專利名稱：開花的遺傳學控制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中開花的遺傳學控制以及其中涉及的基因的克隆和表達。更特別地，本發(fā)明涉及擬南芥的CONSTANS(CO)基因和來自包括蔓菁的其它種的同系物的克隆和表達，以及該基因在植物中的操縱和使用。
植物的有效開花很重要，特別是當所希望的產(chǎn)物是花或從其產(chǎn)生的種子時。這一點的一個方面是開花的時間選擇使開花的開始提前或延遲對于農(nóng)民和種子生產(chǎn)者可能有用。對于影響開花的遺傳學機制的理解提供了一種用于改變目標植物的開花特性的方法。開花對于作物產(chǎn)量具有重要性的種屬很多，基本上所有作物均從種子生長，其重要實例為谷類，稻和玉米，很可能是較暖氣候帶中農(nóng)學上最重要的，以及在較溫氣候中的小麥，大麥，燕麥和黑麥。重要的種子產(chǎn)物為油料種子油菜和canola，制糖甜菜，玉米，向日葵，大豆和高梁。很多作物收獲其根，當然地，每年從種子生長，而任何類的種子的產(chǎn)生非常依賴于植物開花，被授粉和播種的能力。在園藝學中，對開花的時間選擇的控制非常重要?？煽刂崎_花的園藝學植物包括萵苣，苣荬菜和蔬菜蕓苔屬植物包括甘藍，花莖甘藍，花椰菜，和石竹屬植物和老鶴草屬植物。
擬南芥是一種兼性長日照植物，在長日照下開花早而在短日照下晚。由于它具有小的，經(jīng)很好鑒定的基因組，相對易于轉(zhuǎn)化和再生并具有快速生長期，擬南芥屬是研究開花和其控制的理想模型植物。
我們已發(fā)現(xiàn)對光周期的這種反應(yīng)所需要的基因之一是CONSTANS或CO基因，也稱為FG。我們發(fā)現(xiàn)攜帶此基因的突變的植物與它們的野生型相比，在長日照下開花晚而在短日照下同時開花，因而我們總結(jié)出，CO基因產(chǎn)生參與長日照下開花的促進。
Putterill等，在分子基因遺傳學(Mol.Gen.Genet.)239145-157(1993)中描述了初步的克隆工作，涉及使用酵母人工染色(YAC)文庫的染色體步查和擬南芥屬染色體5上1700kb的鄰近DNA，包括含基因CO的300kb區(qū)的分離。該工作的不足在于未克隆和鑒定CO基因。
我們現(xiàn)在已克隆并測定了CO基因的序列(Putterill等，1995)，并在本文中提供。當制造克隆時遇到了意外的困難和復(fù)雜情況，使克隆工作比預(yù)期的更困難，如下文實驗部分中所述。
按照本發(fā)明的第一方面，提供了一種核酸分子，它包含編碼具有CO功能的多肽的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解“CO功能”可用于指象擬南芥的CO基因一樣在表型上影響開花的時間選擇的能力(該時間選擇基本不受春化作用的影響)，特別是補充擬南芥中CO突變的能力，或另一種屬中的CO表型。CO突變型在長日照下表現(xiàn)延遲開花，開花的時間選擇基本不受春化作用的影響(見，如，Korneef等，(1991))。
按照本發(fā)明的核酸可具有擬南芥的CO基因的序列，或為所提供序列的突變型，衍生物或等位基因。優(yōu)選的突變型，衍生物和等位基因為編碼保持由野生型基因編碼的蛋白的功能特性，特另是如本文中所討論的促進開花的能力的蛋白者。其它優(yōu)選的突變型，衍生物和等位基因編碼一種蛋白，它與野生型或具有所提供序列的基因相比使開花延遲。為生產(chǎn)突變型或衍生物而對序列作改變，可通過在核酸中1或多次加入，插入，缺失或取代1或多個核苷酸，導(dǎo)致在編碼的多肽中一或多個氨基酸的加入，插入，缺失或取代。當然，不改變被編碼氨基酸序列的核酸改變也包括在內(nèi)。
CO基因的優(yōu)選核酸序列顯示于

圖1中，同時也顯示了具有CO功能的多肽的編碼氨基酸序列。
本發(fā)明也提供一種包含帶有所提供序列的任意一種的核酸的載體，優(yōu)選可表達由核酸序列編碼的多肽的載體。優(yōu)選該載體適合轉(zhuǎn)化入植物細胞。本發(fā)明還包含用這樣的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，特別是植物細胞。因此，提供了一種包含按照本發(fā)明的核酸的宿主細胞，如植物細胞。在該細胞中，該核酸可摻入染色體中。每個單倍體基因組可有一個以上異源核苷酸序列。這一點，例如，使與內(nèi)源水平相比基因產(chǎn)物的表達增加，如下所討論。
包含按照本發(fā)明的核酸的載體不必包括一個啟動子或其它調(diào)節(jié)序列，特別是如果該載體是用于將核酸導(dǎo)入細胞以供重組入基因組時。
按照本發(fā)明的核酸分子和載體可從它們的自然環(huán)境分離而提供，以基本純或同源的形式，或不含或基本不含所研究種屬的核酸或基因，或來自不編碼能影響開花的多肽的序列，例如在擬南芥中非CO序列的核酸。
當然，核酸可為雙鏈或單鏈的，cDNA或基因組DNA，RNA，全部或部分合成的，根據(jù)需要而定。
本發(fā)明還包括所公開的任何核酸序列的表達產(chǎn)物以及通過在適當條件下在適當宿主中通過編碼核酸的表達制備表達產(chǎn)物的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地構(gòu)建載體和設(shè)計方案以進行表達和回收重組基因表達產(chǎn)物。適當?shù)妮d體可被選擇或構(gòu)建，包含適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列，包括啟動子序列，終止子片段，多腺苷酸化序列，增強子序列，標記基因和其它合適序列。詳情參見，如，分子克隆實驗室手冊第二版，Sambrook等，1989，冷泉港實驗室出版社。轉(zhuǎn)化程序取決于所使用的宿主，但是是公知的。
本發(fā)明還包括包含含有根據(jù)本發(fā)明的核酸的植物細胞的植物，以及自身的或雜種的子代和這種植物的任何后代，和這種植物的任何部分和繁殖體，子代或后代，包括種子。
本發(fā)明還提供了一種方法用于從擬南芥外的其它植物種屬鑒定和克隆CO同系物，該方法使用來自圖1顯示的核苷酸序列。其序列顯示于圖5和圖6的基因用這種方法被克隆。來自這些的序列本身可用于鑒定和克隆其它序列。本文提供的核苷酸序列信息，或其任何部分。可用于數(shù)據(jù)庫搜索以發(fā)現(xiàn)同源序列，并可測定這些同源序列的表達產(chǎn)物影響開花特性的能力。這些可具有“CO功能”或補充突變型表型的能力(特別是在長日照下)，優(yōu)選地，開花的時間選擇基本不受春化作用的影響，如本文所公開。另外，核酸文庫可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)進行篩選，并將所鑒定的同源序列進行測定。
本發(fā)明還延伸至編碼使用衍生自圖1中顯示的核苷酸序列獲得的CO同系物的核酸。CO同系物序列顯示于圖5和6。本發(fā)明還包括編碼使用衍生自顯示于圖5或圖6的序列的核苷酸序列獲得的CO同系物的核酸。
該CO蛋白在蛋白的氨基末端含有半胱氨酸排列，是鋅指的特征，如GATA轉(zhuǎn)錄因子中包含的那些(Ramain等，1993；Sanchez-Garcia和Rabbitts，1994討論)。七種獨立分離的CO突變型已被描述，并且我們已鑒定了序列改變引起在所有7種情況下CO活性下降。其中5種在從它們的序列推測形成鋅指的區(qū)中被改變，另外兩種在蛋白羧基末端的臨近氨基酸中具有變化。這些改變的位置支持我們?nèi)缦碌慕忉?，即CO編碼含鋅指的蛋白，它很可能結(jié)合DNA并起到轉(zhuǎn)錄因子的作用。
擬南芥CO基因的序列信息的提供使從其它植物種屬獲得(obtention)同源序列成為可能。在Southern雜交實驗中，一個含有擬南芥CO基因的探針與從黑芥，蔓菁和花椰菜提取的DNA進行雜交。這些種屬的不同變種在它們的DNA用限制性酶剪切并與CO探針雜交時表現(xiàn)限制性片段長度多態(tài)性。這些RFLP可隨后用于CO基因相對于其它已知位置的RFLP的繪圖。以這種方式，例如，三種CO基因同系物被繪制于蔓菁的連鎖群N5，N2和N12(D.Lydiate，未發(fā)表)。用于RFLP繪圖的種群已預(yù)先進行開花時間的評分并且已證實CO同系物的特定等位基因與影響開花時間的等位基因變異共分離。繪制在連鎖群N2和N12的座位顯示開花時間選擇的最大等位基因變異。
兩種蔓菁同系物的成功克隆描述于實施例5中。
這證實與擬南芥屬的CO基因同源的基因調(diào)節(jié)其它植物種屬中的開花時間。
因此，本發(fā)明包括編碼作為擬南芥的CO的同系物的氨基酸序列的核酸分子。同源性可在核苷酸序列和/或氨基酸序列水平。優(yōu)選地，該核酸序列與來自擬南芥外的其它種屬的圖1的核苷酸序列編碼的序列享有同源性，優(yōu)選約50％，或60％，或70％，或80％同源性，最優(yōu)選約90％同源性，并且所編碼的多肽享有擬南芥CO基因的一種表型，優(yōu)選為影響開花的時間選擇的能力。這些與擬南芥CO相比可促進或延遲開花，而突變型，衍生物或等位基因與野生型相比可促進或延遲開花。
CO基因同系物還可從經(jīng)濟上重要的單子葉作物如稻或玉米鑒定。雖然編碼單子葉和雙子葉植物中相同蛋白的基因在核苷酸水平顯示相對小的同源性，但氨基酸序列是保守的。我們最近在公共序列數(shù)據(jù)庫中鑒定了數(shù)種擬南芥屬cDNA克隆序列，它們在隨機測序程序中獲得并在公知對其活性重要的蛋白的區(qū)中與CO享有同源性。類似地，在隨機測序的稻cDNA中我們鑒定了一個克隆，該克隆在DNA水平享有相對小的同源性但在氨基酸水平享有高度同源性。此克隆，和我們已從玉米鑒定的另一個，可被用于鑒定來自稻和其它谷類作物的整個CO基因家族。通過這些克隆每一個的序列測定，研究它們的表達型和檢查改變它們的表達的效果，可獲得在調(diào)節(jié)開花時間方面具有與CO類似功能的基因。當然，這些序列的突變型，衍生物和等位基因包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，按照與上述擬南芥CO基因相同的說法。
按照本發(fā)明的核酸可包含編碼能補充一種延遲開花的突變型表型，開花的時間選擇基本不受春化作用的影響。延遲的開花可在長日照下。本發(fā)明還提供包含一種核苷酸序列的核酸，該核苷酸序列是編碼具有影響開花時間選擇能力的多肽的野生型基因的突變型或衍生物，該突變型或衍生物表型為提早或延遲的開花，開花的時間選擇基本不受春化作用的影響。這些與Lee等報告的LD基因不同。
春化作用是低溫度(通常剛高于0℃)處理植物(幼苗)或種子一段通常為數(shù)周的時期，很可能約30天。這是一些植物在它們含苞或開花前需要的一種處理，模擬冬季寒冷的作用。
按照本發(fā)明還提供了在其基因組中摻入了一段本發(fā)明提供的核苷酸序列的植物細胞，位于控制表達的調(diào)節(jié)序列的操作性控制之下。本發(fā)明的另一方面提供了一種制造這種植物細胞的方法，涉及向植物細胞中導(dǎo)入包含該核苷酸序列的載體，和引起或允許在載體和植物細胞基因組間發(fā)生重組以向基因組中導(dǎo)入核苷酸序列。
還提供了包含按照本發(fā)明的植物細胞的植物，以及其任何部分或繁殖體，種子，自身或雜種子代和后代。
本發(fā)明還提供影響植物開花特性的一種方法，包含在植物的細胞中表達異源CO基因序列(或其突變型，等位基因，衍生物或同系物，如上所討論)。術(shù)語“異源”表明該被研究核苷酸的基因/序列已通過使用遺傳工程學即通過人類干預(yù)而導(dǎo)入該植物的所述細胞。該基因可位于基因組外載體上或優(yōu)選穩(wěn)定地摻入基因組中。異源基因可置換內(nèi)源等價基因，即在開花的控制中行使相同或類似功能者，或者該插入序列可以是內(nèi)源性基因以外附加的。導(dǎo)入異源基因的有利之處在于能夠置基因的表達于所選擇的啟動子控制之下，以便能夠根據(jù)偏好影響基因表達和因而影響開花。而且，野生型基因的突變型或衍生物，例如比野生型具有更高或更低活性的，可替代內(nèi)源性基因使用。
使用本發(fā)明可改變的主要開花特性是開花的時間選擇。CO基因的基因產(chǎn)物的低表達導(dǎo)致延遲開花(如CO突變型表型所提示)，過表達可導(dǎo)致早開花(如攜帶CO基因額外拷貝的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物和通過CaMV35S啟動子的表達所示)。例如，這種控制的程度可用于保證在雜種生產(chǎn)中雄性和雌性親本系的同步開花。另一項應(yīng)用是根據(jù)氣候的支配使開花提前或延后以延長或縮短生產(chǎn)季節(jié)。這可能涉及到反義或正義調(diào)節(jié)的使用。
可能改變的第二項開花特性是花在抽枝上的分布。在擬南芥中，花開在抽枝的側(cè)面而不是頂部。這通過LEAFY基因的表達的位置決定(Weigel等，1992)，而引起LEAFY在抽枝的頂部表達的突變?nèi)纭澳┒碎_花因子”(terminal flower(shannon和Meeks-Waguer，1991)也導(dǎo)致花在頂部開花。有證據(jù)說明CO為LEAFY的完整活性所需要(Putterill等，1995)。因而通過增加或改變CO表達的類型，LEAFY表達的水平和位置，進而花的發(fā)育，也可被改變。這一點在實施例4中舉例說明。這一點可有利地被采用以產(chǎn)生具有改變的花排列的園藝學種屬新變種。
按照本發(fā)明的核酸，如CO基因或同系物，可被置于外部可誘導(dǎo)基因啟動子的控制下，以使開花的時間選擇處在使用者的控制下。可誘導(dǎo)啟動子的使用在下文描述。這一點的有利之處在于花的產(chǎn)生和隨后的事件如種子結(jié)成，可安排時間而適應(yīng)市場需求，例如，在插花(cutflower)或裝飾性花盆植物中。延遲盆栽植物的開花有利于延長從生產(chǎn)者向銷售地點運輸可能的時間。而延長開花期則顯然對購買者有利。
應(yīng)用于啟動子的術(shù)語“可誘導(dǎo)”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。實質(zhì)上，在可誘導(dǎo)啟動子控制下的表達是對給予的刺激的“接通”或反應(yīng)的增加。刺激的屬性在啟動子間不同。一些可誘導(dǎo)啟動子在缺乏適當刺激時引起小的或不可測水平的表達(或無表達)。其它可誘導(dǎo)啟動子在缺乏刺激時引起可測的組成型表達。不管在缺乏刺激時表達水平如何，在存在適當刺激時來自任何可誘導(dǎo)啟動子的表達均增加。優(yōu)選的情況是當以足夠改變表型特征的量應(yīng)用相關(guān)刺激時表達的水平增加。因此可使用一種可誘導(dǎo)(或“可接通”)啟動子，它在缺乏刺激時引起基礎(chǔ)水平的表達，該水平低至不足以帶來所希望的表型(實際上可為零)。在給予刺激時，表達增加(或接通)達到帶來所希望表型的水平。
適合的啟動子包括花椰菜鑲嵌病毒35S(CaMV 35S)基因啟動子，它以高水平在基本所有植物組織中表達(Benfey等，1990a和1990b)；玉米谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶同種型II(GST-II-27)基因啟動子，它在給予外源性防護劑時被激活(WO/93/01294，ICI有限公司)；花椰菜meri5啟動子，它在植物頂部分生組織以及植物體中很好定位的位置，如內(nèi)韌皮部，花原基，根和幼芽的分枝點表達(Medford，1992；Medford等，1991)；和在花發(fā)育的很早期表達的擬南芥LEAFY啟動子(Weigel等，1992)。
當向細胞內(nèi)導(dǎo)入所選擇的基因結(jié)構(gòu)物時，某些問題必需考慮到，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。應(yīng)將要插入的核酸裝配入一個結(jié)構(gòu)物中，該結(jié)構(gòu)物含有驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的有效調(diào)節(jié)因子。必需有一種方法可將該結(jié)構(gòu)物運送入細胞。一旦該結(jié)構(gòu)物已在細胞膜內(nèi)，將發(fā)生或不發(fā)生向內(nèi)源性染色體物質(zhì)的摻入。最后，如果所關(guān)心的是植物的話，該靶細胞類型必須為能再生為整株植物的細胞。
用含有該序列的DNA片段轉(zhuǎn)化的植物可通過用于植物的遺傳學操縱的標準技術(shù)生產(chǎn)。可使用任何適當技術(shù)將DNA轉(zhuǎn)化入植物細胞中，如利用了其自然的基因轉(zhuǎn)移能力的土壤桿菌所攜帶的去防衛(wèi)Ti質(zhì)粒載體(EP-A-270355，EP-A-0116718，NAR12(22)8711-87215 1984)，顆?；蛭⒘＾Z擊(美國5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)微注射(WO 92/09696，WO/00583，EP 331083，EP 175966)，電穿孔(EP 290395，WO 8706614)，或其它形式的直接DNA攝取(DE 4005152，WO 9012096，美國4684611)。土壤桿菌轉(zhuǎn)化被本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛用于轉(zhuǎn)化雙子葉種屬。雖然已有報導(dǎo)土壤桿菌能轉(zhuǎn)化外源DNA入一些單子葉種屬(WO 92/14828)，但微投射轟擊，電穿孔和直接DNA攝取是優(yōu)選的，而土壤桿菌是不夠的或無效的。另外，可聯(lián)合應(yīng)用不同技術(shù)以增加轉(zhuǎn)化過程的有效性，例如用土壤桿菌包被的微顆粒轟擊(EP-A-486234)或微投射轟擊以誘導(dǎo)傷害繼以用土壤桿菌共培養(yǎng)(EP-A-486233)。
轉(zhuǎn)化技術(shù)的特定選擇取決于其轉(zhuǎn)化某種植物種屬的有效性和用選擇的特定方法實施本發(fā)明的人員的經(jīng)驗和偏好。技術(shù)人員應(yīng)明白將核酸導(dǎo)入植物細胞的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的特定選擇并非必須的或限制本發(fā)明。
在本發(fā)明中，通過在正義方向?qū)牒塑账嵝蛄锌色@得過表達。因而，本發(fā)明提供了一種影響植物開花特性的方法，該方法包含引起或允許在植物細胞內(nèi)從核酸表達一種多肽，該多肽由按照本發(fā)明的核酸的核苷酸序列所編碼。(見實施例4)。
可通過使用反義技術(shù)或“正義調(diào)節(jié)”獲得該基因產(chǎn)物多肽的低表達。使用反義基因或部分基因序列以降調(diào)節(jié)基因表達現(xiàn)已確定。DNA被置于一種啟動子控制下，從而使DNA的“反義”鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生與從目標基因的“正義”鏈轉(zhuǎn)錄的正常mRNA互補的RNA。對于雙鏈DNA，這通過在啟動子控制下將編碼序列或其片段置于“反向”而實現(xiàn)。一般認為該互補反義RNA序列隨后與mRNA結(jié)合以形成雙螺旋，抑制內(nèi)源性mRNA從靶基因翻譯為蛋白。這是否為作用的真實模式尚未確定。然而，該技術(shù)的有效性是確定的。參見，Rothstein等，1987；Smith等，1988；Zhang等，1992。
因此，本發(fā)明也提供了一種影響植物的開花特性的方法，該方法包含引起或允許在植物的細胞內(nèi)從按照本發(fā)明的核酸的反義轉(zhuǎn)錄。
當目標基因的附加拷貝正義插入，即與目標基因同方向時，產(chǎn)生許多表型，包括其中一些個體發(fā)生過表達而另一些發(fā)生來自目標基因的蛋白的低表達。當插入基因只是內(nèi)源性基因的一部分時，在轉(zhuǎn)基因群體中低表達個體的數(shù)量增加。有意義的調(diào)節(jié)，特別是降調(diào)節(jié)產(chǎn)生的機制尚不很明確。然而，此技術(shù)也經(jīng)常在科學和專利文獻中報告并被常規(guī)用于基因控制。見，如，Van der Krol，1990；Nopoli等，1990；Zhang等，1992。
因此，本發(fā)明也提供了一種影響植物開花特性的方法，該方法包含在植物細胞中引起或允許從按照本發(fā)明的核酸的表達。這可用于抑制具有影響開花特性能力的多肽的活性。在此，該多肽活性的受抑制優(yōu)選作為植物細胞內(nèi)低表達的結(jié)果。
如上所述，CO基因可通過將其與外源啟動子融合而使其表達類型改變。例如，帝國化學工業(yè)有限公司的國際專利申請WO 93/01294描述了一種分離自玉米谷胱甘胱-S-轉(zhuǎn)移酶，同種型II基因的27KD亞單位(GST-II-27)的化學可誘導(dǎo)基因啟動子序列(見圖2)。已發(fā)現(xiàn)當連接于一個外源基因并通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入植物中時，該GST-II-27啟動子提供外部調(diào)節(jié)該外源基因表達的一種方法。該CO基因的結(jié)構(gòu)區(qū)在翻譯起始位點的下游融合于GST-II-27啟動子，如圖2所示。
已顯示GST-II-27基因啟動子受可施用于生長植物的某些化學物質(zhì)的誘導(dǎo)。該啟動子在單子葉植物和雙子葉植物兩者中都有功能。因而它可用于控制許多遺傳學上改變的植物的基因表達，包括大田作物如Canola，向日葵，煙草，制糖甜菜，棉花；谷類如小麥，大麥，稻，玉米，高粱；水果如番茄，芒果，桃，蘋果，梨，草莓，香蕉，和甜瓜；以及蔬菜如胡蘿卜，萵苣，甘藍和洋蔥。GST-II-27啟動子也適合用于許多組織中，包括根，葉，莖和繁殖組織。
因而，本發(fā)明進一步提供了一種包含可操作地連接于本發(fā)明提供的核苷酸序列的可誘導(dǎo)啟動子的基因構(gòu)建物，這些核苷酸序列如擬南芥的CO基因，來自其它植物種屬的同系物或其任何突變型，衍生物或等位基因。這使基因的表達能夠控制。本發(fā)明還提供用所述基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的植物，以及包含將這種構(gòu)建物導(dǎo)入植物細胞中和/或通過應(yīng)用適當?shù)拇碳ぜ坝行У耐庠凑T導(dǎo)因素而在植物細胞中誘導(dǎo)一種基因構(gòu)建物的表達的方法。啟動子可為GST-II-27基因啟動子或任何其它可誘導(dǎo)植物啟動子。CO活性的促進作用引起早開花。
降低CO活性的突變引起在誘導(dǎo)性長日照條件下晚開花，表明CO與在長日照下促進開花有關(guān)?？赡茉诜钦T導(dǎo)性短日照下不需要，因為CO突變在這些條件下對開花無影響。在長日照下CO轉(zhuǎn)錄本的豐度很低，只有通過使用PCR擴增cDNA才可被檢測到。一些帶有含CO的T-DNA的轉(zhuǎn)基因植物在長日照下開花稍早于野生型而在短日照下明顯早于野生型的觀察資料提示，特別是在非誘導(dǎo)性短日照下，CO轉(zhuǎn)錄者的水平限制開花時間。這提示可通過使用外來啟動子改變基因的表達而操縱開花。
引起在非誘導(dǎo)性條件下早開花在非誘導(dǎo)性條件下CO轉(zhuǎn)錄本水平的操縱可導(dǎo)致提早的，或受調(diào)節(jié)的開花。如本文中所公開的啟動子融合使在非誘導(dǎo)性條件下以高于在野生型植物中發(fā)現(xiàn)的水平表達CO mRNA成為可能。使用CaMV 35S或meri5融合導(dǎo)致早開花而使用GSTII融合導(dǎo)致受調(diào)節(jié)的開花。
引起在誘導(dǎo)性條件下早開花在誘導(dǎo)性條件下野生型擬南芥屬植物開花特別快而CO基因在開花前表達，雖然是在低水平。盡管如此，一些含有CO的額外拷貝的轉(zhuǎn)基因野生型植物已顯示比野生型植物稍早開花?？赏ㄟ^導(dǎo)入啟動子，如CaMV 35S或meri 5，融合而增加CO產(chǎn)物水平?？烧T導(dǎo)性啟動子，如GSTII。可用于調(diào)節(jié)開花，例如通過首先產(chǎn)生一種特定種屬的CO突變型并隨后以受調(diào)節(jié)方式導(dǎo)入能夠與突變互補的可誘導(dǎo)性啟動子-CO融合。
抑制CO活性以引起晚開花CO突變型引起擬南芥屬的晚開花。在一些植物種屬中轉(zhuǎn)基因方法可用于降低CO活性并從而延遲或防止開花?？墒褂迷S多策略。
正義或反義RNA的表達在一些情況中，內(nèi)源性植物基因的活性已通過來自轉(zhuǎn)基因的同源反義RNA的表達而減低，如上所述。類似地，來自轉(zhuǎn)基因的正義轉(zhuǎn)錄本的表達可降低基因的相應(yīng)內(nèi)源性拷貝的活性，如上所述。CO反義或正義RNA的表達應(yīng)降低內(nèi)源性基因的活性并引起晚開花。
CO蛋白修飾版本(modified version)的表達轉(zhuǎn)錄因子和其它DNA結(jié)合蛋白經(jīng)常帶有一個模塊結(jié)構(gòu)，其中DNA結(jié)合，二聚作用或轉(zhuǎn)錄激活所需的氨基酸序列被蛋白的不同區(qū)編碼(Ptashne和Gnn綜述，1990)。這使只表現(xiàn)DNA結(jié)合蛋白的一種功能的截短的或融合蛋白的構(gòu)建成為可能。對于CO來說，基因的體外改變和蛋白改變型的表達可導(dǎo)致內(nèi)源性完整蛋白的顯性抑制并從而延遲開花。這可以多種方式完成，包括下列只編碼DNA結(jié)合區(qū)的截短CO蛋白的表達含有CO區(qū)的鋅指(zinc-finger)對于允許向DNA結(jié)合是必需和足夠的。如果只編碼DNA結(jié)合區(qū)的截短或突變蛋白以高于內(nèi)源性蛋白的水平表達，則大部分CO結(jié)合位點將會被突變型占據(jù)從而妨礙完全活性的內(nèi)源性蛋白的結(jié)合。突變型蛋白的結(jié)合應(yīng)能具有防止CO作用的效果，因為突變蛋白不包含在生物學過程如轉(zhuǎn)錄激活，轉(zhuǎn)染抑制或蛋白-蛋白相互作用中可能涉及的任何其它區(qū)。
對含有類似于CO的鋅指的鼠轉(zhuǎn)錄因子GF1的體外分析，提示具有上述性質(zhì)的截短CO蛋白可被設(shè)計。Martin和Orkin(1990)證實只含有鋅指的截短型GF1保持DNA結(jié)合活性，但不能轉(zhuǎn)錄激活。類似地，含有黃猩猩果蠅PANNIER蛋白的鋅指是抑制毛形成所需基因的激活所需要的。在不含鋅指的區(qū)中的突變引起基因活性的顯性超-抑制，可能因為這些蛋白結(jié)合DNA但不從野生型蛋白所用的方式與其它蛋白相互作用(Ramain等，1993)。
不編碼DNA結(jié)合區(qū)的突變型CO蛋白的表達可設(shè)計第二種形式的抑制分子，前提是如果CO必須二聚化，或與其它蛋白形成復(fù)合物以得到其生物學效應(yīng)，并且如果這些復(fù)合物可以不需要CO結(jié)合于DNA形成。在這種情況下，在DNA-結(jié)合區(qū)內(nèi)突變但含有野生型蛋白的所有其它性質(zhì)的CO蛋白的表達將具有抑制性效應(yīng)。如果突變型蛋白以高于內(nèi)源性蛋白的濃度存在并且CO正常地形成二聚體，則大多數(shù)內(nèi)源性蛋白將與突變型蛋白形成二聚體而不能結(jié)合DNA。類似地，如果CO與其它蛋白形成復(fù)合物，則突變形式的CO將參與這些復(fù)合物的大多數(shù)使它們不能隨后結(jié)合DNA。
具有這些性質(zhì)的DNA-結(jié)合蛋白的突變形式以前已報導(dǎo)。例如，在酵母中，含GAL4的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的蛋白的表達能降低CYC1基因的表達。CYC1通常不被GAL4激活，所以推測是GAL4激活區(qū)封閉于CYC1激活所需要的蛋白(GILL和Ptashne，1988)。黃猩猩果蠅的PANNIER蛋白的鋅指區(qū)中的突變具有顯性表型，可能是因為突變型蛋白封閉了PANNIER活性所需要的蛋白并降低了它們與野生型蛋白相互作用的有效性(Remain，1993)。
現(xiàn)在將根據(jù)附圖，以實施例方式闡明本發(fā)明實施方案的不同方面。其它方面和實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯見的。在本文提及的所有文獻在此并入作為參考。
在圖中圖1顯示按照本發(fā)明的一項實施方案的核苷酸序列，為來自擬南芥的CO ORF序列(SEQ ID NO.1)，和預(yù)測的氨基酸序列(SEQ IDNO.2)。核苷酸序列顯示于氨基酸序列之上。以粗體顯示的區(qū)被認為包含兩個鋅指區(qū)。
圖2顯示GST-II-27基因啟動子的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)。用干制造融合的片段兩側(cè)有顯示為粗體的Hind III和Nde I位點。
圖3顯示包含從擬南芥獲得的CO基因的基因組DNA的核苷酸序列，包括單個內(nèi)顯子，啟動子序列和存在于轉(zhuǎn)錄終止密碼子之后的序列(SEQ ID NO.4)。所示該基因組區(qū)在翻譯起始位點上游2674bp開始，并恰在多腺苷酸化位點后結(jié)束。CO開放閱讀框以粗體顯示，并被該單個內(nèi)顯子中斷。
圖4顯示用作CaMV 35S啟動子來源的PJIT62質(zhì)粒。顯示為深色粗線的KpnI-HindIII片段被用作該啟動子的來源。
圖5顯示按照本發(fā)明的另一實施方案的核苷酸序列，為從蔓菁獲得的CO ORF(SEQ ID NO.5)，和預(yù)測的氨基酸序列(SEQ IDNO.6)。
圖6顯示按照本發(fā)明的另一實施方案的核苷酸序列，為從蔓菁獲得的第二CO ORF(SEQ ID NO.7)，和預(yù)測的氨基酸序列(SEQ IDNO.8)。
實施例1-CO基因的克隆和分析考斯質(zhì)粒和RFLP標記DNA和λCHS2獲自R.Feinbaum(麻省總醫(yī)院(MGH)，波士頓)?？侱NA作為放射標記的探針被用于YAC文庫菌落濾過物和植物基因組DNA印跡?？妓官|(zhì)粒g6833，17085，17861，19027，16431，14534，g5962和g4568得自Brain Hauge(MGH，波士頓)，在30μg/ml卡那霉素存在下培養(yǎng)，并作為甘油貯存種維持于-70℃。總考斯質(zhì)粒DNA被作為放射標記的探針用于YAC文庫菌落濾過物和植物基因組DNA印跡?？妓官|(zhì)粒pCIT 1243由Elliot Meyerowitz(Caltech，Pasadena)提供，在100μg/ml鏈霉素/壯觀霉素存在下培養(yǎng)并作為甘油貯存種維持于-70℃。PCIT30載體序列與PYAC4衍生的載體有同源性，因而YAC文庫菌落濾過物與從考斯質(zhì)粒提取的插入DNA雜交。PCIT1243的總DNA被用作植物基因組DNA印跡的放射標記的探針。YAC文庫EG，abi和S文庫得自Chris Somerville(密西根州立大學)。EW文庫得自Jeff Dangl(Max Delbruck實驗室，Cologne)并且Yup文庫得自Joe Ecker(賓夕法尼亞大學)。該文庫的原版拷貝貯存于-70℃(詳細描述見Schmidt等，澳大利亞植物生理學雜志(Aust.J.PlanlPhysiol)19341-351(1992))。工作貯存液在4℃維持于選擇性kiwlbfew瓊脂上。kiwibrew是一種選擇性，完全性最低培養(yǎng)基減去尿嘧啶，并含有11％酪蛋白氨基酸。這些文庫的工作貯存液每3個月使用96-尖-復(fù)制儀復(fù)制。酵母菌落濾膜含有來自8-24個文庫板的大量酵母菌落DNA的Hybond-N(Amersham)濾膜(8cm×11cm)被生產(chǎn)和加工(如Coulson等，自然335184-186(1988)所述并改良(如Schimidt和Dean基因組分析，Vol.471-98(1992)所述)。雜交和洗滌條件按照制造商的指示。放射標記的探針DNA通過隨機六聚體標記制備。通過脈沖場凝膠電泳(PFGE)的酵母染色體制備和分級用單個酵母菌落接種5微升Kiwibfew并在30℃培養(yǎng)24小時。通過在室溫用2.5mg/ml Novozym(Novo Biolabs)溫育1小時產(chǎn)生酵母原生質(zhì)球形體，然后加至1M的山梨醇使原生質(zhì)球形體的終濃度為50μl。向原生質(zhì)球形體加入80微升1M山梨醇中的融化LMP瓊脂糖(1％Incert瓊脂糖，F(xiàn)MC)，將該混合物短時間旋動并用吸管處理為栓形，將這種栓置于1.5ml Eppeudrof管中在50℃在1ml 100mM EDTA中的1mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim)，pH8，1％Sarkosyl中溫育4小時。置換溶液并將此栓溫育過夜。將此栓用TE洗滌3次，每次30分鐘，并用0.5×TVBE洗滌2次，每次30分鐘。使用Pulsaphor系統(tǒng)(LKB)進行PFGE。將1個栓的1/3裝載在1％瓊脂糖凝膠上并在4℃在0.5×TBE電泳，以170V，20秒脈沖時間，達6小時。DNA標記為λDNA的多連體，按照Bancroft和Wolk，核酸研究，167405-7418(1988)的描述制備。DNA通過用溴化乙錠染色而可視。用于限制性酶消化和反向多聚酶鏈反應(yīng)(IPCR)的酵母基因組DNA除酵母原生質(zhì)球形體按如上所述制備外，酵母基因組DNA基本按照Heard等所述(1989)制備。最后，DNA用苯酚/氯仿提取兩次，用氯仿提取一次并用乙醇沉淀。從5ml培養(yǎng)物的產(chǎn)量為約10μg DNA。通過IPCR分離YAC末端片段酵母基因組DNA(100ng)用AluI，HaeIII，EcoRV或HincII消化。消化物用苯酚-氯仿提取1次并隨后用乙醇沉淀。DNA片段通過在2U連接酶(BRL)存在下在16℃在100μl容積中連接而環(huán)化。連接混合物在65℃溫育10分鐘后，使用反向引物對對10μl連接混合物進行IPCR。IPCR條件和C和D引物對已由Schimidt等人描述(1992)。JP系列得自M.Hirst(IMM分子遺傳學研究組，牛津)。
在用所指定的酶消化后，下列引物對被使用對于左一末端IPCRAluI，EcoRV；D71 5′tcctgctcgcttcgctactt 3′和C78 5′gcgatgctgtcggaatggac 3′HaeIII；JP1 5′aagytactctcggtagccaag 3′和JP5 5′gtgtggtcgccatgatcgcg 3′對于右一末端IPCRAluI，HincII；C69 5′ctgggaagtgaatggagacata 3′和C70 5′aggagtcgcataagggagag 3′HaeIII；C69和JP4 5′ttcaagctctacgccgga 3′IPCR反應(yīng)的等分試樣通過在1.5％瓊脂糖凝膠上的電泳檢查并將反應(yīng)的1μl通過PCR再擴增，使用I.Hwang(MGH，波士頓)建議的條件和引物系列。再擴增的條件與IPCR相同，只是使用30個周期(1分鐘，94℃；1分鐘，45℃；和3分鐘，72℃)。F引物在非常接近克隆位點處退火并從而降低存在于PCR產(chǎn)物中的載體序列總量。另外在非常接近EW和S YACs的被破壞克隆位點處，它們導(dǎo)入了一個FokI位點。
用于左末端IRCR產(chǎn)物的再擴增的引物如下對于EG，abi和S YACsAluI，F(xiàn)2 5′acgtcggatgctcactatagggatc 3′和C77 5′gtgataaactaccgcattaaagc 3′；HaeIII，F(xiàn)2和JP5；EcoRV，F(xiàn)2和78。
對于EW和Yup YACsAluI，F(xiàn)6 5′acgtcggatgactttaatttattcacta 3′和C77；HaeIII，F(xiàn)6和JP5；EcoRV，F(xiàn)6和C78。
下列引物用于右末端IRCR產(chǎn)物的再擴增對于EG，abi和S YACsAluI，
F3 5′gacgtggatgctcactaaagggatc 3′和C71 5′agagccttcaacccagtcag 3′；HaeIII，F(xiàn)3和JP4；HincII，F(xiàn)3和C70。
對于EW和YUP YACsAluI，F(xiàn)7 5′acgtcggatgccgatctcaagatta 3′和C77；HaeIII，F(xiàn)7和JP4；4HincII，F(xiàn)7和C70。
所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物通過使用最初與BamHI C EG和abi YACs或EcoRI(YUP YACs)一起用于消化的酶剪切而提純并在1％LMP瓊脂糖凝膠上分離。YAC末端探針使用隨機引物(random priming)在融化的瓊脂糖中被放射標記，并在適當情況下用FokI消化以去除載體序列并隨后用作雜交探針。通過質(zhì)粒援救(plasmid rescue)的YAC左末端探針分離YAC左一末端片段從EG，abi和EW YACS的質(zhì)粒援救按照Schmidt等(1992)所描述進行。植物基團組DNA的分離植物基因組DNA基本按照Tai和Tanksley，植物分子生物學報告(plant Mol.Biol.Rep.)8297-303(1991)所述從暖房培養(yǎng)植物分離，區(qū)別在于組織是在液氮中磨碎并且省略了RNA酶步驟。使用這種方法進行大規(guī)模(2.5-5g樹葉)和微量制備(3-4片樹葉)DNA的制備。凝膠印跡和雜交條件向Hybond-N的凝膠轉(zhuǎn)移，雜交和洗滌條件按照制造商的指示，只是DNA通過UV stratalinker處理(1200μJ×100；Stratagene)固定于濾膜上和/或在80℃烘烤2小時。放射標記的DNA通過隨機六聚體標記而制備。RFLP分析2至3微克的植物基因組DNA從用于雜交中的親本植物制備并在300μl容積中使用17種限制性酶的一種進行剪切這17種酶為DraI，BclI，CfoI，EcoRI，EcoRV，HincII，BglIII，RsaI，BamHI，HindIII，SacI，AluI，Hinfl，Sau3A，TaqI和MboI。被消化的DNA用乙醇沉淀并在0.7％瓊脂糖凝膠上分離和印跡至Hybond-N濾膜上。放射標記的考斯質(zhì)粒λ或YAC末端探針DNA與濾膜雜交以確定RFLPs。在CO的附近攜帶重組事件的植物的選擇選擇重組體的第一步是產(chǎn)生攜帶CO突變并與標記密切相連的品系。為不同的側(cè)翼標記將此步驟進行兩次。在第一個實驗中制造了攜帶CO-2等位基因(Koornneef等，1991)和tt4的Landsberg erecta系。tt4突變防止花青苷產(chǎn)生并已被提出是編碼苯丙烯酰苯合酶的基因中的一種損傷。因為它被繪制于類似的位置(Chang等，1988)。將此雙突變型與Niederzenz生態(tài)型的個體雜交并將產(chǎn)生的雜種自受精以產(chǎn)生F2群體。隨后對此群體進行表型篩選以尋找重組發(fā)生于CO-2和tt4之間的個體。另外，兩種突變的F2植物純合體被用于確定標記RFLP g4568相對于CO-2的位置。
第二項實驗通過使用兩種標記的品系作為親本進行。其第一種在landsberg erecta背景中含有ChpT并來自于Maarten Kooynneef(Wageningen)，它來自未確定背景的品系(得自George Redei)對Landsberg erecta的雜交。第二親本含有標記lu和alb2。這通過MaartenKoorneef從帶有alb2突變(M4-6-18；Relichova 1976)的S96背景的植物對含有CO-1和lu的品系(得自Koornneef，來自J.Relichova，但最初來自Cr.Redei)的雜交而選擇。然后將chp 7，CO-1系與lu，alb2系雜交并通過雜種的自受精作用而產(chǎn)生F2代群體。該群體值被用于分離lu和CO-1間和CO-1和alb2間的交換體。兩組重組體均作為lu純合體被表型識別。這些只在重組發(fā)生于lu和alb2間時存在，因為alb2在純合時是致死的。CO(FG)位點的分離CO基因位于染色體5的上臂并在tt4近側(cè)2CM。在擬南芥屬中1CM的平均物理化離約為140kb。因此可估計從CHS到CO的距離大約為300kb。
我們從將4個與CHS緊密連接的(在約2cm之內(nèi))RFLP標記與EG和EW YAC文庫雜交開始。這產(chǎn)生18種雜交YACs，它們在脈沖場凝膠上流出，Southern印跡并與適當?shù)腞FLP克隆雜交。這證實了菌落雜交結(jié)果并測定了YACs的大小。它們的大小范圍為50kb至240kb。將YACs隨后用限制性酶消化，與RFLP標記DNA雜交并將片段的類型與標記的作比較。這使我們能夠確定是否它們含有所有RFLP標記中的片段或只含有其中一些并使我們能夠推斷YACs相互之間的位置。這種排列在大多數(shù)情況下隨后通過反向多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段的分離和將它們與適當?shù)闹丿BYACs雜交而證實，這些片段位于插入YAC中的擬南芥屬DNA的末端。
圍繞RFLP標記的短contigs隨后被延伸。我們從這一區(qū)獲得了兩套重疊考斯質(zhì)?？寺〔⑦m當?shù)哪切┯糜赮AC文庫。這鑒定了兩種新YACs。我們已鑒定的來自20YACs中大多數(shù)的末端探針隨后被用于篩選文庫并且鑒定了在兩個方向延伸被克隆區(qū)的新的YACs。總共需要67個YACs的詳細分析。這使我們能夠裝配包括RFLP標記6833，CHS，pCIT 1243和5962并約為1700kb長的擬南芥屬DNA的一個鄰近節(jié)段。
在含有與CO非常緊密相連接的交換的重組體分離后，通過詳細的RFLP分析確定CO在contig中的位置。該重組體通過使用側(cè)翼表型標記鑒定。首先我們制造一個用CO和tt4標記的Laulsberg erecta染色體。然后我們將它與Niedersenz雜交并篩查1200 F2植物得到攜帶CO和tt4間的交換的重組體染色體。以這種方法我們發(fā)現(xiàn)了12個通過后代的表型評分被證實的重組體。這些重組體的罕見證實了tt4和CO間的極度緊密連接。這些重組體隨后被用于確定CO在Contig上的位置。例如，它們中的一些在交換的tt4側(cè)含有Landsberg DNA并在CO側(cè)含NiedersenzDNA。通過使用小片段作為RFLP標記并將它們與從重組體提取的DNA雜交，在我們的工作中分離的DNA被定位于相對于CO的位置。通過篩查CO和alb2間的重組體，我們在近側(cè)使用相似的方法。這項工作初步將CO定位在相互分開約300kb的兩個YAC末端探針間。
為更精確切確定CO在300kb中的位置，篩查CO和側(cè)翼表型標記間的更多交換。使用如前所述的類似基本原理，鑒定了CO和Alb2(在CO近側(cè)間隔1.6cm)間總共46個交換，和CO和lu(在CO遠側(cè)間隔5.3cm)間的135個交換并用來自我們的contig的適當?shù)腞FLP標記進行分析。這將該基因定位于由兩個YAC末端探針確定的非常短的區(qū)。這些被用于篩查明尼蘇達大學向我們提供的一個考斯質(zhì)粒文庫，并構(gòu)建了一個跨整個區(qū)的包含3個考斯質(zhì)粒的短考斯質(zhì)粒contig。對這些質(zhì)粒的分析表明詳細的RFLP制圖已將CO定位于一個約38kb長的區(qū)。
為確定該基因在考斯質(zhì)粒中的位置，將它們的每一種導(dǎo)入CO突變型中并檢測產(chǎn)生的植物以確定那一種考斯質(zhì)粒改正了CO突變型表型。對CO-2和tt4突變純合的植物的根與含有每一種考斯質(zhì)粒的土壤桿菌屬株系共培養(yǎng)(Olszewski和Ausubel，1988；Valvekens等，1989)并再產(chǎn)生卡那霉素抵抗植物。再生體(T1代)自受精并將它們的后代播種在含卡那霉素的培養(yǎng)基上以證實它們含T-DNA(表1)。
共有含有考斯質(zhì)粒A的5種獨立的轉(zhuǎn)化體，9種含考斯質(zhì)粒B的和13種含考斯質(zhì)粒C的產(chǎn)生卡那霉素抵抗T2后代并被進一步研究。在長日照曖房中測定來自這些T2家族的每一種的20-40株植物的開花時間。所有用考斯質(zhì)粒A制造的轉(zhuǎn)基因植物的后代開花與CO-2突變型一樣晚，提示此考斯質(zhì)粒不含CO基因。然而，來自含考斯質(zhì)粒B和C的植物的數(shù)個家族包含早開花個體?？偣?，來自含有考斯質(zhì)粒B的植物的9個家族中的6個和來自攜帶考斯質(zhì)粒C的13個家族中12個含有開花與野生型一樣早的植物。所有這些早開花個體產(chǎn)生淺顏色的種子，表明它們攜帶存在于用于轉(zhuǎn)化的系中的tt4突變，并因而不簡單地是實驗被野生型植物的種子污染的結(jié)果(實驗方法)。這些結(jié)果強烈提示CO基因包含在考斯質(zhì)粒B和C兩者中。
進一步的實驗在T3代中進行以證實互補作用結(jié)果?？偣?種來自考斯質(zhì)粒B的T2早開花植物和6種來自考斯質(zhì)粒C的被自受精并進一步在T3代中被研究。此分析選用的每一種T2植物來自不同的轉(zhuǎn)化體，為T2家族中的最早開花植物并且為顯示了卡那霉素抵抗幼苗比1卡那霉素敏感的一些家族，因而可能只在一個位點含有轉(zhuǎn)基因(表1)。在這些T3家族中的所有幼苗對卡那霉素抵抗，證明親本T2植物對T-DNA是純合體。這證明最早開花的T2植物對CO轉(zhuǎn)基因是純合的。
在所使用的長日照條件下，CO-2突變型植物開花明顯晚于野生型對照(表1)。T3植物在給定的長日照條件下開花至少與野生型一樣早，并且一些個體開花早于野生型(表1)。這一分析證實考斯質(zhì)粒B和C可糾正CO-2突變對長日照下開花時間的效應(yīng)，提示這兩種考斯質(zhì)粒都包含CO，并且因而該基因位于它們的重疊區(qū)中。這一區(qū)為6.5kb長。
我們確定了考斯質(zhì)粒B和C共有的6.5kb的序列。它只含有一個我們可從DNA序列鑒定的基因。多聚酶鏈反應(yīng)被用于從3個獨立分離的CO突變型擴增此基因，并且，這些基因的序列測定證實所有這3種都含有突變。這與互補分析一起，是此基因為CO基因的結(jié)論性證據(jù)。CO的推測氨基酸序列與以前報告的基因顯示無同源性。然而，氨基末端含有兩個被推測形成鋅指的區(qū)，提示此蛋白產(chǎn)物與DNA結(jié)合并可能是一種轉(zhuǎn)錄因子。在由REG17B5和LEW4A9限定的300kb區(qū)中鑒定CO中的意外困難1.通過更詳細的RFLP制圖和互補定位基因如前所述，Patterill等分子基因遺傳學(Mol.Gen.Genet.)239145-157(1993)描述了將CO定位在300kb的區(qū)中。為更確切地通過RFLP制圖定位CO，需要兩項物質(zhì)更多的在300kb區(qū)內(nèi)攜帶交換的重組體，和更多的用作針對這些重組體的探針的RFLP標記。
lu和CO間或co和Alb2間的重組體被選擇。總共鑒定了lu和co間1.6cM中的68個交換，和co和alb2間5.3cM中的128個。這相當于6.8cM中196個交換，或平均每cM29個交換。在這些重組體中，在此300kb內(nèi)的交換意外地低體現(xiàn)300kb相當于約1.5cm，所以在此區(qū)中預(yù)期應(yīng)有43(2.9×1.5)個交換。但只發(fā)現(xiàn)了23個。
這些交換的分析也困難，因為沒有一個落在此300kb內(nèi)的YAC末端探針可被用作RFLP探針。這是因為它們之中沒有一個在用于制造重組體的親本間檢測RFLPs。一個RFLP標記可在此區(qū)內(nèi)使用，并且當它被用于分析重組體時，被發(fā)現(xiàn)是在REG17B5和CO之間，從而將該基因定位于pCIT1243和LEW4A9之間。然而，該基因的更確切位置不能通過此方法獲得，因為缺乏適合的探針。
在pCIT1243和LEW4A9間的交換的分布是不對稱的在pCIT1243和CO間有1個而在CO和LEW4A9間有19個。我們猜測該基因可能與pCIT1243接近。因此使用來自此區(qū)的一個探針池(LEG4C9，Labi19E1，pCIT1243，LEG21H11和REG4C9)來篩選一個考斯質(zhì)粒文庫以提供從pCIT1243向LEW4A9延伸的一系列考斯質(zhì)?？寺　Ｓ脝蝹€探針對這些克隆的分析顯示三種考斯質(zhì)粒A，B和C在需要的方向從pCIT1243延伸。這些隨后被用作RFLP標記并且證實該基因位于這些考斯質(zhì)粒上。
該步驟因此比Putterill等的文章中設(shè)想的更復(fù)雜，是因為在300kb區(qū)內(nèi)制造足夠的重組體和鑒定適當?shù)腞FLP標記中的困難。2.通過互補鑒定基因這3種考斯質(zhì)粒A，B和C被導(dǎo)入突變型植物，并且顯示B和C可糾正突變的效應(yīng)。因此該基因肯定位于B和C共有的DNA上，但在Putterill文章中提出的CO基因的最終鑒定方法失敗了。曾假想CO轉(zhuǎn)錄本的鑒定可通過使用互補DNA作為針對Northern印跡的探針，或者7個等位基因之一可在Southein印跡上顯示能引導(dǎo)至該基因的重排。但事實上，我們不能在Northern印跡上檢測CO轉(zhuǎn)錄本，也無任何重排表明基因可能在哪里。
這種方法的失敗使我們把與突變互補的基因組DNA按順序排好。地這種DNA的計算機分析確定了兩個互相鄰近的開放閱讀框，我們推測這些可能代表CO基因。我們還沒有這些開放閱讀框(ORF)被活躍地轉(zhuǎn)錄的證據(jù)，如人們對一個基因所期待的，因為在Northern印跡上未檢測到轉(zhuǎn)錄本并且在幾個cDNA文庫中未檢測到cDNA。因此我們使用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)以從RNA標本擴增cDNA。這顯示這兩種ORFs確實代表一種活性基因。對CO等位基因進行序列分析隨后證實它們含有單個堿基改變，或在一種情況下含有一個9bp缺失，通過Putterill等人的文章中提出的方法是不可能檢測到的?；蚪Y(jié)構(gòu)為確定該基因結(jié)構(gòu)，使用RT-PCR鑒定CO基因的cDNA(實驗步驟)。該cDNA的序列含有1122bp ORF，該ORF通過去除233bp內(nèi)含子從在基因組序列中鑒定的兩種ORFs得到。此開放閱讀框的翻譯預(yù)期可形成分子量為42kd，含373個氨基酸的蛋白。轉(zhuǎn)錄開始位點未被確定，但一個框內(nèi)翻譯終止密碼子位于ATG上游三個密碼子，表明整個被翻譯區(qū)已得到確定。通過3′-RACE產(chǎn)生的四個片段的序列測定，轉(zhuǎn)錄本的3′末端被定位。它們均在相互之間5個堿基之內(nèi)的不同位置含有多聚-A尾部。
搜尋可得到的數(shù)據(jù)庫以尋找與CO基因的推測翻譯產(chǎn)物享有同源性的蛋白。對PROSITE目錄的搜尋未檢測到CO蛋白內(nèi)的基序。而且，將CO蛋白序列與GenBank中的蛋白序列相比較的FASTA搜尋未檢測到顯著同源性。將co序列與LUMINIDENS，即從擬南芥屬克隆的另一種開花時間基因(Lee等，1994)，的序列的直接比較未檢測到同源性。然而，用眼對蛋白序列的分析確定了一個引人注目的半胱氨酸殘基的排列，它存在于接近CO蛋白的氨基末端的兩個區(qū)中。這些區(qū)中每一個含有以C-X2-C-X16-C-X2-C方式排列的4個半胱氨酸，這類似于GATA-1轉(zhuǎn)錄因子的鋅指區(qū)(C-X2-C-X17-C-X2-C)。
比較在預(yù)期的CO蛋白序列中直接互相鄰近并且每1個各自含有一個推定的鋅指的2個43氨基酸連續(xù)部分，顯示顯著的同源性氨基酸的46％相同而且86％為相同或相關(guān)。該保守性在每個突指的羧基側(cè)最明顯，這又使人想起GATA1轉(zhuǎn)錄因子，在該因子中此區(qū)是DNA結(jié)合所需要的一個基本區(qū)并且是高度保守的(Trainor等，1990；Brendel和Karlin，1989；Ramain等，1993)。在CO蛋白中此區(qū)還帶正電荷在鄰近氨基突指的區(qū)中帶有6個凈正電荷并且在鄰近羥基指突的區(qū)中帶有3個。
使用Wisconsin套件的FASTA程序?qū)O鋅指的CO蛋白序列與含有hGATAI的鋅指并且在GATAI家族的成員中保守的116氨基酸作比較(見Ramain等，1993)，鑒定了一個跨過CO的兩個鋅指并排列好hGATAI的鋅指和CO的鋅指的半胱氨酸的同源81氨基酸區(qū)。在CO和hGATAI的這些區(qū)之間，21％的氨基酸是一致的并且65％是相似或一致的。因此雖然CO不是GATAI家族的一員，它在鋅指區(qū)顯示對它們的相似性，并代表了含鋅指蛋白的新的一族。
這些區(qū)對CO活性的重要性的另一個指征是在CO-1和CO-2等位基因兩者中的突變影響在推測的鋅指區(qū)之間保守的殘基CO-2改變N-末端突指的羧基側(cè)的一個精氨酸為組氨酸，而CO-1缺失去除了C-末端突指的羧基側(cè)的3個氨基酸。在長和短日照生長植物中CO mRNA的表達通過篩查數(shù)個擬南芥屬cDNA文庫未發(fā)現(xiàn)CO cDNA克隆，而且在從3-4葉階段的幼苗提取的多聚A mRNA的Northern印跡上未檢測到該mRNA(資料未顯示)。因此使用RT-PCR繼以Southern印跡和對CO特異性探針的雜交以檢測CO轉(zhuǎn)錄本。這些實驗中使用的RNA分離自3-4葉階段的幼苗，因為這正處于在長日照下花芽可見之前并因此看來可能是基因?qū)⒁磉_的時間。
從在長日照下生長的植物制造的六個獨立的RNA標本均產(chǎn)生了COcDNA預(yù)期大小的雜交片段。在野生型或CO-1突變型植物之間未測到CO轉(zhuǎn)錄本含量的不同，提示CO基因的活性不是促進其自身轉(zhuǎn)錄所需要的。在長日照下開花時間受CO基因劑量影響對野生型等位基因和CO-1或CO-2雜合的植物在長日照下在介于CO純合體和Landsberg erecta之間的時間開花(Kooineef等，1991；F.Robson，未發(fā)表)。對這些突變型等位基因的序列測定證實它們均含有氨基酸序列的框內(nèi)改變。這可能提示CO的不完全顯性的兩種模型。突變型等位基因可能產(chǎn)生阻礙成花誘導(dǎo)的產(chǎn)物，或者突變可能在雜合體中引起功能喪失功CO蛋白水平的兩倍下降導(dǎo)致開花時間的延遲(單倍體不足(haplo-insufficiency))。本文所包括的結(jié)果傾向于單倍體不足的解釋。
在互補實驗中，含有兩拷貝考斯質(zhì)粒B或C并且對CO-2等位基因純合的轉(zhuǎn)基因植物在長日照下常在與野生型植物相同的時間開花。如果突變型等位基因編碼一種阻礙野生型蛋白活性的產(chǎn)物，則預(yù)期這不應(yīng)發(fā)生。而且，需要使用RT-PCR檢測CO轉(zhuǎn)錄本這一點提示它以非常低的水平存在，這與轉(zhuǎn)錄本水平的進一步降低引起晚開花的可能性是一致的。
CO劑量的增加可導(dǎo)致在長日照下開花稍稍提前。這是從一些攜帶CO基因的額外拷貝的轉(zhuǎn)基因系開花稍早于野生型植物的觀察結(jié)果總結(jié)出的(表1和表2)。這種觀察結(jié)果，與上面討論的單倍體不足表型一起，提示CO的表達水平是長日照下擬南芥屬開花時間的關(guān)鍵決定因子。方法生長條件和開花時間的測定開花條件通過在20℃在Sanyo Gelleukamp控制的環(huán)境室中培養(yǎng)植物在限定條件下測定。短日照包含10小時的光照射，使用400瓦金屬鹵化物能量之星燈補充以100瓦鹵化鎢燈照亮。這提供了113.7μmol光子/m2 S的有效光合照射水平和2.41的紅遠紅外線比例。類似的保溫室和燈被用于長日照。光照射期是在短日照時使用的相同條件下10小時并單使用鹵化鎢燈再延長8小時。在此保溫室中，用于10小時階段的燈的組合提供92.9μ mol光子/m2S的PAR和1.49的紅遠紅外線比例。8小時延長產(chǎn)生14.27μmol光子/m2S的PAR和0.66的紅遠紅外線比例。
大群體植物的開花時間在暖房中測定。在夏季只簡單地在陽光下培養(yǎng)植物。在冬季提供補充光照以使最短日長度為16小時。
為測定開花時間，將種子在4℃在濕濾紙上放置4天以打破休眠并隨后種在土壤上。發(fā)芽的幼苗在前1-2周通常用粘性薄膜或繁殖密封蓋封閉以防止脫水。開花時間通過在花蕾可見時計數(shù)瓣形體中包括子葉在內(nèi)的葉數(shù)而測定。葉數(shù)以95％可信限處的標準誤顯示。也記錄了從播種至花芽出現(xiàn)的天數(shù)，但未顯示。以前已證實對于Landsbrg erecta和CO等位基因在葉數(shù)和開花時間之間存在密切關(guān)聯(lián)(Koorneef等，1991)。植物材料使用的標準野生型表型為擬南芥Landsberg erecta。CO-1突變由Redei分離(1962)并且是在ERECTA背景中，在我們的實驗中顯示與Landsberg erecta無可檢測的RFLPs或序列變異。CO-2等位基因從Landsberg erecta中分離(Koornneef等，1991)。CO的精確RFLP制圖使用的系的詳情已在以前被描述(Putterill等，1993)。
在所有被描述的情況下，攜帶CO-2的系也攜帶tt4，雖然為了不使文中的表型描述過于復(fù)雜這一點未被提起。tt4突變是在苯丙烯酰苯合酶基因中并且防止種皮中的花青苷積蓄，但不影響開花時間(Koornneef等，1983)。該突變位于染色體5上，離CO約3.3cM(Putterill等，1993)。CO-2 tt4系的使用在證實個體植物確定攜帶CO-2突變中有用途。RNA提取RNA使用Stiekma等(1988)所述方法的改良版方法提取。在液氮中冷凍的約5g組織在咖啡豆磨具中磨碎并用15ml苯酚和15ml提取緩沖液(50mM Tris pH8，1mM EDTA，1％SDS)的混合物提取。該混合物被振蕩，離心并回收25ml水層。然后將它與0.7ml 4M氯化鈉，10ml苯酚和10ml氯仿的混合物劇烈搖動。在離心后回收水層并用25ml氯仿提取。隨后通過加入2ml 10M的LiCL從25ml水層中沉淀RNA，并通過離心回收沉淀物。將沉淀物溶于2ml DEPC水中并通過加入0.2ml 4M氯化鈉和4ml乙醇沉淀RNA。離心后將沉淀物溶于0.5mlDEPC水中并測定RNA濃度。DNA提取擬南芥屬DNA通過Dean等(1992)描述的GAB提取方法進行。通過RT-PCR的cDNA分離總RNA從暖房中長日照下生長的2-3葉階段整株幼苗分離。對第一條鏈cDNA合成，將10μl容積中的10μg RNA加熱至65℃3分鐘，然后快速在冰上冷卻。制造10μl反應(yīng)混合物，包含1μl RNAsin，1μl標準dT17-轉(zhuǎn)換器引物(1μl/μl，F(xiàn)rohman等，1988)，4μl 5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(250mM Tris Hcl pH8.3，375mM KCl，15mMMgCl2)，2μl GTT(100mM)，1μl dNTP(20mM)，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶(200單位，M-MLV Gibco)。此反應(yīng)混合物隨后被加至RNA中，產(chǎn)生20μl的終容積。該混合物在42℃溫育2小時并隨后用水稀釋至200μl。
將10μl稀釋的第一條鏈合成反應(yīng)物加至90μl PCR混合物中，此混合物含4μl 2.5mM dNTP，10μl 10×PCR緩沖液(Boehringcrplus Mg)，1μl每種引物的100ng/μl溶液，73.7μl水和0.3μl 5單位/μl Taq多聚酶(Boehringer or Cetus Amplitaq)。使用的引物為CO49(5′GCTCCCACACCATCAAACTTACTAC 5′末端位于CO翻譯起始點上游38bp)和CO50(5′CTCCTCGGCTTCGATTTCTC 5′末端位于CO的翻譯終止密碼子上游57bp)。反應(yīng)在94℃進行1分鐘，進行34次在55℃1分鐘在72℃2分鐘的循環(huán)并最后在72℃10分鐘。
將20μl反應(yīng)物通過瓊脂糖凝膠分離，并且通過用溴化乙錠染色證實存在期望大小的片段。將DNA轉(zhuǎn)至濾膜，并且目標片段顯示與來自CO基因的短DNA片段雜交。PCR反應(yīng)的剩余物被加載至另一凝膠上，提取被擴增的片段，用T4 DNA多聚酶處理并連接至用EcoRV剪切的藍本(Bluscript)載體(Stratagene)。該PCR反應(yīng)以雙份進行，并將兩份獨立擴增的cDNA測序以保證檢出任何PCR引起的錯誤。通過3′RACE的cDNA片段分離第1條鏈cDNA合成使用如上所述與RT-PCR相同條件，RNA標本和dT17-轉(zhuǎn)移器進行。該PCR隨后使用標準轉(zhuǎn)移器引物(5′gactcgagtcgacatcg；Frohman等，1988)和上述CO49引物進行。PCR條件除擴增循環(huán)前加上在72℃40分鐘的延伸外與上述相同。將20μl反應(yīng)物通過瓊脂糖凝膠分離，并檢測到少量長度在550bp和1.6kb之間的片段。反應(yīng)物的剩余部分被加至類似的凝膠上，切下預(yù)測含有1-2kb片段的區(qū)，提取DNA并進行第二輪使用轉(zhuǎn)換器引物和另一CO特異性引物(CO28，5′tgcagattctgcctacttacttgtgc，5′末端位于CO的翻譯開始位點下游94bp)的PCR。當在瓊脂糖凝膠上監(jiān)測此PCR時，檢測到約為1.3kb預(yù)期大小的片段。此片段從凝膠上被提取，用T4 DNA多聚酶處理并連接至用EcoRV剪切的藍本DNA。從這兩種獨立的擴增回收的四個被擴增片段進行完整的序列測定。所有四個片段都在稍微不同的位置被多腺苷酸化，如文中所述。通過RT-PCR檢測CO轉(zhuǎn)錄本除了RNA是從生長于受控制環(huán)境室的植物在不同階段分離外，第一條鏈合成完全按照上述用于分離cDNA克隆的方法進行。所有樣本都以雙份收獲和分析。
用于擴增CO cDNA的引物在文中和以前在實驗方法中描述。用于擴增用作對照的基因的cDNA的引物為CO1(5′TGATTCTGCCTACTTFTFCTC)和CO2(5′GCTTGGTTTGCCTCTTCATC)。DNA序列測定使用Sanger方法以測定插入藍本質(zhì)粒載體中的被研究片段的序列。反應(yīng)使用序列測定酶試劑盒進行(美國生物化學公司)。分離含有7個CO等位基因中的每一個的克隆DNA從對于每一種等位基因純合的植物提取。約1ng基因組DNA用水稀釋至10μl并被加至90μl反應(yīng)混合物，如上所述，只是使用引物1041(5′ggtcccaacgaagaagtgc 5′末端位于CO的翻譯起始密碼子上游263bp)和CO42(5′cagggaggcgtgaaagtgt5′末端位于CO的翻譯終止密碼子下游334bp)。PCR條件為94℃3分鐘，繼以34次94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘的循環(huán)，最后是72℃10分鐘。在每種情況中，這產(chǎn)生了預(yù)期大小1.95kb的一種主要片段。對每一等位基因，該PCR以雙份進行。在每一種情況，該反應(yīng)物都用苯酚和氯仿提取，乙醇沉淀并用T4 DNA多聚酶處理。反應(yīng)物隨后通過瓊脂糖凝膠分離，片段被純化并連接于sk+用EcoRV剪切的藍本。連接物被導(dǎo)入E.coli DH5 atpha并將重組體質(zhì)粒用菌落PCR篩選以尋找攜帶期望大小的插入者。來自每種等位基因的兩種獨立擴增的片段的DNA序列被測定。篩選噬菌體和考斯質(zhì)粒文庫考斯質(zhì)粒文庫的溶菌產(chǎn)物(Olszewski和Ausubel，1988)被用于E.coli DH5 alpha，并用本中描述的探針篩選2萬菌落。篩選3個cDNA文庫以試圖鑒定CO cDNA。篩選的噬菌斑數(shù)目為，5×105來自“氣生部分(aerial parts)”文庫(由EC擬南芥屬貯存種中心(ArabidopsisStock Center)，MPI，Cologne提供)，3×55個噬菌斑是從生長于滅菌燒杯中的植物制造的文庫(由Dr A.Bachmair制造并由EC擬南芥屬貯存種中心提供)，以及1×106噬菌斑來自CD4-71-PRL2文庫(由俄亥俄州立大學擬南芥屬生物資源中心(Arabidopsis BiologicalResource Center)提供)。擬南芥屬的轉(zhuǎn)化含有來自CO的鄰近的DNA的考斯質(zhì)粒被移動入根瘤桿菌屬C58C1中，并且T-DNA按照Valvekens等，1988所述導(dǎo)入擬南芥屬植物中。體外培養(yǎng)的植物的根被分離并在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(ValVekens等，1988)上培養(yǎng)2天。隨后根被切為短片段并與攜帶所研究質(zhì)粒的根瘤桿菌屬共培養(yǎng)。將根外植體在印跡紙上干燥并置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上2-3天。洗去土壤桿菌，根被干燥并置于抽枝誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(Valvekens等，1988)，此培養(yǎng)基含有萬古霉素以殺死土壤桿菌和卡那霉素以選擇轉(zhuǎn)化的植物細胞。在約6周后，根上的綠愈傷組織開始產(chǎn)生抽枝。將它們移去并置于含發(fā)生培養(yǎng)基(Valvekens等，988)的皮特里盤或品紅罐中。這些植物在品紅罐中產(chǎn)生種子。它們隨后被播種于含卡那霉素的發(fā)生培養(yǎng)基上以鑒定含有轉(zhuǎn)基因的被轉(zhuǎn)化幼苗(Valvekens等，1988)。實施例2-融合于CO開放閱讀框的啟動子的構(gòu)建將含有整個CO基因的PvuII-EcoRV片段插入藍本TM質(zhì)粒的獨特EcoRV位點。CO基因片段以特定方向插入以使EcoRV位點限定的末端鄰近于藍本TM多連接體(polylinker)中的HindIII位點。該質(zhì)粒被稱為PCOl。插入PCO1的PvuII-EcoRV片段含有兩個HindIII位點，二者都是CO蛋白翻譯開始點的5′。PCO1經(jīng)HindIII剪切產(chǎn)生一個含有從翻譯起始位點上游63bp至多腺苷酸化位點下游的PvuII位點的整個CO開放閱讀框的片段，以及來自通過多連接體內(nèi)對HindIII位點的連接事件產(chǎn)生的PvuII/EcoRV接點的所有藍本載體。以適當方向?qū)⒑衅蔚膯幼优c此片段連接產(chǎn)生了該啟動子對CO開放閱讀框的融合。例如，許多啟動子可在此位置被插入，如下所述。一種GSTII啟動子對CO開放閱讀框的融合GSTII含啟動子片段作為一個HindIII-NdeI片段來自質(zhì)粒pGIE7(由Zeneca提供)，其序列顯示于圖2中。將一個寡核苷酸轉(zhuǎn)化器(5′TACAAGCTTG)在NdeI位點插入以轉(zhuǎn)化其為HindIII位點。所產(chǎn)生的質(zhì)粒隨后用HindIII剪切，并將含啟動子的片段連接于含有CO開放閱讀框的HindIII片段。按照適當方向含有GSTII啟動子以使轉(zhuǎn)錄向著CO開放閱讀框方向發(fā)生的一種重組質(zhì)粒通過PstI消化被鑒定。該GSTII-CO融合體隨后被移入Jones等(1992)描述的二元載體，作為一種ClaI-XbaI片段。
該二元載體可被導(dǎo)入土壤桿菌株系并用于向雙子葉種屬導(dǎo)入該融合體，或者可通過裸DNA轉(zhuǎn)化步驟將該融合體導(dǎo)入單子葉種屬。轉(zhuǎn)化的程序?qū)τ谠S多種屬已建立，如以前所述。
通過施用一種外源性誘導(dǎo)物如除草劑防護劑dichloramid和flurazole，GSTII啟動子可用于誘導(dǎo)CO基因的表達，如WO 93/01294(帝國化學工業(yè)有限公司)中所述。一種熱休克啟動子對CO開放閱讀框的融合另一種誘導(dǎo)系體采用已被很好地進行特征描繪的大豆熱休克啟動子，Gmhsp 17.3B，它通過許多植物種屬中暴露于高溫引起的表達誘導(dǎo)(Balcells等討論，1994)。該啟動子可作為一種440bp Xba-XhoI片段得到(Balcells等，1994)，它在用T4 DNA多聚酶處理后可插入用HindIII剪切的pCO1，如上關(guān)于GSTII融合體所述。所產(chǎn)生的融合體可隨后被導(dǎo)入二元載體，土壤桿菌屬和轉(zhuǎn)基因植物，如前所述。CO表達可通過將植物暴露大約40℃的溫度而誘導(dǎo)。對含有四環(huán)素抵抗基因操縱基因的改良CaMV 35S啟動子的CO基因的融合含有來自細菌四環(huán)素抵抗基因的3個操縱基因的改良CaMV 35S啟動子已被發(fā)展為一種化學可誘導(dǎo)系統(tǒng)。在四環(huán)素基因阻遏蛋白存在下此啟動子是無活性的，但這種抑制作用可通過向植物提供四環(huán)素克隆(Gatz等，1992)。這是可融合于CO開放閱讀框的另一種化學可誘導(dǎo)啟動子。此啟動子可以作為SmaI-XbaI片段獲得(Gatz等，1992)，它在用T4 DNA多聚酶處理后可插入用HindIII剪切的pCO1，如前所述。在向也含有阻遏蛋白基因的植物中導(dǎo)入此融合體后，可通過向植物提供四環(huán)素誘導(dǎo)CO表達。一種CaMV 35S啟動子對CO開放閱讀框的融合CaMV 35S啟動子從質(zhì)粒pJIT62分離(其物理圖顯示于圖4)。通過連接于用HindIII和KpnI剪切的質(zhì)粒pCO1，含有CaMV 35S啟動子的KpnI-HindIII片段被融合于CO開放閱讀框。然后通過插入轉(zhuǎn)換器寡核苷酸(5′TATCGATAGTAC)將單KpnI位點轉(zhuǎn)變?yōu)镃laI位點，并隨后將含有融合于CO ORF的啟動子的ClaI-BamHI片段插入一個二元載體中。通過使用根瘤桿菌屬或作為裸DNA，該融合體可被導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物中。如前所述。meri 5啟動子對CO開放閱讀框的融合meri 5啟動子可作為2.4kb BglII StuI片段獲得(Medford等，1991)。它可用T4 DNA多聚酶處理并插入pCO1的HindIII位點，如上所述。該融合體可隨后被導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物，如上所述。實施例3-攜帶CO的額外拷貝的植物在短日照下的開花時間在短日照條件下，野生型植物和CO-2純合體兩者在近似相同的時間開花(表1)，提示CO產(chǎn)物不是在這些條件下開花需要的。然而在短日照下，攜帶來自考斯質(zhì)粒B和C的T-DNA的CO-2 tt4家族中的數(shù)種開花早于親本CO-2系和野生型兩者(表1)。特別地，攜帶考斯質(zhì)粒C的兩系(4和6)開花更早于野生型。這提示在一些家族中，CO的轉(zhuǎn)基因拷貝以高于原始拷貝的水平表達，或異位表達，因而這導(dǎo)致了在短日照條件下開花早于野生型植物。
考斯質(zhì)粒B也被導(dǎo)入野生型Landsberg erecta植物，并且在單個位點對轉(zhuǎn)基因純合的T2植物以上述相同方式被鑒定(表1)。在T3代中分析的3種獨立轉(zhuǎn)化體中，一種在長日照下開花稍早于野生型植物，并在短日照下明顯地更早(表1)。這再一次提示，至少在一些染色體位置，CO基因的額外拷貝可引起早開花。實施例4-使用CaMV 35S啟動子/CO基因融合體影響開花特性CaMV 35S啟動子對CO開放閱讀框的融合體被導(dǎo)入CO突變體擬南芥屬植物。首先將實施例2中描述的ClaI-BamHI片段插入二元載體SLJ 1711的ClaI-BamHI位點(Jones等，1992)。攜帶此載體的根瘤桿菌株系隨后被用于擬南芥屬根外框體的轉(zhuǎn)化，隨后是被轉(zhuǎn)化的植物的再生，如Valvekens等所述(1988)。
在誘導(dǎo)性和非誘導(dǎo)性兩種條件下，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物開花顯著早于野生型。例如，在誘導(dǎo)性長日照條件下，野生型植物在形成約5片葉后開化，而轉(zhuǎn)基因植物在3-4片葉時開花。在非誘導(dǎo)性短日照下，野生型植物在有約20片葉時開花，而轉(zhuǎn)基因植物形成3-4片葉。使用啟動子融合體以增加CO mDNA的豐度，或改變CO轉(zhuǎn)錄的特性，可因而被用于引起比野生型植物顯著提早的開花。
另外，一些攜帶CaMV 35S啟動子對CO基因的融合體的轉(zhuǎn)基因植物在抽枝的末端形成頂生花。野生型植物的抽枝顯示無限的生長，無限地在抽枝的側(cè)面生長和形成花。然而，頂生花(tfl)突變型顯示有限的生長，通過在抽枝頂部形成花而提前終止抽枝發(fā)育。在野生型植物中，TFL基因被認為能防止在抽枝頂部花的形成，是通過防止促進花發(fā)育的基因如LEAFY(LFY)在頂部細胞中的表達實現(xiàn)的。支持這一點的觀察結(jié)果為LFY在tf1突變型的抽枝頂部表達但不在野生型植物中表達，以及CaMV 35S啟動子對LFY的融合體引起轉(zhuǎn)基因植物形成頂生花(Weigel和Nilsen，1995)。意在不受任何特定理論的束縛，因而CO對CaMV 35S啟動子的融合體可能通過在抽枝頂部激活象LFY那樣的基因而引起頂生花。
CO對CaMV 35S啟動子的融合體引起的兩種表型即早開花和形成頂生花，可通過使用其它啟動子分開。例如，通過使用一種主要在頂分生組織中表達的啟動子如上述meri 5基因的啟動子，可使頂生花形成最優(yōu)化，而通過來自在頂分生組織中不良好表達的啟動子如熱休克啟動子的基因的表達可導(dǎo)致早開花而無頂生花。實施例5-來自蔓菁的CO純合體的克隆低嚴格性雜交(Sambrook等，1989)被用于篩查從蔓菁DNA制造的λ基因組DNA文庫。陽性雜交克隆通過構(gòu)建它們的限制性酶剪切位點圖譜(使用HindIII，XhoI，EcoRV，XbaI，EcoRI和NdeI)分析和分類。CO純合體能夠與CO基因家族的其它成員區(qū)分開的原因在于它們的限制性酶圖譜與擬南芥屬CO基因的圖譜的相似性，以及因為位于擬南芥基因組中緊臨CO的第二基因顯示出現(xiàn)于蕓苔屬克隆中相似位置。兩種CO同系物，即對應(yīng)于存在于蔓菁連接基因N10和N19(Sharpe等，1995)上的基因隨后被亞克隆入質(zhì)粒并測序。來自N10連接基團的基因的序列顯示于圖5而來自N9連接基團的顯示于圖6。由這些基因編碼的蛋白的氨基酸序列非常類似于擬南芥屬CO基因的，特別是在通過突變發(fā)生證實對蛋白的功能重要的區(qū)中；跨鋅指區(qū)的86個氨基酸84％一致，蛋白的羧基末端的50個氨基酸區(qū)，即在兩種擬南芥屬突變型中受影響的區(qū)，為88％相同。這兩個區(qū)非常保守，而蛋白中部插入的187個氨基酸為64％相同。
此序列分析表明CO同系物可從擬南芥屬外的其它植物種屬分離。另外，限制性片段長度多態(tài)性繪圖強烈提示CO同系物對調(diào)節(jié)其它種屬的開花時間是重要的。在黑芥中CO同系物與開花時間的一個主要定量特征位點緊密共分離(U.Lagercrantz等，印刷中)，以及在蔓菁中繪制于連接基團N2和N12的CO同系物與開花時間的等位基因變異共分離。表1.在攜帶考斯質(zhì)粒B或C植物T-DNA的co-2的T2和T3代中的開花時間和卡那霉素性抵抗性的分離
<p>通過計數(shù)花蕾出現(xiàn)于瓣形體中央時存在的葉數(shù)測量開花時間(Koornneef等，1991；實驗方法)。
1.在每一家族中80株以上植物被測定，但對于考斯質(zhì)粒B系3，其中只使用了35株植物。
2.每一家族中10株植物被測定。
3.此群體中的大標準誤是由于2株植物帶有18片葉開花，而其它8株在開花時葉數(shù)為5.1+/-1。使用T-DNA片段作為探針進行Sourtheen分析，鑒定了6個雜交片段。開花時間的變異因此是由于一種早開花所需要的T-DNA拷貝的分離，或由于在一些個體中轉(zhuǎn)基因抑制活性的共抑制的發(fā)生。
表2-攜帶10基因額外拷貝的轉(zhuǎn)基因野生型植物的開花時間
1.每一家族中80株以上植物被測定。
2.每一家族中10株植物被測定。
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權(quán)利要求
1.一種核酸分離體，它包含編碼具有CO功能的多肽的核酸序列。
2.按照權(quán)利要求1的核酸，其中所述核苷酸序列是擬南芥的CO基因或其它植物種屬的CO同系物，或該基因或同系物的突變型，衍生物或等位基因的核苷酸序列。
3.按照權(quán)利要求2的核酸，其中所述CO核苷酸序列顯示于圖1中。
4.按照權(quán)利要求2的核酸，其中所述CO同系物來自蕓苔屬。
5.按照權(quán)利要求4的核酸，其中所述CO同系物核苷酸序列顯示于圖5或圖6。
6.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的核酸，其中所述核苷酸序列的表達延遲在轉(zhuǎn)基因植物中的開花。
7.按照權(quán)利要求2的核酸，其中被所述核苷酸序列編碼的多肽是野生型CO或野生型CO同系物的突變型或衍生物并且所述核苷酸序列的表達延遲植物中的開花。
8.按照權(quán)利要求2的核酸，其中被所述核苷酸序列編碼的多肽是野生型CO或野生型CO同系物的突變型或衍生物并且所述核苷酸序列的表達促進植物中的開花。
9.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的核酸，其中所述核苷酸序列的表達促進轉(zhuǎn)基因植物中的開花。
10.一種核酸分離體，它包含編碼能夠補足植物中的突變型表型的多肽的一種核苷酸序列，所述表型為延遲的開花，該開花時間基本不受春化作用的影響。
11.一種核酸分離體，它包含一種核苷酸序列，此序列是編碼能夠影響開花時間的多肽的野生型基因的突變型或衍生物，該突變型或衍生物表型為延遲或提早的開花，開花時間基本不受春化作用的影響。
12.按照權(quán)利要求1至11的任意一項的核酸，還包含一個用于所述多肽的表達的調(diào)節(jié)序列。
13.按照權(quán)利要求12的核酸，它包含一個可誘導(dǎo)啟動子。
14.按照權(quán)利要求13的核酸，其中該啟動子來自編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，同種型II的27KD亞單位的一種玉米基因。
15.一種核酸分離體，它包含一種核苷酸序列，此序列互補于權(quán)利要求1至11中任意一項的編碼序列或所述編碼序列的一個片段。
16.按照權(quán)利要求1至12或權(quán)利要求15中任意一項的是DNA的核酸，其中所述核苷酸序列或其片段是在用于所述核苷酸序列或其片段的反義轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列控制之下。
17.按照權(quán)利要求16的核酸，它包含一種可誘導(dǎo)啟動子。
18.按照權(quán)利要求17的核酸，其中該啟動子來自編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，同種型II的27KD亞單位的玉米基因。
19.一種核酸載體，它適合于植物細胞的轉(zhuǎn)化并包含按照前述權(quán)利要求之任意一項的核酸。
20.一種植物細胞，它包含按照任何前述權(quán)利要求的核酸。
21.按照權(quán)利要求20的一種植物細胞，在其基因組內(nèi)具有異源的所述核酸。
22.按照權(quán)利要求21的一種植物細胞，它的每個單倍體基因組具有一個以上所述核苷酸序列。
23.一種植物，它包含按照權(quán)利要求20至22的任意一項的植物細胞。
24.按照權(quán)利要求23的植物的自身或雜種子代或后代，或這種植物，子代或后代的任意一部分或繁殖體，如種子。
25.一種影響植物的開花特性的方法，該方法包含引起或允許由按照權(quán)利要求1至14的任意一項的核酸編碼的多肽從植物細胞中的該核酸表達。
26.一種影響植物的開花特性的方法，該方法包含引起或允許在植物細胞內(nèi)從按照權(quán)利要求1至14的任意一項的核酸的轉(zhuǎn)錄。
27.一種影響植物的開花特性的方法，該方法包含引起或允許在植物細胞內(nèi)從按照權(quán)利要求15至18的任意一項的核酸的反義轉(zhuǎn)錄。
28.一種從擬南芥以外其它植物種屬鑒定和克隆CO同系物的方法，該方法使用一種來自顯示于圖1中的核苷酸序列。
29.編碼CO同系物的核酸，通過權(quán)利要求28的方法獲得。
30.按照權(quán)利要求29的核酸，它包含顯示于圖5或圖6的核苷酸序列。
31.一種從擬南芥外其它植物種屬鑒定和克隆CO同系物的方法，該方法使用一種衍生自顯示于圖5或圖6中的序列的核苷酸序列。
32.編碼CO同系物的核酸，通過權(quán)利要求31的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供擬南芥的CONSTANS(CO)基因和來自蔓菁的同系物,并可用于影響轉(zhuǎn)基因植物中的開花特性,特別是開花的時間選擇。
文檔編號C12N15/82GK1171817SQ9519714
公開日1998年1月28日 申請日期1995年11月1日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月2日
發(fā)明者G·M·科帕蘭德, J·J·普特利爾 申請人:約翰·英尼斯創(chuàng)新中心有限公司