專利名稱：生產(chǎn)D－N－氨基甲?；粒被岬姆椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的方法。更具體地講，本發(fā)明涉及用一種新型轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的方法，該轉(zhuǎn)化體具有編碼一種酶的基因，該酶能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸(以下將所述酶稱作乙內(nèi)酰脲酶)。
旋光D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸可被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-α-氨基酸，而旋光D-α-氨基酸是重要的制藥用中間化合物。具體地講，工業(yè)用化合物包括用作生產(chǎn)半合成青霉素和半合成頭孢菌素的中間化合物的D-苯基甘氨酸和D-(P-羥苯基)甘氨酸。
為了生產(chǎn)D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸，已知采用能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的微生物酶促反應(yīng)的方法，所述方法披露于JP-A 53-91189、JP-A 53-44690、JP-A 53-69884、JP-A53-133688等中。
此外，由嗜熱微生物獲得了一種與乙內(nèi)酰脲酶有關(guān)的基因(所述酶是一種能將5-取代的乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的酶)并將該基因插入中溫微生物中以產(chǎn)生具有乙內(nèi)酰脲酶活性的轉(zhuǎn)化型微生物。另外，在WO 94/00577中，乙內(nèi)酰脲酶基因片段是從屬于農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的微生物中提取，并將其導(dǎo)入大腸桿菌(E.Coli)或農(nóng)桿菌屬的一種微生物中，以表達這種酶的活性。
上述利用微生物酶促反應(yīng)的方法具有以下缺陷已知為所述酶的來源的微生物的酶產(chǎn)量不足，而且，培養(yǎng)基昂貴。
另外，就JP-A 62-87089中所披露的轉(zhuǎn)化型微生物而言，其酶促活性僅比具有乙內(nèi)酰脲酶活性的孢子形成嗜熱微生物高幾倍，而且酶的產(chǎn)量仍然不足。
此外，現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有用上述轉(zhuǎn)化型微生物對5-取代乙內(nèi)酰脲進行不對稱裂解水解以便產(chǎn)生和積累相應(yīng)的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的先例。
本發(fā)明就是為了解決上述問題，而且涉及創(chuàng)造一種具有極高的酶產(chǎn)量的微生物，還涉及用由此所獲得的酶源有效地生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸。
JP-A 62-87089和WO 94/00577披露了通過重組DNA技術(shù)獲得乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)微生物的方法。不過，用于提供乙內(nèi)酰脲酶基因的來源微生物完全不同于在本發(fā)明中被用于獲得乙內(nèi)酰脲酶基因的微生物。另外，所述乙內(nèi)酰脲酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列明顯不同于本發(fā)明的有關(guān)序列本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的方法，該方法包括在一種含水介質(zhì)中使5-取代乙內(nèi)酰脲與乙內(nèi)酰脲酶反應(yīng)，該乙內(nèi)酰脲酶是由一種轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生，而轉(zhuǎn)化體又是通過用含有源自芽胞桿菌KNK245(FERMBP-4863)、農(nóng)桿菌KNK712(FERM BP-1900)或假單胞菌KNK003A(FERM BP-3181)的乙內(nèi)酰脲酶編碼基因的一種DNA片段和一種載體DNA的重組DNA轉(zhuǎn)化一種宿主微生物，如屬于埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬、黃桿菌屬、芽胞桿菌屬、沙雷菌屬(Serratia)、農(nóng)桿菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物而獲得的。
迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中尚未見具有極高乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體，如在本發(fā)明中所得到的轉(zhuǎn)化體，而且，通過利用該轉(zhuǎn)化體的酶的反應(yīng)能夠極為有效和經(jīng)濟地生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸。
隨后，將結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細說明。


圖1是質(zhì)粒pAH1043的限制酶圖。
圖2是質(zhì)粒pTH102的限制酶圖。
圖3是質(zhì)粒pTH103的限制酶圖。
圖4是質(zhì)粒pTH104的限制酶圖。
圖5是質(zhì)粒pPHD301的限制酶圖。
圖6是質(zhì)粒pTHB301的限制酶圖。
可以從芽胞桿菌KNK245、農(nóng)桿菌KNK712或假單胞菌KNK003A獲得帶有用于本發(fā)明的基因的DNA片段。
農(nóng)桿菌KNK712和假單胞菌KNK003A已由本發(fā)明人保藏于NIBH(National Institute of Bioscience and Human Technology)，A-gency of Industrial Science&Technology，Ministry of internationalTrade&Industry，保藏編號分別為FERM BP-1900和FERM BP-3181，這些菌株詳細披露于Wo 92/10579中。芽胞桿菌KNK245是由本發(fā)明人新發(fā)現(xiàn)的菌株，并于1994年11月2日提交NIBH保藏，保藏編號為FERM BP-4863。
芽胞桿菌KNK245的微生物學(xué)特征如下芽胞桿菌 KNK245形狀 棒狀，絲狀大小 0.5-0.8x3-10(μm)革蘭氏染色 +孢子+游動性 -生長溫度 37-60℃生長pH 5.0-8.9生長于5％NaCl中 -生長于7％NaCl中 -生長于0.02％疊氮化物中 -生長于0.001％溶菌酶中 -硝酸還原-淀粉水解+酪蛋白分解 +酪氨酸分解 -過氧化氫酶 -氧化酶 +吲哚產(chǎn)生-
由碳水化合物產(chǎn)生酸甘露糖 (+)木糖 -阿拉伯糖 +鼠李糖-萄萄糖+果糖 +棉子糖-蔗糖 +麥芽糖+乳糖 -為了從所述菌株中獲取乙內(nèi)酰脲酶基因，通常采用以下方法。
首先，從一種微生物細胞中提取基因組DNA，然后用合適的限制酶，如Sau3AI等對該DNA進行部分水解。將所得到的片段連接到載體DNA上，以得到具有各種基因組DNA片段的重組DNA分子作為基因文庫(見JP-A 58-126789和US 4,237,224)。
然后，從該基因文庫中選擇帶有所需基因的重組體。例如，可以通過檢測表達蛋白的酶促活性進行選擇，或通過分析蛋白的N-末端序列，合成相應(yīng)的DNA探針并通過菌落雜交等檢測目的基因的存在。另外，可以采用DNA引物通過菌落雜交或聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法獲得所需要的基因，所述DNA引物是合成的已知乙內(nèi)酰脲酶堿基序列的合適部分。一旦得到目的基因，即分析其核苷酸序列。另外，對一種乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)微生物和一種含有該酶基因的重組體進行培養(yǎng)。純化所得到的酶，并測定所得蛋白的分子量。同時，用一臺氣相蛋白測序儀或類似裝置測其N-末端部分的氨基酸序列。
接著，通過比較所述DNA核苷酸序列和N-末端氨基酸序列，確定編碼乙內(nèi)酰脲酶蛋白的核苷酸序列部分翻譯成蛋白的起始位點，而且，通過考慮其與該蛋白分子量的關(guān)系證實，該酶蛋白是由所述基因上從該起始位點至終止密碼子的部分編碼，從而證實了所述目的基因(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Chapter 4和13)。因此，從芽胞桿菌KNK245、農(nóng)桿菌KNK712和假單胞菌KNK003A中獲得了序列1、2和3的DNA片段。眾所周知，編碼由此獲得的酶的基因和/或帶有該基因的DNA片段與具有編碼相應(yīng)于上述基因和/或DNA片段的氨基酸序列的另一種核苷酸序列的DNA片段相同，因為一個氨基酸通常相應(yīng)于若干個堿基密碼子。
可用于本發(fā)明的載體包括質(zhì)粒、噬菌體或其衍生物，它們源于微生物，并能夠在屬于埃希氏菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、芽胞桿菌屬、沙雷菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬的細菌細胞中自主生長。
例如，可以采用披露于“Guidelines on Recombinant DNA Experi-ments，-Commentation，Q and A-”(The life Science Section of theResearch Development Office in the Science and Technology Agency，Ed.，revised Sept.16，1987)的第25至27頁和第36至38頁上的宿主-載體系統(tǒng)。另外，可將重組DNA用于提高待生產(chǎn)的酶的量的目的，該重組DNA具有一個與一種載體的適當(dāng)位置連接的翻譯起始位點，對該載體作過修飾，使其具有強結(jié)構(gòu)啟動子。用一種限制酶對該片段的兩端進行切割，以形成與合適載體的重組體。通過直接轉(zhuǎn)化屬于埃希氏菌、假單胞菌、黃桿菌、芽胞桿菌、沙雷桿菌、農(nóng)桿菌、棒狀桿菌或短桿菌屬的微生物可以產(chǎn)生乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)重組微生物。
無須直接轉(zhuǎn)化上述屬的微生物也可獲得乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)重組微生物；即，一旦用其它微生物，如大腸桿菌將目的基因克隆到宿主載體系統(tǒng)中，此后便產(chǎn)生了具有合適載體的重組DNA。
以下文獻所披露的內(nèi)容可廣泛用于生產(chǎn)重組體授予S.N.Cohen等的美國專利US4,237,244說明書；Idenshi-SousaJikken-hou(Experimental Method of Gene Manipulation)”[Ed.，Yasuyuki TAKAGI，Kohdan-sha Scientific(1980)]；Method in En-zymology，68，Recombinant DNA[Ed.，Ray Mv，Academic Press(1979)]，JP-A58126789說明書等。
克隆目的基因，并除去其不必要的DNA?？梢杂闷浞g起始位點與一個載體上的合適位置連接的重組DNA轉(zhuǎn)化上述宿主細胞，以便提高待生產(chǎn)的酶產(chǎn)量，對所述載體作過修飾，使其具有強結(jié)構(gòu)啟動子。
在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，以表達導(dǎo)入的重組DNA。當(dāng)來自基因DNA或載體DNA的一個性狀被賦予重組DNA之后，可根據(jù)具體性狀將一種合適的成分加入培養(yǎng)基中。
為了將由此所得的轉(zhuǎn)化體作為酶的生產(chǎn)源，可以用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)化體。如果必要，還可以進行一種處理，以便誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生，如添加乙內(nèi)酰脲化合物、尿嘧啶、異丙基-1-硫基-β-D-半乳糖苷(IPTG)等，并提高溫度。通常，用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基可以是含有碳源、氮源和無機離子的培養(yǎng)基。在很多場合，通過進一步添加有機微量養(yǎng)分，如維生素、氨基酸等可以獲得理想的結(jié)果。通常，可將諸如葡萄糖和蔗糖之類的碳水化合物、諸如乙酸之類的有機酸、和醇等用作碳源。作為氮源，可以采用氨氣、氨水、銨鹽等。作為無機離子，可以采用磷酸根離子、鎂離子、鉀離子、鐵離子、錳離子、鉆離子、鎳離子、銅離子、鋁離子、鉬離子等。
如果在需氧條件下培養(yǎng)1～10天，同時，分別將pH和溫度調(diào)整至4-8和25-60℃的合適范圍，可以獲得理想結(jié)果。
由轉(zhuǎn)化體所產(chǎn)生的酶促活性可以如下形式表現(xiàn)，如轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液、其微生物細胞、自該微生物細胞中提取的酶、固定化微生物細胞等。
作為微生物細胞，可以采用任何培養(yǎng)液，在結(jié)束培養(yǎng)液的培養(yǎng)之后，從培養(yǎng)液中分離微生物細胞，洗滌微生物細胞，然后即可使用。作為處理過的微生物細胞，可以采用凍干的微生物細胞、丙酮干燥的微生物細胞、與甲苯或洗滌劑接觸的微生物細胞、溶菌酶處理過的微生物細胞、超聲處理過的微生物細胞、機械研磨的微生物細胞等。另外，可以使用獲自上述處理過的微生物細胞、固定化微生物細胞、不可溶化處理的微生物細胞的具有乙內(nèi)酰脲酶活性的酶提取物，固定在用于固定化的支持物(如陰離子交換樹脂)上的酶蛋白。固定化的方法可以參考JP-A63-185382等的說明書。
作為固定化用的支持物，適用的有酚醛陰離子交換樹脂，如Duolite A568或DS17186(Rohm&Haas Co.注冊商標(biāo))；以及含有各種胺、銨鹽、或二羥乙基胺類官能團類的各種陰離子交換樹脂，例如聚苯乙烯樹脂，如Amberlite IRA935、IRA945、IRA901(Rohm&haas Co.注冊商標(biāo))、Lewatit OC1037(Bayer A.G.注冊商標(biāo))和Diaion EX-05(Mitsubishi Chemical Industries，Ltd.注冊商標(biāo))。其它支持物，如DEAE-纖維素也可以采用。
另外，為了獲得更強、更穩(wěn)定的酶吸收，通常采用交聯(lián)劑，交聯(lián)劑的優(yōu)選例子為戊二醛。所使用的酶不僅可以是純化酶，而且可以是具有不同純化度的酶，如部分純化的酶、解離的微生物細胞的懸浮液和無細胞提取液。固定化酶的制備可以按常規(guī)方法進行，例如，將酶吸附在一種支持物上，隨后進行交聯(lián)處理。
對用作本發(fā)明酶促反應(yīng)的底物的5-取代乙內(nèi)酰脲無特殊限制，可以是通常用于此類反應(yīng)的任何化合物。其例子包括由以下通式(1)所代表的化合物
式(1)化合物的取代基的選擇范圍很寬。為了提供工業(yè)用制品，如藥物的中間化合物，優(yōu)選的R為苯基、由羥基取代的苯基、烷基、取代烷基、芳烷基或噻吩基。對于由羥基取代的苯基來說，羥基數(shù)可以為一個或幾個，而且可以位于鄰-、間-和對-位中的任一位置上，其典型例子為對羥苯基。烷基是1-4個碳原子的基團，相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸是D-N-氨基甲?；?丙氨酸、D-N-氮基甲?；i氨酸、D-N-氨基甲酰基亮氨酸、D-N-氨基甲?；惲涟彼岬取Ｋ鋈〈榛鶠橛昧u基、烷基硫基、羧基、氨基、苯基、羥基取代的苯基、酰胺基等取代的1-4個碳原子的烷基，其相應(yīng)的D-N-氨基甲?；被釣镈-N-氨基甲?；?絲氨酸、D-N-氨基甲酰基蘇氨酸、D-N-氨基甲?；鞍彼帷-N-氨基甲?；腚装彼?、D-N-氨基甲?；於０?、D-N-氨基甲?；劝滨０?、D-N-氨基甲?；野彼?、D-N-氨基甲酰基-色氨酸、D-N-氨基甲?；於彼?、D-N-氨基甲?；劝彼帷-N-氨基甲?；M氨酸、D-N-氨基甲?；嚢彼?、D-N-氨基甲?；彼?、D-N-氨基甲?；习彼岬?。芳烷基是具有7-8個碳原子的基團，例如芐基或苯乙基，相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸為D-N-氨基甲?；?苯丙氨酸等。
作為含水介質(zhì)，可以使用含有水、緩沖液或有機溶劑，如乙醇的介質(zhì)。另外，必要時還可向該含水介質(zhì)中加入微生物生長所需的營養(yǎng)物、抗氧化劑、洗滌劑、輔酶、羥胺、金屬等。
當(dāng)在水溶性介質(zhì)中培養(yǎng)上述微生物的微生物細胞時，讓該微生物細胞接觸一種特定的5-取代乙內(nèi)酰脲的情況下，采用一種不僅含有5-取代乙內(nèi)酰脲，而且含有微生物生長所需的營養(yǎng)物，如碳源、氮源和無機離子源的含水介質(zhì)。如果再向其中加入諸如維生素和氨基酸之類的有機微量營養(yǎng)物，在多數(shù)情況下會取得理想效果。作為碳源，通常采用諸如葡萄糖、蔗糖之類的碳水化合物，諸如乙酸之類的有機酸；醇等。作為氮源，可以采用氨氣、氨水、銨鹽等。作為無機離子，可以采用磷酸根離子、鎂離子、鉀離子、鐵離子、錳離子、鉆離子、鎳離子、銅離子、鋁離子、鉬離子等。
培養(yǎng)是在有氧條件下進行，同時，分別將pH和溫度調(diào)至4-8和25～60℃的適當(dāng)范圍內(nèi)。如果培養(yǎng)進行1～10天，能高效地將5-取代的乙內(nèi)酰脲僅轉(zhuǎn)化為D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸。
另一方面，當(dāng)讓上述微生物的培養(yǎng)液原樣與培養(yǎng)的微生物細胞、處理過的微生物細胞、酶提取物、固定化微生物細胞、不可溶化的微生物細胞或固定的酶蛋白在含有溶解的或懸浮的5-取代乙內(nèi)酰脲的含水介質(zhì)中反應(yīng)時，可將反應(yīng)混合物靜置一段時間或攪拌，同時維持10-80℃的適當(dāng)溫度和pH4-9.5的適當(dāng)pH值。因此，如果將反應(yīng)進行5-100小時，由乙內(nèi)酰脲酶進行底物的D-特異性水解反應(yīng)，而且底物發(fā)生化學(xué)外消旋，所有D-，DL-或L-5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸，從而在所述含水介質(zhì)中積累大量的氨基酸。另外，可以隨著反應(yīng)的進行，以單獨部分加入5-取代乙內(nèi)酰脲。
可以分離所產(chǎn)生的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸，并通過常規(guī)分離方法提純。
通過采用按上述方法獲得的分離并純化的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸或由乙內(nèi)酰脲酶反應(yīng)所獲得的反應(yīng)混合物可很容易地獲得D-α-氨基酸，通過化學(xué)作用或具有脫甲氨酰酶活性的酶促作用將D-N-氨基甲?；?α-氨基酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-α-氨基酸。
下面的實施例將對本發(fā)明作進一步的詳細說明。例1從土壤中分離具有乙內(nèi)酰脲酶活性的微生物將0.5g土壤樣品懸浮于2ml生理鹽水中之后，靜置該懸浮液，然后將1滴上清液涂在一種分離瓊脂板培養(yǎng)基(1.0％肉膏，1.0％胨，1.0％酵母提取物，0.3％氯化鈉，2.0％瓊脂；pH7.5)上。將其在50℃下培養(yǎng)2天，并將所得菌落轉(zhuǎn)移到添加了0.1％尿嘧啶和20ppm氯化錳的同一分離平板培養(yǎng)基上，并在50℃下再培養(yǎng)1天。將所獲得的微生物細胞懸浮于100μl反應(yīng)底物溶液[DL-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲30mM，亞硫酸鈉0.1％，碳酸緩沖液50mM]中，并讓其在50℃下反應(yīng)2小時。然后，將反應(yīng)混合物點滴在TLC板上，用展開溶劑丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶1)展開，接著用在濃鹽酸中配制的10％對二甲氨基苯甲醛溶液顯色，檢測黃色斑點，以便選擇能產(chǎn)生N-氨基甲?；?對羥苯基甘氨酸的微生物菌株。這樣，從2740個菌落中分離得到具有高乙內(nèi)酰脲酶活性的芽胞桿菌KNK245(FERM BP-4863)。例2得自芽胞桿菌KNK245的乙內(nèi)酰脲酶的N-末端氨基酸測序?qū)⒁徽h(huán)的芽胞桿菌KNK245接種到盛于500ml體積的Sak-aguchi燒瓶中的100ml接種培養(yǎng)基(1.0％肉膏、1.0％胨、0.5％酵母提取物；pH7.5)里，并在55℃下培養(yǎng)19小時。然后將2％的該培養(yǎng)物接種到盛于2L Sakaguchi燒瓶中的500ml主培養(yǎng)基(1.0％肉膏，1.0％胨，0.5％尿嘧啶，20ppm氯化錳四水合物；pH7.5)里，并在55℃下培養(yǎng)19小時。通過離心從由此獲得的9升培養(yǎng)液中收集微生物細胞。將其懸浮于含有20mM硫酸錳的0.2M Tris-HCl(pH8.0)中，超聲波破碎并離心，以獲得無細胞提取物。然后，通過硫酸銨沉淀分級分離、DEAE-Sepharose和苯基-Sepharose將該提取物純化32倍。此外，用硫酸銨獲得乙內(nèi)酰脲酶結(jié)晶。將該結(jié)晶溶于水中，并用A470A Model Gas Phase Protein Sequencer(由AppliedBiosystems生產(chǎn))進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該乙內(nèi)酰脲酶的N-末端的氨基酸序列為1 5 10Met-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Asn-Gly-Thr-Ile-Val-Thr-例3獲得帶有源于農(nóng)桿菌KNK712(FERM BP-1900)的編碼乙內(nèi)酰脲酶基因的質(zhì)粒通過以下方法進行的研究業(yè)已發(fā)現(xiàn)，乙內(nèi)酰脲酶基因位于克隆于質(zhì)粒pADH101中的DNA片段上，該質(zhì)粒披露于WO 92/10579中。用常規(guī)方法由pAHD101轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，接種到含有100mg/l氨芐青霉素的50ml的L-液(10g/l胨，5g/l酵母提取物、5g/l氯化鈉；pH7.0)里，并在37℃培養(yǎng)16小時。然后，收集50ml培養(yǎng)液，除去上清液，將微生物細胞懸浮于50ml底物溶液(0.5％5-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲，0.05％Triton x-100，0.05 M磷酸緩沖液；pH8.7)里，在37℃下，在氮氣流中反應(yīng)3小時。將反應(yīng)混合物點滴到TIC板上，展開，并用在氫氯酸中配制的對二甲氨基苯甲醛顯色，以便檢測與真實樣品相符合的D-N-氨基甲?；?(對羥苯基)甘氨酸斑點。關(guān)于前者，我們證實pAHD101轉(zhuǎn)化體能表達編碼乙內(nèi)酰脲酶的基因。
將通過用SacI和SalI裂解質(zhì)粒pAHD101縮短插入的片段而獲得的2.1kbp片段連接到用SacI和SalI裂解的pUC18片段上，以獲得質(zhì)粒pAH1043(見圖1)。
另外，用DNA測序試劑盒(由APPlied Biosystems生產(chǎn))對乙內(nèi)酰脲酶基因進行核苷酸測序。結(jié)果示于序列1中。
用質(zhì)粒pAH1043轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，以便獲得大腸桿菌HB101 pAH1043(FERM BP-4865)轉(zhuǎn)化體。例4制備芽胞桿菌KNK245基因組DNA與載體DNA的重組DNA將芽胞桿菌KNK245(FERMBP-4863)放在2升培養(yǎng)液(10g/l肉膏、10g/l胨、5g/l酵母提取物；pH7.5)中，在45℃下培養(yǎng)24小時，收集微生物細胞。從按照Marmur方法獲得的微生物細胞中提取基因組DNA。將10單位BamHI加入1μg基因組DNA中，并讓其在37℃下反應(yīng)16小時。
另一方面，用BamHI對質(zhì)粒pUC19進行徹底裂解，并用T4DNA連接酶將其連接到上述所得到的基因組DNA片段上，以便得到各種重組質(zhì)粒的混合物。例5獲得源于芽胞桿菌KNK245的乙內(nèi)酰脲酶基因根據(jù)源于例3的農(nóng)桿菌KNK712(FERM BP-1900)和披露于JP-A62-87089中的Iu1220菌株的乙內(nèi)酰脲酶基因的核苷酸序列，合成兩種引物，引物1和引物2(見表1)，各種引物具有上述核苷酸序列互補鏈的序列，并且從1155bp間斷核苷酸序列起取向相反。用兩種引物進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，引物是以在例4中制備的源于芽胞桿菌KNK245的基因組DNA為模板合成的，以獲得約1.2kbp的片段。用DNA測序試劑盒(由APPlied Biosystems生產(chǎn))對所述片段進行核苷酸測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它對已知的乙內(nèi)酰脲酶基因有很高的互補度，而且發(fā)現(xiàn)所獲得的PCR片段是乙內(nèi)酰脲酶基因的一部分。然后，合成兩個引物，引物3和引物4(表1)，其具有相應(yīng)于該片段互補鏈的反向取向的序列。
另外，合成具有例4的重組DNA上的載體部分序列的引物5(表1)，通過采用上文合成的引物和后一種引物，并以例4的重組DNA為模板進行PCR，以獲得分別含有乙內(nèi)酰脲酶基因的前半部分和后半部分的兩類DNA片段。對所得到的DNA片段進行核苷酸測序。根據(jù)由例2中乙內(nèi)酰脲酶蛋白的N-末端氨基酸序列預(yù)計的核苷酸序列，確定翻譯密碼子。與上述確定的核苷酸序列一起確定編碼乙內(nèi)酰脲酶的基因的整個核苷酸序列。
結(jié)果示于序列2中。
然后，根據(jù)由此獲得的核苷酸序列，合成具有乙內(nèi)酰脲酶基因起始密碼子和NdeI限制位點的序列的引物6(表1)和具有乙內(nèi)酰脲酶基因上的PstI限制位點的序列的引物7(表1)，并以例4的基因組DNA為模板進行PCR，以獲得1.2kb的片段1。然后合成在上述PstI限制位點上具有反向序列的引物8(表1)和具有相應(yīng)于終止密碼子的下游的序列和HindIII限制位點的引物9(表1)，并以例4的基因組DNA為模板進行PCR，以便獲得0.25kb的片段2。用NdeI和PstI對片段1進行限制性酶切，用PstI和HindIII對片段2進行限制性酶切，并用NdeI和HindIII對pUCNT進行限制性酶切，pUCNT是披露于WO94/03613中的pUC19的改進載體質(zhì)粒。用T4DNA連接酶將上述限制片段連接在一起，以便獲得含有乙內(nèi)酰脲酶基因的質(zhì)粒pTH102(見圖2)。
Table l引物1
引物2
引物35-TAACATCCTTTTGCATCAACCACTTC-3引物45-AAAAAAGGAAGAATCACGTTAAA-3引物55-GTTTTCCCAGTCACGAC-3引物65-TACGAGCATATGAAAAAGATCATTAAGAACGGAAC-3引物75-GTGTGTTTCTGCAGAAATTACCCGTTC-3引物85-TAATTTCTGCAGAAACACACCATAT-3引物95-GCTGAAAGCTTCGAAATAAGCCATTTTCGAGCAG-3引物105-TAATTTCTGCAGAAACACACCACATGGCCGTCG-3引物115-CGAGCAAGCTTCTACTAAATGGTTAATTTCTCAT-3引物125-GGAAGCTTTCATTAAATGGTTAATTTCTCATCTTGTT-3引物135-TACGAGGGATCCTATAAATTCCAACAAGTGCTATA-3例6制備用于表達芽胞桿菌KNK245乙內(nèi)酰脲酶基因的重組DNA按照與獲得例5的片段2相同的方法進行PCR，以便得到0.25kb的片段3，所不同的是，不采用用于產(chǎn)生片段2的、具有Pst I限制位點的引物，而是采用合成的引物10(表1)代替具有終止密碼子序列的引物，其中，靠近PstI限制位點的NdeI限制位點上的一個核苷酸被取代，以阻止NdeI的裂解作用，并采用合成的引物11(表1)，基中，在終止密碼子下游的核苷酸數(shù)目進一步減少。然后，按照獲得例5中pTH102相同的方法由片段1和3和pUCNT(見圖3)獲得質(zhì)粒pTH103。
此外，以與獲得pTH103相同的方法獲得pTH104，所不同的是，不采用具有終止密碼子下游序列的引物11，而采用引物12(表1)。
由pTH104轉(zhuǎn)化的大腸桿菌HB101被命名為大腸桿菌HB101pTH104。該菌株已于1994年11月2日保藏于NIBH，保藏編號為FERM BP-4864。例7獲得含有源于假單胞菌KNK003A(FERM BP-3181)的乙內(nèi)酰脲酶編碼基因的質(zhì)粒按照例3所述方法發(fā)現(xiàn)，乙內(nèi)酰脲酶基因位于WO92/10579中所披露的質(zhì)粒pPHD301上。
用pPHD301轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，以獲得大腸桿菌HB101pPHD301(FERM BP-4866)。pPHD301的限制酶圖如圖5所示。
按照與例3相同的方法對乙內(nèi)酰脲酶基因進行核苷酸測序。結(jié)果如序列3所示。例8用所獲得的轉(zhuǎn)化體將5-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成D-N-氮基甲酰基-(對羥苯基)甘氨酸。
將在例6中得到的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌HB101pTH104接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和400ppm氯化錳四水合物的50ml 2YT培養(yǎng)液(16g/l多胨(polypeptone)，10g/l酵母提取物，5g/l氯化鈉；pH 7.0)里，并在37℃培養(yǎng)24小時。以50ml上述培養(yǎng)液中收集微生物細胞，并懸浮于0.05M的碳酸緩沖液(pH8.7)中，定容至50ml。以0.05％的終濃度加入Triton x-100。向該溶液中添加1.5g 5-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲，在40℃溫度下，在氮氣流中反應(yīng)3小時，同時攪拌，用6N NaOH將pH調(diào)至8.7。反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)混合物進行離心，取上清液，用在濃氫氯酸配制的10％對二甲氨基芐醛溶液顯色，對其中的D-N-氨基甲?；?(對羥苯基)甘氨酸進行比色測定。結(jié)果，以97.5％的轉(zhuǎn)化率獲得了D-N-氨基甲酰基-(對羥苯基)甘氨酸。
用氫氯酸將反應(yīng)混合物的pH調(diào)至5。離心以后，濃縮上清液，用濃氫氯酸調(diào)至pH2，并于4℃下保存。濾除沉淀的結(jié)晶，并從水-乙醇中再結(jié)晶，以獲得970mg D-N-氨基甲?；?(對羥苯基)甘氨酸，m.p.176-177℃，[α]D20＝-177.0°(C＝0.5，5％乙醇)。例9制備固定化乙內(nèi)酰脲酶從1升按例7所述方法獲得的大腸桿菌HB101 pTH104培養(yǎng)液中收集微生物細胞，懸浮于1mM硫酸錳水溶液中，定容至60ml，將pH調(diào)至8.5，并通過超聲波破碎。向由此獲得的酶溶液中加入20g陰離子交換樹脂Duolite A-568，平衡至pH8.5，并在15℃下攪拌該混合物20小時，以吸附所述酶。向該混合物中加入戊二醛，使其終濃度為0.1％，攪拌混合物1小時，以便進行交聯(lián)反應(yīng)。然后收集樹脂并洗滌，以獲得20g固定化乙內(nèi)酰脲酶。例10用固定化酶將5-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成D-氨基甲?；?(對羥苯基)甘氨酸將5g在例9中獲得的固定化乙內(nèi)酰脲酶加至溫度為40℃的100ml 1mM硫酸錳水溶液中，該溶液中用氮氣起泡。向該溶液中加3g 5-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲，在40℃下，在攪拌條件下反應(yīng)3小時，同時用氮氣起泡。反應(yīng)結(jié)束后，靜置反應(yīng)混合物，并吸取收集反應(yīng)混合物。按照與例8相同的方法純化上述氨基甲?；被嶂破?，獲得2.2g D-N-氨基甲酰基-(對羥苯基)甘氨酸。例11在枯草桿菌(Bacillus subtilis)中表達芽胞桿菌KNK245乙內(nèi)酰脲酶基因按照與例5相同的方法進行PCR，以芽胞桿菌KNK245基因組DNA為模板，并采用引物12和13(表1)，以便獲得1.7kb的片段。用BamHI和HindIII裂解該片段，并將其連接到以類似方法裂解過的質(zhì)粒pHY300PLK(Takara Shuzo)上，獲得質(zhì)粒pTHB301。其限制酶圖如圖6所示。
通過電擊法(用Shimadzu公司的GTE-10型，10KV/cm，2ms)將質(zhì)粒pTHB 301導(dǎo)入枯草桿菌ISW 1214(可從Takara Shuzo獲得)、枯草桿菌YS-11(IAM12019)或枯草桿菌3115(IAM12020)，并在添加了0.02g/l氯化鎂四水合物的例4的培養(yǎng)基中、在37℃下培養(yǎng)20小時。通過收集微生物細胞并通過超聲波將其破碎，以制備無細胞提取物。結(jié)果，各種乙內(nèi)酰脲酶的活性比在相同條件下培養(yǎng)芽胞桿菌KNK245所獲得的活性高大約2.2倍。例12在嗜熱生物中表達芽胞桿菌KNK245乙內(nèi)酰脲酶基因用J.Bacteriol，149，824(1982)中披露的原生質(zhì)體法，由在例11中制備的質(zhì)粒pTH301轉(zhuǎn)化嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus Stearother-mophilus)IFO12550，并以與例11相同的方法培養(yǎng)，以制備無細胞提取物。乙內(nèi)酰脲酶的活性比在相同條件下制備的芽胞桿菌KNK245的乙內(nèi)酰脲酶的活性高大約3.6倍。
如上所述，按照本發(fā)明可以創(chuàng)造一種具有極高的乙內(nèi)酰脲酶活性的微生物，以其為酶源可以有效生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸。
微生物保藏已按照布達佩斯條約分別將有關(guān)微生物保藏在下述保藏機構(gòu)。農(nóng)桿菌KNK712，保藏日1988年5月31日，保藏號為FERM BP-1900；假單胞菌KNK003A，保藏日1990年12月1日，保藏編號為FERM BP-3181；芽胞桿菌KNK245，保藏日1994年11月2日，保藏編號為FERM BP-4863；大腸桿菌HB101 pAH1043，保藏日1994年11月2日，保藏編號為FERM BP-4866。
保藏機構(gòu)名稱National Institute of Bioscience and Human-Technology(以前的Fermentation Research Institute)，Agency of In-dustrial Science&Technology，Ministry of International Trade&In-dustry。
地址1-3，Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305，日本。
序列表序列1序列長度2518序列類型核酸序列10 203040 50 60GAGCTCGGCCTCGTCGGTGAAATGCCAGCGCGGGAAGAAGGTCGTAAGCGCGAGTTCGGG70 8090 100 110 120GAAGACAATGAAATTCGCGCCCCGGCTCGCGGCTTTCGTCAGCATGTCGAGAAGACGAAC130 140 150 160 170 180GACGACCTGTTCGCGTGTCTCCGCGCGCGCGATCGGACCTTGTTGTCCCACTGCAAGTAT190 200 210 220 230 240CATCTGACGTGTCATGAACCTCTGCTCCTTCCTAGGTGATGTCCGGCCCAGCGGCCGGGA250 260 270 280 290 300AAACGTTGTGAAACACATCGCCGAAAACCGGCTTTGTGACTCGCGGCGCAATGCAAATTC310 320 330 340 350 360TACATAAAGTACGAAATATTACATGCAGCACGACAATAACAGGCGTAAAATTTTTGATCT370 380 390 400 410 420GTCAACCGGAGCGGAACCGGAATTTGCGCTGCTTGACAAGCTCTCGCGCGAGCCCGCCGT430 440 450 460 470 480CGACTTCAACTCGTTCCGCCTCGAACGAGAGCGCTCTGCACAGAATCGTCTTCGCTAGGC490 500 510 520 530 540CGCCGTTCCGCTTGACAGCTTCAAAACACCATGCAAACTTGTATAAAGAATTACATTCCA550 560 570 580 590 600TATACGGAACAAACTCTTCAATCCTGAGAGCGACATCATGGACATCATTATCAAAAACGGMetAspIleIleIleLysAsnGly610 620 630 640 650 660AACCATCGTGACCGCGGATGGCATTTCTCGCGCCGATCTCGGGATCAAGGATGGCAAGATThrIleValThrAlaAspGlyIleSerArgAlaAspLeuGlyIleLysAspGlyLysIle670 680 690 700 710 720CACCCAGATCGGCGGCGCGCTCGGCCCAGCGGAGCGGACGATCGACGCGGCCGGCCGCTAThrGlnIleGlyGlyAlaLeuGlyProAlaGluArgThrIleAspAlaAlaGlyArgTyr730 740 750 760 770 780CGTCTTTCCGGGCGGCATAGACGTTCACACGCATGTCGAAACGGTCAGCTTCAACACGCAValPheProGlyGlyIleAspValHisThrHisValGluThrValSerPheAsnThrGln790 800 810 820 830 840GTCGGCCGACACGTTCGCAACAGCGACGGTCGCGGCCGCCTGTGGCGGAACGACAACCATSerAlaAspThrPheAlaThrAlaThrValAlaAlaAlaCysGlyGlyThrThrThrIle850 860 870 880 890 900CGTCGATTTCTGTCAGCAGGATCGCGGCCACAGCCTGGCGGAACCCGTCCCCAAGTGGGAValAspPheCysGlnGlnAspArgGlyHisSerLeuAlaGluProValProLysTrpAsp910 920 930 940 950 960CGGTATGGCCGGCGGCAAGTCGGCGATCGATTACGGCTACCACATCATCGTGCTCGACCCGlyMetAlaGlyGlyLysSerAlaIleAspTyrGlyTyrHisIleIleValLeuAspPro970 980 990 1000 1010 1020GACCGACAGCGTGATTGAGGAGCTGGAGGTGCTTCCCGATCTTGGCATTACCTCCTTCAAThrAspSerValIleGluGluLeuGluValLeuProAspLeuGlyIleThrSerPheLys1030 1040 1050 1060 1070 1080GGTCTTCATGGCCTATCGCGGCATGAACATGATCGACGACGTGACGCTGCTGAAGACGCTValPheMetAlaTyrArgGlyMetAsnMetIleAspAspValThrLeuLeuLysThrLeu1090 1100 1110 1120 1130 1140CGACAAGGCGGTCAAGACCGGATCGCTCGTCATGGTGCACGCGGAAAACGGCGACGCCGCAspLysAlaValLysThrGlySerLeuValMetValHisAlaGluAsnGlyAspAlaAla1150 1160 1170 1180 1190 1200CGACTATCTGCGCGACAAGTTCGTGGCCGAGGGCAAAACCGCGCCGATCTACCACGCGCTAspTyrLeuArgAspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAlaLeu
1210 1220 1230 1240 1250 1260CAGCCGCCCGCCCCGGGTCGAAGCCGAGGCAACCGCGCGGGCCCTCGCCCTGGCCGAAATSerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAlaLeuAlaGlulle1270 1280 1290 1300 1310 1320CGTCAACGCCCCGATCTACATAGTCCATGTGACCTGCGAGGAGTCCCTTGAGGAGGTGATValAsnAlaProIleTyrIleValHisValThrCysGluGluSerLeuGluGluValMet1330 1340 1350 1360 1370 1380GCGCGCAAAATCGCGAGGCGTCCGCGCTCTGGCGGAAACCTGCACGCATTACCTTTACCTArgAlaLysSerArgGlyValArgAlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyrLeu1390 1400 1410 1420 1430 1440CACCAAGGAAGACCTGGAGCGGCCGGATTTCGAAGGTGCGAAATACGTTTTCACACCGCCThrLysGluAspLeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrProPro1450 1460 1470 1480 1490 1500GGCCCGCGCGAAGAAAGACCATGACGTTCTCTGGAACGCACTCAGAAACGGTGTGTTCGAAlaArgAlaLysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsnGlyValPheGlu1510 1520 1530 1540 1550 1560AACGGTTTCCTCCGACCATTGCTCCTGGCTCTTCAAGGGGCACAAGGACCGGGGCCGGAAThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheLysGlyHisLysAspArgGlyArgAsn1570 1580 1590 1600 1610 1620CGACTTTCGCGCCATCCCGAACGGCGCGCCGGGCGTCGAGGAACGGTTGATGATGGTCTAAspPheArgAlaIleProAsnGlyAlaProGlyValGluGluArgLeuMetMetValTyr1630 1640 1650 1660 1670 1680TCAGGGCGTCAACGAAGGCCGGATTTCCCTTACCCAGTTCGTGGAACTGGTCGCCACGCGGlnGlyValAsnGluGlyArgIleSerLeuThrGlnPheValGluLeuValAlaThrArg1690 1700 1710 1720 1730 1740CCCGGCCAAGGTCTTCGGAATGTTTCCGCAAAAGGGGACGATCGCGGTCGGTTCGGACGCProAlaLysValPheGlyMetPheProGlnLysGlyThrIleAlaValGlySerAspAla1750 1760 1770 1780 1790 1800CGACATCGTCCTTTGGGACCCCGAGGCCGAAATGGTGATCGAACAGACCGCCATGCACAAAspIleValLeuTrpAspProGluAlaGluMetValIleGluGlnThrAlaMetHisAsn1810 1820 1830 1840 1850 1860CGCCATGGATTACTCCTCCTACGAGGGACACAAGGTCAAGGGCGTGCCGAAGACGGTGCTAlaMetAspTyrSerSerTyrGluGlyHisLysValLysGlyValProLysThrValLeu1870 1880 1890 1900 1910 1920CCTGCGTGGCAAGGTTATCGTCGACGAAGGTTCCTATGTCGGCGAACCGACGGACGGGAALeuArgGlyLysValIleValAspGluGlySerTyrValGlyGluProThrAspGlyLys1930 1940 1950 1960 1970 1980ATTCCTGAAACGTCGCAAATACAAGCAGTAAACCGGCATTCTACGAGAACGATGATGACAPheLeuLysArgArgLysTyrLysGln***4571990 2000 2010 2020 2030 2040ATACACACTTCGACAAGTGTCGTCGCGCCTGACGGCGACAGCGTTGCAAGCGGCTTCGAC2050 2060 2070 2080 2090 2100AGGCGTTACGGCGCACCGACATTCAATCAGATACCATCGGGCGAACGGCTGGTGTCGGAC2110 2120 2130 2140 2150 2160TGCATCGCGCTGATGCTGAAGCACCGTTCCGTCAGACGCTACACGGGGGAACCTCTCCCC2170 2180 2190 2200 2210 2220CCAGGCACGCTGGAAATGCTGATGGCGGCGGGTCAGTCGGCTGCGACATCCTCCAACATG2230 2240 2250 2260 2270 2280CAGACCGTGTCGGTCATCGCGGTGACGGACCCCGAGAAAAAGACCCGTCTCGCGAAGACA2290 2300 2310 2320 2330 2340TGCGCCGGGCAGGACTTCATCGCCAACGCTCCTGTGCTCCTGTGTTTCGTGACGGATCTT2350 2360 2370 2380 2390 2400GCGCGCCCCGCCAGGGTCGCCTCCACGATTGGCGCCGATCTTTTCGCGTTGCCGATGATC2410 2420 2430 2440 2450 2460GACACCTTTCTGGCGTCCATCAGCGATTGTTCCATCTTCGCGCAAAACCTTGTTCTCGCC2470 2480 2490 2500 2510GCGGAATCGCTCGGCATGGGCACCTGCTATGTCGGGAGCCTGCGCAACCGGCCTGATC序列2序列長度2105序列類型核酸序 列102030405060GTCGACTTCAACTCGTTCCGCCTCGAACGAGAGCGCTCTGCACAGAATCGTCTTCGCTAG708090 100 110 120GCCGCCGTTCCGCTTGACAGCTTCAAAACACCATGCAAACTTGTATAAAGAATTACATTC130 140 150 160 170 180CATATACGGAACAAACTCTTCAATCCTGAGAGCGACATCATGGACATCATTATCAAAAACMetAspIleIleIleLysAsn190 200 210 220 230 240GGAACCATCGTGACCGCGGATGGCATTTCTCGCGCCGATCTCGGGATCAAGGATGGCAAGGlyThrIleValThrAlaAspGlyIleSerArgAlaAspLeuGlyIleLysAspGlyLys
250 260 270 280 290 300ATCACCCAGATCGGCGGCGCGCTCGGCCCAGCGGAGCGGACGATCGACGCGGCCGGCCGCIleThrGlnIleGlyGlyAlaLeuGlyProAlaGluArgThrIleAspAlaAlaGlyArg310 320 330 340 350 360TACGTCTTTCCGGGCGGCATAGACGTTCACACGCATGTCGAAACGGTCAGCTTCAACACGTyrValPheProGlyGlyIleAspValHisThrHisValGluThrValSerPheAsnThr370 380 390 400 410 420CAGTCGGCCGACACGTTCGCAACAGCGACGGTCGCGGCCGCCTGTGGCGGAACGACAACCGlnSerAlaAspThrPheAlaThrAlaThrValAlaAlaAlaCysGlyGlyThrThrThr430 440 450 460 470 480ATCGTCGATTTCTGTCAGCAGGATCGCGGCCACAGCCTGGCGGAACCCGTCCCCAAGTGGIleValAspPheCysGlnGlnAspArgGlyHisSerLeuAlaGluProValProLysTrp490 500 510 520 530 540GACGGTATGGCCGGCGGCAAGTCGGCGATCGATTACGGCTACCACATCATCGTGCTCGACAspGlyMetAlaGlyGlyLysSerAlaIleAspTyrGlyTyrHisIleIleValLeuAsp550 560 570 580 590 600CCGACCGACAGCGTGATTGAGGAGCTGGAGGTGCTTCCCGATCTTGGCATTACCTCCTTCProThrAspSerValIleGluGluLeuGluValLeuProAspLeuGlyIleThrSerPhe610 620 630 640 650 660AAGGTCTTCATGGCCTATCGCGGCATGAACATGATCGACGACCTGACGCTGCTGAAGACGLysValPheMetAlaTyrArgGlyMetAsnMetIleAspAspValThrLeuLeuLysThr670 680 690 700 710 720CTCGACAAGGCGGTCAAGACCGGATCGCTCGTCATGGTGCACGCGGAAAACGGCGACGCCLeuAspLysAlaValLysThrGlySerLeuValMetValHisAlaGluAsnGlyAspAla730 740 750 760 770 780GCCGACTATCTGCGCGACAAGTTCGTGGCCGAGGGCAAAACCGCGCCGATCTACCACGCGAlaAspTyrLeuArgAspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAla790 800 810 820 830 840CTCAGCCGCCCGCCCCGGGTCGAAGCCGAGGCAACCGCGCGGGCCCTCGCCCTGGCCGAALeuSerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAlaLeuAlaGlu850 860 870 880 890 900ATCGTCAACGCCCCGATCTACATAGTCCATGTGACCTGCGAGGAGTCCCTTGAGGAGGTGIleValAsnAlaProIleTyrIleValHisValThrCysGluGluSerLeuGluGluVal910 920 930 940 950 960ATGCGCGCAAAATCGCGAGGCGTCCGCGCTCTGGCGGAAACCTGCACGCATTACCTTTACMetArgAlaLysSerArgGlyValArgAlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyr970 980 990 1000 1010 1020CTCACCAAGGAAGACCTGGAGCGGCCGGATTTCGAAGGTGCGAAATACGTTTTCACACCGLeuThrLysGluAspLeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrPro1030 1040 1050 1060 1070 1080CCGGCCCGCGCGAAGAAAGACCATGACGTTCTCTGGAACGCACTCAGAAACGGTGTGTTCProAlaArgAlaLysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsnGlyValPhe1090 1100 1110 1120 1130 1140GAAACGGTTTCCTCCGACCATTGCTCCTGGCTCTTCAAGGGGCACAAGGACCGGGGCCGGGluThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheLysGlyHisLysAspArgGlyArg1150 1160 1170 1180 1190 1200AACGACTTTCGCGCCATCCCGAACGGCGCGCCGGGCGTCGAGGAACGGTTGATGATGGTCAsnAspPheArgAlaIleProAsnGlyAlaProGlyValGluGluArgLeuMetMetVal1210 1220 1230 1240 1250 1260TATCAGGGCGTCAACGAAGGCCGGATTTCCCTTACCCAGTTCGTGGAACTGGTCGCCACGTyrGlnGlyValAsnGluGlyArglleSerLeuThrGlnPheValGluLeuValAlaThr1270 1280 1290 1300 1310 1320CGCCCGGCCAAGGTCTTCGGAATGTTTCCGCAAAAGGGGACGATCGCGGTCGGTTCGGACArgProAlaLysValPheGlyMetPheProGlnLysGlyThrIleAlaValGlySerAsp1330 1340 1350 1360 1370 1380GCCGACATCGTCCTTTGGGACCCCGAGGCCGAAATGGTGATCGAACAGACCGCCATGCACAlaAspIleValLeuTrpAspProGluAlaGluMetValIleGluGlnThrAlaMetHis
1390 1400 1410 1420 1430 1440AACGCCATGGATTACTCCTCCTACGAGGGACACAAGGTCAAGGGCGTGCCGAAGACGGTGAsnAlaMetAspTyrSerSerTyrGluGlyHisLysValLysGlyValProLysThrVal1450 1460 1470 1480 1490 1500CTCCTGCGTGGCAAGGTTATCGTCGACGAAGGTTCCTATGTCGGCGAACCGACGGACGGGLeuLeuArgGlyLysValIleValAspGluGlySerTyrValGlyGluProThrAspGly1510 1520 1530 1540 1550 1560AAATTCCTGAAACGTCGCAAATACAAGCAGTAAACCGGCATTCTACGAGAACGATGATGALysPheLeuLysArgArgLysTyrLysGln***1570 1580 1590 1600 1610 1620CAATACACACTTCGACAAGTGTCGTCGCGCCTGACGGCGACAGCGTTGCAAGCGGCTTCG1630 1640 1650 1660 1670 1680ACAGGCGTTACGGCGCACCGACATTCAATCAGATACCATCGGGCGAACGGCTGGTGTCGG1690 1700 1710 1720 1730 1740ACTGCATCGCGCTGATGCTGAAGCACCGTTCCGTCAGACGCTACACGGGGGAACCTCTCC1750 1760 1770 1780 1790 1800CCCCAGGCACGCTGGAAATGCTGATGGCGGCGGGTCAGTCGGCTGCGACATCCTCCAACA1810 1820 1830 1840 1850 1860TGCAGACCGTGTCGGTCATCGCGGTGACGGACCCCGAGAAAAAGACCCGTCTCGCGAAGA1870 1880 1890 1900 1910 1920CATGCGCCGGGCAGGACTTCATCGCCAACGCTCCTGTGCTCCTGTGTTTCGTGACGGATC1930 1940 1950 1960 1970 1980TTGCGCGCCCCGCCAGGGTCGCCTCCACGATTGGCGCCGATCTTTTCGCGTTGCCGATGA1990 2000 2010 2020 2030 2040TCGACACCTTTCTGGCGTCCATCAGCGATTGTTCCATCTTCGCGCAAAACCTTGTTCTCG2050 2060 2070 2080 2090 2100CCGCGGAATCGCTCGGCATGGGCACCTGCTATGTCGGGAGCCTGCGCAACCGGCCTGATCCCGGG序列3序列長度1569序列類型核酸序列1020304050 60TCGGAACCTGAAAACGAAATATCCCGCCGGACGGTGGGAAGGTGAAAGGAGGAGTCTCCA
Met708090 100 110 120TGACAACAGTTATCAAGGGTGGAACGATCGTCGCCGCCGATCGCAGCTATGAAGCCGATAThrThrValIleLysGlyGlyThrIleValAlaAlaAspArgSerTyrGluAlaAspIle130 140 150 160 170 180TCCTGATCGAAGGCGAAAAGATCGCCCAGATCGGCAGGGATCTGCAGGGCGACAAGATTGLeuIleGluGlyGluLysIleAlaGlnIleGlyArgAspLeuGlnGlyAspLysIleVal190 200 210 220 230 240TAGACGCCGAGGGTGCCTATATCATTCCCGGCGGCATCGATCCTCACACGCATCTTGAAAAspAlaGluGlyAlaTyrIleIleProGlyGlyIleAspProHisThrHisLeuGluMet250 260 270 280 290 300TGCCCTTTATGGGCACGACCACTGCCGAGACCTGGGAGTCCGGCACTTTCGCGGCTCTCTProPheMetGlyThrThrThrAlaGluThrTrpGluSerGlyThrPheAlaAlaLeuSer310 320 330 340 350 360CCGGCGGCACCACGATGGTTGTGGATTTCGTCATTCCCGGGCCGGCGGGAATGCTTGCCGGlyGlyThrThrMetValValAspPheValIleProGlyProAlaGlyMetLeuAlaAla370 380 390 400 410 420CCTTCGATCAATGGCAGGAGAGGGCAGCGCGCCAGGCTTCGTCCGACTACTCGCTGCATAPheAspGlnTrpGlnGluArgAlaAlaArgGlnAlaSerSerAspTyrSerLeuHisMet
430 440 450 460 470 480TGTGCGTGACCGGCTGGTCAAAGCAGATCTTCGAGGACATGGCGAAGGTGGTCGAGCGCGCysValThrGlyTrpSerLysGlnIlePheGluAspMetAlaLysValValGluArgGly490 500 510 520 530 540GTGTCAACACCTTCAAGCATTTCATGGCCTATAAGGGCGCGCTGATGGTGAACGACGACGValAsnThrPheLysHisPheMetAlaTyrLysGlyAlaLeuMetValAsnAspAspGlu550 560 570 580 590 600AGATGTTCGCCTCCTTCCAGCGCTGCGCCGCCCTGGGCGCCCTCCCGCTCGTGCATGCGGMetPheAlaSerPheGlnArgCysAlaAlaLeuGlyAlaLeuProLeuValHisAlaGlu610 620 630 640 650 660AAAACGGCGACATCGTCGCCTCGCTGCAGCAGAAATATATGCAGGAAGGCCTCACGGGTCAsnGlyAspIleValAlaSerLeuGlnGlnLysTyrMetGlnGluGlyLeuThrGlyPro670 680 690 700 710 720CGGAGGCTCATGCCTATTCCCGCCCGCCGGAGGTCGAGGGCGAGGCCACCAACCGCGCCAGluAlaHisAlaTyrSerArgProProGluValGluGlyGluAlaThrAsnArgAlaIle730 740 750 760 770 780TCATGATCGCCGATGCCGCAGGCGTGCCGGTCTATATCGTGCATGTCTCCTGTGAACAGGMetIleAlaAspAlaAlaGlyValProValTyrIleValHisValSerCysGluGlnAla790 800 810 820 830 840CGCACGAAGCGATCCGCCGCGCACGCCAGAAGGGAATGCGCGTCTATGGCGAGCCGCTCAHisGluAlaIleArgArgAlaArgGlnLysGlyMetArgValTyrGlyGluProLeuIle850 860 870 880 890 900TCCAGCACCTGCTGCTTGACGAGTCCGAGTACAAGAGAGCCGACTGGGACGAGGCGGCTCGlnHisLeuLeuLeuAspGluSerGluTyrLysArgAlaAspTrpAspGluAlaAlaArg910 920 930 940 950 960GGCGGGTGATGTCCGCGCCATTCCGCGATAAAAGCCATCAGGACAGCCTCTGGGCTGGGCArgValMerSerAlaProPheArgAspLysSerHisGlnAspSerLeuTrpAlaGlyLeu970 980 990 1000 1010 1020TCGCAGCGGGCTCGCTGCAGGTCGTGGCAACGGACCACTGCGCCTTTACCACTGAACAGAAlaAlaGlySerLeuGlnValValAlaThrAspHisCysAlaPheThrThrGluGlnLys1030 1040 1050 1060 1070 1080AGCGGCTGGGACTCAACGACTTCACGAAAATCCCGAACGGCACCGGGGGGTTAGAGGACCArgLeuGlyLeuAsnAspPheThrLysIleProAsnGlyThrGlyGlyLeuGluAspArg1090 1100 1110 1120 1130 1140GGTTGTCGCTGCTCTGGACCTATGGCGTGAAGACGGGGCGGCTCACGCCTAACGAATTCGLeuSerLeuLeuTrpThrTyrGlyValLysThrGlyArgLeuThrProAsnGluPheVal1150 1160 1170 1180 1190 1200TCGCCGTCACCTCCACCAATATCGCACAAATCCTGAACATCTATCCGCAAAAGGGCGCAAAlaValThrSerThrAsnIleAlaGlnIleLeuAsnIleTyrProGlnLysGlyAlaIle1210 1220 1230 1240 1250 1260TCCTGCCTGGGTCCGATGCCGACCTCGTCGTCTGGGATCCAGCCAAATCGAAGAAGATCALeuProGlySerAspAlaAspLeuValValTrpAspProAlaLysSerLysLysIleThr1270 1280 1290 1300 1310 1320CTGCTTCCGCTCAGAAATCCATCATCGACTACAATATCTTCGAGGGCTACGAGGTGACCGAlaSerAlaGlnLysSerIleIleAspTyrAsnIlePheGluGlyTyrGluValThrGly1330 1340 1350 1360 1370 1380GCATGCCGCGATACACGCTCTCACGCGGCGAGGTCGTATGGGGCGAGGAAGGCAGCAACGMetProArgTyrThrLeuSerArgGlyGluValValTrpGlyGluGluGlySerAsnGlu1390 1400 1410 1420 1430 1440AACCGCGGCCCGGTCGCGGTAGGTTCGTCGAGCGCCGGCCCTTTGCCGCCGTCAGCCGTGProArgProGlyArgGlyArgPheValGluArgArgProPheAlaAlaValSerArgAla1450 1460 1470 1480 1490 1500CCCTTTCAACCTGGAAGGAGATCGTCGCTCCGCGTGCGGTGGAGCGCTCGGCAAAGCATALeuSerThrTrpLysGluIleValAlaProArgAlaValGluArgSerAlaLysHisMet1510 1520 1530 1540 1550 1560TGCCGATCGGCGTTTGAATTTTGGGAGGCAGGCTCGAACTACGGTTTGGCCTGTCTCAGGProIleGlyVal***ACAATCCAT
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化型微生物，它是用含有編碼一種酶的基因的DNA片段和一種載體DNA的重組DNA轉(zhuǎn)化宿主微生物所獲得的，所述基因源于芽胞桿菌KNK245(FERM BP-4863)、農(nóng)桿菌KNK712(FERM BP-1900)或假單胞菌KNK003A(FERM BP-3181)，所述酶(以下稱之為乙內(nèi)酰脲酶)能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸。
2.如權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化型微生物，其特征在于所述宿主微生物選自屬于埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、沙雷菌屬(Serrati-a)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibactrium)的微生物。
3.如權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)化型微生物，其特征在于所述轉(zhuǎn)化型微生物是大腸桿菌HB101 pTH102，大腸桿菌HB101 pTH103，大腸桿菌HB101 pTH104(FERM BP-4864)，大腸桿菌HB101 pAH1043(FERM BP-4865)或大腸桿菌HB101 pPHD301(FERM BP-4866)。
4.一種生產(chǎn)一種能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶的方法，包括使用權(quán)利要求1-3中任一項的轉(zhuǎn)化型微生物。
5.一種用于生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的方法，包括使用按權(quán)利要求4的方法所獲得的酶。
6.如權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述5-取代乙內(nèi)酰脲是一種由下面的通式(1)所代表的化合物
其中，R是苯基，由羥基取代的苯基，烷基，取代烷基，芳烷基或噻吩基。
7.一種通過重組源于芽胞桿菌KNK245(FERM BP-4863)的編碼乙內(nèi)酰脲酶的DNA片段和一種質(zhì)粒pUCNT所獲得的重組質(zhì)粒，它具有圖2-4中任一個所示的限制酶圖。
8.如權(quán)利要求7的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒是pTH102、pTH103或pTH104。
9.一種通過重組源于農(nóng)桿菌KNK712(FERM BP-1900)的編碼乙內(nèi)酰脲酶的DNA片段和一種質(zhì)粒pUC18所獲得的重組質(zhì)粒，它具有圖1所示的限制酶圖。
10.如權(quán)利要求9的重組質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒是pAH1043。
11.一種通過重組源于假單胞菌KNK003A(FERM BP-3181)的編碼乙內(nèi)酰脲酶的DNA片段所獲得的重組質(zhì)粒，它具有圖5所示的重組酶圖。
12.如權(quán)利要求11的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒是pPHD301。
13.一個編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因編碼序列2所示氨基酸序列從第一個氨基酸至第472個氮基酸的全部或部分氨基酸序列。
14.一個DNA片斷，它含有編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因具有序列2所示核苷酸序列的從第1個核苷酸至第1776個核苷酸的全部或部分核苷酸序列，或等同于它的序列。
15.一個編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因編碼序列1所示氨基酸序列的從第1個氨基酸至第457個氨基酸的全部或部分氨基酸序列。
16.一種DNA片斷，它含有編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因具有序列1所示核苷酸序列的第1個核苷酸至第2518個核苷酸的全部或部分核苷酸序列，或等同于它的序列。
17.一種酶蛋白，它含有序列2所示氨基酸序列的第1至第472個氨基酸的全部或部分氨基酸序列，并具有通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性。
18.一種酶蛋白，它含有序列1所示氨基酸序列的第1至第457個氨基酸的全部或部分氨基酸序列，并具有通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性。
19.一個編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因編碼序列3所示氨基酸序列的第1至第485個氨基酸的全部或部分氨基酸序列。
20.一個DNA片斷，它含有編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氮基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因具有序列3所示核苷酸序列的第1至第1569個核苷酸的全部或部分核苷酸序列或等同于它的序列。
21.一種酶蛋白，它含有序列3所示氨基酸序列的第1至第485個氨基酸的全部或部分氨基酸序列，并具有通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的酶促活性。
全文摘要
披露了用一種乙內(nèi)酰脲酶由5－取代的乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)D－N－氨基甲?；粒被岬姆椒?所述乙內(nèi)酰脲酶由一種用含有編碼乙內(nèi)酰脲酶的基因的DNA片段和一種載體DNA的重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化型微生物生產(chǎn),所述乙內(nèi)酰脲酶源自芽胞桿菌屬(Bacillus)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)或假單胞菌屬的一種具體微生物。
文檔編號C12P13/04GK1171812SQ9519713
公開日1998年1月28日 申請日期1995年12月26日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月28日
發(fā)明者難波弘憲, 矢島麗嘉, 高野昌行, 山田勇喜雄, 池中康裕, 高橋里美 申請人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會社