專利名稱：低溫失活的工業(yè)用面包酵母的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種研制具有Lti特性的工業(yè)用面包酵母菌株的方法，根據本發(fā)明方法研制的酵母菌株，所說菌株在制備烤制用生面團中的應用，制備含有這些酵母菌株之一的冷卻烤制用生面團的方法以及根據本發(fā)明方法制備的烤制用生面團。
已知用酵母發(fā)酵的烤制用生面團的口味和質地比用化學試劑發(fā)酵的生面團有許多優(yōu)點。商業(yè)上銷售的面包房產品也是已知的。例如制作面包卷和croissants的生面團，這些產品在發(fā)酵和焙烤前打算保存在冰箱中，不過它們含有化學發(fā)酵劑。
相應地，EP0,487,878描述了具有Lti特性的作為發(fā)酵劑的酵母菌株在制備制面包產品(其在冷藏后放在爐子中烘烤)中的應用，換句話說Lti特性是在冷藏期間活性非常低但在這些溫度下能存活的特性(Lti是英語表達“低溫失活”的首字母縮略詞)。然而這些酵母太旺盛，即是說在稍高的冷卻溫度即8-12℃之間，或甚至于14℃時釋放太多的氣體，事實上，有時在通常的工業(yè)貯存冷藏產品條件下過長時間后普遍能觀察到這種現象。這種活力尤其應歸因子這些菌株中MAL等位基因的存在，該等位基因是活化的并且不受分解代謝途徑的阻遏，而且這種活力還歸因于未足夠選擇這些菌株的Lti特性。最終，這些酵母就不能最佳地順利地響應其工業(yè)生產所需的所有條件，例如良好的干燥性能或高的生長率。
另外，WO93/01724和EP0,556,905描述了具有與EP0,487,878中所述相似特性的酵母菌株的應用。但是，所描述的菌株屬于Lts突變體類型(Lts是英語表達“低溫敏感性”的首字母縮略詞；Singh等人，1974，Genetics 77，651-659)，其通常在冷卻溫度下快速地喪失其生活力。此外，這些酵母適應最佳工業(yè)生產及應用的能力很差。的確，它們是單倍體和營養(yǎng)缺陷型實驗室酵母，其在傳統(tǒng)的工業(yè)用培養(yǎng)基上幾乎不能生長。此外，與那些工業(yè)用制面包酵母菌株例如“Levure de boulangerie bleue”(LBB)(藍面包酵母)(Lesaffre，France)相比，這些酵母在上述培養(yǎng)基上的生長潛力和生產率可能很低。而且，這些菌株的遺傳穩(wěn)定性可能也不足以適應其工業(yè)生產。的確在一些生產中有失去Lts特性的危險。最后，這些菌株幾乎不能在與一種工業(yè)用面包酵母菌株能生存的干燥方式相同的傳統(tǒng)干燥過程中存活。
WO93/01724還描述了一種制備含有作為發(fā)酵劑的Lts酵母的包裝好的且冷藏過的烤制用生面團的方法。在該方法中，通過將所說酵母至少與面粉和水混合來制備所說生面團，然后將該生面團放入到一個容器中并密封，然后在所說的生面團在保持于冷卻溫度的所述容器中發(fā)酵。從而獲得了含有冷卻生面團的密封容器，其中在該容器貯存于低溫的整個過程中所述Lts酵母實際上應該是失活的。
但是，由于各種原因該方法不是令人滿意的。首先，在打開容器過程中，由于減壓可觀察到生面團快速膨脹。不幸的是，這種膨脹趨于毀壞生面團的傳統(tǒng)質地。
此外，Lts酵母在稍高冷卻溫度即所說的8至12℃或者甚至于14℃溫度下能釋放太多的氣體和氣味，事實上在工業(yè)貯存冷卻產品的常規(guī)條件下常常能觀察到這種狀況。從而，在貯存幾個星期以后，該容器的內部壓力就可能有引起容器爆炸的危險。再者，在生面團和容器的大氣中存在的氣味的濃度也具有改變生面團的傳統(tǒng)嗅味以及感觀質量的危險。
另外，在較低冷卻溫度，即所說的最高達8℃時，推測所述酵母沒有釋放使容器內壓力急劇升高的氣體，從而沒有釋放出氣味。于是，推測這些氣味主要是在生面團發(fā)酵期間產生的，發(fā)酵之后幾乎沒有氣味產生。相應地，由于氣味本性上是不穩(wěn)定的，所以在貯存期間生面團也可快速地失去其感觀質量。
最終，在生面團發(fā)酵期間酵母被高度激活，并且簡單地通過將含有這些酵母的生面團貯存于冷卻溫度下因而帶來了酵母易失活的麻煩。的確，此后酵母具有高度活躍的發(fā)酵代謝作用。
因而，在生面團的整個保存期間，促進酵母發(fā)酵的氣味特性的出現，但是不要超出一定的濃度是有利的。還能消除由于容器的內部壓力而強制產生的限制也是十分有利的。
本發(fā)明的主題是克服了現有技術中的缺點，從而提供了一種研制具有Lti特性的工業(yè)用面包酵母菌株的方法，以及一種制備含有所說酵母菌株的冷卻的烤制用生面團的方法。
為此，在研制具有Lti特性的工業(yè)用面包酵母菌株的方法中，首先將具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株與至少具有一個MAL等位基因的單倍體釀酒酵母菌株進行雜交，所述等位基因是活化的但受分解代謝抑制，然后在第二階段，將分離的后代雜交，最后，選擇出一種具有Lti表現型，具有一種活化的但受分解代謝抑制的Mal表現型并且具有在分批補料發(fā)酵方法中生長的潛力的原養(yǎng)型二倍體菌株。
在利備冷藏的包裝好的烤制用生面團的方法中，通過將本發(fā)明的酵母至少與水和面粉混合來制備所述生面團，然后將該生面團包裝在具有排氣閥門的容器中。
詞語“MAL等位基因”在本發(fā)明說明書中是指一種復合基因，該基因是編碼三種功能即α-葡糖苷酶、一種透性酶和一種調節(jié)蛋白的MAL基因族的一部分。詞語“活化的但受分解代謝抑制的MAL等位基因”是指一種MAL等位基因，其功能的表達是例如受培養(yǎng)基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制(稱為誘導型MAL等位基因)，或是指一種MAL等位基因，其能表達其功能但它的功能本身例如受培養(yǎng)基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制(稱為組成型MAL等位基因)。
另外，詞語“生長潛力”是指由工業(yè)生產上可使用的方法，尤其是由傳統(tǒng)的面包酵母培養(yǎng)方法，已知稱之為分批補料法(在通氣條件下將糖溶液慢速地逐漸地加入到一種懸浮液中，以便避免在生物量產生期間形成乙醇并且達到最大產量)培養(yǎng)時具有高產量及高生產率的能力。
此外，術語“原養(yǎng)型”是指在僅含有碳源，氮源、磷酸鹽或硫，微量元素以及微量維生素的培養(yǎng)基上繁殖的酵母。該培養(yǎng)基也稱為“基本培養(yǎng)基”。
另外，詞語“冷卻溫度”是指所有低于或等于12℃的溫度，在該溫度下生面團不會凍結。
最后，在其余的描述中，術語“生面團”或“烤制用生面團”是指傳統(tǒng)的烤制用生面團，例如匹薩(pizza)生面團，面包生面團或croissant生面團。特別是這些生面團含有至少適當量的例如小麥面粉，鹽類，油和水。
于是，可以研制具有在冷卻溫度下的生面團中失活但存活的特性甚至在更高的溫度，即最高達18℃下實際仍失活的特性的出乎意料的Lti面包酵母菌株。
這些面包酵母菌株還具有更適合于工業(yè)上使用的特性。因此這些菌株具有類似于或甚至于等同于商品工業(yè)菌株例如LBB酵母的生長產率。這些菌株還出乎意料地適用于為了其保存目的而進行的干燥過程中，而在再水合后并不以顯著方式失去其活性。最后，還應注意到這些菌株與其Lti特性相關的令人驚奇的遺傳穩(wěn)定性。
最終，使用制備本發(fā)明所述生面團的方法，可以避免與容器內部壓力相關的所有缺陷。因而可以使用更具柔韌性的包裝材料。并且，由于酵母的殘留活性(所述酵母在整個保存期間產生氣味但并未使生面團復活(rise))，還由于貯存期間產生的過量氣味外溢至包裝之外而改善了生面團的口味。
最終，在其貯存期間，生面團為氣體所飽和，從而可直接烘烤該生面團，因為生面團中氣體的存在足以使之在烘烤時復活。從而避開了發(fā)酵生面團的預備階段。
為了實現研制具有Lti特性的酵母菌株的本發(fā)明方法，首先將具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株與至少具有一個活化的但受分解代謝抑制的MAL等位基因的單倍體釀酒酵母菌株雜交。
為了達到該目的，可以選擇一種具有良好Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株，所述Lti特性即是在例如3至10℃之間，較好的是在10℃以上時能失活。
還可以選擇一種含有至少一個受分解代謝抑制的誘導型MAL等位基因的釀酒酵母菌株，所謂誘導型是指在工業(yè)培養(yǎng)基中栽培的該酵母其組成上并不存在α-葡糖苷酶。的確，這些培養(yǎng)基包含作為主要糖類的引起分解代謝抑制作用的糖類，例如葡萄糖和/或蔗糖。另一方面，在烤制用生面團中，僅當酵母已缺失引起分解代謝抑制的糖類時，該酵母才合成α-葡糖苷酶以便于利用生面團的麥芽糖。從而可以選擇例如MAL2、MAL3或MAL6等位基因。
此外，受分解代謝抑制的MAL等位基因也是組成型的，即α-葡糖苷酶天然地存在于酵母中，盡管受培養(yǎng)基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制。在烤制用生面團中，僅當該酵母已缺失引起分解代謝抑制的糖類時該酵母才直接利用生面團的麥芽糖。因此可以選擇例如MAL2-8c等位基因。
然后使來源于首次雜交的二倍體子代在傳統(tǒng)的孢子形成培養(yǎng)基上形成孢子，以獲得單倍體分離子代。在該階段，通過在包含作為唯一碳源的麥芽糖的培養(yǎng)基，例如YPM-瓊脂培養(yǎng)基(見培養(yǎng)基部分)上培養(yǎng)，可以核驗單倍體分離子代的Mal特性。還可以例如通過在8-10℃的冷卻溫度下在YPD-瓊脂培養(yǎng)基上(見培養(yǎng)基部分)至少培養(yǎng)21天而檢驗單倍體分離子代的Lti特性。至少三星期后，根據沒有可見的細胞生長而鑒定出存活的但仍保持相對失活狀態(tài)的Lti菌落。事實上，Lti候選株沒有可見細胞生長相當于親代非Lti單倍體菌株充分生長。
然后，在第二階段，在合適培養(yǎng)基上相對性別的分離子代進行相互雜交。因此可將從相同的首次雜交獲得的分離子代進行雜交，或將從不同的首次雜交獲得的分離子代進行雜交，即是說，各自具有可能為不同親本的，以及其親本之一可能是相同的兩個分離子代進行雜交。從而獲得了具有各種各樣特性的大量的二倍體酵母菌株。
例如將二倍體酵母培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基上可以檢驗其原養(yǎng)型特性。通過在例如YPM-瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)也可檢驗Mal表現型。因而從其親本遺傳了一個或多個受分解代謝抑制的MAL基因的酵母可以利用麥芽糖，并且然后由培養(yǎng)基中存在的pH指示劑顯示這一特性。使之在例如合適的培養(yǎng)基上形成孢子也可檢驗酵母的二倍體性狀。最后，通過例如在8℃的冷卻溫度下將其在YPD-瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天可檢驗二倍體菌株的Lti特性。在這種情況下，Lti菌株在該培養(yǎng)基上生長非常緩慢。
結果，在這些二倍體酵母菌株中篩選出一種具有Lti表現型，具有活化的但受分解代謝抑制的Mal表現型以及具有在分批補料方法中的生長的潛力的原養(yǎng)型菌株。
在該階段，因而可選擇比前面階段所用的更嚴格更精確的篩選標準。從而可以通過檢測菌株在例如8-14℃溫度下幾天之內在烤制用生面團中產生的CO2量而篩選特定的Lti特性。
也可以根據其在分批補料方法中的生長能力來篩選所說的二倍體菌株，即將其培養(yǎng)于要求酵母具有碳源呼吸代謝作用能力的培養(yǎng)基上。
從而通過使用本發(fā)明研制的方法，可以研制具有顯著Lti特性的酵母菌株。的確，對MAL基因的抑制使生面團中存在的酵母的活性延遲產生，所述生面團處于其中所述酵母又具有潛在活性的溫度下。這種延遲作用實際上可由下列事實解釋，即酵母在能夠利用麥芽糖之前必須首先利用引起分解代謝抑制作用的糖類，并且這些糖類存在的量不足以確保酵母的最適發(fā)酵活性。
另外，當Lti酵母具有誘導性的但受分解代謝抑制的MAL等位基因時，這種延遲作用甚至更大，因為事實上當酵母已經利用了引起分解代謝抑制的糖類之后，必須另外合成能具有利用麥芽糖的功能的產物。結果Lti酵母對冷藏溫度以上的溫度變化更不敏感。
因此這些酵母可用于制備冷卻保藏以后在爐子上烘烤的面包房產品。
因而可以制備在分批補料發(fā)酵過程中具有高于0.5克干生物量/每克糖的生長產率以及在最高達8℃溫度時CO2產生量低于7ml/小時/每kg生面團，最高達12℃時CO2產生量低于12ml/小時/每kg生面團的工業(yè)用面包房釀酒酵母菌株。該酵母在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，在最高至18℃時具有的CO2產生量還低于10ml/每克濃縮酵母。
還可以篩選例如在最高至12℃溫度時CO2產生量低于3ml/小時/每kg生面團的酵母菌株。
在以上獲得的各個釀酒酵母菌株中，其中兩個菌株作為例子，已按布達佩斯條約規(guī)定，于94年1月28日保存于NationalCollection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，P.O.Box 31，135 Abbey Road，ABERDEEN AB98DG，Scotland(英國)，兩菌株的保藏號為NCIMB 40611和40612。
菌株NCIMB 40611還有下列特征-形態(tài)學為大小相對均勻的橢園形細胞。
-發(fā)酵特性為能發(fā)酵蔗糖、葡萄糖和麥芽糖的酵母。
同樣，菌株NCIMB 40612具有下列特性-形態(tài)學為大小相對均勻的橢園形細胞。
-發(fā)酵特性為能發(fā)酵蔗糖、葡萄糖和麥芽糖的酵母。
在制備本發(fā)明所述的冷卻的包裝好的烤制用生面團的方法中，通過將本發(fā)明所說的一種酵母至少與水和面粉混合制備一種生面團，然后將該生面團包裝于含有排氣閥門的容器中。
從而可以在冷藏溫度下混合然后包裝生面團。
該容器中的大氣也可由一種惰性氣體如氮氣或二氧化碳單獨組成或由其混合而成。例如通過抽真空從容器中吸出氧氣，然后注入惰性氣體，隨后密封所說容器來制造所述大氣環(huán)境。這種大氣環(huán)境特別能避免真菌繁殖。
具體地講，還可以將所述酵母與生面團混合，所述酵母量為0.1-1％的濃縮或再水化酵母的干物質量。
此外，這些酵母可以含有海藻糖。并且可向生面團中加入1.2-2％NaCl，以便減少天然生面團菌叢的過分繁殖。
本發(fā)明所述的冷藏生面團具有用傳統(tǒng)面包酵母發(fā)酵的并具有上面所述相同組成的生面團所特有的質地和口味。但是當后者在正常冷藏溫度下保存2-60天時優(yōu)選本發(fā)明的冷藏生面團。
下面列舉的實施例是為了說明研制Lti菌株的方法，制備本發(fā)明所述生面團的方法，由該研制方法獲得的Lti菌株，以及由本發(fā)明制備方法得到的包裝好的冷藏生面團。
除非另有說明，所述百分數是指重量百分數。在描述各個實施例之前先描述各種試驗，各種培養(yǎng)基的組分以及附圖的簡要說明。
試驗1.生面團中CO2的產生量為了實施該試驗，制備用作為培養(yǎng)基的烤制用生面團。該生面團包含60.2％面粉，29.2％水，1.4％NaCl，7.2％花生油，以及2％Lti酵母(其中含15％干物質)。所有成分保存于4℃，并且在4-8℃之間制備該生面團。
為此，首先將含30％干物質的幾克Lti酵母懸液置于50mlFalcon管中，并加入相同量的水，以得到含15％干物質的懸液，然后振蕩整個試管而制備一種均勻酵母懸液。接著，將上述面粉和鹽混合，然后加入花生油和水，最后加入Lti酵母懸液。最后，拌合該生面團，直到不再粘滯，但不要操作過長時間。從而獲得了一種光滑生面團。然后取出100克的這種生面團轉移到Risograph(RDesign，USA)，然后立即檢測放出的CO2。
首先在8℃每隔1小時檢測放出的氣體，共檢測120小時。然后將溫度升高到12℃，并每隔1小時檢測放出的氣體，共檢測120小時。最后，將溫度升高到30℃，并每隔10分鐘檢測放出的氣體，共檢測6小時。然后計算每一溫度時氣體形成的起始斜率(ml/h/kg生面團)而測出酵母活性。
2.生長能力該試驗目的是為了篩選與工業(yè)用酵母菌株具有相似生長能力的酵母菌株。
為此，將酵母菌株培養(yǎng)于一種培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基誘導與在分批補料發(fā)酵法中培養(yǎng)的菌株相類似的代謝作用。的確，已知在傳統(tǒng)的分批補料發(fā)酵法中，酵母通過呼吸代謝途徑同化碳源，它們很少積累或不積累乙醇或乙酸鹽，并且它們還能通過呼吸途徑非?？焖俚貙⒁掖蓟蛞宜猁}再同化。從而通過將其在需要酵母能完成碳源的呼吸代謝途徑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)而篩選出所需酵母。
為了上述目的，將酵母培養(yǎng)于錐形瓶(含有促進培養(yǎng)基通氣的擋板)中，該瓶中裝有包含作為碳源的乙醇和乙酸鹽的YNEA培養(yǎng)基。為了模擬常規(guī)的工業(yè)培養(yǎng)基如含有糖蜜的培養(yǎng)基，加入小量酵母提取物。再者，用琥珀酸鹽和鹽酸將培養(yǎng)基的pH值緩沖到4，以有利于乙酸鹽以其酸形式存在。
在該試驗中，將檢測的酵母于30℃在5ml YPD培養(yǎng)基中預培養(yǎng)，并在30℃以約190轉/分鐘(rpm)的轉速攪拌12小時。然后，將1 ml預培養(yǎng)物接種到100ml YNE培養(yǎng)基(裝在含有擋板的500ml錐形瓶中)上，并于30℃攪拌(190rpm)培養(yǎng)24小時。最后，將前面的培養(yǎng)物接種于100ml YNEA培養(yǎng)基(裝于含有擋板的500ml錐形瓶中)，接種量為使培養(yǎng)液OD600接近于0.1，在30℃攪拌培養(yǎng)10小時，每隔2小時檢測OD600。
然后，選擇具有最佳生長曲線的菌株。從而篩選起始生長速率至少相當于LBB菌株的65％，優(yōu)選接近于或相當于對照LBB菌株的100％的菌株。
3.分批補料培養(yǎng)法的產率在分批補料發(fā)酵的工業(yè)生產條件下培養(yǎng)選出的酵母。
為此，首先將酵母于30℃振蕩培養(yǎng)于各含有400ml YPD培養(yǎng)基的幾個容器中，然后無菌條件下將3升前面的培養(yǎng)物接種于含有8升“原糖蜜”培養(yǎng)基(見“培養(yǎng)基”部分)的一個30升發(fā)酵罐(Chemap，瑞士)。最后，根據傳統(tǒng)分批補料方法進行發(fā)酵，即在30℃攪拌(250-450rpm)及增加通氣量(0.02-0.8m3/小時)的條件下培養(yǎng)24小時，通過加入適當量的NH4OH而使pH維持在4.5，通過加入增大量的消沫劑如Contraspum 210(1.5％重量/培養(yǎng)基體積；Binggeli-Chemie，瑞士)而控制所產生的泡沫，并且有規(guī)模地加入適當的加大量的“糖蜜”培養(yǎng)基，直至終體積為約22升。
最終，在無菌條件下將最后發(fā)酵產物轉移到一個300升發(fā)酵罐(Chemap，瑞士)中，并且再進行一個分批補料發(fā)酵階段，即在30℃，攪拌(240-350rpm)和增加通氣量(0.2至10m3/h)條件下培養(yǎng)28小時，通過加入適當量的NH4OH而使pH維持于4.5，通過加入增大量的消沫劑如Contraspum(5％重量/體積)而控制產生的泡沫，并且有規(guī)律地在26小時內加入適當的增大量的“糖蜜”培養(yǎng)基，直至終體積為約180升。
在發(fā)酵的最后2小時內，不再進一步加入糖蜜；從而降低培養(yǎng)基中殘留的底物量，以避免在冷藏溫度下促進酵母生長的糖類的存在。
最后，由此也有利于酵母中海藻糖的形成。該貯存糖對于在傳統(tǒng)干燥過程中提高酵母的存活力是十分重要的。
下面表1描述了在30和300升發(fā)酵過程中作為時間的函數所加入的“糖蜜”培養(yǎng)基的量。
表1<
<p>然后將300升發(fā)酵罐培養(yǎng)物冷卻到12℃，之后離心(Westfalia離心機)直至獲得約20％干物質，然后將沉淀酵母重懸于水中。然后再將該懸液離心，在這次離心期間用約300-400升無菌水/100升懸液洗滌該生物質(biomass)。
在此階段，可加入維生素C，以便降低生物質的氧化。維生素C還具有將pH降至4.4的優(yōu)點。
最后，將生物質離心(“De Laval”離心機)以除去雜質，直到獲得28％干物質。然后擠壓(Bücher壓榨機)所說生物質直到獲得34-35％干物質。從而獲得濃縮的酵母。
然后可測定酵母的生長產率。為此，測定獲得的干生物質量，相當于發(fā)酵期間加入的糖類的量(主要是存在于糖蜜中的蔗糖)。
4.遺傳穩(wěn)定性具有如Lti特性的一種特定特征的酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性是該菌株適于工業(yè)化使用的決定性因子。
為了評估該穩(wěn)定性，對Lti特性的回復突變型進行研究。為此，用工業(yè)分批補料方法將細胞培養(yǎng)物中的約108個細胞置于含YPD培養(yǎng)基的10個培養(yǎng)皿上平板培養(yǎng)，將培養(yǎng)皿在8℃培養(yǎng)，然后，檢查約4星期后此溫度下產生的菌落。
5.在一個溫度梯度下CO2的產生量在為此而特別設計的儀器中進行該試驗，該儀器包括例如具有不同溫度的腔室的溫度梯度裝置，在其中可放入發(fā)酵管的底端。這些管具有封閉和有刻度的上端，以及從側面分枝出的膨脹瓶。由酵母產生的CO2積累在每個管的有刻度的上端，被積累的氣體置換的培養(yǎng)基可能進入到膨脹瓶中。
為了進行該試驗，將2ml在YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜的待測菌株培養(yǎng)物接種于含200ml的含有0.67％的無氨基酸氨源(nitrogen base)例如由Difco公司市售的商品名為“無氨基酸酵母氮源”的產品，如0.5％酵母提取物，2％蔗糖、1％琥珀酸鈉以及調節(jié)pH至4.5的濃鹽酸的第一種培養(yǎng)基的500ml瓶中。在30℃攪拌培養(yǎng)24小時。
通過在20℃以6000gn離心5分鐘來分離細胞，并將其懸浮于含200ml的含有0.67％無氨基酸氮源，0.3％酵母提取物和0.3％蔗糖，1％琥珀酸鈉和為將pH調至4.5的濃鹽酸的第二種培養(yǎng)基的500ml瓶中。在30℃攪拌培養(yǎng)24小時。
在4℃，以6000gn離心5分鐘而將細胞分離，用50ml蒸餾水將所得的沉淀的酵母細胞洗滌兩次。
將細胞懸浮于10ml蒸餾水中，并將其轉移至有刻度的并預先稱重的15ml聚丙烯管中。在4℃，以3000gn將其離心10分鐘。將試管中水排干，稱酵母沉淀物的重量，并將其以每毫升中加入相當于具有干物質量約27％的0.5克濃縮酵母的0.61克酵母沉淀物的量懸浮到第三種培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有0.67％無氨基酸氮源，2％麥芽糖，1％琥珀酸鈉和濃鹽酸，以將pH調到4.5。將0.5-3ml懸液(溫度＞10℃檢測)或1-3ml(溫度＜10℃檢測)懸液加到上面描述的發(fā)酵管中。每個發(fā)酵管中預先裝有50ml所述第三種培養(yǎng)基，換句話說，是含有糖蜜的培養(yǎng)基，并將其冷卻到4℃。
在所需溫度以及在上面描述的溫度梯度裝置中培養(yǎng)發(fā)酵管。在將試管放入聲波振蕩浴中幾秒鐘后，在選定的時間間隔內觀察生成的CO2，以便使釋放出的CO2氣泡進入液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基除非另有說明，給出的化合物的百分數為重量/體積百分數。YPM-瓊脂1％“Difco Bacto酵母提取物”。
2％“Difco Bacto胨”。
2％麥芽糖。
2％“Difco Bacto瓊脂”。
0.9％體積/體積(V/V)的溶解于純乙醇中的0.4％(V/V)Bromcresol Red溶液。YPD 2％“Difco Bacto胨”。
1％“Difco Bacto酵母提取物”。
2％葡萄糖。YPD-瓊脂含有2％“Difco Bacto胨”的YPD。YNE 0.67％“Difco無氨基酸酵母氮源”。
0.5％“Difco Bacto酵母提取物”。
1％琥珀酸二鈉。
1.12％(V/V)5M HCl。
0.7％(V/V)乙醇。YNEA 加0.3％(V/V)冰醋酸的YNE。前糖蜜 含有前糖蜜培養(yǎng)基的起始分批補料發(fā)酵培養(yǎng)基，它具有下列組分100kg 的軟化水263g (NH4)2HPO462gMgSO48.6g NaCl
7.82gCaCl217g 肌醇0.84g泛酸鈣0.006g 生物素糖蜜 84.85％無菌糖蜜(Aarberg，瑞士)。
13.85％水。
1％H2SO4。
按下列方式將糖蜜滅菌。在80℃熱處理30分鐘而誘導污染的孢子繁殖，在室溫使其繁殖20小時，在125℃滅菌2分鐘。然后冷卻之后離心(Westfalia離心機)分離沉淀。
附1表示對于菌株NCIMB 40611，40612和Hindelbank面包酵母，100克含有1％濃縮酵母的生面團在8℃，12℃和30℃時產生的CO2含量與時間的函數關系。
圖2和3表示菌株NCIMB 40612(圖2)和“Levure deboulangerie bleue”(藍面包酵母)(LBB，用于比較，圖3)在含糖蜜培養(yǎng)基上產生的CO2含量與溫度及持續(xù)時間之間的三維函數關系圖。
實施例1具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株，例如具有MATα、mal3，lts500基因型的NCIMB 40613菌株用作為起始材料。該菌株按布達佩斯條約規(guī)定于94年1月28日保藏于National Collection ofIndustrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，P.O.Box31，135 Abbey Road，ABERDEEN AB98DG，蘇格蘭(英國)。
將該菌株與包含活化的但受分解代謝抑制的并且是誘導型的MAL等位基因的單倍體釀酒酵母菌株，尤其是具有MATa，trp5，ade7，ade1，MAL6基因型的NCIMB 40614菌株進行雜交，該菌株已按布達佩斯條約規(guī)定于94年1月28日保藏于上面描述的保藏機構。
使二倍體酵母形成孢子，分離單倍體的孢子，然后用傳統(tǒng)方法鑒定其性別類型，通過在8℃YPD-Agar培養(yǎng)基上培養(yǎng)鑒別其Lti表現型，在YPM-Agar培養(yǎng)基上培養(yǎng)鑒別其Mal表現型。然后將相反性別的分離子代相互雜交。
然后篩選二倍體原養(yǎng)型酵母菌株。并也在YPM-Agar培養(yǎng)基上培養(yǎng)而檢查Mal表現型。最后，通過檢測上面描述的烤制用生面團中菌株的CO2產生量而篩選Lti特性，并根據前面的“生長潛力”試驗培養(yǎng)酵母而檢測其在分批補料發(fā)酵法中的生長能力。然后選出起始生長速率大于對照LBB菌株65％的菌株。
在由此獲得的各種菌株中，以上面介紹的NCIMB 40611菌株作為舉例進行了保藏。
該菌株具有顯著的Lti特性。正如在描述根據“生面團中CO2產生量”試驗獲得的結果的

圖1中所看到的那樣。在3和12℃之間時該菌株實際上是失活的。的確，在3-12℃溫度時它的CO2產生量低于3ml/h/kg生面團。還觀察到在30℃時產生的CO2量快速上升。
此外，在“在溫度梯度下產生的CO2量”試驗中獲得的結果表明在最高至18℃時在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天之后，該菌株不釋放任何氣體。
另外，該菌株的起始生長速率相當于LBB酵母的66％，并且在根據前面描述的檢測法，該菌株在分批補料方法中的生長產率相當于以同樣方式測出的LBB菌株的生長產率，就是說0.5g干生物量/每克糖。
最后，根據上面描述的對遺傳穩(wěn)定性的檢測未發(fā)現回復突變型。因而該菌株實際上是穩(wěn)定的。
實施例2以具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株，例如具有MATα、mal3，lts 500基因型的NCIMB 40613菌株作為起始材料。該菌株已根據布達佩斯條約于94年1月28日保藏于National Co1lection ofIndustrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，P.O.Box31，135 Abbey Road，ABERDEEN AB98DG，蘇格蘭(英國)。
將該菌株與包含活化的但受分解代謝抑制并且是組成型的Mal等位基因的單倍體釀酒酵母菌株，尤其是具有MATa，leu2，trp1，ura3，NAL2-8c，MAL3基因型的NCIMB 40615菌株進行雜交，NCIMB 40615菌株已按布達佩斯條約于94年1月28日進行保藏。
使雙倍體形成孢子，然后將分離子代雜交，按與實施例1同樣的方式篩選菌株。
在由此獲得的各個菌株中，作為舉例寄存了上面介紹的NCIMB40612菌株。
正如在描述根據“生面團中產生的CO2量”試驗中獲得的結果的圖1中所看出的那樣，實際上在3至12℃之間時該菌株是失活的。的確，在3-8℃溫度時其CO2產生量低于7ml/h/kg生面團。在至少12℃時CO2產生量低于12ml/h/kg生面團，并且還觀察到在30℃時產生的CO2含量快速上升。
此外，正如在描述由“在溫度梯度下CO2生成量”試驗獲得的結果的圖2中所看到的那樣，該菌株還在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天之后，在最高至18℃時其CO2的生成量為每克濃縮酵母低于10ml。作為比較，還將對照LBB菌株也進行了該試驗(圖3)。
另外，該菌株的起始生長速率相當于LBB酵母的90％，并且根據前面描述的試驗其在分批補料方法中的生長產率相當于按同樣方法測出的LBB菌株的生長產率，即每克培養(yǎng)基中產生0.5g干生物量最后，根據上面描述的遺傳穩(wěn)定性檢測試驗沒有發(fā)現回復突變型。因而該菌株實際上是穩(wěn)定的。
實施例3按下面方式將Lti面包酵母干燥以便能夠以粉末形式將其保存較長時間。使用包含約20％干物質并且經離心和洗滌過的NCIMB40612菌株的培養(yǎng)物。然后例如按美國專利4,358,250中描述的傳統(tǒng)方法將酵母干燥。從而獲得了包含96％干物質的干酵母粉。
然后按下面方式將這些酵母再水合。在30℃將10％干酵母加到90％水中。然后溫和地混合20分鐘，最后，在4℃加入一定量的水從而獲得了具有所需干物質量的酵母懸液。
可以看到經脫水，然后再水合的酵母完全保存其發(fā)酵活性。
實施例4制備包含濃縮酵母菌株NCIMB 40612的冷藏的并經包裝好的烤制用生面團。為此，按前面描述方法將NCIMB 40612酵母的濃縮的新鮮培養(yǎng)物用于“分批補料培養(yǎng)產率”檢測試驗。然后將一定量的所述濃縮酵母(包含約35％干物質)與面粉、水、脂肪和鹽混合，從而得到包含0.2％濃縮酵母干物質，60％面粉，30％水，8％人造奶油和1.8％NaCl的生面團。
然后以與在歐洲專利EP 0,158,590中描述的相同方式將該生面團包裝，不同之處在于不能透過空氣的塑料包裝物包含有一個排氣閥門，即是說，一個閥門允許氣體從包裝物的內部溢出到外部，并且阻止空氣從包裝物外界流進其內部。此外，該包裝物的內部大氣還包含50％氮氣和50％二氧化碳。
實施例5制備包含再水合的酵母菌株NCIMB 40612的冷藏的并經包裝好的烤制用生面團。
使用包含10％干物質的實施例3所述的再水合NCIMB 40612酵母懸液。由此制備包含0.3％再水合酵母干物質，60％面粉，30％水，8％人造奶油和1.7％NaCl的生面團。于是按與實施例4所述的相同方式包裝該生面團。
實施例6使用在冷藏溫度下保存了一天的實施例4的生面團，然后將該生面團在220℃直接烘烤約15分鐘。
另外，以與上述同樣方式分別將冷藏保存7天、28天和60天的實施例4的生面團烘烤。
最后，為了比較，制備具有與實施例4所述的相同組分的生面團，唯一不同之處是加入傳統(tǒng)面包酵母以替代Lti酵母。將該生面團在室溫下發(fā)酵45天，然后在與上述同樣條件下烘烤該生面團。
三種分別保存了7天、28天和60天的經烘烤的生面團具有與按上述傳統(tǒng)方式用酵母發(fā)酵的生面團非常相似的口味及質地。
另一方面，保存了1天的經烘烤的生面團具有的口味及質地與按傳統(tǒng)方法用酵母發(fā)酵的生面團有一些差異。這可以用下列事實解釋，在保存的第一天過程中，Lti酵母還沒有產生使生面團十分相似于傳統(tǒng)生面團的足量的氣味和氣體。
權利要求
1.制備具有Lti特性的面包酵母菌株的方法，其特征在于，首先將具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株與至少具有一個活化的但受分解代謝抑制的MAL等位基因的單倍體釀酒酵母菌株進行雜交，然后在第二階段，將分離子代進行雜交，并且最后，選出具有Lti表現型、活化的但受分解代謝抑制的Mal表現型，和在分批補料方法中具生長能力的原養(yǎng)型二倍體菌株。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于，在第二階段，將各自來自于不同的第一雜交組合的分離子代進行雜交。
3.根據權利要求1的方法，其特征在于，在酵母中，活化的但受分解代謝抑制的MAL等位基因可以是組成型的或誘導型的。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，為檢測所要選擇的所述二倍體菌株的Lti特性，將其在3至30℃之間的溫度下檢測幾天內烤制用生面團中產生的CO2量。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，檢測所要選擇的所述二倍體菌株在分批補料方法中的生長能力，是在需要碳源呼吸代謝的一種培養(yǎng)基中進行的。
6.工業(yè)用面包酵母菌株釀酒酵母，它在分批補料方法中的生長產率大于0.5克干生物量/每克糖，在最高達8℃時CO2產生量低于7ml/h/kg生面團，在最高達12℃時CO2產生量低于12m1/h/kg生面團，并且在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，在最高達18℃溫度時CO2產生量還低于10ml/每克濃縮酵母。
7.根據權利要求6所述的菌株，其特征在于，在最高達12℃時它具有低于3ml/h/kg生面團的CO2生產量。
8.選自權利要求6的釀酒酵母菌株NCIMB 40612以及權利要求7的NCIMB 40611的工業(yè)用面包酵母菌株。
9.權利要求1-8中任何一項所述的工業(yè)用面包酵母菌株用于制備在冷藏保存后在爐子中烘烤的面包房產品的應用。
10.制備經冷藏的并經包裝好的烤制用生面團的方法，其中所述生面團制備如下，即通過將權利要求1-9中任何一項所述的酵母至少與水和面粉混合，然后將該生面團包裝于有排氣閥門的容器中。
11.根據權利要求10所述的制備方法，其特征在于，將所述生面團在冷藏溫度下混合并然后進行包裝。
12.根據權利要求10所述的制備方法，其特征在于，將生面團在包含氮氣或二氧化碳或其兩者的混合物的大氣中包裝。
13.根據權利要求10所述的制備方法，其特征在于，將酵母以0.1-1％干物質量的濃縮或再水合酵母的量與生面團混合。
14.根據權利要求10所述的制備方法，其特征在于，所述酵母含有海藻糖。
15.根據權利要求10所述的制備方法，其特征在于，向所述生面團中加入1.2至2％的NaCl。
16.根據權利要求10-15中任何一項所述的冷藏的并經包裝好的烤制用生面團。
17.根據權利要求16的烤制用生面團，其特征在于，將其于冷藏溫度下保存至少1天。
全文摘要
制備具有Lti特性的面包酵母菌株的方法，其中首先將具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株與至少具有一個活化的受分解代謝抑制的MAL等位基因的單倍體釀酒酵母菌株雜交，然后在第二階段，將分離子代進行雜交，最后，選出具Lti表現型、活化的但受分解代謝抑制的Mal表現型以及具有在分批補料方法中具生長能力的原養(yǎng)型二倍體菌株。將所研制的菌株用于一種制備冷藏的經包裝好的烤制用生面團的方法中，其中將該Lti酵母至少與水和面粉混合，然后將該生面團包裝于含有排氣閥門的容器中。
文檔編號C12R1/865GK1118007SQ9510249
公開日1996年3月6日 申請日期1995年3月16日 優(yōu)先權日1994年3月16日
發(fā)明者J·巴恩什, C·吉斯勒, P·尼德堡格 申請人:雀巢制品公司