專利名稱：用于分光光度法測定分析物的染料偶合對的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明是關于一種檢驗儀器和方法，它應用于比色法測定水流體，如全血中的化學和生物化學組分(分析物)，并且，特別是關于用于該儀器和方法中的染料偶合對。
背景技術(shù)：
有色水流體，尤其是有色生物流體，例如全血、尿和生物流體衍生物，如血清和血漿中的化學和生物化學組分的定量分析的重要性正在與日俱增。它主要應用于醫(yī)療診斷和治療，以及藥物、毒物和有害化合物的劑量的定量分析和類似工作。在某些實例中，被測定的物質(zhì)的量是如此之小，如毫克/分升量級或更小或是難于精密地測定，因此要使用復雜的儀器和熟練的實驗員才能勝任此項工作。在此種情況下，測定結(jié)果一般是取樣以后幾個小時或幾天才能得到。在另外一些實例中，一般強調(diào)非專業(yè)操作人員在實驗室外有能力隨時、迅速和重現(xiàn)地進行測定，并快速、及時地出示信息。
血糖水平的測定是糖尿病患者的一種常規(guī)的醫(yī)療檢驗?，F(xiàn)代的學說勸告糖尿病人每天測定2-7次血糖水平，測定次數(shù)根據(jù)患者的具體病情而定。依據(jù)從血糖水平檢驗結(jié)果所觀察的病情，病人和醫(yī)生一起商定飲食、鍛煉和胰島素的輸入量，以便更有利于治病。顯然，對于這種病人，信息應能及時知道。
在技術(shù)上，許多血糖檢驗方法和制品已眾所周知，這些方法都有種種局限性。很多改進已被公開和申請專利權(quán)，其中Phillips等人的美國專利4,935,344、5,049,487、5,059,394和5,179,005，并已轉(zhuǎn)讓給本專利申請的同一受讓人。
公開的和這些專利申報的方法包括，當被分析的流體被加入到用試劑浸過的惰性多孔基體的一邊，并遷移到讀數(shù)的一邊，在那里分析物與試劑相互作用并產(chǎn)生一種吸光的反應產(chǎn)物，光反射比從這一邊可以讀到。試劑包括葡萄糖氧化酶，一種消耗樣品中的葡萄糖而產(chǎn)生過氧化氫的酶；在另一種辣根過氧化物酶存在的條件下，過氧化氫氧化染料偶合對，即3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氫氯化物(MBTH)和3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)，產(chǎn)生藍色染料。然后，分別用兩束不同波長的入射光測量其光反射比。根據(jù)用LED-分光光度計測定的染料顏色的強度，血液中葡萄糖的濃度可以被確定。在我的共同待審的、共同轉(zhuǎn)讓的美國專利U.S.S.N、245,940，其提交日期為1994年5月19日，(LFS，30)，公開了一種染料偶合對，它們包括3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙的游離型或酸型(MBTH)和8-苯胺基-1-萘磺酸或其鹽(ANS)，此染料偶合對用于代替上述的MBTH-DMAB染料偶合對。在氧化作用時，MBTH-ANS染料偶合對是微溶的，并因此提供更穩(wěn)定的終點，它與氧化的MBTH-DMAB染料對相比，染料退色很少。
雖然在生產(chǎn)用于測定葡萄糖的存在或含量的檢驗儀器中，上述體系已被有效地應用，但已發(fā)現(xiàn)其一些缺點。含染料偶合對的檢驗儀器被設計適合于家用和專業(yè)應用，并被制造商和批發(fā)商出售，預期用戶的存貨持續(xù)一段時間，當然，在這段保存時間內(nèi)，儀器必須保持有效。一個合適貨架壽命的要求，使得在使用MBTH作為染料偶合對的組分進行產(chǎn)品配方時產(chǎn)生了困難。
首先，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MBTH的穩(wěn)定性隨著溫度和堿度的升高而降低。MBTH的無酸型是易于升華的。為了克服這一點，優(yōu)選的形式是MBTH的酸水化物，如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氫氯化物。很遺憾，這種酸水化物本身隨著濕度的升高而變得不穩(wěn)定，并且加熱時很容易分解為MBTH的無酸型和HCl。再則，在高pH值時，它的穩(wěn)定性低，MBTH與其配偶體進行氧化反應的效率也隨著堿度的升高而降低，以至在高pH值時，該染料偶合對產(chǎn)生的顏色很淡或無色。
從這些相關性出發(fā)，在實施中，MBTH的加入量要很大，pH值要低，以減少其不穩(wěn)定性和無效性。為了使該化合物降低升華，提高效率，pH值應選擇在低于2.0。令人遺憾的是，對于這里討論的體系，如此理想的低pH值不能被應用。如上所述，所用的試劑體系取決于與分析物作用并產(chǎn)生一定量的氧化劑的酶，該氧化劑量指示出被測定樣品中的分析物含量。對MBTH試劑是理想的pH值，卻完全不適合于酶，例如葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶。在此低pH值條件下，許多商品酶只有很低活性或無活性。因此，從技術(shù)方面不得不選擇適中的pH值，如4，和過量試劑，以保證檢驗儀器在所要求的貨架期內(nèi)的有效性。
發(fā)明概述按照本發(fā)明的教導，含酶的檢驗儀器中應加入一種高穩(wěn)定性的組分作為染料偶合對之一員。與上述的那些檢驗儀器中的組分相反，在適合于高酶效率的pH值，這種組分能與各種偶合對有效地氧化。具體地講，本發(fā)明的染料偶合對化合物是被用于一種含試劑體系的檢驗儀器中，該儀器用來分析樣品中分析物的存在或含量，其中試劑體系包括一種或多種酶，在分析物存在時，體系產(chǎn)生定量的氧化劑，以指示樣品中分析物的含量。按照上述說明，試劑體系還包括染料偶合對，它們能被產(chǎn)生的上述氧化劑所氧化，生成一種顯色物質(zhì)；染料偶合對包括化合物

結(jié)構(gòu)式中，R選自烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基，雜環(huán)基、季胺基或有機酸部分；Y選自NO2，SO3-，H，鹵素離子、烷基或SiZ3，Z可以任選烷基或芳香基。優(yōu)選的Y是H。在優(yōu)選的實施例中，R是

其中，R1、R2和R3分別選自下列基團H、烷基、芳香基、甲硅烷基、鹵離子、羥基、烴硫基、烷氧基、硫代烷氧基、胺基、磺酸根或羧酸根；X選自下列基團胺基、磺酸根或羧酸根。在具體實施例中，檢驗儀被用于測定分析物的存在或含量，例如葡萄糖、膽固醇、醇、脲酸、甲醛或甘油-3-磷酸酯和常規(guī)檢驗中血樣的分析物。在此情況下，酶體系將包含選自這樣一組酶，其中包括葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、醇類氧化酶、脲酸酶、醛類氧化酶和甘油磷酸酯氧化酶；還有過氧化物酶或具有類似過氧化物酶活性的無機復合物，例如正高鐵血紅素、氯化血紅素和〔磺基苯基〕卟啉錳。
選用的過氧化物酶是辣根過氧化物酶。
附圖簡述

圖1是檢驗儀器實施例的透視圖，其中包含一個反應基體，被分析的液體樣品就加到基體上；和圖2是與圖1相同儀器的另一個實施例的透視圖。
發(fā)明詳細討論如上所述，本發(fā)明包含改進的染料偶合對化合物，該化合物用在檢驗儀器之中，可以測定液體樣品中分析物的存在或含量。參見圖1，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，檢驗儀器包括一個多孔的基體(10)，其中摻入化學反應試劑體系，與支撐體(12)粘接。有一個穿過支撐體的圓孔(16)，借此可將液體樣品施于基體(10)的樣品接收面(17)?；瘜W體系可與液體樣品中的分析物相互作用，使基體的檢驗表面(19)顯示光反射性質(zhì)，指示出液體樣品中的分析物含量。檢驗表面(19)可用裸眼讀，但最好還是用光檢驗器來讀。這種儀器的元件如圖1所示，其中包括一個光源(18)，如發(fā)光二極管，以便將優(yōu)選單一波長的光入射到檢驗表面(19)。另外還附有光檢測器(20)，以便測定從表面(19)反射的光，并產(chǎn)生一個信號(22)，作為被檢測光的量的指示，這種信號可用安裝在讀數(shù)裝置中的微處理器處理，計算出樣品中分析物的含量。
現(xiàn)在如上所述的體系已為本領域的技術(shù)人員所熟悉，并已被美國專利很好地闡述，這些美國專利號是4,935,346；5,049,487；5,059,394和5,179,005。這些體系企圖把檢驗儀器與讀數(shù)計連接，而后，樣品如血液被加到樣品接收表面(17)。圖2表示另一種方式，先把血液加到樣品表面(17)并接著測定表面(19)，顯示在讀數(shù)計上。在所有其他方面，圖2中標號碼的元件是與圖1中的元件等同的。
檢驗表面的光反射性質(zhì)隨著分析物的量而改變，這種變化是由于液體樣品中的分析物與多孔基體中的化學試劑發(fā)生一系列化學反應的結(jié)果。在特定情況下，基體包含有一種或多種酶，該酶與分析替代物一起產(chǎn)生過氧化氫或其他強氧化劑?；w之中含有染料偶合對，即可被氧化而生成能吸收一定波長的光的顯色物質(zhì)的兩種化合物，吸光度與顯色劑的量成正比。酶催化反應產(chǎn)生氧化劑，再與染料樣品反應生成顯色劑。
酶產(chǎn)生的氧化劑的選擇和染料偶合對的選擇在本領域內(nèi)廣泛地變化，并在很大程度上取決于具體要測定的分析物。例如，在測定血液樣品中的膽固醇時，要加入一種氧化酶，如膽固醇氧化酶。同樣，甲醇或乙醇的測定可加入醇類氧化酶；甲醛的測定可加入醛類氧化酶；或甘油醇-3-磷酸酯的測定可加入甘油磷酸酯氧化酶。這些酶催化反應的產(chǎn)物過氧化氫可能被隨后的酶催化反應改性，產(chǎn)生活性氧化劑，該氧化劑再與染料偶合對反應產(chǎn)生顯色劑。因此，例如產(chǎn)生活性氧化劑的過氧化氫的反應可能被辣根過氧化物酶催化。
因而，雖然人們可以理解，本發(fā)明公開的內(nèi)容具有廣泛的應用，但為了以下的討論，把全血液體樣品中的葡萄糖作為分析物的一個實例。優(yōu)選的化學體系則以葡萄糖氧化酶為例，它和葡萄糖底物作用，產(chǎn)生過氧化氫。然后，過氧化氫被另一種酶，辣根過氧化物酶催化反應變?yōu)榛钚匝趸瘎?br> 如上所述，至今，被廣泛地應用于有關葡萄糖的診斷檢驗中的染料對是3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氯化氫水合物(MBTH氯化氫水合物)(結(jié)構(gòu)式I)和二甲基苯胺(結(jié)構(gòu)式II)結(jié)合物
＝過氧化氫/辣根過氧化物酶如上所述，這種體系存在一些缺點。在加熱和堿性條件下，MBTH甚至MBTH的氯化氫水合物是相當不穩(wěn)定的。況且，在高酸度條件下，例如pH2或更低，以上反應是最有效的。遺憾的是，在這樣的條件下，在檢驗儀器中應用的酶，例如葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶只有很低活性或無活性。因此，商業(yè)實踐已指明，為了獲得相對穩(wěn)定的體系，最優(yōu)的應用pH值是大約4，同時加入大量的酶和染料偶合對，以便彌補偶合反應中酶活性和氧化效率的降低問題。
按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MBTH的改性型可用以克服遇到的穩(wěn)定性問題，并更進一步，它在更有利于檢驗儀器中所用的酶的活性的條件下，例如pH值范圍大約4-7，能有效地反應。一些優(yōu)選的衍生物已被發(fā)現(xiàn)，它們與要求的配偶如芳香胺，有高的反應性。本發(fā)明的衍生物具有結(jié)構(gòu)通式(IV)

式中R選自烷基、取代烷基、芳香基，取代芳香基、雜環(huán)基、季胺基或有機酸根；Y選自NO2，SO3-，H，鹵素離子，烷基或SiZ3，Z是烷基或芳香基。優(yōu)選的Y基團是H。在優(yōu)選的實施例中，R是

式中的R1、R2和R3分別選自H、烷基、芳香基、甲硅烷基、鹵素離子、氫氧基、烴硫基、烷氧基、硫代烷氧基、胺基、磺酸根或羧酸根；X選自胺基、磺酸根或羧酸根。
本發(fā)明的MBTH衍生物能與廣泛的染料配偶發(fā)生氧化反應，例如芳香胺、苯酚和取代苯酚。此外，在室溫及pH范圍4-11條件下，這一反應可以有效地進行。對于本發(fā)明優(yōu)選的衍生物，氧化反應的最佳pH值范圍為4-7，因此，反應對診斷化學中感興趣的胺染料配偶特別有用，例如3-二甲基胺基苯甲酸和8-苯胺基-1-萘磺酸鹽。
不象MBTH無酸型或MBTH酸水合物，這些衍生物是相當穩(wěn)定的，甚至耐在100℃加熱16小時。此外，在氧化反應條件下，過氧化物催化酶，如辣根過氧化物酶，對于氧化偶合反應是特別有效的。
例1-MBTH衍生物的合成間-[3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙]-N-磺?；交撬?鈉鹽，[2]合成路線

材料3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氫氯化物(MBTH·HCl)，NaI，四丁基氫氧化銨，二氯甲烷，和N-甲基-2-吡咯烷酮購自Aldrich公司(Milwankee，Wisconsin)并且使用時未經(jīng)純化。三乙胺是從BakerChemicals得到的，并批發(fā)自Baxter公司(Phillipsburg,New Jersey)。1，3-二氯亞砜基苯購自Fluka Chemicals(Ronkonkoma，New York)或Lancaster Chemicals(Windhan,New Hampshire)。
化合物(1)的合成把4克MBTH·HCl加到150mlErlenmeyer燒瓶中，將攪拌磁子置入燒瓶，再加入50ml的N-甲基-2-吡咯烷酮和5ml三乙胺。燒瓶加上橡皮塞后，放在磁攪拌加熱板上，劇烈攪拌，在60-70℃加熱半小時，有黃色漿液生成。把燒瓶放在冰浴中冷卻。
5克1，3-二氯亞砜苯加入到一個250ml的Erlenmeyer燒瓶中并放入一個磁攪拌條。把燒瓶浸在冰浴之中，再向燒瓶中加入20ml的N-甲基-2-吡咯烷酮，攪拌至所有固體溶解。(大約15分鐘)。把前面獲得的游離堿MBTH漿液倒入該溶液，所得淺黃色混合物在冰浴溫度反應1個半小時。然后，加入10ml 2N HCl抑制反應，再在室溫攪拌30分鐘。向溶液中加入50毫克12目Norti(活性碳粒)，攪拌10分鐘之后，呈淡黃色溶液。溶液經(jīng)過細密玻璃砂漏斗抽濾。得到的濾液為黃至淡棕色均勻的溶液。向黃色溶液中加入300ml 2N HCl并攪拌，有淺白色粉狀的沉淀生成。固體用真空過濾收集并用25ml去離子水洗滌三次。固體經(jīng)過110℃真空干燥2小時，可得到5.6克淺白色的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)過1H NMR和HPLC分析，其純度為97％。
化合物〔1〕不容易溶于絕大多數(shù)常見有機溶劑和水。但是，它溶于堿性溶液和某些極性溶劑，例如DMSO，NMP和DMF。
化合物〔2〕的合成把2.0克的化合物〔1〕粗樣品加入到50ml的二氯甲烷中。向不斷攪拌的懸濁液中用2分鐘緩慢地加入4ml 1M四丁基氫氧化銨，懸濁液變?yōu)榈S色溶液。溶液用10ml去離子水洗滌，再用無水硫酸鈉干燥。硫酸鈉用重力過濾除去，所得混合物用旋轉(zhuǎn)蒸餾器蒸發(fā)至干。收集到的產(chǎn)物是一種深黃色油。用125ml丙酮將油從蒸餾器中提取出來，再向油溶液中滴加10ml 20％NaI丙酮溶液，在5分鐘內(nèi)加完。有白色沉淀出現(xiàn)?；旌衔镌俜磻?0分鐘，然后，沉淀經(jīng)過玻璃砂漏斗真空過濾收集。所得淺白色固體用20ml丙酮洗滌3次。在110℃干燥45分鐘，得到所要的產(chǎn)物1.3克(65％)。
化合物〔2〕非常容易溶于水和水與乙醇混合溶劑。固體在空氣和光照射條件下很穩(wěn)定，但當溶液在長時間的光照射條件下，會緩慢分解成為淺黃色混濁的混合物。
例2-檢驗儀器的制造一條高分子膜帶(反應基體)被浸入如表1所組成的水溶液中，直至飽和為止。將高分子膜帶從溶液中取出并用一根玻璃棒將過多的試劑刮去。將帶懸置在空氣循環(huán)干燥器中，在56℃條件下干燥大約5-10分鐘，然后將帶取出并浸入如表1中組成的有機溶液，直至飽和為止。再重復上述的干燥操作。將所得的帶加工成檢驗所需要的形狀。
表1-試劑配方

例3-葡萄糖的測定把含葡萄糖的血液樣品加到吸滿試劑的帶的表面。樣品立即被吸入基體并有藍色出現(xiàn)。顏色的強度隨時間增強并正比于分析物的濃度。依據(jù)顏色的強度，通過與標準校正曲線比較測定葡萄糖濃度。
同樣，過氧化氫水溶液(有機過氧化物、三價鐵和苯醌)也能與吸滿試劑的帶反應產(chǎn)生所要的藍色。分析物的濃度用上述方法被測定。
現(xiàn)在，本發(fā)明已得到充分的闡述，顯而易見，對本領域技術(shù)人員來說，不離開本發(fā)明的精神和范圍，任何一種改進和變化都是可能做到的。
權(quán)利要求
1.在一種檢驗儀器中包括一個試劑體系，用于測定樣品中分析物的存在或含量，該試劑體系包括能產(chǎn)生一種氧化劑的酶，該氧化劑的量指示出所述樣品中所述分析物的量；其改進如下所說的試劑體系包括一種染料偶合對，它被氧化劑所氧化時形成顯色劑，染料偶合對包括一種結(jié)構(gòu)式如下的化合物
其中，R選自烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基、雜環(huán)基、季胺基或有機酸部分；Y是選自NO2，SO3-，H，鹵素離子，烷基或SiZ3，其中Z是烷基或芳香基。
2.按照權(quán)利要求1檢驗儀器，其中R是
其中，R1、R2和R3獨立選自H、烷基、芳香基、甲硅烷基、鹵素離子、氫氧基、烴硫基、烷氧基、硫代烷氧基、胺基、磺酸根或羧酸根；X選自胺基、磺酸根或羧酸根。
3.按照權(quán)利要求2的檢驗儀器，其中Y是H。
4.按照權(quán)利要求1的檢驗儀器，其中所述的酶選自葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶醇類氧化酶、脲酸酶、醛類氧化酶和甘油磷酸酯氧化酶。
5.按照權(quán)利要求4的檢驗儀器，其中所述的酶還包括過氧化物酶或具有類似過氧化物酶性質(zhì)的無機復合物。
6.按照權(quán)利要求4的檢驗儀器，其中的酶包括葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶。
7.按照權(quán)利要求1的檢驗儀器，其中的染料偶合對還包括3-二甲基胺基苯甲酸。
8.按照權(quán)利要求1的檢驗儀器，其中所述的染料偶合對還包括8-苯胺基-1-萘磺酸鹽。
9.按照權(quán)利要求1的檢驗儀器，其中所述化合物是間-(3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)-N-磺?；交撬?鈉鹽。
全文摘要
一種染料偶合的化合物用于一種檢驗儀器中，該儀器包含一個試劑體系，可測定樣品中分析物的存在或含量。試劑體系包括一種或多種酶，酶與分析物一起產(chǎn)生一種氧化劑，其量可作為樣品中分析物含量的指示。入選的化合物是間-(3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)-N-磺?；交撬?鈉鹽。
文檔編號C12Q1/26GK1162981SQ95196104
公開日1997年10月22日 申請日期1995年9月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月8日
發(fā)明者Y·S·余 申請人:生命掃描有限公司