèi)使用時(shí)，Lamb和Hay建議要增加互補(bǔ)臂的長(zhǎng)度。但如果臂太長(zhǎng)，在靶RNA與核酶之間可產(chǎn)生穩(wěn)定的雙螺旋，阻礙核糖酶的解離，使其不能催化另一裂解反應(yīng)。再者，根據(jù)互補(bǔ)臂的長(zhǎng)度和序列，核酶本身可形成二極結(jié)構(gòu)，這減小了其裂解活性。
Edington和Nelson(“Gene Regulation；Biology ofAntisense RNA and DNAERICKSON和IZANT編輯，RavenPress Ltd，New－York，1992)已描述了在體外和體內(nèi)使用單核酶滅活煙草花葉病毒(TMV)的聚合酶基因。他們觀察到根據(jù)體外還是體內(nèi)使用，核酶表現(xiàn)非常不同的行為。因此核酶的體外活性不能用于預(yù)測(cè)同一核酶的體內(nèi)活性。例如，體外裂解看來(lái)效力低，需要高于TMV基因組RNA濃度20倍的核酶濃度。另一方面，使用TMV感染的煙草原生質(zhì)體的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，核酶抑制病毒RNA增殖的90％。令人感興趣的是，注意到用作對(duì)照的反義RNA僅抑制病毒增殖的20％。這些作者還參考了Gerlach等的研究，后者使用了定向于TMV的聚合酶基因的多核酶。這種多核酶在體外不起作用，因?yàn)槠溟L(zhǎng)度使核酶與靶RNA間形成雙螺旋。而在體內(nèi)，該多核酶可以裂解底物。表達(dá)單核酶或多核酶的轉(zhuǎn)基因煙草植物已顯示在用TMV感染后可延緩癥狀但未提及完全抗性，即最終不存在癥狀。作者得出結(jié)論說(shuō)，必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定諸如互補(bǔ)臂的最佳長(zhǎng)度、靶序列的選擇和啟動(dòng)子的選擇這些參數(shù)，以使解決核酶的“compartment－alisation”問(wèn)題成為可能。
EP－A－0421376描述了針對(duì)CMV的非編碼RNA的核酶。WO－A－9213090描述了通過(guò)用“第I類內(nèi)含子”型的單核酶在序列中引入外源序列來(lái)滅活CMV衣殼蛋白的RNA。這些文件都沒(méi)有提到產(chǎn)生對(duì)CMV的完全抗性。
本發(fā)明提出要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可使植物對(duì)病毒具有抗性而無(wú)所述缺點(diǎn)的可靠物質(zhì)。
本發(fā)明者已通過(guò)針對(duì)病毒衣殼蛋白的多核酶的概念和應(yīng)用解決了這一問(wèn)題。這種多核酶能夠滅活編碼所述蛋白的基因，從而提供對(duì)病毒的完全抗性。
考慮到現(xiàn)有技術(shù)中使用衣殼蛋白基因的反義序列所得平凡結(jié)果，本發(fā)明的多核酶的效力是令的驚異的，因?yàn)檫@些方法都涉及相應(yīng)RNA的滅活。另外，幾位作者還曾反對(duì)使用反式作用多核酶，因?yàn)榇撕嗣覆荒芟嗷オ?dú)立地起作用，還因?yàn)榫哂邢嗤蛄械拇呋瘏^(qū)有時(shí)趨于相互雜交，這樣形成非活性結(jié)構(gòu)(見(jiàn)，例如，Taira，Workshop”RNA－Editing－Plant Mitochondria”，AbstractBook，Berlin，September15－20，1992)。鑒于所選擇的靶標(biāo)是衣殼蛋白和用于滅活此靶標(biāo)的方法是多核酶，本發(fā)明所得結(jié)果是出人意外的。
除滅活的效力外，與已知方法相比，本發(fā)明的多核酶具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)－核酶的酶功能特異性地催化幾種病毒RNA的裂解而無(wú)結(jié)構(gòu)修飾。這種酶切導(dǎo)致用于衣殼蛋白表達(dá)的病毒RNA全部破壞，它作為病毒增殖抑制劑抑制了病毒的感染功能。
－此核酶是一種非編碼RNA分子，它不能誘導(dǎo)異體衣殼化或產(chǎn)生新的病毒株。
－鑒于衣殼蛋白誘導(dǎo)的耐受性的特異性難于預(yù)測(cè)，如果互補(bǔ)臂相當(dāng)于不同病毒株或不同相關(guān)病毒間保守的同源區(qū)，可以構(gòu)建核酶使其特異性地裂解一種或多種病毒株，或數(shù)種相關(guān)病毒。
為了徹底理解本發(fā)明，將關(guān)于核酶的概括特征具體化將是有用的。核酶是一種RNA分子，鑒于其序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)，它具有核糖核酸酶活性，它這使得它與第二個(gè)互補(bǔ)RNA分子雜交時(shí)可以裂解該第二種RNA。因此，后者稱為核酶的“底物”。
核酶具有兩個(gè)必需部分(i)以下將稱為“互補(bǔ)序列”的序列，選擇這種序列以使其與要裂解的底物互補(bǔ)，使這兩種分子雜交；和
(ii)催化區(qū)，它具有與所選底物無(wú)關(guān)不參與與底物的雜交的序列，構(gòu)成其“環(huán)”形二級(jí)結(jié)構(gòu)。
一般，催化區(qū)位于互補(bǔ)序列之內(nèi)，這樣，一部分互補(bǔ)序列位于催化區(qū)的5’端，另一部分位于其3’端。在催化區(qū)每一側(cè)的這些具有互補(bǔ)序列的片斷常稱為“雜交臂”。
本發(fā)明的目的是一種多核酶。更具體地講，它是一種稱為“多核酶”的核酸序列，它具有核糖核酸內(nèi)切酶活性，能夠使病毒衣殼蛋白的基因滅活，其特征在于它包括i)與該基因或其轉(zhuǎn)錄本或其復(fù)制中間體的至少一部分互補(bǔ)的序列，在此互補(bǔ)序列中的不同位點(diǎn)包括ii)多重核酶催化區(qū)，和iii)任選的一種或多種不與所述基因的轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的序列，所述非互補(bǔ)序列插入在互補(bǔ)序列的2個(gè)連續(xù)堿基間。
本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“多核酶”指由一系列核酶從頭到尾構(gòu)建而成的RNA分子，因此核酶是多核酶的主要單元。換句話說(shuō)，它是通過(guò)雜交臂連結(jié)起來(lái)的一系列催化區(qū)，這些臂的總長(zhǎng)構(gòu)成了互補(bǔ)序列。多核酶一般作為對(duì)單一轉(zhuǎn)錄本的“單一分子”，而每個(gè)催化區(qū)的裂解位點(diǎn)位于同一轉(zhuǎn)錄本上衣殼蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多核酶還可包括除上述的2個(gè)必需部分〔(i)互補(bǔ)序列和(ii)催化區(qū)〕以外的，一種或多種對(duì)底物的非互補(bǔ)序列(iii)。下列將詳細(xì)描述這些非互補(bǔ)序列的性質(zhì)和功能。
多核酶的兩個(gè)必需部分中，互補(bǔ)序列定決定底物的序列。對(duì)本發(fā)明來(lái)講，它是與病毒衣殼蛋白基因互補(bǔ)的序列，或與該基因的片斷互補(bǔ)的序列。當(dāng)病毒是RNA(+)病毒時(shí)，其基因直接作為mRNA，互補(bǔ)序列與此基因真正互補(bǔ)。在另一情況下，它是與基因的轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)。它還可以與一復(fù)制中間體互補(bǔ)。
互補(bǔ)序列可與衣殼基因的全長(zhǎng)雜交。此時(shí)互補(bǔ)序列的總長(zhǎng)為所研究的衣殼蛋白基因長(zhǎng)度的函數(shù)而變化。另一方面，互補(bǔ)序列可以僅與基因的片斷雜交。所述片斷必須足夠長(zhǎng)以能在相應(yīng)的多核酶序列中包括至少兩個(gè)催化區(qū)?？傮w來(lái)講，催化區(qū)不計(jì)在內(nèi)，互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度(即雜交臂之和)可在約40－2000個(gè)堿基間變化。優(yōu)選400－1000堿基的長(zhǎng)度，許多病毒的衣殼蛋白基因有的1000個(gè)堿基(如CMV，PLRV)。
本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”指多核酶與此底物間具有足夠高的互補(bǔ)性使得能夠穩(wěn)定地雜交，并有效地裂解底物。當(dāng)多核酶不含有(iii)型序列(即“非互補(bǔ)”序列)時(shí)，互補(bǔ)度通常為100％。在序列中存在一定數(shù)量的失配是充許的，只要它不妨礙雜交和底物的裂解。
多核酶的第(ii)部分(即催化區(qū))可來(lái)自任何類型適宜的核酶，例如“榔頭”型、“發(fā)夾”型或“第I類內(nèi)含子”型。同一種多核酶可含有來(lái)自不同類型核酶的催化區(qū)，例如“榔頭”型和“發(fā)夾”型。催化區(qū)優(yōu)選來(lái)自“榔頭”型核酶，

圖1A、B、C和D中表明了其序列結(jié)構(gòu)。專利申請(qǐng)EP－A－321021和WO－A－9119789中詳細(xì)描述了這些核酶。
雖然圖1中所示催化區(qū)具有保守序列，但已觀察到某些核苷酸可以被缺失、插入、取代或修飾而不影響核酶的活性。本發(fā)明包括在多核酶中使用這些修飾的催化區(qū)，只要保留其催化活性即可。用下面描述的實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證此活性。
例如，圖1A中所示催化區(qū)II的一個(gè)或多個(gè)核苷酸可被含有諸如腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、甲基胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、肌苷或其它甲基化堿基的核苷酸所置換?！氨Ｊ亍眽A基C－G一起形成催化環(huán)的第一個(gè)堿基對(duì)，它可以用U－A代替(Koizumi等，F(xiàn)EBS Letts、228,2,228－230，1988)。
圖1中所示催化區(qū)的核苷酸還可以被化學(xué)修飾。核苷酸由堿基、糖和單磷酸酯基因組成。這些基因每個(gè)都可以被修飾。在“Principles of Nucleic Acid Structure”(Ed.Wolfram Sanger，Springer Verlay，New York，1984)中描述了這種修飾。例如，堿基可帶有取代基如鹵原子、羥基、氨基、烷基、疊氮基、硝基、苯基等。也可以對(duì)核苷酸的糖部分進(jìn)行修飾，用鹵原子、氨基或疊氮基取代仲羥基，甚至進(jìn)行2’甲基化。
核苷酸的磷酸酯基團(tuán)可用N，S或C代替氧原子進(jìn)行修飾，分別形成氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和膦酸酯。這些物質(zhì)可能表現(xiàn)有用的藥代動(dòng)力學(xué)性能。
催化區(qū)的堿基和/或核苷酸還可帶有諸如氨基酸的取代基，例如，酪氨酸或組氨酸。
還觀察到可以在催化區(qū)的某些位點(diǎn)插入外加的核苷酸，而不影響核酶的活性。例如，選自A、G、C或U的外加堿基可以插在圖1A或1B中的1A之后。
根據(jù)本發(fā)明的一種方案，核酶可含有諸如圖1D中所示的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)作為催化區(qū)。該結(jié)構(gòu)稱為“微小酶”，在國(guó)際專利申請(qǐng)WO－A－919789中有述。它代表一個(gè)“榔頭”型的催化區(qū)，其“環(huán)”已用“P”代替。P可以是G和1A間的共價(jià)連結(jié)，一個(gè)或多個(gè)核苷酸(RNA或DNA，或混合物，或甚至為上述的衍生物)或除核苷酸以外的不影響催化活性的任何原子或原子集團(tuán)。當(dāng)P代表多個(gè)核苷酸時(shí)，它可含有多個(gè)內(nèi)部堿基配。構(gòu)成基團(tuán)“P”的序列和核苷酸數(shù)目不是關(guān)鍵之處，可在1－20個(gè)核苷酸內(nèi)變化，例如優(yōu)選1－6個(gè)。最好選擇沒(méi)有Watson－Crick型的內(nèi)部堿基配對(duì)的序列。
通過(guò)將多核酶，或轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生多核酶的序列與底物接觸，然后證明裂解的發(fā)生，這樣可在體外證實(shí)本發(fā)明多核酶的催化活性。體外裂解反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件如下溫度在4－60℃之間，優(yōu)選20－55℃之間，PH在約7.0到9.0之間，存在二價(jià)金屬如Mg2+，濃度為1－100mM(優(yōu)選1－20mM)。多核酶的量一般與底物等摩爾比，或過(guò)量。體外裂解反應(yīng)最好按照Hamb和Hay描述的方法進(jìn)行(J.Gen.Virol.，1990，71，2251－2264)。這篇文章中描述了從插入質(zhì)粒的寡脫氧核糖核苷酸體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生核酶的適當(dāng)條件。
體內(nèi)裂解條件是細(xì)胞中天然存在的條件。
“榔頭”型核酶從“靶”點(diǎn)XXX(優(yōu)選XUX)的緊下游裂解底物，其中X代表4個(gè)堿基A、C、G、U中的一種，U代表尿嘧啶。一種特別優(yōu)選的靶序列是XUY，其中Y代表A、C或U，X常為G，例如GUC。其它可能的但效力較差的靶點(diǎn)，例如是CAC、UAC和AAC。對(duì)于“發(fā)夾”型核酶，優(yōu)選的靶序列是AGUC。
這些靶序列在多核酶的構(gòu)建和功能化中很重要，這不但是因?yàn)樗鼈冎甘镜孜锏牧呀馕恢?，而且因?yàn)樗鼈兌x了必須在互補(bǔ)序列中插入催化區(qū)的位置。實(shí)際上，多核酶的每個(gè)催化區(qū)必須位于互補(bǔ)序列中相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄本中XUX位點(diǎn)的位置。例如，如果一個(gè)XUX位點(diǎn)位于衣殼蛋白基因的108位，另一個(gè)在205位，則催化區(qū)一個(gè)插入在互補(bǔ)序列中相應(yīng)的108位，另一個(gè)插入在205位。
XUX單元是RNA序列中存在的高頻單元。例如，在堿基隨機(jī)等同分布的序列中，平均每64個(gè)堿其中有一個(gè)GUC單元。這表明底物通常含有多個(gè)XUX裂解位點(diǎn)。如上所述，多核酶的催化區(qū)位于互補(bǔ)序列中相應(yīng)于XUX位點(diǎn)的位置。但是根據(jù)本發(fā)明，為達(dá)到有效裂解，不必包括相應(yīng)于底物的每個(gè)XUX靶序列的催化區(qū)。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)多核酶含有至少2個(gè)催化區(qū)時(shí)，可達(dá)到有效裂解?；パa(bǔ)序列中包含的催化區(qū)的總數(shù)等于或小于基因中存在的XUX總數(shù)。因此本發(fā)明的多核酶所含催化區(qū)的數(shù)目變化很大。例如，對(duì)CMV，當(dāng)靶序列為GUC時(shí)，多核酶可含有的2個(gè)到的11或12個(gè)催化區(qū)。當(dāng)決定在互補(bǔ)序列中包含數(shù)目少于底物中XUX位點(diǎn)數(shù)的催化區(qū)時(shí)，根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)選擇位點(diǎn)a)2個(gè)XUX靶點(diǎn)間的距離，相應(yīng)的多核酶中2個(gè)催化區(qū)間的距離必須足夠長(zhǎng)，使得位于相應(yīng)催化區(qū)之間的多核酶的雜交臂能與底物穩(wěn)定雜交，并防止催化區(qū)與其自身雜交。至少8個(gè)堿基，優(yōu)選至少14個(gè)堿基，例如約20個(gè)堿基的距離是特別有利的。當(dāng)然，只有當(dāng)?shù)孜锼琗UX位點(diǎn)非?？拷鼤r(shí)才考慮這一標(biāo)準(zhǔn)。否則，如果底物的XUX位點(diǎn)間相互以大于8－20個(gè)堿基分隔，該標(biāo)準(zhǔn)就不重要。
b)XUX靶點(diǎn)優(yōu)選位于衣殼蛋白基因的沒(méi)有明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)的部分。這有助于多核酶與底物接近，并增加其效力。
c)XUX位點(diǎn)可形成同一病毒的不同株或不同的相關(guān)病毒所保守的同源性區(qū)域的一部分。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建的多核酶可特異性地裂解數(shù)個(gè)病毒株或數(shù)個(gè)相關(guān)病毒。例如，與相關(guān)病毒BWYV和BYDV的衣殼蛋白序列相比，PLRV的衣殼蛋白基因的中央?yún)^(qū)域是高度保守的。此中央?yún)^(qū)域內(nèi)的XUX位點(diǎn)，特別是GUX，因此構(gòu)成本發(fā)明的一種多核酶的優(yōu)選位點(diǎn)。
另外，作為實(shí)例，在毒株I17F、FNY、M、I、O、Y、D和C之間，CMV衣殼蛋白質(zhì)序列的5’末端(100多個(gè)堿基長(zhǎng))是高度保守的。在該保守序列內(nèi)的位置84處，所有這些毒株均有一保守的GUC位點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的這一方案，能使數(shù)個(gè)CMV毒株滅活的多核酶在催化區(qū)域中含有一個(gè)催化區(qū)，位于互補(bǔ)序列相當(dāng)于位置84的位點(diǎn)(參見(jiàn)下文實(shí)驗(yàn)例)。
d)XUX靶點(diǎn)的另一選擇標(biāo)準(zhǔn)是與被轉(zhuǎn)化植物的內(nèi)源基因沒(méi)有同源性。事實(shí)上，盡管很少，但有些病毒擁有在植物基因組中能找到同源序列的序列。因此，避免XUX位點(diǎn)位于這種序列內(nèi)是很重要的。
根據(jù)本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案，除上述的2個(gè)必需部分(i)和(ii)外，多核酶還可含有第三個(gè)組分(iii)，即一個(gè)或多個(gè)與病毒衣殼蛋白基因不互補(bǔ)的序列。象催化區(qū)一樣，這些非互補(bǔ)序列被插入到互補(bǔ)區(qū)的不同位點(diǎn)，互補(bǔ)性因插入而被中斷。令人驚奇地是，本發(fā)明人觀察到在多核酶雜交臂內(nèi)存在所述非互補(bǔ)序列并不妨礙多核酶與底物的雜交，而且在某些情況下，甚至可提高裂解反應(yīng)的效率。
將這些非互補(bǔ)序列插入在互補(bǔ)序列的兩個(gè)連續(xù)的堿其之間，從而非互補(bǔ)序列與互補(bǔ)序列形成一個(gè)共線性插入。在這種情況下，多核酶具有結(jié)構(gòu)((雜交臂－催化區(qū)－雜交臂)－(非互補(bǔ)序列)n)p其中n＝0或1，p＞1。
作為本發(fā)明這一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例，可提及由核酶序例、與底物的不同片段(連續(xù)的和鄰接的)互補(bǔ)并且由非互補(bǔ)序列連在一起的雜交臂組成的多核酶。換句話中，在所述結(jié)構(gòu)中，雜交臂的聚集重新組成了與衣殼蛋白基因互補(bǔ)的序列。
在多核酶中非互補(bǔ)序列的存在表明，多核酶兩個(gè)催化區(qū)之間的距離大于底物中兩個(gè)相應(yīng)GUC位點(diǎn)間的距離。根據(jù)本發(fā)明的這種方案，位于催化區(qū)每一側(cè)的雜交臂的長(zhǎng)度必須至少是4個(gè)堿基，而且優(yōu)選的是每一側(cè)至少8個(gè)堿基，并可多達(dá)800到1000個(gè)堿基。
非互補(bǔ)序列的特性可隨其功能的不同而異?？梢允蔷哂小疤畛洹惫δ艿男蛄?，即在底物相應(yīng)的兩個(gè)XUX位點(diǎn)彼此非常近時(shí)，可以增大多核酶兩個(gè)催化區(qū)之間的距離。用這種方式，可以避免在兩個(gè)相鄰的催化區(qū)之間形成失活的雙螺旋。也可以用作非互補(bǔ)序列使用具有確定的二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，其可具有防止可觀長(zhǎng)度的多核酶，如有800多堿基的多核酶在無(wú)活性的二級(jí)結(jié)構(gòu)中自身再折疊。作為這種結(jié)構(gòu)類型的一個(gè)實(shí)例，可提及通過(guò)缺失一個(gè)或多個(gè)必需的堿基而使其失活的核酶。由下文實(shí)施例中描述的多核酶136舉例說(shuō)明了本發(fā)明實(shí)施方案的這種模式。
多核酶的非互補(bǔ)序列也可具有明確的功能，例如，它可以由用于篩選轉(zhuǎn)化株的編碼序列或者含有作用于衣殼蛋白以外之底物或者順式作用于多核酶某部分之核酶的序列構(gòu)成。總而言之，非互補(bǔ)序列并不編碼蛋白質(zhì)。它也可含有多克隆位點(diǎn)。非互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度通常在2到500個(gè)堿基之間，如20到100個(gè)堿基。當(dāng)存在多個(gè)互補(bǔ)序列時(shí)，它們可共同構(gòu)成核酶長(zhǎng)度的高達(dá)約90％，例如50％。
本發(fā)明的多核酶通常由RNA組成。然而，可以由DNA取代多核酶的某些部分，如雜交臂或這些臂的部分，或者催化區(qū)的部分，特別是“環(huán)”，條件是保持催化活性(參見(jiàn)，如國(guó)際專利申請(qǐng)WO－9119789中描述的DNA取代RNA)。
可以構(gòu)建本發(fā)明的多核酶以使任何病毒衣殼蛋白失活。衣殼蛋白是蛋白質(zhì)亞單位，由病毒基因組編碼，構(gòu)成多聚衣殼。所述衣殼由這些相同的蛋白質(zhì)亞單位沿核酸一個(gè)接一個(gè)排列組成。衣殼亞單位的空間排列，根據(jù)病毒不同，要么產(chǎn)生螺旋要么是二十角結(jié)構(gòu)。本發(fā)明涉及針對(duì)具有螺旋顆?；蚨穷w粒的病毒以及具有被膜之病毒衣殼蛋白的多核酶。所述被膜是位于核蛋白衣殼外周的脂蛋白膜。
作為適宜病毒的實(shí)例，可從下列各類中選擇花椰菜花葉病毒組，如花椰菜花葉病毒(CaMV)；雙聯(lián)病毒組，如EcoRI米線條病毒(MSV)；呼腸孤病毒科，如傷瘤病毒(WTV)；彈狀病毒科，如馬鈴薯黃矮病毒(PYDV)；蕃茄斑萎病毒(TSWV)；煙草花葉病毒組，如煙草花葉病毒(TMV)；馬鈴薯X病毒組，如馬鈴薯X病毒(PVX)；馬鈴薯Y病毒組，如馬鈴薯Y病毒(PVY)；荷蘭石竹隱潛病毒組，如荷蘭石竹隱潛病毒(CLV)；黃化病毒組，如甜菜黃化病毒(BYV)；煙草脆裂病毒組，如煙草脆裂病毒(TRV)；大麥病毒組，如大麥條斑花葉病毒；蕪菁病毒組，如蕪菁黃花葉病毒(TYMV)；黃癥病毒組，如大麥黃矮病毒(BYDV)或馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)；蕃茄叢矮病毒組，如蕃茄叢矮病毒(TBSV)；南方菜豆花葉病毒，如南豆花葉病毒(SBMV)；煙草壞死病毒(TNV)；蠕傳多面體病毒組，如煙草環(huán)斑病毒(TRSV)；豇豆花葉病毒組，如豇豆花葉病毒(CPMV)；豌豆耳突花葉病毒(PEMV)；黃瓜花葉病毒組，如黃瓜花葉病毒(CMV)；雀麥花葉病毒組，如雀麥花葉病毒(BMV)；等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒組，如煙草線條病毒(TSV)，這些蛋白質(zhì)的序列是已知的(如參見(jiàn)，在專著“Elements de VirologieVégétale”，Pierre Cornuet，.I.N.R.A.Paris，1987，ISBN2－85340－808－6中引述的大量文獻(xiàn))。
根據(jù)一種特別優(yōu)選的方案，衣殼蛋白是黃瓜花葉病毒(CMV)的衣殼蛋白質(zhì)。由于CMV可以感染750種以上的植物，因此屬于黃瓜花葉病毒組的黃瓜花葉病毒有很大的農(nóng)學(xué)重要性。CMV是一種多組分病毒，由含三個(gè)基因組RNA(RNA1－3)和一個(gè)亞基基組RNA(RNA4)的二十面體顆粒組成，RNA3含有一個(gè)拷貝的衣殼蛋白質(zhì)基因；但得自RNA3的亞基因組RNA4用作合成衣殼蛋白質(zhì)的基體。將不同的CMV株分成兩類含毒株C、D、FNY、Y、I17F和Chi的亞組I；毒株Q和WL所屬的亞組II。
比較屬于相同亞組的CMV毒株衣殼蛋白質(zhì)的氨基酸序列表明有95％的同源性。亞組I和II之間的序列同源性較低，為80％左右。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗CMV(毒株I17F)衣殼蛋白的本發(fā)明多核酶對(duì)于滅活不同CMV毒株是極為有效的，而且被轉(zhuǎn)化植物得到完全抗性。
除多核酶外，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)抗病毒植物的方法，特征在于將多核酶或如上述的編碼多核酶的序列導(dǎo)入植物。
通常，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化，由此將編碼多核酶的DNA序列穩(wěn)定整合到植物其因組中，從而將多核酶導(dǎo)入植物。
可以使用所有將外源DNA導(dǎo)入植物的導(dǎo)入植物的方法，如土壤桿菌、電穿孔、厚生質(zhì)體融合、用顆粒槍轟擊、或DNA滲入細(xì)胞如花粉、微孢子、種子和不成熟胚胎中，病毒載體如雙聯(lián)病毒或者衛(wèi)星病毒。根瘤土壤桿菌和根毛土壤桿菌構(gòu)成優(yōu)選的工具。在這種情況下，將編碼多核酶的序列連同所有必需的調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、終止子等以及篩選轉(zhuǎn)化株必需的任何序列一起導(dǎo)入適宜的載體中。
本發(fā)明還涉及由該方法得到的轉(zhuǎn)基因植物。更具體地說(shuō)，涉及對(duì)病毒有抗性的轉(zhuǎn)基因植物，特征在于它們?cè)谄浠蚪M中含有轉(zhuǎn)錄后可產(chǎn)生本發(fā)明多核酶的序列。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“完全抗性”指完全沒(méi)有癥狀，“耐受性”指植物被感染(即顯示出癥狀)但隨后又恢復(fù)。術(shù)語(yǔ)“敏感性的”指植物表現(xiàn)出病癥并復(fù)制病毒?！翱剐孕汀敝竿耆剐灾参锖湍褪苄灾参锏目偤?。
可以用下列方法檢測(cè)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的“抗性”性質(zhì)對(duì)第一子代完成自體受精或與未轉(zhuǎn)化的基因型雜交以得到T1。隨后，用所研究的病毒接種T1植物。根據(jù)本發(fā)明，75％的自體受精T1是有完全抗性。在與未被轉(zhuǎn)化之基因型雜交的情況下，50％的植物是完全抗性的(根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)檢測(cè)已經(jīng)經(jīng)受轉(zhuǎn)化和再生過(guò)程的整個(gè)植物群體來(lái)得到這些數(shù)據(jù)。應(yīng)注意這些植物中只有75％的是被轉(zhuǎn)化了的)。
可用“Southern印跡”分析證實(shí)植物的轉(zhuǎn)化性質(zhì)，可用Northern印跡分析確定通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入的序列的表達(dá)。在下文實(shí)施例中將描述這些分析。
用本領(lǐng)域已知的植物轉(zhuǎn)化和再生方法可很好地生產(chǎn)由本發(fā)明多核酶保護(hù)的轉(zhuǎn)基因植物。一個(gè)實(shí)例是在專利公開(kāi)No.EP－A－0412912中描述的甜瓜轉(zhuǎn)化和再生方法。
抗CMV的轉(zhuǎn)基因植物是特別優(yōu)選的，如甜瓜，黃瓜，筍瓜(courgette)、蕃茄胡椒和菜豆。
下述附圖舉例說(shuō)明了本發(fā)明的各個(gè)方面－圖1表示本發(fā)明多核酶催化區(qū)的優(yōu)選結(jié)構(gòu)，這些區(qū)在每一側(cè)均由與病毒衣殼蛋白的部分互補(bǔ)的序列包圍(i)在圖1A中X代表A、G、C或U；每個(gè)X是相同或不同的；n＋n’≥，6，n和n’是相同或不同的；(★)代表互補(bǔ)核糖核苷酸之間的氫鍵；X’和X”代表在至少其部分長(zhǎng)度上彼此互補(bǔ)并可由至少一個(gè)核苷酸彼此相連，由此形成一個(gè)環(huán)的寡核糖核苷酸。可將選自A，G、C或U的附加核苷酸插入A’后。核酶的催化區(qū)由圖1A的部分(II)表示，部分(I)表示雜交臂。
(ii)在圖1B中，X，(★)，n，n’和A’具有與圖1A中相同的意思。M和M’≥1，并且是相同或不同的。B代表一個(gè)鍵，一個(gè)堿基對(duì)，一個(gè)核糖核苷酸或含至少2個(gè)核糖核苷酸的寡核糖核苷酸。
(iii)圖1C代表核酶的一個(gè)優(yōu)選模式(Haseloff and Gerlach，1988)，RNA底物在與核酶互補(bǔ)的GUC裂解位點(diǎn)周?chē)梢杂腥魏涡蛄?X)。箭頭表示裂解位點(diǎn)。用黑色顯示保守堿基。
(iV)圖1D表示核酶(稱為“微小酶”)的結(jié)構(gòu)，由元件“P”取代催化區(qū)的環(huán)。P可以是至少一個(gè)核苷酸(核核苷酸，脫氧核糖核苷酸，衍生物或混合物)，條件是在序列(X’)n和(X)n’及P僅由核糖核苷酸構(gòu)成時(shí)，“P”基團(tuán)的核糖核苷酸不是經(jīng)“Watson－Crick”堿基配對(duì)的堿基對(duì)?！癙”也可以是不影響核糖酶催化活性的鍵或任何原子或原子集團(tuán)。X的意思與圖1A中的相同。
－圖2表示CMV(I17F)衣殼蛋白質(zhì)的序列，下面劃線的是GUC位點(diǎn)。
－圖3顯示為了在CMV衣殼蛋白質(zhì)序列中的不同位點(diǎn)處導(dǎo)入TobRSV催化位點(diǎn)而進(jìn)行定點(diǎn)誘變實(shí)驗(yàn)的寡脫氧核糖核苷酸A、B、C、E的結(jié)構(gòu)(表明與DNA基質(zhì)序列雜交)。
－圖4說(shuō)明為了誘導(dǎo)對(duì)CMV抗性而構(gòu)建的基因的結(jié)構(gòu)(i)衣殼蛋白質(zhì)(ii)多核酶136與帶有2個(gè)核酶的衣殼蛋白質(zhì)互補(bǔ)的序列(ii)多核酶161與帶有3個(gè)核酶的衣殼蛋白質(zhì)互補(bǔ)的序列(iv)多核酶163與攜帶3個(gè)核酶的衣殼蛋白質(zhì)互補(bǔ)的片段；(v)多核酶165與帶4個(gè)核酶的衣殼蛋白互補(bǔ)的序列；－圖5顯示對(duì)表達(dá)多核酶136之轉(zhuǎn)基因甜瓜植物在某些情況下的原始轉(zhuǎn)化株，T1和T2后代)的Northern印跡分析結(jié)果T0原始轉(zhuǎn)化株；T1；T1后代；T2T2后代；A品系141.1NT未轉(zhuǎn)化的對(duì)照組。
－圖6顯示對(duì)表達(dá)多核酶136之轉(zhuǎn)基因甜瓜植物(在有些情況下的原始轉(zhuǎn)化株T1和T2后代)的Southern印跡分析結(jié)果
T0原始轉(zhuǎn)化株；T1T1后代；T2T2后代；NT未被轉(zhuǎn)化的對(duì)照組。
－圖7顯示對(duì)表達(dá)衣殼蛋白質(zhì)基因之轉(zhuǎn)基因甜瓜植物(在某些情況下的原始轉(zhuǎn)化株，T1和T2后代)的Southern印跡分析結(jié)果T0原始轉(zhuǎn)化株；T1T1后代；T2T2后代；A品系88.105；B品系159.8；NT未轉(zhuǎn)化對(duì)照組。
－圖8顯示對(duì)由pBIOS135轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因甜瓜植物(原始轉(zhuǎn)化株)的Western印跡分析結(jié)果A、B、C、D和E5個(gè)品系的原始轉(zhuǎn)化株；NT未被轉(zhuǎn)化的對(duì)照組；R用20ng CMV重新構(gòu)建；－圖9表示在pBIOS135轉(zhuǎn)化的品系中，隨時(shí)間延長(zhǎng)CMV癥狀的發(fā)展情況D天數(shù)；無(wú)癥狀植物；耐受性植物；敏感性植物。
－圖10表示在pBIOS135轉(zhuǎn)化的品系中，隨時(shí)間延長(zhǎng)CMV癥狀的發(fā)展情況D天數(shù)無(wú)癥狀植物耐受性植物敏感性植物。
下列實(shí)施例描述了含3或4個(gè)核酶的4種多核酶的構(gòu)建，所述核酶由24個(gè)堿基的榔頭型保守序列(圖1)和與不同大小的CMV(I17F毒株)衣殼蛋白質(zhì)序列互補(bǔ)的臂。在這些實(shí)施例中顯示的衣殼蛋白核苷酸序列的編號(hào)與專利申請(qǐng)EP－A－0412912中的相同。
這些核酶的每一種都裂解CMV衣殼蛋白質(zhì)基因序列上的不同GUC序列。圖4中舉例說(shuō)明了這些構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)－多核酶1361074個(gè)堿基長(zhǎng)，含有核酶A(位置84)和B(位置108)及從中區(qū)缺失了一個(gè)G和一個(gè)A(位置20和21)的核酶C★(位置204)，所述核酶由下列長(zhǎng)度的互補(bǔ)臂包圍·從5’末端到核酶A的82個(gè)核苷酸·核酶A和B之間的22個(gè)核苷酸；·核酶B和C★之間的94個(gè)核苷；·從核酶C★到3’末端的803個(gè)核苷酸。
－多核酶1611076個(gè)堿基后，與多核酶136相同，區(qū)別僅在于核酶C在位置204有核酶C★中缺失的G和A。
－多核酶163426個(gè)核苷酸長(zhǎng)，含有由下列長(zhǎng)度的互補(bǔ)臂包圍的3個(gè)核酶A(位置84)，B(位置108)和C(位置204)
·從5’末端到核酶A的82個(gè)核苷酸；·核酶A和B之間的22個(gè)核苷酸，·核酶B和C之間的94個(gè)核苷酸；·從核酶C到3’末端的153個(gè)核苷酸。
－多核酶1651099個(gè)核苷酸長(zhǎng)，含有由下列長(zhǎng)度的互補(bǔ)臂包圍的4個(gè)核酶A(位置84)，B(位置108)，C(位置204)和E(位置608)·從5’末端到核酶A的82個(gè)核苷酸；·核酶A和B之間的22個(gè)核苷酸；·核酶C和E之間的94個(gè)核苷酸；·從核酶E到3’末端的399個(gè)核苷酸。
這些多核酶不含有對(duì)于其表達(dá)并整合到植物基因組中所需的信號(hào)。必須將構(gòu)成性或非構(gòu)成性啟動(dòng)子(如病毒或細(xì)菌啟動(dòng)子如NOS，或者植物啟動(dòng)子如Rubisco的啟動(dòng)子和遍在蛋白的啟動(dòng)子)放在多核酶的5’末端，并且必須在3’末端放置poly(A)序列?？梢杂迷谥参镏杏泄δ艿倪m宜啟動(dòng)子；本發(fā)明人選擇了得自花椰菜花葉病毒(CaMV)的被人為是最強(qiáng)的構(gòu)成性啟動(dòng)子的35S啟動(dòng)子。多聚腺苷酸化信號(hào)poly(A)可以是來(lái)自CaMV35S基因，從植物中分離的基因或者章魚(yú)堿合成酶的基因；本發(fā)明人選擇了得自胭脂堿合成酶(tnos)基因的poly(A)信號(hào)。將構(gòu)建的表達(dá)盒導(dǎo)入得自pBI121載體的pBIOS4轉(zhuǎn)化載體中，所述pBI121載體含有卡那霉素抗性基因(編碼新霉素磷酸－轉(zhuǎn)移酶的基因neo)和編碼葡糖苷酸酶的iud A基因。遺傳轉(zhuǎn)化甜瓜子葉并再生轉(zhuǎn)基因甜瓜植物的方法與專利“轉(zhuǎn)基因甜瓜”，No.EP－A－412912(BIOSEM)中描述的相同。
實(shí)施例1；構(gòu)建抗黃瓜花葉病毒株I17F衣殼蛋白質(zhì)基因的核酶噬菌粒藍(lán)本(bluescribe)pBSIISK(SIRATAGENE)含有與稱為pBIOS113的CMV毒株I17F的RNA4互補(bǔ)的DNA(在歐洲專利公開(kāi)EP－A－0412912中描述了它的生產(chǎn)方法)，用其作為構(gòu)建不同核酶的起始點(diǎn)，用所述核酶得到抗不同CMV毒株的轉(zhuǎn)基因甜瓜。
衣殼蛋白質(zhì)基因序列的不同位置導(dǎo)入衛(wèi)星TobRV(煙草環(huán)斑病毒)的催化位點(diǎn)。EP－A－0412912的圖3中列出了與CMV毒株I17F的RNA4(1007個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng))互補(bǔ)的DNA序列；用氨基酸序列顯示編碼衣殼蛋白質(zhì)的部分。
由于Hasehoff和Gerlach描述的的“榔頭”型核酶優(yōu)先在GUC單元的C后裂解，所以在衣殼蛋白質(zhì)編碼序列上選擇4個(gè)位置(圖2)*位置A，核苷酸84，*位置A，核苷酸108，*位置C，核苷酸204*位置E，核苷酸608為了在這些位置導(dǎo)入通常稱為“榔頭”的24堿基核酶，決定使用KUNKEL研制的在單鏈DNA上誘變的方法(Proc.Nat.Acad，Sci.82488－492)，該方法需要與被誘變DNA部分雜交的并且在使用DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)在3’末端作為引物的合成的寡脫氧核糖核酸。從EUROGENTEC公司訂購(gòu)了下列4種寡核苷酸oligo A5′TCGACGGTTACCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCAGCACTGGTTG 3′oligo B5′CGGGAACCACCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGCGGACGACG3′oligo C5′GTTAATAGTTGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGACCAGCTGC 3′oligo E5′GAATACACGAGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGCGTACTTTC 3′用這4種寡核苷酸和購(gòu)自BIORAD公司的定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?日錄號(hào)170－3576)，誘變由噬菌粒pBIOS113產(chǎn)生的單鏈DNA。圖3顯示4種寡核苷酸與靶單鏈DNA的雜交，箭頭指示DNA聚合物對(duì)合成互補(bǔ)鏈的作用。分析轉(zhuǎn)化大腸桿菌后得到的幾個(gè)重組克隆，首先用限制酶消化以檢測(cè)一些片段大小的增加。借助從美國(guó)Biochemicals公司購(gòu)得的“seguenasek”盒變體II，使用22個(gè)堿基的寡核苷酸，oligo No.13(位置53到74)對(duì)顯然含3個(gè)催化位點(diǎn)的克隆pBIOS116進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明催化位點(diǎn)A和B完全插入，催化點(diǎn)C不完全插入。在位置20和21(G和A)發(fā)生兩個(gè)堿基的缺失。盡管Lamb和Hay(Journal of Cencral Virology，1990，712257－2264)證明該位點(diǎn)對(duì)裂解沒(méi)有影響，但決定在表達(dá)載體pBIOS3(Perez al，Plant Mol，Biology 1989，13365－373)中的反方向上克隆約1100bp的DNA片段(1007bp＋21bp×2＋19bp＋在5’和3’的多接頭相鄰序列)，以研究在多核酶中存在無(wú)核酶活性的非互補(bǔ)序列的影響。為此目的在得自PROMEGA BIOTECH公司的質(zhì)粒pGEH 72f(+)的KpnI－XbaI位點(diǎn)克隆pBIOS113的KpnI－XbaI片段；這樣在含催化位點(diǎn)的衣殼蛋白質(zhì)序列的任一側(cè)都會(huì)含有BamHI位點(diǎn)。然后用BamHI消化所得的質(zhì)粒pBIOS151，將所研究的片段(多核酶136，圖4)導(dǎo)入pBIOS3的BamHI位點(diǎn)。篩選在反義方向上含有位于花椰菜花葉病毒強(qiáng)構(gòu)成性啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶基因的終子止控制下之片段的重組克隆，稱為pBIOS125。
在二重載體pBIOS4的EcoRI位點(diǎn)處克隆含有處于上述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列控制下之核酶(帶2個(gè)功能催化位并缺失了一個(gè)的互補(bǔ)片段)的該質(zhì)粒之EcoRI片段。后者是載體pBI121(Jefferson etal，1987EMBO Journal63901－3907)的衍生物，通過(guò)抑制位于編碼β－葡糖苷酸酶基因3’末端的EcoRI位點(diǎn)，而在同一基因的5’末端設(shè)定一個(gè)EcoRI位點(diǎn)而修飾之。在無(wú)御能力的根瘤土壤根菌RC58’3菌株的三親接合后，在不同的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中使用所得的二元載體，pBIOS136，所述RC58’3菌株得自菌株C58’3(Muclineaux et al.，Plant Seience 63237－245，1989)而且事實(shí)上是抗利福霉素的自發(fā)突變體。
實(shí)施例2構(gòu)建抗黃瓜花葉病毒株I17F衣殼蛋白質(zhì)基因的不同核酶鑒于實(shí)施例1中所述的多核酶136(圖4)不含有針對(duì)位置608的催化位點(diǎn)，而且針對(duì)位置204的是不完全的，故開(kāi)始進(jìn)一步的定點(diǎn)誘變實(shí)驗(yàn)。為此目的，將所述質(zhì)粒的EcoRI片數(shù)克隆到經(jīng)EcoRI消化的噬菌體M13mp18(得自PHARMACIA公司)中。確定充許包裹含兩個(gè)催化位衣殼蛋白基因編碼鏈的重組噬菌體的特征，并用它作為使用寡脫氧核糖核苷酸C和E(一起或分別地)進(jìn)行新的誘變實(shí)驗(yàn)的基體。按前文實(shí)施例所述步驟完成誘變，由于起始物質(zhì)是噬菌體，故單鏈基體的產(chǎn)率更高。用寡核苷酸No.13和19－mer寡核苷酸(位置694到位置676)對(duì)不同重組克隆測(cè)序，后者得以定序位置608處導(dǎo)入的催化位點(diǎn)。用含有與本發(fā)明一致之催化位點(diǎn)的克隆構(gòu)建二重載體pBIOS161，pBIOS163和pBIOS165(見(jiàn)圖4)。除pBIOS161含有未缺失的催化位點(diǎn)C外，二重載體pBIOS161與pBIOS136完全相同。
對(duì)于編碼核酶的與衣殼蛋白質(zhì)基因的全序列雜交并含有三個(gè)功能性催化位點(diǎn)A，B，C(對(duì)pBIOS161而言)或四個(gè)功能性催化位點(diǎn)A，B，C，E(對(duì)pBIOS165而言)的基因而言，在純化含35S啟動(dòng)子、核酶、終止子NOS的EcoRI片段后，立即將所述基因克隆到二重載體pBIOS4的EcoRI位點(diǎn)處。對(duì)于含3個(gè)催化位點(diǎn)A，B，C并只與CMV之RNA45’末端的前360個(gè)堿基雜交的核酶而言(就pBIOS163來(lái)說(shuō))，用限制酶HindIII消化后，缺失剩余的3’部分(在衣殼蛋白質(zhì)基因和該序列3’側(cè)HindIII位點(diǎn)處且得自多接頭的位置361)。然后將該質(zhì)粒缺失的EcoRI片段克隆于二重載體pBIOS4的EcoRI位點(diǎn)上。
表達(dá)多核酶之甜瓜的轉(zhuǎn)化和再生將后3個(gè)二重載體導(dǎo)入土壤桿菌中并按專利申請(qǐng)EP－A－0412912中所述方法用于轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例3；轉(zhuǎn)基因植物的分子分析Northern印跡分析借助Northern印跡分析用pBIOS136轉(zhuǎn)化后得到的甜瓜植物(圖5)。按照Chandlor等的(Plant Physiology(1983)7447－54)所述方法，從培養(yǎng)在溫室中的轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因植物的幼葉中提取總RNA。
在1％變性瓊脂糖凝膠中對(duì)其進(jìn)行電脈分離，轉(zhuǎn)移到Hybond C上并與經(jīng)由三重消化BamHI片段所得到的片段而構(gòu)成的探針雜交，所說(shuō)的片段相當(dāng)于衣殼蛋白質(zhì)基因的完整互補(bǔ)片段，其攜帶有3個(gè)核酶，其中兩個(gè)是有功能活性的(多核酶136)。三重消化有利于同源序列間的雜交并使之有可能得到更強(qiáng)的信號(hào)。
用亞甲蘭著染膜以證實(shí)加于凝膠上的總量RNA的同質(zhì)性和RNA的質(zhì)量。在轉(zhuǎn)錄水平上得到的初級(jí)轉(zhuǎn)化株和相應(yīng)的T1和T2后代的結(jié)果示于圖2中并顯示－在所有得自被圍化植物的樣品中均觀察到1.45kb的主轉(zhuǎn)錄本，但陰性對(duì)照樣品中則沒(méi)有；－依據(jù)初級(jí)轉(zhuǎn)化株的不同，轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目有相當(dāng)大的變化。這種變化可以解釋為T(mén)－DNA和T－DNA的片段整合在植物基因組的不同位點(diǎn)并因此而受到環(huán)境的影響所造成的。
－初級(jí)轉(zhuǎn)化株的轉(zhuǎn)錄水平和它們的T1與T2后代的轉(zhuǎn)錄水平間沒(méi)有相關(guān)性。
Southern印跡分析借助Southern印跡分析用pBIOS136或pBIOS135轉(zhuǎn)化后得到的甜瓜植物(圖6和7)。按照Dellaporta等人(Plant MolecularBioloygy Reporeter(1983)1；19－21)方法，從培養(yǎng)在溫室中的轉(zhuǎn)基因(初級(jí)轉(zhuǎn)化株，有些情況下使用T1和T2后代)以及非轉(zhuǎn)基因植物的幼葉中提取總DNA。因EcoRI(在pBIOS4中所研究基因之表達(dá)盒的克隆位點(diǎn))水解該DNA，在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，轉(zhuǎn)移到Hybond N+上并與三個(gè)探針基因nptII、三重消化的多核酶136(參見(jiàn)Northern印跡分析)和基因gus雜交。
用pBIOS136 5次轉(zhuǎn)化過(guò)程的結(jié)果(圖6)表明－品系146.42在初級(jí)轉(zhuǎn)化株146.42、其T1后代和T2后代的情況下，與3個(gè)探針的雜交特征完全相同，此表明T－DNA的片段已沒(méi)有分離，并且可能有一個(gè)單一的座位。多核酶136的幾個(gè)拷貝存在于植物基因組中。事實(shí)上，可見(jiàn)到大小為1.75kb、4.4kb、8.3kb和8.8kb的4個(gè)雜交帶。1.75kb帶相應(yīng)于預(yù)期成對(duì)的理論大小的帶(EcdRI，多核酶)。4.4kb帶與多核酶136和基因nptII雜交。此外，用EcoRI/nwptII對(duì)進(jìn)行分析并沒(méi)有測(cè)出該帶，這表明在植物基因組中存在nptII基因的單一拷貝。8.3kb和8.8kb的帶與多核酶136和gus基因雜交。用EcoRI/gus對(duì)只測(cè)到這兩個(gè)帶，表明存在所有或部分gus基因的兩個(gè)拷貝。3個(gè)探針均與用XhoI消化之T0、T1和T2的DNA雜交也提示存在一單一座位。
－品系146.34在初級(jí)轉(zhuǎn)化株146.34和其T1后代的情況下，只有初極轉(zhuǎn)化株的某些雜交帶仍存在于個(gè)別T1中，此結(jié)果進(jìn)一步表明T－DNA的某些片段已被除去。就EcoRI/多核酶136的分析來(lái)說(shuō)，分子大小為1.75kb、3kb和5.3kb的3個(gè)帶對(duì)于T0和T1植物是共同的，而另外3條大小為7.3kb、6.8kb和4.25kb的帶則是T0的特征帶。這一結(jié)果表明在T1和T0植物中分別存在多核酶的3個(gè)和6個(gè)拷貝。在nptII雜交中，于T0植物中檢測(cè)到兩條3kb和5.3kb的EcoRI帶，顯示存在所有或部分nptII基因的兩個(gè)拷貝。在T1基因中只看到3kb的EcoRI帶，表明存在nptII基因的單個(gè)拷貝。在gus雜交中，于T0植物中發(fā)現(xiàn)有3條大小為4.25的、5.3kb和6.8kbr EcoRI帶，而T1后代中只存在5.3kb的帶。這一結(jié)果揭示在T0和T1植物中分別存在整個(gè)或部分gus基因的3個(gè)拷貝和1個(gè)拷貝。再者，3個(gè)探針均與XhoI消化的T0和T1植物的DNA雜交提示存在2個(gè)座位。
－品系146.30和146.28在初極轉(zhuǎn)化株146.30和146.28以及它們的相應(yīng)T1后代中，觀察到相似情況。
－品系141.1在初極轉(zhuǎn)化株141.1和其后代的情況下，雜交特征是相似的。1.75的、10kb和10kb的EcoRI帶分別揭示了與探針多核酶136、nptII和gus的雜交。這表明存在有整合到植物基因組中的T－DNA的單一拷貝。
最后，在對(duì)轉(zhuǎn)化株146.42和其后代(T1和T2)以及轉(zhuǎn)化株141.1和其后代T1的分析中觀察到了遺傳穩(wěn)定性。所研究的4條泳道揭示了T－DNA或T－DNA片段的高拷貝數(shù)特征，而品系141.1則只具有一個(gè)已整合的T－DNA拷貝。
此外，注意到在用pBIOS135轉(zhuǎn)化的品系中也存在T－DNA拷貝和/或T－DNA部分的拷貝(圖7)。
Western印跡分析(比較分析)借助Western印跡分析用含有衣殼蛋白質(zhì)基因的表達(dá)盒的PBIOS4轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因甜瓜植物。BIOSEM的專利申請(qǐng)EP－A－0412912(1989年8月11日)詳細(xì)描述了所使用的方法學(xué)和所得到的結(jié)果。然而，應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，衣殼蛋白質(zhì)基因的表達(dá)水平占總蛋白質(zhì)含量的0.001％至0.4％不等。借助少數(shù)實(shí)例，圖8說(shuō)明了取決于葉齡和對(duì)植物基因組的可能環(huán)境影響而造成的這種表達(dá)水平的變化。
實(shí)施例4由多核酶136和衣殼蛋白質(zhì)特化的甜瓜對(duì)CMV的抗性試驗(yàn)(比較試驗(yàn))使表達(dá)衣殼蛋白質(zhì)基因或多核酶136之基因的轉(zhuǎn)基因甜瓜植物(基因型TEZIER10)自體受精或與基因型TEZIER10的未被轉(zhuǎn)化植物雜交。將得自這些自身受精的種子(T1代)和繼后自體受精的種子(T2代等)播種于人工氣候室(以16小時(shí)光照周期變化的氣候小室)中。
在2至4片葉階段，將用CMV毒株TL28感染之新鮮葉的粉碎制劑機(jī)械接種到源于后代的23株植物上。
感染16天后(最佳時(shí)期)，估計(jì)癥狀(花葉病，葉片拆迭、黃化)。將被感染的植物分成三類－沒(méi)有癥狀的抗性植物(R)；－有癥狀的敏感植物(S)；－“恢復(fù)”的耐受植物(T)，即新生的葉發(fā)育沒(méi)有癥狀，而老葉表現(xiàn)有癥狀。
可以出現(xiàn)幾次“恢復(fù)”循環(huán)。新生的健康葉是否變成新感染的葉取決于氣候條件。
“抗性型”植物包括沒(méi)有癥狀的植物和耐受植物。
用于抗CMV抗性試驗(yàn)中的對(duì)照組包括
－敏感對(duì)照組TEZIER10和Vedrantais；－至少有CMV、Virgos和Free Cucumber的三個(gè)隱性基因的抗性對(duì)照組。
表達(dá)衣殼蛋白質(zhì)基因之T1代甜瓜品系對(duì)CMV毒株TL28的抗性表1中給出了所得的20個(gè)品系的結(jié)果并顯示－用TL28感染導(dǎo)致3至30％沒(méi)有癥狀的T1植物產(chǎn)生。接種TL28的未轉(zhuǎn)化的對(duì)照組TEZIER10產(chǎn)生0％沒(méi)有癥狀的植物?？剐詫?duì)照組Virgos和Free Cucumber分別產(chǎn)生92％和100％無(wú)癥狀植物，并且均沒(méi)有顯示任何耐受現(xiàn)象。
－恢復(fù)現(xiàn)象以高比例存在。所研究的14個(gè)品系顯示沒(méi)有較明顯比例(22至59％)的耐受性T1植物。
－抗性和耐受T1植物的百分比與衣殼蛋白質(zhì)的表達(dá)水平向沒(méi)有相關(guān)性。事實(shí)上，例如品系159.8和164.2有相同的衣殼蛋白質(zhì)表達(dá)水平(0.01％)而表現(xiàn)出不同的抗性水平。159.8品系的T1個(gè)體都是敏感性的，而在164.2品系中則26％是沒(méi)有癥狀的且有48％是耐受性的。
－經(jīng)自體受精得到大多數(shù)表達(dá)衣殼蛋白質(zhì)基因的品系。在接種CMV的T1植物中，預(yù)期的衣殼蛋白質(zhì)基因的理論頻率為75％。抗性型植物(沒(méi)有癥狀和耐受性的)的百分比根據(jù)轉(zhuǎn)基因品系的不同而25％和82％間有所變化。
表1表達(dá)衣殼蛋白質(zhì)基因的T1代甜瓜植物對(duì)CMV毒株TL28的抗性
說(shuō)明I自體受精BC與未被轉(zhuǎn)化的基因型TEZIER 10雜交％CP；作為可溶性總蛋白質(zhì)百分比的衣殼蛋白質(zhì)表達(dá)水平％R抗性植物或沒(méi)有證狀植物的百分比％T耐受性植物的百分比％S敏感植物的百分比*表達(dá)多核酶136的T1代中甜瓜植物對(duì)CMV毒株TL28的抗性表2中給出了所得到的13個(gè)品系的結(jié)果并顯示
－在10個(gè)品系的病例中，因TL28感染后30％至87％的T1個(gè)體沒(méi)有癥狀；－“恢復(fù)”現(xiàn)象很少存在。只有4個(gè)品系顯示有耐受性T1植物，范圍達(dá)9％至26％。
經(jīng)與未被轉(zhuǎn)化的品系TZ10雜交得到大多數(shù)表達(dá)多核酶136的品系。在接種CMV的T1植物中，預(yù)期的多核酶的理論頻率為50％。根據(jù)轉(zhuǎn)基因品系的不同?！翱剐孕汀敝参锏陌俜直仍?0％至65％之間不等。
最后，在使用“核酶”戰(zhàn)略的情況下，較大數(shù)目的T1代的品系沒(méi)有癥狀并有很少的耐受性植物。
表2表達(dá)多核酶136的T1代甜瓜植物對(duì)CMV毒株TL28的抗性
說(shuō)明I自身受精BC與未被轉(zhuǎn)化的基因型TEZIER 10雜交％R抗性植物或沒(méi)有癥狀植物的百分比％T耐受性植物的百分比％S敏感性植物的百分比*對(duì)CMV毒株TL28的抗性和借助對(duì)某些系的GUS試驗(yàn)估計(jì)分離的試驗(yàn)總結(jié)表3中給出的結(jié)果顯示－產(chǎn)生兩個(gè)品系(品系88.105和153.8)的表達(dá)衣殼蛋白質(zhì)基因的抗性型植物(沒(méi)有癥狀的植物和耐受植物)，以及一個(gè)表達(dá)多核酶136(品系146.42)的完全抗性品系(沒(méi)有癥狀的植物)；－產(chǎn)生兩個(gè)表達(dá)多核酶136(品系141.1和146.28)的耐性品系(耐性植物)。
表3對(duì)CMV毒株TL28的抗性試驗(yàn)和GUS基因及抗性基因在后代中的行為
說(shuō)明X雜交的類型；I自體受精；BC與未被轉(zhuǎn)化的基因型TEZIER 10雜交GEN代；T0初始轉(zhuǎn)化株；T1No.1代；T2No.2代KnptII基因，CP衣殼蛋白質(zhì)基因；RZ多核酶136；Ggus基因+存在；-不存在；QT數(shù)量％G表達(dá)gus基因之植物的百分比％R抗性植物或沒(méi)有癥狀植物的百分比％T；耐性植物的百分比％S敏感性植物的百分比1)對(duì)各品系的遺傳學(xué)研究能夠根據(jù)gus基因的表達(dá)水平確定分離的類型和純合性狀態(tài)。
就88.105和153.8兩個(gè)品系來(lái)說(shuō)，在自體受精得到的T1代中g(shù)us基因的表達(dá)水平分別是80％和73％。這表明在單一座位有T－DNA整合之顯性基因的孟德?tīng)栃头蛛x(3∶1)。分子分析已顯示存在被整合到植物基因組中的單一拷貝。
此外，兩個(gè)品系的T2代中g(shù)us基因的表達(dá)水平均為100％，從而進(jìn)一步證實(shí)被整合基因的純合性狀態(tài)。
就品系146.42來(lái)說(shuō)，在自體受精得到的T1代中g(shù)us基因的表達(dá)水平為77％，此表明在單一座位有T－DNA整合之顯性基因的孟德?tīng)栃头蛛x。分子分析已顯示在植物基因組的單一座位存在幾個(gè)T－DNA和/或T－DNA片段。
再者，在T2代中g(shù)us基因的表達(dá)水平為90％這一事實(shí)強(qiáng)調(diào)，對(duì)于被整合的基因所試驗(yàn)的品系不是純合的(表3)。就品系146.42來(lái)說(shuō)，在T3中得到純合性。對(duì)于品系141.1，在與未被轉(zhuǎn)化的TEZIER10基因型雜交后得到的T1代中，gus基因的表達(dá)水平為57％。這一事實(shí)也與在單一座位有T－DNA整合的顯性基因的孟德?tīng)栃头蛛x(1∶1)相符。分子分析已顯示被整合到植物基因組中的單一T－DNA的存在。
就品系146.28來(lái)說(shuō)，在與未被轉(zhuǎn)化的TEZIER10基因型雜交后得到的T1代中，gus基因的表達(dá)水平為73％。這一事實(shí)表明在幾個(gè)座位有T－DNA整合的顯性基因的分離。分子分析已顯示在植物基因組的兩個(gè)座位上存在幾個(gè)T－DNA或T－DNA片段。
2)針對(duì)病毒的行為所有抗性型植物都表達(dá)gus基因。某些敏感植物表達(dá)gus基因(表3)。
就品系88.105來(lái)說(shuō)，在自體受精后的T1代中得到25％的抗性型植物和75％的敏感植物。這表明對(duì)抗性基因之隱性基因的孟德?tīng)栃头蛛x(1∶3)。
就品系153.8來(lái)說(shuō)，在自體受精的T1代中得到55％的抗性型植物和45％敏感植物。根據(jù)這一事實(shí)難以對(duì)抗性基因的行為作出結(jié)論。
就品系141.1來(lái)說(shuō)，在與未被轉(zhuǎn)化的TEZIER10基因型雜交的T1代中，得到40％的耐受植物和60％的敏感植物。這一結(jié)果表明對(duì)抗性基因之顯性基因的孟德?tīng)栃头蛛x(1∶1)。因此多核酶136的行為相似于gus基因的行為。
就品系146.42來(lái)說(shuō)，經(jīng)自體受精后產(chǎn)生的T1代中，得到79％沒(méi)有癥狀的植物和21％敏感植物。這一結(jié)果暗示對(duì)抗性基因之顯性基因的孟德?tīng)栃头蛛x(3∶1)。因此多核酶136的行為相似于gus基因的行為。
3)估計(jì)病毒的量用ELISA檢測(cè)法測(cè)定的病毒量在沒(méi)有癥狀植物中相當(dāng)?shù)停坏€比Free Cucumber抗生對(duì)照植物中高些(表10)。
耐受植物含有可估計(jì)量的病毒。
敏感植物具有很高量的病毒。
表達(dá)多核酶的植物(品系146.42，T2和T3)比表達(dá)衣殼蛋白質(zhì)的抗性型植物(系153.8，T2)含有較小量的病毒。
雖然在所測(cè)得的病毒量與癥狀嚴(yán)重程度間有著相當(dāng)好的相關(guān)性。
4)隨時(shí)間CMV引起的癥狀的發(fā)展用CMV毒株TL28感染圖1和2中所示品系的植物。接種后第6、8、12、14、16和19天記錄癥狀。結(jié)果以直方圖形式給出(圖9和10)。
16天后得到的值沒(méi)有顯示進(jìn)一步的變化。就“衣殼蛋白質(zhì)”品系來(lái)說(shuō)，注意到無(wú)癥狀植物的數(shù)目有可波動(dòng)的迅速減少趨勢(shì)有利于有癥狀植物的出現(xiàn)。就品系88.105和153.8來(lái)說(shuō)(T1代)，分別在第16天和14天增加了以“恢復(fù)”現(xiàn)象為特征的耐性植物。此外，在品系88.105的T2代中，在第8天100％無(wú)癥狀的植物轉(zhuǎn)變?yōu)?00％耐受植物并直到第19天仍繼續(xù)存在(圖9)。
這種無(wú)癥狀植物突然變成耐受植物的現(xiàn)象可解釋為氣候條件的顯著影響。
在品系153.8的T2代中，注意到耐受植物的逐漸出現(xiàn)。從第16天以后，有50％的T2植物無(wú)癥狀并有50％植物是耐受性的。
就“多核酶”品系來(lái)說(shuō)，在品系141.1和146.28中強(qiáng)調(diào)無(wú)癥狀T1植物數(shù)目的減少有利于有癥狀植物(圖10)。
此外，就品系141.1來(lái)說(shuō)，從第16天后記錄到40％的耐受性T1植物。在品系146.28中，從D14天有耐受性T2植物發(fā)育并且在第16天達(dá)到26％。
再者，在品系146.42中，在第6天出現(xiàn)80％的沒(méi)有癥狀的T1植物，并且隨時(shí)間進(jìn)程仍幾乎保持在穩(wěn)定水平(第8、12和14天為78％，第16天為79％)。
品系146.42的T2植物表現(xiàn)有相似的行為。這一結(jié)果顯示出該系的很高的抗性水平并后代中抗性基因的穩(wěn)定性。
最后，得到兩個(gè)表達(dá)衣殼蛋白質(zhì)基因的“抗性”型的品系，以及一個(gè)表達(dá)多核酶136完全抗性品系。就兩個(gè)表達(dá)衣殼蛋白質(zhì)基因的品系來(lái)說(shuō)，所觀察到的抗性與完全抗性相比更相似于耐受性。帶實(shí)上，在某些條件下，有些病毒感染的表現(xiàn)嚴(yán)重癥狀的植物能夠發(fā)育新的健康葉。
就表達(dá)多核酶136的完全抗性品系來(lái)說(shuō)，沒(méi)有觀察到耐受現(xiàn)象。就兩個(gè)表達(dá)衣殼蛋白質(zhì)的品系來(lái)說(shuō)，在抗性植物中觀察到相對(duì)大量的病毒，對(duì)在表達(dá)多核酶136的抗性植物中病毒的量幾乎是與Free Cucumber抗性對(duì)照植物是同樣的。
實(shí)施例5表達(dá)多核酶165的T1代甜瓜品系對(duì)CMV毒株TL28感染的抗性。
就表達(dá)多核酶165的13個(gè)T1品系所得到的結(jié)果示于表4中并表明－被TL28感染后，12個(gè)品系的15％至100％和T1個(gè)體沒(méi)有癥狀；－只輕微地存在“恢復(fù)”現(xiàn)象。只有5個(gè)品系有6％至60％的T1耐受植物。
經(jīng)自體受精已得到了大部分表達(dá)多核酶的品系。在接種CMV的T1植物中，多核酶165的理論頻率為75％。根據(jù)轉(zhuǎn)基因系的不同，“抗性型”植物的百分比為15％至100％。
最后，同表達(dá)多核酶136的品系一樣，大多數(shù)表達(dá)多核酶165的品系沒(méi)有癥狀并且只有很少的耐受植物。多核酶165不同于多核酶136在于有兩個(gè)附加的功能性核酶。就對(duì)CMV感染的抗性來(lái)說(shuō)，兩種構(gòu)建得到了相似的結(jié)果。
表4表達(dá)多核酶165的T1代甜瓜植物對(duì)CMV毒株TL28感染的抗性<
說(shuō)明I自體受精BC與未被轉(zhuǎn)染的TELIZIER10基因型雜交％R抗性植物或無(wú)癥狀植物的百分比％T耐受植物的百分比％S敏感植物的百分比
權(quán)利要求
1.一種具有核糖核酸內(nèi)切酶活性并能夠滅活病毒衣殼蛋白基因的，稱為“多核酶”的核酸序列，其特征在于它包括i)與所述基因或其轉(zhuǎn)錄本或其復(fù)制中間體的至少一部分互補(bǔ)的序列，和在此互補(bǔ)列中不同位點(diǎn)上包含ii)多個(gè)核酶催化區(qū)域；和iii)任選的，與所述基因的轉(zhuǎn)錄本不互補(bǔ)的一種或多種序列，所述非互補(bǔ)序列插入在互補(bǔ)序列的兩個(gè)連續(xù)堿基間。
2.權(quán)利要求1的多核酶，其特征在于所述催化區(qū)源自榔頭型核酶或發(fā)夾型核酶或兩者的混合物。
3.權(quán)利要求2的多核酶，其特征在于每個(gè)催化區(qū)位于互補(bǔ)序列中相應(yīng)于所述基因轉(zhuǎn)錄本或其片斷中的XUX位點(diǎn)的位置。
4.權(quán)利要求3的多核酶，其特征在于互補(bǔ)序列中包含的催化區(qū)的數(shù)目等于或小于相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本或轉(zhuǎn)錄本片斷中存在的XUX位點(diǎn)的總數(shù)。
5.權(quán)利要求4的多核酶，其特征在于互補(bǔ)序列催化區(qū)的插入位點(diǎn)全部相應(yīng)于轉(zhuǎn)錄本中存在于相同病毒的不同毒株間或不同相關(guān)病毒間保守的同源性區(qū)域中的XUX位點(diǎn)。
6.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多核酶，其特征在于除催化區(qū)外，互被序列中含有一個(gè)或多個(gè)非互補(bǔ)序列，其插入在互補(bǔ)序列的兩個(gè)堿基間，這樣非互補(bǔ)列與互補(bǔ)序列形成共線插入。
7.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多核酶，其特征在于互補(bǔ)序列與選自下組的植物病毒的衣殼蛋白基因互補(bǔ)花椰菜花葉病毒組，如花椰菜花葉病毒(CaMV)；雙聯(lián)病毒組，如玉米線條病毒(MSV)；呼腸孤病毒科，如傷瘤病毒(WTV)；彈狀病毒科，如馬鈴薯黃矮病毒(PYDV)；蕃茄斑萎病毒(TSMV)；煙草花葉病毒組，如煙草花葉病毒(TMV)；馬鈴薯X病毒性，如馬鈴薯X病毒，馬鈴薯Y病毒組，如馬鈴薯Y病毒(PYV)荷蘭石竹潛伏病毒組，如荷蘭石竹潛伏病毒(CLV)；黃化病毒組，如甜菜黃病毒(BYV)；煙草脆裂病毒組，如煙草脆裂病毒(TRV)；大麥病毒組，如大麥條斑花葉病毒；蕪菁病毒組，如蕪菁黃花葉病毒(TYMV)；黃癥病毒組(Luteoviruses)，如大麥黃矮病毒或馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)；蕃茄絲矮病毒組，如蕃茄絲矮病毒(TBSV)；南方菜豆花葉病毒組，如南方菜豆花葉病毒(SBMV)；煙草壞死病毒(TNV)；蠕傳多面體病毒組，如煙草環(huán)斑病毒(TRSV)；豇豆花葉病毒組，如豇豆花葉病毒(CPMV)，豌豆耳突花葉病毒(PEMV)；黃瓜花葉病毒組，如黃瓜花葉病毒(CMV)；雀麥花葉病毒組，如雀麥花葉病毒；等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒組，如煙草線條病毒。
8.權(quán)利要求7的多核酶，其特征在于互補(bǔ)序列源自黃瓜花葉病毒的衣殼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本。
9.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多核酶，其特征在于，它由RNA組成。
10.含有編碼上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)之多核酶的序列的DNA序列。
11.一種提供植物對(duì)病毒抗性的方法，其特征在于，向植物中引入多核酶或編碼權(quán)利要求1－10中任一項(xiàng)之多核酶的序列。
12.權(quán)利要求11的方法，其特征在于，通過(guò)用編碼多核酶的DNA序列對(duì)植物的一部分進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化來(lái)引入多核酶，然后將轉(zhuǎn)基因植物再生。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于，用根瘤土壤桿菌或根毛土壤桿菌為媒介進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
14.抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于在其基因組中含有轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生權(quán)利要求1－9中任一項(xiàng)的多核酶的序列。
15.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，它對(duì)CMV有抗性。
16.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，它是甜瓜、黃瓜、筍瓜(courgette)、馬鈴薯、甜胡椒或菜豆。
17.權(quán)利要求14－16中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物的果實(shí)和種子。
18.用權(quán)利要求10的序列轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有核糖核酸內(nèi)切酶活性并能夠滅活病毒衣殼蛋白基因的，稱為多核酶”的核酸序列，其特征在于它包括(i)與所述基因或其轉(zhuǎn)錄本或其復(fù)制中間體的至少一部分互補(bǔ)的序列，和在此互補(bǔ)列中不同位點(diǎn)上包含(ii)多個(gè)核酶催化區(qū)域；和(iii)任選的，與所述基因的轉(zhuǎn)錄本不互補(bǔ)的一種或多種序列，所述非互補(bǔ)序列插入在互補(bǔ)序列的兩個(gè)連續(xù)堿基因。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1118609SQ94191308
公開(kāi)日1996年3月13日 申請(qǐng)日期1994年2月25日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月26日
發(fā)明者P·萊尼, P·普里茲, V·格魯伯, G·保多特, C·奧利沃 申請(qǐng)人:基因剪切公司