專利名稱：活細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有干燥的停滯態(tài)微生物細(xì)胞的組合物的制備方法、所述組合物及由該組合物制備的活培養(yǎng)物。
活培養(yǎng)物的貯存是本領(lǐng)域中公認(rèn)的難題。例如，美國(guó)專利3,897,307公開了(ⅰ)使用抗壞血酸鹽化合物和谷氨酸鹽或天冬氨酸鹽的組合物作為產(chǎn)乳酸細(xì)菌細(xì)胞的穩(wěn)定劑；(ⅱ)使用某些糖類，特別是濃度為每亳升樣品溶液25mg的肌醇，作為冰凍干燥所述細(xì)菌細(xì)胞時(shí)的低溫防護(hù)劑。
Mugnier等人(Applied and Environmental Microbiology，1985，pp108-114)公開了使用多糖凝膠與某些營(yíng)養(yǎng)物(如C1-3和C6-12化合物)組合作為冰凍干燥細(xì)菌細(xì)胞的基質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)，形成凝膠的多糖在冰凍干燥時(shí)并不收縮。
Redway等人(Cryobiology，1173-79，1974)考察了作為長(zhǎng)期存活的冰凍干燥細(xì)菌的培養(yǎng)基的某些單糖(濃度最高為150mg/2ml樣品)和有關(guān)的化合物。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，如果將微生物細(xì)胞懸浮于如下所限定的某些基質(zhì)中，并在某些條件下干燥，則其短期存活率提高；如果將上述干燥體系貯存起來(lái)，并在如下所限定的某些條件下再水化，則微生物細(xì)胞的長(zhǎng)期存活率提高。
我們還進(jìn)一步意外地發(fā)現(xiàn)，懸浮有微生物細(xì)胞的基質(zhì)的收縮并不導(dǎo)致短期存活率差。
本發(fā)明的第一方面提供了一種穩(wěn)定化的干燥組合物，該組合物含有懸浮于收縮基質(zhì)中的停滯態(tài)微生物細(xì)胞。
“穩(wěn)定化”是指微生物細(xì)胞的降解減少(所述降解會(huì)導(dǎo)致可恢復(fù)的活細(xì)胞的損失)。
“停滯態(tài)”是指細(xì)胞不進(jìn)行代謝、分裂或生長(zhǎng)(但如進(jìn)行適當(dāng)處理就可恢復(fù))。
“可恢復(fù)”是指細(xì)胞處于適當(dāng)條件下時(shí)(即在進(jìn)行再水化和有營(yíng)養(yǎng)源時(shí))能夠生長(zhǎng)和分裂。
“活細(xì)胞”是指細(xì)胞處于適當(dāng)條件下時(shí)(即在進(jìn)行再水化和有營(yíng)養(yǎng)源時(shí))能夠生長(zhǎng)和分裂。
“收縮”是指(1)基質(zhì)已發(fā)生收縮，孔隙度變小，使低分子量擴(kuò)散物幾乎不能穿透基質(zhì)，例如，基質(zhì)在暴露于潮濕空氣中時(shí)幾乎不吸水；和/或(2)基質(zhì)已經(jīng)歷了其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)以上的溫度，從而使其發(fā)生粘性流，導(dǎo)致表面積/體積比大大降低，并將細(xì)胞包封在低孔隙度的保護(hù)層中。
本發(fā)明的第二方面提供一種穩(wěn)定化干燥組合物的制備方法，所述組合物含有懸浮于基質(zhì)中的停滯態(tài)微生物細(xì)胞，所述方法包括如下步驟A.將微生物細(xì)胞與含有將衍生出基質(zhì)的材料的水性組合物混合；B.在能使材料發(fā)生粘性流并使基質(zhì)收縮但不會(huì)過(guò)分損傷細(xì)胞的條件下對(duì)上述混合物進(jìn)行干燥。
步驟B制得的組合物優(yōu)選在低于基質(zhì)的Tg的溫度下貯存，即，該組合物的Tg高于其預(yù)期的貯存溫度。
因此，優(yōu)選對(duì)步驟B制得的組合物進(jìn)行進(jìn)一步的干燥，即所謂“二次干燥”，以提高基質(zhì)的Tg，使組合物對(duì)更寬范圍的貯存條件穩(wěn)定化，即可在更高的溫度下貯存。
本發(fā)明的穩(wěn)定化干燥組合物所包含的微生物細(xì)胞優(yōu)選為細(xì)菌細(xì)胞，然而并不排除使用其他微生物細(xì)胞如真菌、酵母等的可能性。如果微生物細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，則優(yōu)選為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，但并不排除可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的可能性。可以提到的這類革蘭氏陰性細(xì)胞的例子有熒光假單胞菌、大腸桿菌及根際細(xì)菌等。
本發(fā)明方法的步驟A中制備的混合物中，微生物細(xì)胞的濃度為104-1013個(gè)/ml，優(yōu)選1010-1011個(gè)/ml。
本發(fā)明方法的步驟A中，與微生物細(xì)胞混合的材料是多羥基化合物，例如多元醇類，如甘露醇、肌醇、山梨醇、半乳糖醇，或優(yōu)選為碳水化合物，更為優(yōu)選的是一種糖。
如果該材料是一種糖，那么它可以是二糖、三糖、寡糖，或優(yōu)選為單糖。單糖的例子可以舉出己糖，如鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。二糖的例子可以舉出麥芽糖、乳糖、海藻糖和蔗糖等。三糖的例子可以舉出棉子糖。寡糖的例子可以舉出麥芽糖糊精。
本發(fā)明方法的步驟A中的混合物中，所用的多羥基化合物的濃度為10-1000mg/1010個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選200-400mg/1010個(gè)細(xì)胞。對(duì)特定的多羥基化合物而言，技術(shù)人員利用簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)就能找出能制得收縮基質(zhì)的多羥基化合物濃度。例如，我們發(fā)現(xiàn)肌醇的最佳濃度為約45mg/ml，它在60mg/ml以上引起大量細(xì)胞損傷，而在約25mg/ml以下則不收縮。
某些多羥基化合物在很寬的濃度范圍內(nèi)都具有保護(hù)性質(zhì)，而某些其他多羥基化合物則在某個(gè)臨界濃度以上具有有害作用，這個(gè)臨界濃度可能與多羥基化合物在水性介質(zhì)中的溶解度有關(guān)。
現(xiàn)參照附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這些附圖以舉例形式說(shuō)明了本發(fā)明的組合物。
附圖中


圖1以曲線圖形式說(shuō)明了在從水或0.04M MgSO4中冰凍干燥時(shí)，熒光假單胞菌的存活率隨肌醇(添加物)濃度的變化?？v軸代表以ppb表示的存活率(即1E＋09＝109ppb，1E＋08＝108ppb，等等)，橫軸代表每個(gè)樣品中添加物的濃度(mg)。曲線圖上的黑方塊(■)標(biāo)示硫酸鎂中的肌醇，圓圈(○)則標(biāo)示水中的肌醇。
圖2-7以曲線圖形式說(shuō)明了冰凍干燥的熒光假單胞菌的存活率隨一系列單糖的單糖濃度的變化。縱軸代表存活率(ppb)，以多少億表示(即1E＋0＝10億，5E－1＝5億，2E－1＝2億，等等)，橫軸代表每個(gè)樣品中的糖濃度(mg)。所示單糖有圖2半乳糖圖5 木糖圖3果糖 圖6 鼠李糖圖4葡萄糖圖7 甘露糖圖8以曲線圖形式說(shuō)明了細(xì)胞死亡率(k1)隨基質(zhì)Tg的變化以及Tg隨目對(duì)濕度的變化。左邊的縱軸代表k1，右邊的縱軸代表Tg(℃)，橫軸代表相對(duì)濕度(％)。曲線圖上由實(shí)線連接的黑方塊標(biāo)示細(xì)胞死亡率常數(shù)(k1)，由虛線連接的菱形則標(biāo)示玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)。
在圖中，存活率以每109個(gè)原始懸浮液中的活細(xì)菌中活細(xì)菌的數(shù)目表示，即，它代表每10億個(gè)原始活細(xì)菌中存活下來(lái)的細(xì)菌數(shù)目，以ppb存活率表示，即，109ppb等于100％存活，108ppb等于10％存活，等等。
由圖1可以看出，在低肌醇濃度下，細(xì)胞存活率得以維持，而在較高濃度下，例于大于100mg/樣品(等于50mg/ml)時(shí)，細(xì)胞存活率迅速下降。
由圖2-7可以看出，某些單糖在低濃度下，例如小于10mg/樣品(等于5mg/ml)時(shí)，能保護(hù)細(xì)胞不受損傷，而在高濃度下，例如約400mg/樣品(等于130mg/ml)時(shí)，這種保護(hù)作用基本得以維持。
由圖8可以看出，如果Tg降至貯存溫度(由上部21-22℃處的橫線表示)以下，則細(xì)胞死亡率(k1)明顯提高，這說(shuō)明了在貯存過(guò)程中維持玻璃態(tài)的重要性。
材料能起作用即能夠收縮又不過(guò)分損傷細(xì)胞的濃度，取決于多種因素，主要包括步驟A的懸浮液中細(xì)胞的體積份額；多羥基化合物的固有玻璃化轉(zhuǎn)變溫度；基質(zhì)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度隨其中的水濃度的變化；以及基質(zhì)在冰凍干燥過(guò)程中和冰凍干燥后所處的溫度。
應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，多羥基化合物可以起如下作用(ⅰ)在低溫下作為低溫防護(hù)劑，特別是在冰凍干燥過(guò)程中防止冰顆粒造成的損傷；(ⅱ)作為液體保護(hù)劑(lyo-protectant)，防止在干燥和/或貯存過(guò)程中由于失水而造成損傷；(ⅲ)在細(xì)胞恢復(fù)過(guò)程中作為營(yíng)養(yǎng)源。
用于本發(fā)明方法的微生物細(xì)胞可以在常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液或胰胨大豆培養(yǎng)液)中培養(yǎng)，可在任何方便的生長(zhǎng)期收集，優(yōu)選在靜止早期收集。
例如，將某一培養(yǎng)物培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基之內(nèi)或之上，例如液體或固體平板，得到所需的細(xì)胞濃度。一般用離心法分離細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在含有將形成基質(zhì)的材料的水性組合物中，該組合物任選含有下面提到的某些其他添加物。
優(yōu)選的是，從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離出本發(fā)明的方法中所用的微生物細(xì)胞，將其再懸浮于含多羥基化合物、合適的添加物等的溶液中，并進(jìn)行干燥，但并不排除將多羥基化合物和合適的添加物加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞中并干燥所得混合物的可能性。
如果重新懸浮微生物細(xì)胞，則最好重新懸浮在合適的水性介質(zhì)中，例如含有多羥基化合物的MgSO4溶液或優(yōu)選為水。
本發(fā)明方法的步驟B中的干燥可通過(guò)蒸發(fā)、真空干燥、噴霧干燥、空氣干燥等來(lái)進(jìn)行，優(yōu)選冰凍干燥。
如上所述，重要的是至少在干燥步驟即步驟B或任何后續(xù)步驟中達(dá)到粘性流。
步驟B中制備的干燥組合物的含水量一般低于15％w/w。
如果步驟B中的干燥包括冰凍干燥，則組合物中一般含有一種或更多種合適的添加物。可以舉出的合適添加物的例子主要有低溫防護(hù)劑，例如糖類或聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；液體保護(hù)劑，例如糖類或聚合物，如聚乙烯醇、聚乙二醇；或優(yōu)選為抗氧劑或所謂的增效劑，如抗壞血酸鹽或谷氨酸鹽，但并不排除存在其他添加物的可能性，例如所謂的填充劑，例如結(jié)晶糖類，如甘露醇；以及滲透壓調(diào)節(jié)劑，如甜菜堿、脲/三甲胺-N-氧化物、脯氨酸、肌氨酸。
現(xiàn)參照下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1-6這些實(shí)施例說(shuō)明基質(zhì)中含鼠李糖的本發(fā)明組合物。
在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(雙強(qiáng)度營(yíng)養(yǎng)液)中培養(yǎng)熒光假單胞菌，并在靜止早期用離心法進(jìn)行收集。將細(xì)胞濃縮液再懸浮于無(wú)菌水中，并加入足量的經(jīng)高溫滅菌的鼠李糖濃溶液，得到約200個(gè)裝在容量為5ml的冰凍干燥瓶中的等份試樣，總體積為4ml，終濃度為200mg糖/2×1010個(gè)細(xì)胞。
將冰凍干燥瓶放到冰凍干燥器的控溫架上，并將架溫調(diào)至-30℃，從而使瓶中的內(nèi)容物冰凍并使其溫度在2小時(shí)內(nèi)降至-28℃至-30℃。抽真空并進(jìn)行48小時(shí)的初步干燥。將架溫升至0℃，并令二次干燥進(jìn)行24小時(shí)。將瓶溫調(diào)至室溫并在真空下密封，然后從冰凍干燥器中取出。
將各瓶于4℃下貯存于真空(實(shí)施例1)或于21℃下貯存于控濕空氣中(實(shí)施例2-6)。
將樣品在無(wú)菌水中再水化，通過(guò)在水中連續(xù)稀釋繼而在金氏(King’s)B生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測(cè)定活細(xì)菌細(xì)胞數(shù)。利用最高稀釋度平板上菌落形成單位(cfu)的數(shù)目，計(jì)算出在冰凍干燥和貯存后每單位體積存活的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)。
冰凍干燥剛剛結(jié)束后細(xì)胞存活率為3×108ppb。
由4℃下真空貯存的細(xì)菌得到的結(jié)果示于表1。
表1
ND未測(cè)CT1為不含鼠李糖的對(duì)比試驗(yàn)。
從表1可以看出，鼠李糖基質(zhì)的存在大大提高了細(xì)菌的存活率。
由在21℃下貯存于控濕室中的細(xì)菌得到的結(jié)果示于表2。
由表2可以看出，即使在低相對(duì)濕度下，即實(shí)施例2與CT2相比較，糖的存在也大大提高了存活率。
實(shí)施例7-10這些實(shí)施例說(shuō)明基質(zhì)中含鼠李糖和硫酸鎂的本發(fā)明組合物。
重復(fù)實(shí)施例1-6的步驟，但將細(xì)胞濃縮液再懸浮于0.04M硫酸鎂而非無(wú)菌水中，然后再加入鼠李糖溶液。
冰凍干燥剛剛結(jié)束后細(xì)胞存活率為5×108。
將冰凍干燥細(xì)胞于表3所示的溫度下貯存表3所示的時(shí)間。
表3
由表3可以看出，該制劑在一定范圍的溫度內(nèi)能提供實(shí)質(zhì)性的保護(hù)作用。
實(shí)施例11-15這些實(shí)施例說(shuō)明基質(zhì)中含有抗壞血酸鈉和谷氨酸鈉的本發(fā)明組合物。
重復(fù)實(shí)施例1-6的步驟，所不同的是，在再懸浮于水和鼠李糖中的細(xì)胞中加入濃抗壞血酸鈉和谷氨酸鈉水溶液。
冰凍干燥剛剛結(jié)束后細(xì)胞存活率為2×108ppb。
樣品于21℃下貯存于濕空氣中。
表4
由表4中的實(shí)施例11和12可以看出，在低于基質(zhì)Tg的溫度下貯存干燥細(xì)胞，能使細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定。
結(jié)果表明，玻璃態(tài)的收縮基質(zhì)與所含的抗氧劑組合使基質(zhì)能使活細(xì)胞在較為嚴(yán)酷的環(huán)境下長(zhǎng)期穩(wěn)定。
實(shí)施例16用離心法從培養(yǎng)基中分離出含有5×1012個(gè)活細(xì)胞的4g熒光假單胞菌細(xì)胞沉淀，將其與14g商業(yè)級(jí)麥芽糖糊精(Glucidex IT19)和1.6g抗壞血酸鈉混合，將該材料在初始為室溫下減壓干燥，其中所蒸發(fā)出的水冷凝到維持在-50℃的冰阱上。
約18小時(shí)后停止干燥，此時(shí)真空度為1毫巴左右。
樣品經(jīng)用純水再水化并在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)后，活細(xì)胞恢復(fù)率一般為50-90％。
該方法制得的材料以收縮無(wú)定形基質(zhì)的形式存在，其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度超過(guò)20℃(當(dāng)樣品處于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度時(shí))。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定化干燥組合物，該組合物包含懸浮于收縮基質(zhì)中的停滯態(tài)微生物細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述微生物細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述革蘭氏陰性細(xì)胞是熒光假單胞菌、大腸桿菌或根際細(xì)菌。
5.一種制備穩(wěn)定化干燥組合物的方法，所述組合物含有懸浮于基質(zhì)中的停滯態(tài)微生物細(xì)胞，所述方法包括如下步驟A.將微生物細(xì)胞與含有將衍生出基質(zhì)的材料的水性組合物混合；B.在能使材料發(fā)生粘性流并使基質(zhì)收縮但不會(huì)過(guò)分損傷細(xì)胞的條件下對(duì)上述混合物進(jìn)行干燥。
6.權(quán)利要求5的方法，其中對(duì)步驟B制得的組合物進(jìn)行進(jìn)一步的干燥，以提高基質(zhì)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，使組合物對(duì)更寬范圍的貯存條件穩(wěn)定化。
7.權(quán)利要求5的方法，其中步驟A中制得的混合物中微生物細(xì)胞的濃度為104-1013個(gè)/ml。
8.權(quán)利要求7的方法，其中細(xì)胞濃度為1010-1011個(gè)/ml。
9.權(quán)利要求5的方法，其中該方法的步驟A中與微生物細(xì)胞混合的材料是多羥基化合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中多羥基化合物為單糖。
11.權(quán)利要求9的方法，其中步驟A的混合物中所用的多羥基化合物的濃度為10-1000mg/1010個(gè)細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中多羥基化合物的濃度為200-400mg/1010個(gè)細(xì)胞。
13.按權(quán)利要求5制備的組合物，該組合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高于其預(yù)期的貯存溫度。
全文摘要
將微生物細(xì)胞穩(wěn)定化，以便以干燥組合物的形式以懸浮在收縮基質(zhì)中的停滯態(tài)貯存。該組合物的制備方法是將微生物細(xì)胞如革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞(例如熒光假單胞菌)與一種含有將衍生出基質(zhì)的多羥基化合物(優(yōu)選糖類)的水性組合物混合物，并在能使多羥基化合物發(fā)生粘性流并使基質(zhì)收縮但不過(guò)分損傷細(xì)胞的條件下干燥上述混合物?；|(zhì)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度最好高于組合物的貯存溫度。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1121731SQ9419190
公開日1996年5月1日 申請(qǐng)日期1994年4月18日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月28日
發(fā)明者D·K·羅德漢姆, J·B·坎特韋爾 申請(qǐng)人:曾尼卡有限公司