專利名稱：分泌產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，更具體地說，本發(fā)明涉及到一種用大腸桿菌轉(zhuǎn)化菌株分泌產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述大腸桿菌能在其周質(zhì)中有效地分泌和積累所述蛋白質(zhì)。
近年來，重組DNA技術(shù)已能用微生物為宿主產(chǎn)生有用的蛋白質(zhì)。這一技術(shù)主要的例子包括胞內(nèi)產(chǎn)生方法和分泌產(chǎn)生方法。
已知胞內(nèi)產(chǎn)生方法是一種以高產(chǎn)率在胞質(zhì)中產(chǎn)生和積累所需蛋白質(zhì)的方法。然而，在胞質(zhì)中產(chǎn)生和積累的蛋白質(zhì)是非天然型的，其中蛋氨酸添加到天然型氨基酸序列的N-末端，并且，大量產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)通常變?yōu)榉Q作包含體的不溶形式，以致在提取操作后易于形成與真正的結(jié)構(gòu)不同的不正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，在胞內(nèi)產(chǎn)生方法中，需要一個(gè)將具有高級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其真正結(jié)構(gòu)的重折疊步驟，這意味著在制造過程中必須加上這一復(fù)雜的步驟。
另一方面，在以上提到的分泌產(chǎn)生方法中，所需重組蛋白質(zhì)以一種融合蛋白質(zhì)形式(一種前體，其中一種分泌信號(hào)肽加到N-末端上)被表達(dá)。因?yàn)檫@一分泌信號(hào)肽在透過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移期間被酶促缺失，所以，可以分泌出真正的蛋白質(zhì)。結(jié)果是分泌出天然型蛋白質(zhì)。在分泌產(chǎn)生方法的情況下，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以具有真正的一級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，這一方法比胞內(nèi)產(chǎn)生方法更好。然而，在分泌產(chǎn)生方法中，額外地需要一個(gè)透過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移步驟和一個(gè)前體加工步驟，這樣，其產(chǎn)率通常是低的。特別是，已知在用無核生物產(chǎn)生和必泌源于哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)時(shí)，其產(chǎn)率較用其產(chǎn)生和分泌源于原核生物的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率低得多。因此，人們期望有一種更好的分泌產(chǎn)生方法。
現(xiàn)在，已報(bào)道了與微生物蛋白質(zhì)分泌有關(guān)的各種因子，并已進(jìn)行了使用這些報(bào)道的因子改進(jìn)分泌產(chǎn)率的幾種研究。其中之一是分泌信號(hào)肽的研究。已知分泌信號(hào)肽在分泌步驟的早期階段起重要作用[J.Biol.Chem.，Vol.263.p.8164-8169(1990)]就從宿主微生物分泌蛋白質(zhì)來說，在胞質(zhì)中合成的融合蛋白質(zhì)必需被轉(zhuǎn)移透過細(xì)胞膜并被正確地加工已形成真正的結(jié)構(gòu)。USP4,680,260已公開了一種用于分泌一種堿性磷酸酶或一種腸毒素分泌信號(hào)肽可作為分泌分子量約為22,000的人生長(zhǎng)激素(此后將人生長(zhǎng)激素稱為＂hGH＂，將具有所述分子量的人生長(zhǎng)激素稱為＂22KhGH＂)的優(yōu)選的分泌信號(hào)肽。此外，該專利同時(shí)報(bào)道，使用得自原核生物的分泌信號(hào)肽試驗(yàn)了幾種真核生物蛋白質(zhì)的分泌，但在一些實(shí)施例中，不合成任何蛋白質(zhì)，在另一些實(shí)施例中，即使蛋白質(zhì)在胞質(zhì)中表達(dá)，它也不能分泌。這一事實(shí)表明，對(duì)每一種待分泌的蛋白質(zhì)來說，需要選擇一種合適的分泌信號(hào)肽。迄今還沒有發(fā)現(xiàn)一種能用于每一種蛋白質(zhì)分泌的全能分泌信號(hào)肽。而且，關(guān)于分泌信號(hào)肽的序列，最近已闡明在N-端正電荷區(qū)的正電荷和中心疏水區(qū)的疏水性是重要的[J.Biol.Chem.，Vol.267.p.4882-4888(1992)]。已知一些基于這一認(rèn)識(shí)的成功的例子。例如，Udaka等已報(bào)道，在使用短芽孢桿菌為宿主的分泌產(chǎn)生中，將兩個(gè)堿性氨基酸(Arg)和三個(gè)疏水氨基酸Leu加入到短芽孢桿菌MWP(中間壁蛋白質(zhì))分泌信號(hào)肽的堿性疏水區(qū)引起hGH的有效表達(dá)。在這種情況下，累積的hGH達(dá)到200mg/L(專利申請(qǐng)WO 94/9474)。然而，對(duì)于這種分泌信號(hào)肽的修飾，不存在任何一般性的指導(dǎo)原則，仍需一個(gè)接一個(gè)地反復(fù)試驗(yàn)來發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的序列。此外，該分泌信號(hào)肽對(duì)將前體融合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)膜起作用，但它不直接涉及下一個(gè)步驟，在該步驟中，前體蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)穿過胞質(zhì)膜以從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到周質(zhì)或培養(yǎng)基中。因此，分泌信號(hào)肽的修飾對(duì)改進(jìn)前體蛋白質(zhì)向膜的轉(zhuǎn)移(定位)是有效的，但是，它對(duì)待分泌蛋白質(zhì)從胞質(zhì)通過胞質(zhì)膜到達(dá)周質(zhì)或培養(yǎng)基的接下來的步驟幾乎是無效的，即，在膜通過步驟是速度控制步驟的情況下，改進(jìn)分泌信號(hào)肽的效能是有限的?？偟膩碚f，為改進(jìn)分泌效力起見而進(jìn)行的分泌信號(hào)肽的修飾對(duì)前體蛋白質(zhì)向胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移是重要的，這一點(diǎn)是公知的。然而，在接下來的膜通過步驟中存在麻煩的情況下，這種修飾沒有任何改進(jìn)的效果。
這樣，在蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生中，低的分泌效力的原因存在于分泌蛋白質(zhì)(待從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到周質(zhì)或培養(yǎng)基中)通過胞質(zhì)膜的步驟中的情況下，也需要一種改進(jìn)的技術(shù)，而不是修飾分泌信號(hào)肽。現(xiàn)在，已報(bào)道涉及大腸桿菌蛋白質(zhì)分泌的幾種蛋白質(zhì)因子(SecA、SecB、SecD、SecE、secF、SecY、SecG等)，并已在體外測(cè)試了各個(gè)因子對(duì)分泌的作用。然而，幾乎沒有有關(guān)其體內(nèi)應(yīng)用的報(bào)道。僅有的一個(gè)例子是，最近報(bào)道了通過增強(qiáng)大腸桿菌SecY/E基因的表達(dá)可以改進(jìn)白細(xì)胞介素6(IL-6)的分泌產(chǎn)生[Bio/Technology，Vol.12，p.178-180(1994)]。使用涉及分泌的蛋白質(zhì)因子的研究迄今還沒有投入實(shí)際應(yīng)用。為了有效地產(chǎn)生和分泌不同種類的蛋白質(zhì)(特別是得自哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì))，可以考慮待研究的各種課題，但具體地就較少分泌蛋白質(zhì)來說，不存在任何改善其分泌產(chǎn)率的普通技術(shù)，因此，仍然需要許多試驗(yàn)，且對(duì)這些試驗(yàn)的結(jié)果會(huì)是成功的無任何保證。
本發(fā)明發(fā)明人試驗(yàn)了哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的分泌。在這種情況下，22KhGH能相對(duì)較好地被分泌，但就分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素(此后稱為＂20KhGH＂)來說，其分泌產(chǎn)率卻非常低。由此，為了改進(jìn)20KhGH的分泌產(chǎn)率，采用上述公知方法(分泌信號(hào)肽氨基酸序列的修飾和蛋白質(zhì)分泌基因的表達(dá))進(jìn)行了各種研究。然而，在任何研究中，未能發(fā)現(xiàn)有效的分泌產(chǎn)生方法。
本發(fā)明的目的是提供一種有效的分泌產(chǎn)生方法，所述的分泌產(chǎn)生包括將一種重組蛋白質(zhì)(特別是得自哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì))分泌到微生物周質(zhì)中，所述蛋白質(zhì)用現(xiàn)有技術(shù)的方法在微生物中難以產(chǎn)生和分泌。
為了發(fā)現(xiàn)非常新的分泌促進(jìn)因子(它背離了上述公知的觀念)這一目的，本發(fā)明發(fā)明人進(jìn)行了廣泛的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽還原酶(此后簡(jiǎn)稱為＂GR＂)可以在大腸桿菌中與靶重組蛋白質(zhì)同時(shí)表達(dá)，即共表達(dá)，從而分泌到周質(zhì)中的蛋白質(zhì)的量可以顯著改善?；谶@一新的認(rèn)識(shí)，相應(yīng)地完成了本發(fā)明。
(1)本發(fā)明的第一方面針對(duì)一種分泌產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，所述的分泌產(chǎn)生包括將重組蛋白質(zhì)分泌到宿主大腸桿菌周質(zhì)中，所述方法包括在相同的宿主大腸桿菌中人工同時(shí)表達(dá)谷胱甘肽還原酶與靶重組蛋白質(zhì)。
(2)本發(fā)明的第二方面針對(duì)一種分泌產(chǎn)生分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素的方法，所說的分泌產(chǎn)生包括將分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素分泌到宿主大腸桿菌周質(zhì)中，所述方法包括在相同的宿主大腸桿菌中人工同時(shí)表達(dá)谷胱甘肽還原酶與所述人生長(zhǎng)激素。
(3)本發(fā)明的第三方面針對(duì)一種能將重組蛋白質(zhì)分泌到周質(zhì)中的重組大腸桿菌，所述的重組大腸桿菌能夠人工同時(shí)表達(dá)谷胱甘肽還原酶和靶重組蛋白質(zhì)。
(4)本發(fā)明的第四方面針對(duì)一種能將分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素分泌到周質(zhì)中的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌能夠人工同時(shí)表達(dá)谷胱甘肽還原酶和分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素。
按照本發(fā)明的方法，過去在微生物中難以產(chǎn)生和分泌的重組蛋白質(zhì)(特別是得自哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì))可被分泌到微生物周質(zhì)中，從而能有效地產(chǎn)生該重組蛋白質(zhì)。
而且，按照本發(fā)明的方法，20KhGH的產(chǎn)率可由采用大腸桿菌為宿主的遺傳重組技術(shù)改進(jìn)。
本發(fā)明的方法也被認(rèn)為甚至可以改進(jìn)胞內(nèi)產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。


圖1是說明GR表達(dá)質(zhì)粒pKKGR1制備方法的示意圖。
圖2是說明分泌的22KhGH質(zhì)粒pGHW300制備方法的示意圖。
圖3是部分說明用于修飾源于中性蛋白酶的分泌信號(hào)肽的分泌20KhGH質(zhì)粒pGHV1制備方法的示意圖。
圖4是部分說明用于修飾源于中性蛋白酶的分泌信號(hào)肽的分泌20KhGH質(zhì)粒pGHV2制備方法的示意圖。
圖5是部分說明具有修飾過的得自中性蛋白酶的分泌信號(hào)肽的20KhGH分泌質(zhì)粒制備方法的示意圖。
圖6是部分說明具有藥物抗性標(biāo)記的20KhGH分泌質(zhì)粒制備方法的示意圖。
圖7是部分說明具有藥物抗性標(biāo)記的20KhGH分泌質(zhì)粒制備方法的示意圖。
圖8是部分說明具有藥物抗性標(biāo)記的20KhGH分泌質(zhì)粒制備方法的示意圖。
圖9是部分說明具有藥物抗性標(biāo)記的20KhGH分泌質(zhì)粒制備方法的示意圖。
圖10是說明在相同的質(zhì)粒中包含GR基因和20KhGH基因(具有修飾過的分泌信號(hào)肽)的分泌質(zhì)粒pGHV45GR制備方法的示意圖。
圖11是說明在相同的質(zhì)粒中包含GR基因和20KhGH基因(具有修飾過的分泌信號(hào)肽)并且能恰好用于無lacIq基因的宿主菌株的分泌質(zhì)粒pGR10制備方法的示意圖。
Ptac……tac啟動(dòng)子區(qū)SD……核糖體結(jié)合區(qū)TrrnB……rrnB轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)Ampr……氨芐青霉素抗性基因區(qū)pBR322ori……pBR322復(fù)制起點(diǎn)區(qū)
GR……谷胱甘肽還原酶基因PNP……解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶基因啟動(dòng)子區(qū)SS……解淀粉芽胞桿菌的中性蛋白酶分泌信號(hào)肽或修飾過的分泌信號(hào)肽的編碼區(qū)22KhGH……22KhGH基因pUB110ori……pUB110的復(fù)制起點(diǎn)區(qū)TNP……解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)20KhGH……20KhGH基因Tetr……四環(huán)素抗性基因區(qū)lacZ……β-半乳糖苷酶基因區(qū)ColE1ori……ColE1復(fù)制起點(diǎn)區(qū)Ttrp……trpA基因轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)lacIq……lacIq基因現(xiàn)在詳細(xì)描述本發(fā)明。
GR是一種黃素(FAD)酶，它需要NAD(P)H為輔酶，能將氧化型谷胱甘肽還原成還原型谷胱甘肽，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物組織中。已知GR產(chǎn)生可與存在于胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)的二硫鍵反應(yīng)的還原型谷胱甘肽，這樣保留了其SH的還原態(tài)，或者GR具有將過氧化氫交換到水中的解毒功能。此外，已報(bào)道在其葉綠體中表達(dá)得自大腸桿菌的GR的一種植物(煙草)中，對(duì)由光引起的氧化應(yīng)力的抗性增加[＂Plant Cell Physiol.＂，Vol.34，p.129-135(1993)]。然而，本發(fā)明中的GR增加的表達(dá)與分泌效率有關(guān)這一認(rèn)識(shí)迄今還不存在。
GR基因和重組蛋白質(zhì)基因的共表達(dá)可以由使所述兩種基因存在于一個(gè)復(fù)制子中的方式或使它們分別存在于不同的復(fù)制子中的方式完成。所述復(fù)制子指DNA復(fù)制的一個(gè)自主單位。“使所述兩種基因存在于一個(gè)復(fù)制子中”指所述兩種基因一起存在于一個(gè)染色體或一個(gè)質(zhì)粒中?！笆顾鼈兎謩e存在于不同的復(fù)制子中”指GR基因和重組蛋白質(zhì)基因存在于染色體和一個(gè)質(zhì)?；驈?fù)制子不同的兩個(gè)質(zhì)粒的每一組合中。
在本發(fā)明中，可以使用得自任何生物的有效的GR基因。而且也可以使用任何已知的GR基因，例如從GR的mRNA獲得的cDNA和由化學(xué)合成裝配的基因。源于大腸桿菌的GR基因可容易地獲得并適于使用。在本發(fā)明中，當(dāng)使用源于大腸桿菌的GR基因時(shí)，可允許所獲得的GR基因與染色體或質(zhì)粒共存，并且GR基因可與重組蛋白質(zhì)同時(shí)表達(dá)，因?yàn)榈米源竽c桿菌的GR原始存在于大腸桿菌染色體中。
只要其能在大腸桿菌中表達(dá)，本發(fā)明中對(duì)分泌的重組蛋白質(zhì)沒有特別的限制。所述重組蛋白質(zhì)的例子包括22KhGH、20KhGH和β-內(nèi)酰胺酶，本發(fā)明對(duì)產(chǎn)生20KhGH特別有效。本發(fā)明已提出了一種使用大腸桿菌分泌產(chǎn)生20KhGH的方法，其中使用了得自解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶基因的啟動(dòng)子，即一種分泌信號(hào)肽(USP5,496,713)。按照所提出的方法，分泌產(chǎn)生20KhGH可以提高到30mg/升培養(yǎng)基。但仍期望培養(yǎng)一種能獲得更高產(chǎn)量的菌株。
20KhGH具有一個(gè)176個(gè)氨基酸的序列，在構(gòu)成22KhGH的191個(gè)氨基酸序列中缺失了其第23到46位氨基酸(15個(gè)殘基)。近年來，盡管22KhGH已用于醫(yī)療，但人們更多得注意到作為一種具有較低的葡萄糖耐受畸變性和較低的白血病起因的hGH的20KhGH的生物學(xué)性質(zhì)。同以，20KhGH是一種作為新的藥用hGH被表達(dá)的蛋白質(zhì)。而且，就20KhGH的N-端14位氨基酸來說，已有兩種報(bào)道，即，一種報(bào)道它為絲氨酸，另一種報(bào)道它為蛋氨酸。這就是說，在Masuda，N.et al.，＂Biophysica Acta＂，Vol.949，p.125(1988)中，一段cDNA堿基序列是AGT(它編碼絲氨酸)，在Martial，J.A.et al.，＂Science＂，Vol.205，p.602(1979)中，包含為20KhGH的從N-末端起的第14位氨基酸編碼的序列的一段mRNA是AUG(它編碼蛋氨酸)。本發(fā)明的20KhGH指第14位氨基酸為蛋氨酸的氨基酸序列和第14位氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列兩者。此外，其1或2位氨基酸被取代、丟失、插入或缺失的氨基酸序列也包含在本發(fā)明的20KhGH類別的范圍內(nèi)。
對(duì)分泌信號(hào)肽的類別沒有特別的限制，源于任何分泌蛋白質(zhì)的分泌信號(hào)肽均是可用的。然而，優(yōu)選的分泌信號(hào)肽應(yīng)考慮待分泌蛋白質(zhì)的種類來選擇。就分泌產(chǎn)生20KhGH而言，得自解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶的分泌信號(hào)肽是優(yōu)選的，如USP5,496,713所述。為了發(fā)現(xiàn)一種對(duì)分泌20KhGH比得自解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶更有利的氨基酸序列這一目的，本發(fā)明發(fā)明人進(jìn)行了一種實(shí)驗(yàn)。即，將一個(gè)堿性氨基酸(Lys)加入到分泌信號(hào)肽N-末端氨基酸序列的正電荷區(qū)，將5個(gè)疏水氨基酸(Leu)加入到分泌信號(hào)肽N-末端氨基酸序列的中心疏水區(qū)，有秩序地組裝攜帶各種修飾分泌信號(hào)肽的20KhGH分泌質(zhì)粒。如比較實(shí)施例1所述。然后，培養(yǎng)用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主大腸桿菌，結(jié)果某些修飾的分泌信號(hào)肽提高了分泌蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。而如實(shí)施例4所示，如果GR基因和20KhGH基因在大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)時(shí)，在所有轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中觀察到具有修飾分泌信號(hào)肽的20KhGH的分泌改善效果。修飾分泌信號(hào)肽pGHV45的序列示于序列表的SEQ ID NO1中，利用這一序列可以獲得最高的分泌水平。
GR基因與編碼待分泌的靶蛋白質(zhì)基因同時(shí)人工表達(dá)，因此，如果GR基因表達(dá)非常強(qiáng)烈，這種情況下就會(huì)影響大腸桿菌的生長(zhǎng)和靶蛋白的分泌。這一問題可以基于已知信息通過控制GR基因的表達(dá)來解決。例如，當(dāng)使用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(tac啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子等)表達(dá)GR基因時(shí)，可以適當(dāng)?shù)夭捎靡环N方法，如降低加入的誘導(dǎo)劑的濃度、不加誘導(dǎo)劑或使用啟動(dòng)子的抑制基因(如tac啟動(dòng)子的LacIq)。GR基因的過度強(qiáng)烈地表達(dá)可很容易地通過對(duì)由超聲波處理培養(yǎng)細(xì)胞的溶液進(jìn)行電泳分析來證實(shí)。
為了制備本發(fā)明的重組大腸桿菌，將(a)包含上述的GR基因和與此連接的啟動(dòng)子的一段DNA和/或(b)包含編碼重組蛋白質(zhì)的基因的一段DNA和編碼啟動(dòng)子和在上游側(cè)向與重組蛋白基因連接的分泌信號(hào)肽序列的一段DNA摻入到一個(gè)可復(fù)制的載體中或分別摻入到不同的可復(fù)制的載體中，以產(chǎn)生一種質(zhì)粒，然后用轉(zhuǎn)化的方法將這一質(zhì)粒引入到宿主大腸桿菌中。換種方法，以上DNA(a)和(b)可以一起摻入到染色體DNA中，或者可以各自分別摻入到一種染色體DNA和一種質(zhì)粒中。
就在本發(fā)明中能用作宿主的大腸桿菌菌株來說，任何菌株都是可接受的。但無致病性的且實(shí)際已經(jīng)常應(yīng)用的大腸桿菌菌株是優(yōu)選的。這種合適的可用的菌株的例子包括JM109、HB101和W3110(ATCC27325)。這里，ATCC編號(hào)是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心收藏的微生物的編號(hào)，ATCC27325可以售賣給任何一個(gè)需要它的人。
這樣，可以獲得轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株，在該菌株中，蛋白質(zhì)可以通過GR基因的表達(dá)得到有效的分泌。特別是20KhGH的分泌作用可以得到明顯改善。可以分泌和產(chǎn)生20KhGH的菌株的例子是MT-10765，這一菌株以保藏號(hào)BP-5020保藏在1-1-3，Higasi，Tsukuba City，Ibaraki Prefecture，Japan的工業(yè)科學(xué)技術(shù)局國(guó)家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所。因MT-10765菌株可在30℃的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，所以可以縮短培養(yǎng)時(shí)間，且20KhGH的產(chǎn)率可高達(dá)每升培養(yǎng)基70mg或更高。
涉及靶蛋白質(zhì)產(chǎn)生的改進(jìn)的GR以增加的量在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的機(jī)制不清楚?？赡苁荊R與有關(guān)胞質(zhì)膜中質(zhì)子梯度的形成的現(xiàn)象和在待分泌蛋白質(zhì)通過胞子膜的轉(zhuǎn)運(yùn)步驟中需要的氧化還原電位有關(guān)。
轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株按已知的培養(yǎng)技術(shù)在包含可被同化的碳源、氮源和無機(jī)鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。就培養(yǎng)方法來說，可優(yōu)選地使用液體培養(yǎng)。優(yōu)選的培養(yǎng)基是包含0.2到1.0％甘油的加倍濃縮的LB培養(yǎng)基(20g/l聚蛋白胨和10g/l酵母膏)。
經(jīng)培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株，分泌的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化菌株的周質(zhì)中積累。從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株的周質(zhì)中收集分泌的蛋白質(zhì)可以用從周質(zhì)中收集純化蛋白質(zhì)的常用方法進(jìn)行。例如，滲透休克方法[Nossal G.N.，＂J.Biol.Chem.＂，Vol.241(13)，p.3055-3062(1996)]或類似的方法。
因此，按照本發(fā)明的產(chǎn)生方法，所需蛋白質(zhì)可以有效地分泌到轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株的周質(zhì)中，并在該周質(zhì)中積累。
下面將結(jié)合實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍絲毫不受這些實(shí)施例的限制。
在下列實(shí)施例中具有“FERM BP-”編號(hào)的菌株保藏在以上所述的“國(guó)家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所”。實(shí)施例1GR基因和hGH基因共表達(dá)對(duì)hGH分泌效率的影響(1)大腸桿菌GR基因表達(dá)質(zhì)粒pKKGR1的制備制備這一質(zhì)粒的一種方法示于圖1中。制備大腸桿菌K-12菌株(ATCC23716)的染色體DNA。使用化學(xué)合成的寡核苷酸引物SEQ IDNO2和SEQ ID NO3，以上述染色體為模板用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增GR基因[Mullis，K.B.et al.，＂MethodsEnzymol.＂，Vol.155，P.335-350(1987)]。結(jié)果獲得了一個(gè)包含編碼大腸桿菌GR基因的序列的DNA區(qū)段。接著，用限制酶EcoRI和PstI消化這一DNA區(qū)段，以分離1352bp的DNA片段。接著用限制酶EcoRI和PstI消化從Pharmacia Co.Ltd獲得的載體質(zhì)粒pKK223-3，分離4.6kb的DNA片段(2)，將這一DNA片段(2)與上述DNA片段(1)連接，制備表達(dá)大腸桿菌GR基因的質(zhì)粒pKKGR1的。此后，按InoueH.et al.[＂Gene 96＂，p.23-28(1990)]的方法用以上提到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株(從Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)，獲得一個(gè)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株(MT-10771)。(2)22KhGH分泌質(zhì)粒pGHW300的制備制備這一質(zhì)粒的一種方法示于圖2中。用限制酶StuI和BglII消化用于枯草桿菌宿主的22KhGH分泌質(zhì)粒phGH526[Nakayama A.et al.，J.Biotech，Vol.8，p.123-134(1988)]，分離一個(gè)包含C-末端截短的22KhGH基因的DNA比段(3)。另一方面，用限制酶StuI和BglII消化從MT-10712(FERM BP-4361)抽提出的人20KhGH分泌質(zhì)粒pGHW3(USP5,496,713)獲得一個(gè)載體片段(4)。該這一載體片段(4)與以上提到的DNA片段(3)連接，獲得一個(gè)22KhGH分泌質(zhì)料pGHW300。此后，用以上提到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101菌株(從Takara Shuzo Co.Ltd.獲得)，獲得MT-10773。如此獲得的MT-10773以FERM BP-5019的保藏號(hào)保藏。(3)hGH基因和GR基因的共表達(dá)上述質(zhì)粒pGHW3具有編碼作為從20KhGH N-末端起的第14位氨基酸的絲氨酸的DNA堿基序列。另一方面，本發(fā)明人制備了一種攜帶包括為從N-末端起的14位氨基酸的蛋氨酸編碼的密碼子在內(nèi)的核苷酸序列的20KhGH分泌質(zhì)粒pGHW30。具體來說，以質(zhì)粒pGHW3為模板，用化學(xué)合成的寡核苷酸SEQ ID NO17和市售的M4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約0.6kbp的DNA片段。用限制酶StuI和BglII消化這一擴(kuò)增的DNA片段，然后用質(zhì)粒pGHW3相應(yīng)的部分取代所形成的StuI-BglII片段，制備出具有為20KhGH編碼的核苷酸序列的20KhGH分泌質(zhì)粒pGHW30，所述序列具有為作為從N-末端起的14位氨基酸的蛋氨酸編碼的密碼子。此外，用上述質(zhì)粒pGHW30轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110菌株(ATCC27325)，獲得轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株(MT-10772)。接著，用常用的方法從這一轉(zhuǎn)化菌株抽提和純化質(zhì)粒pGHW30。此后，按照Inoue H.et al.，[＂Gene96＂，p.23-28(1990)]的方法，分別用pGHW30與pKKGR1的組合和pGHW300和pKKGR1的組合來轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌JM109菌株。將如此獲得的每一種轉(zhuǎn)化體于30℃下在含有10μg/ml氨芐青霉素和10μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其形成菌落。接下來將分離的轉(zhuǎn)化體在30℃的培養(yǎng)溫度下在含有100μg/ml氨芐青霉素和10μg/ml四環(huán)素的雙倍濃縮的LB培養(yǎng)基(20g/l聚蛋白胨和10g/l酵母膏)中培養(yǎng)24小時(shí)。因質(zhì)粒pKK223-3和pKKGR1具有tac啟動(dòng)子，所以要監(jiān)測(cè)在培養(yǎng)具有這類質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株的培養(yǎng)開始時(shí)加入1mM IPTG的影響。在培養(yǎng)之后，用滲透沖擊方法[Nossal G.N.，＂J.Biol.Chem.＂，Vol.241(13)，p.3055-3062(1996)]收集分泌到周質(zhì)部分中的hGH。以酶疫免測(cè)定法[Kato K.et al.，＂J Immunol.＂，Vol.116，p.1554(1967)]用hGH的抗體測(cè)定hGH在周質(zhì)部分中的濃度。按以下方法制備周質(zhì)部分溶液。這就是說，采用離心培養(yǎng)基的方法，以沉淀組分的狀態(tài)收集培養(yǎng)的大腸桿菌的細(xì)胞沉淀，然后懸浮在原始培養(yǎng)基1/10量的等滲溶液(含有20％蔗糖和1mM EDTA的10mM tris-鹽酸緩沖液(ph7.0))中。此后，使懸液靜置30分鐘，接著進(jìn)行離心分離并收集細(xì)胞沉淀。接下來，將如此收集的細(xì)胞沉淀懸浮在4℃的冷水中，抽提存在于細(xì)胞沉淀周質(zhì)中的蛋白質(zhì)。將該懸液離心分離，從其中除去細(xì)胞沉淀。收集作為周質(zhì)組分的所形成的上清液(提取的組分)。用酶免疫測(cè)定法測(cè)定在周質(zhì)組分中的收集的hGH的濃度。根據(jù)測(cè)定值，計(jì)算每升培養(yǎng)基中分泌的hGH的量。結(jié)果示于表1和表2中。
表1由GR基因同時(shí)表達(dá)引起的20KhGH分泌量的提高(以mg/升培養(yǎng)基)
表2由GR基因同時(shí)表達(dá)引起的22KhGH分泌量的提高(以mg/升培養(yǎng)基表示)
當(dāng)GR基因與hGH基因共表達(dá)時(shí)，20khGH和22khGH兩者均比在單獨(dú)使用hGH分泌質(zhì)粒時(shí)得到更大量的分泌。當(dāng)使載體質(zhì)粒pKK223-3和hGH分泌質(zhì)粒存在于同一細(xì)胞中的情況下，分泌的20khGH和22khGH兩者的量都降低。而使GR表達(dá)質(zhì)粒pKKGR1和hGH分泌質(zhì)粒存在于同一細(xì)胞中時(shí)，分泌的20khGH和22khGH兩者的量均明顯增加。這一事實(shí)表明，GR基因的共表達(dá)可以提高分泌的靶產(chǎn)物的產(chǎn)量。為什么在載體質(zhì)粒pKK223-3和hGH分泌質(zhì)粒的共存在時(shí)，分泌的hGH的量比hGH分泌質(zhì)粒單個(gè)存在時(shí)的量要小的原因還不確定。但是，與hGH分泌質(zhì)粒類似，pKK223-3有源于pBR322的復(fù)制起點(diǎn)，因此可以假定會(huì)出現(xiàn)復(fù)制和相容性致劣的競(jìng)爭(zhēng)。也可以假定，pKK223-3的藥物抗性標(biāo)記β-內(nèi)酰胺酶是一種分泌蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在膜通過步驟中與hGH前體競(jìng)爭(zhēng)。
在用GR表達(dá)質(zhì)粒pKKGR1和hGH分泌質(zhì)粒兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株JM109中，需要加入GR表達(dá)的誘導(dǎo)劑(IPTG)。實(shí)施例2GR基因和β-內(nèi)酰胺酶基因的共表達(dá)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶分泌效率的影響在從Pharmacia Labs.，Inc.獲得的載體質(zhì)粒pKK223-3上，β-內(nèi)酰胺酶基因以一種藥物抗性標(biāo)記存在。β-內(nèi)酰胺酶在大腸桿菌胞質(zhì)中表達(dá)，然后分泌到周質(zhì)空間并在那里積累。將GR基因滲入到pKK223-3中形成質(zhì)粒pKKGR1，因而該質(zhì)粒僅在這一點(diǎn)上與pKK223-3不同，質(zhì)粒pKKGR1的剩下的部分與pKK223-3中的完全相同(包括β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)區(qū)在內(nèi))。因此，通過將由質(zhì)粒pKKGR1表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶的分泌量與由質(zhì)粒pKK223-3表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶的分泌量進(jìn)行比較，可以看出GR同時(shí)表達(dá)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶分泌效率的影響。以與上述hGH產(chǎn)生菌株的培養(yǎng)相同的方法培養(yǎng)用各個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的JM109菌株。收集周質(zhì)部分溶液，進(jìn)行SDS-PAGE，然后用考馬斯亮藍(lán)R250染色。此后，用光密度計(jì)測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶帶(32.0kDa)，以檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶相對(duì)于總的周質(zhì)蛋白質(zhì)的含量比率(％)。結(jié)果示于表3中。
表3GR基因的共表達(dá)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶分泌效率的影響[A660(32.0kDa)/A660(周質(zhì)組分中總蛋白量)％]
大腸桿菌的β-內(nèi)酰胺酶向周質(zhì)中的分泌也能被GR基因的共表達(dá)加強(qiáng)得到了證實(shí)。實(shí)施例3使用源于大腸桿菌OmpA的分泌信號(hào)肽分泌和產(chǎn)生20KhGH
(1)嘆基因和具有得自大腸桿菌OmpA基因的分泌信號(hào)肽編碼區(qū)的20KhGH基因的共表達(dá)按與實(shí)施例1相同的方式將20KhGH分泌質(zhì)粒pGHW40與GR表達(dá)質(zhì)粒pKKGR1一起轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109菌株中，所述質(zhì)粒pGHW40攜帶有源于解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和源于大腸桿菌外膜蛋白OmpA基因的分泌信號(hào)肽。用與實(shí)施例1相同的方法培養(yǎng)如此轉(zhuǎn)化的菌株，然后抽提周質(zhì)組分。接著用酶免疫測(cè)定法測(cè)定分泌的20KhGH的量，結(jié)果示于表4中。
表4由使用源于大腸桿菌OmpA的信號(hào)肽共表達(dá)GR基因產(chǎn)生的分泌促進(jìn)作用(以mg/升培養(yǎng)基表示)
對(duì)20KhGH的分泌來說，源于解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶的分泌信號(hào)肽是優(yōu)選的(表1)，分泌的20KhGH的量可以經(jīng)共表達(dá)GR基因明顯增加。然而，即使通過使用用具有源于大腸桿菌OmpA的分泌信號(hào)肽的分泌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株，由于GR基因的共表達(dá)，其分泌效率能明顯提高，但分泌的20KhGH的量比使用源于中性蛋白酶的分泌信號(hào)肽時(shí)的量相對(duì)小一些。
而且，如實(shí)施例2所示，在具有β-內(nèi)酰胺酶的分泌信號(hào)肽的β-內(nèi)酰胺酶分泌中也可以觀察到GR基因的同時(shí)表達(dá)產(chǎn)生的分泌促進(jìn)作用。就這一事實(shí)來看，GR基因同時(shí)表達(dá)的作用并不被特定種類的分泌信號(hào)肽所限制，這一點(diǎn)是明顯的。比較實(shí)施例1使用源于解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶的修飾分泌信號(hào)肽產(chǎn)生20KhGH(1)用于修飾源于中性蛋白酶的分泌信號(hào)肽的20KhGH分泌質(zhì)粒pGHV2的裝配為了將一個(gè)可有可無的氨基酸殘基插入到源于解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶的分泌信號(hào)肽中，向分泌信號(hào)肽序列中引入一個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)，并同時(shí)組成一個(gè)完整的質(zhì)粒，以產(chǎn)生用于修飾分泌信號(hào)肽的質(zhì)粒pGHV2。方法示于圖3和圖4中。在用限制酶消化pGHV2后，用克列諾酶處理使pGHW30末端變成平端，使限制酶BamHI作用在pGHW30上，從而制備約0.85kbp的DNA片段(5)，該片段含有一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)分泌信號(hào)肽編碼區(qū)，兩個(gè)中性蛋白酶基因和20KhGH基因。將這一DNA片段(5)與載體部分(6)連接，所述載體部分是由為了產(chǎn)生pGHV1(圖3)用限制酶SmaI和BamHI處理市售的克隆載體pUCll9獲得的。接著，以所述pGHVl為模板，用化學(xué)合成的寡核苷酸SEQ ID NO4和市售M4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約100bp的包含中性蛋白酶基因啟動(dòng)子的DNA片段(7)。此外，也用化學(xué)合成的寡核苷酸SEQ ID NO5和市售RV引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約700bp的含有中性蛋白酶分泌信號(hào)肽編碼區(qū)基因和20KhGH基因的DNA片段(8)。接著，為了用這一PCR擴(kuò)增將可有可無的氨基酸殘基插入到分泌信號(hào)肽中這一目的，設(shè)計(jì)一種引物SEQ ID NO5，以使其中可包含識(shí)別限制酶NdeI和SpeT的位點(diǎn)。如圖4所示，分別用限制酶EcoRI和NdeI、NdeI和HindIII消化擴(kuò)增的DNA片段(7)和(8)，然后連接到用EcoRI和HindIII消化市售的克隆載體pUC118獲得的載體部分(9)上，從而產(chǎn)生pGHV2(圖4)。在由這一質(zhì)粒編碼的源于中性蛋白酶的信號(hào)肽中，由于限制酶NdeI和SpeI識(shí)別位點(diǎn)的插入，其從N-末端起的第8位絲氨酸(Ser)殘基被蘇氨酸(Thr)殘基取代。(2)具有修飾分泌信號(hào)肽序列的20K hGH分泌質(zhì)粒的產(chǎn)生為了在分泌信號(hào)肽序列中增加一個(gè)正電荷區(qū)和一個(gè)疏水區(qū)，分別插入正電荷氨基酸(Lys)和疏水氨基酸(Leu)。Mizusima等已報(bào)道，從分泌效率考慮，有許多構(gòu)成疏水區(qū)的疏水氨基酸殘基(Hikita C.and Mizushima S.，＂J.Biol.Chem.＂，Vol.267，p.4882-4888(1992)]，因此合成了SEQ ID NO 6-10所示的接頭DNA，其中改變了被插入的亮氨酸殘基的數(shù)量。用夾在pGHV2的限制酶NdeI和SpeI之間的區(qū)取代每一合成接頭，產(chǎn)生20KhGH分泌質(zhì)粒(pGHV3、pGHV4、pGHV5、pGHV6和pGHV)，所述質(zhì)粒在分泌信號(hào)肽序列中具有不同的亮氨酸殘基(圖5顯示了使用SEQ ID NO8為代表性例子的方法)。經(jīng)使用熒光探針DNA序列試劑盒(ABI Co.，Ltd.制造)翻譯在分泌信號(hào)肽序列中編碼氨基酸殘基的DNA序列來證實(shí)修飾分泌信號(hào)肽序列中的氨基酸序列。在引入了額外的亮氨酸殘基后，用上述pGHV2的絲氨酸(Ser)殘基再次取代蘇氨酸(Thr)殘基，除了插入的殘基外，原始序列被保持。(3)使用具有修飾分泌信號(hào)肽的20KhGH分泌質(zhì)粒產(chǎn)生20KhGH用與實(shí)施例1相同的方式培養(yǎng)用以上獲得的具有修飾分泌信號(hào)肽的每一20KhGH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109菌株，然后提取周質(zhì)組分。此后，測(cè)量20KhGH的含量，再計(jì)算每升培養(yǎng)其中20KhGH的產(chǎn)量。結(jié)果示于表5中。在表5中，符號(hào)K代表Lys殘基，L代表leu殘基。各符號(hào)前面的數(shù)字分別代表插入后在正電荷區(qū)和疏水區(qū)存在的賴氨酸殘基的亮氨酸殘基的數(shù)目。
表5分泌信號(hào)肽序列的修飾對(duì)分泌的20KhGH的量的影響(以mg/升培養(yǎng)基表示)
實(shí)施例4GR基因的共表達(dá)和分泌信號(hào)肽序列的修飾對(duì)分泌20KhGH的影響(1)通過分泌信號(hào)肽的修飾改變20KhGH分泌質(zhì)粒的藥物抗性標(biāo)記將GR表達(dá)質(zhì)粒和用修飾分泌信號(hào)肽分泌20KhGH的質(zhì)粒滲入到相同的宿主細(xì)菌中，且為了測(cè)定GR基因的同時(shí)表達(dá)對(duì)分泌20KhGH的影響，有必要將具有帶修飾信號(hào)肽的20KhGH分泌質(zhì)粒的藥物抗性標(biāo)記從氨芐青霉素改變成四環(huán)素。對(duì)攜帶有修飾分泌信號(hào)肽編碼區(qū)的質(zhì)粒(pGHW30、pGHV2、pGHV3、pGHV4、pGHV5、pGHV6和pGHV7)進(jìn)行所有相同的操作，因此僅以pGHV5為代表例在以下進(jìn)行描述。
簡(jiǎn)單地說，用pGHV5和EcoRI-HindIII部分(含有中性蛋白酶基因的啟動(dòng)子和編碼由修飾信號(hào)肽與20KhGH組成的前體的區(qū))取代pBR322的EcoRi-HindIII部分?？寺≥d體pBR322是可以購買到的。
在這種情況下，為了阻止中性蛋白酶啟動(dòng)子的引入，將trpA終止子序列直接加在編碼20KhGH的DNA序列的下游側(cè)向。
具體地說，將SEQ ID NO11所示的含有trpA終止子的合成接頭插入到夾在pGHV5的限制酶Bamhi和XbaI之間的位點(diǎn)，以獲得pGHV15(圖6)。接著，用限制酶EcoRI和HindIII切割pGHV15，獲得約0.85kbp的DNA片段(10)。另一方面，用限制酶EcoRI和HindIII切割pBR322，以取得載體部分(11)。將所述DNA片段(10)與載體部分(11)連接制備pGHV25(圖7)。然而，該質(zhì)粒缺失四環(huán)素抗性基因，HindIII上游的-35序列，因而它僅表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性，而不表現(xiàn)出四環(huán)素抗性功能。為了將-35序列插入到四環(huán)素基因的上游側(cè)向這一目的，化學(xué)合成SEQ ID NO12所示的DNA接頭，然后插入到夾在pGHV25的限制酶XbaI和HindIII之間的位點(diǎn)上，以制備pGHV35(圖8)。此外，為了消除pGHV35具有的氨芐青霉素抗性基因，使約0.8kbp的區(qū)缺失產(chǎn)生pGHV45(圖9)，所述約0.8kbp的區(qū)位于限制酶EcoRI和VspI之間以固定啟動(dòng)子區(qū)的氨芐青霉素抗性基因。對(duì)具有其它修飾信號(hào)肽的20KhGH分泌質(zhì)粒進(jìn)行類似的操作，產(chǎn)生pGHV42、pGHV43、pGHV44、pGHV46和PGHV47。
(2)用具有修飾分泌信號(hào)肽編碼區(qū)的20KhGH分泌質(zhì)粒的GR表達(dá)質(zhì)粒分泌20KhGH將同時(shí)用20KhGH分泌質(zhì)粒(具有修飾分泌信號(hào)肽編碼區(qū)，該區(qū)帶有獲得的四環(huán)素抗性標(biāo)記)和GR表達(dá)質(zhì)粒pKKGR1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109菌株加入到含有IPTG(1mM)的培養(yǎng)基中。然而用與實(shí)施例1相同的方法培養(yǎng)，然后提取周質(zhì)組分。此后，測(cè)定20KhGH的含量，再計(jì)算每升培養(yǎng)基中20KhGH的產(chǎn)量。結(jié)果示于表6中。在表6中，符號(hào)K代表Lys殘基、符合L代表Leu殘基。這些符號(hào)前面的數(shù)字分別代表插入后在正電荷區(qū)和疏水區(qū)存在的賴氨酸殘基和亮氨酸殘基的數(shù)目。
表6在GR基因共表達(dá)下分泌信號(hào)肽序列的修飾作用(對(duì)分泌的20KhGH的量的影響)(以mg/升培養(yǎng)基表示)
在這些具有修飾分泌信號(hào)肽的20KhGH質(zhì)粒中，pGHV45給出最大的分泌產(chǎn)量。實(shí)施例5用在同一質(zhì)粒中包含20KhGH基因(帶有修飾分泌信號(hào)肽編碼區(qū))和GR基因的質(zhì)粒產(chǎn)生20KhGH(1)在同一質(zhì)粒中包含帶有分泌信號(hào)肽編碼區(qū)的20KhGH基因和GR基因的分泌質(zhì)粒pGHV45GR的產(chǎn)生用示于SEQ ID NO 13和14中的合成寡核苷酸為引物，將包含tac啟動(dòng)子、GR基因和TrrnB終止子的pKKGR1的一個(gè)區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得約2.0kbp的DNA片段(12)。在這種情況下，設(shè)計(jì)各引物，以使限制酶AvaI和AccIII的識(shí)別序列可以存在于DNA片段的兩端。接著將包含GR基因表達(dá)區(qū)的DNA片段(12)插入到用限制酶AvaI和AccIII消化的pGHV45的位點(diǎn)上，產(chǎn)生pGHV45GR(圖10)。
(2)使用在同一質(zhì)粒中包含20KhGH基因(帶有修飾分泌信號(hào)肽編碼區(qū))和GR基因的分泌質(zhì)粒pGHV45GR產(chǎn)生20KhGH用與實(shí)施例1相同的方法培養(yǎng)由pGHV45GR轉(zhuǎn)化的各種大腸桿菌菌株，提取各周質(zhì)組分。接著測(cè)定20KhGH的含量，并計(jì)算每升培養(yǎng)基中20KhGH的產(chǎn)量(mg)，結(jié)果示于表7中表7經(jīng)使用pGHV45GR的20KhGH的產(chǎn)率(以mg/升培養(yǎng)基表示)
在以JM109為宿主并且向培養(yǎng)基中加入IPTG的情況下，分泌的20KhGH的量與使用兩種不同質(zhì)粒的實(shí)施例1、2和3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較相反地要低。當(dāng)將超聲波處理制備的全細(xì)胞提取溶液進(jìn)行SDS-PAGE分析時(shí)，可證實(shí)GR非常高的產(chǎn)量。相反地，在不向培養(yǎng)基中加入IPTG的非誘導(dǎo)條件下，獲得了大量的分泌產(chǎn)物。用SDS-PAGE將這些培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行類似的分析，結(jié)果證實(shí)產(chǎn)生的GR的量比在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的GR的量小。從這些結(jié)果可明顯看出，對(duì)轉(zhuǎn)化的JM109(其中20KhGH基因和GR基因存在于同一質(zhì)粒中)，向培養(yǎng)基中加入IPTG的條件是優(yōu)選的。GR基因被tac啟動(dòng)子表達(dá)，但宿主是JM109的情況下，可以認(rèn)為加入IPTG的誘導(dǎo)作用導(dǎo)致GR基因的過度表達(dá)，這引起分泌作用的降低。
在轉(zhuǎn)化的W3110中，在IPTG誘導(dǎo)和無IPTG誘導(dǎo)兩種情況下都獲得了小量的分泌，如表7所示。當(dāng)由超聲波處理制備的全細(xì)胞提取溶液用于SDS-PAGE分析時(shí)，可證實(shí)GR非常高的產(chǎn)量。在以HB101為宿主的情況下也獲得了類似的結(jié)果。
可以假定由于不同宿主JM109和W3110引起的上述不同與每一宿主染色體上的lacIq的存在/不存在有關(guān)。這就是說，JM109具有起到tac啟動(dòng)子的抑制劑作用的tacIq基因，而W3110沒有任何lacIq基因。用以RB791為宿主的以下實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一假設(shè)是正確的。RB791(ATCC53622)是由將lacIq基因整合到W3110中制備的菌株，RB791的其它特征與W3110的相同。在使用RB791的情況下，在IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件下分泌的20KhGH的量降低，與在JM109的情況下一樣，電泳證實(shí)了GR的高產(chǎn)量。另一方面，在無IPTG誘導(dǎo)的情況下，可以獲得大量分泌的20KhGH。電泳證實(shí)了不存在GR的過度產(chǎn)生。實(shí)施例6無lacIq基因的宿主菌株的使用為了使在實(shí)施例5中令人不滿意的大腸桿菌宿主的W3110和HB101能夠使用，進(jìn)行了以下所述的研究(1)在相同的質(zhì)粒中包含20KhGH基因(帶有修飾分泌信號(hào)肽編碼區(qū))和GR基因并且即使在無lacIq基因的宿主中也是有效的分泌質(zhì)粒pGHR10的產(chǎn)生為了將lacIq基因整合到作為20KhGH基因表達(dá)區(qū)的相同的復(fù)制子中，以化學(xué)合成的示于SEQ ID NO 15和16為引物，將市售表達(dá)載體pTrc99A(Pharmacia Labs.，Inc.)的lacIq基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在這種情況下，設(shè)計(jì)各引物使限制酶EcoT141和AvaI識(shí)別位點(diǎn)可以加入到DNA片段(13)的兩端。接著，用限制酶EcoT141和AvaI消化pGHV56GR，以得到載體片段(14)。將這一載體片段(14)與含有l(wèi)acIq基因的DNA片段(13)連接，產(chǎn)生pGHR10(圖11)。所插入的lacIq基因僅含有RBS序列(一個(gè)核糖體鍵合區(qū))，但不含有任何啟動(dòng)子區(qū)，因此它可以經(jīng)引入上游四環(huán)素抗性基因被轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
(2)使用在同一質(zhì)粒中含有20KhGH基因(帶有修飾的分泌信號(hào)肽編碼區(qū))和GR基因且其中GR的表達(dá)由lacIq基因控制的分泌質(zhì)粒pGHR10產(chǎn)生20KhGH。
用與實(shí)施例1相同的方式培養(yǎng)用pGHR10轉(zhuǎn)化的各種轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，然后提取各周質(zhì)組分。接著測(cè)定20KhGH的含量，并計(jì)算每升培養(yǎng)基中20KhGH的產(chǎn)量(mg)。結(jié)果示于表8中。在所有轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株中，大腸桿菌W3110菌株(MT-10765)(攜帶pGHR10)以保藏號(hào)FERM BP-5020保藏。HB101菌株從Takara Shuzo Co.，Ltd.獲得，LE392菌株(ATCC 33572)從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得。
表8用pGHR10產(chǎn)生20K/hGH(以mg/升培養(yǎng)基表示)
通過采用pGHR10(其中20KhGH基因表達(dá)區(qū)和GR基因存在于相同的復(fù)制子上)和使lacIq基因(控制由啟動(dòng)子(tac)定向的GR基因的表達(dá))存在于相同的質(zhì)粒中，使用不具有l(wèi)acIq基因的宿主菌株也是可能的。
權(quán)利要求
1.一種分泌產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，所述的包括分泌產(chǎn)生將重組蛋白質(zhì)分泌到宿主大腸桿菌的周質(zhì)中，所述方法包括在相同的宿主大腸桿菌中人工同時(shí)表達(dá)谷胱甘肽還原酶和靶重組蛋白質(zhì)這一步驟。
2.按照權(quán)利要求1的分泌產(chǎn)生方法，其中的人工表達(dá)的谷胱甘肽還原酶源于大腸桿菌。
3.按照權(quán)利要求1或2的分泌產(chǎn)生方法，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼靶重組蛋白質(zhì)的基因位于同一復(fù)制子中。
4.按照權(quán)利要求1或2的分泌產(chǎn)生方法，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼靶重組蛋白質(zhì)的基因分別位于不同的復(fù)制子中。
5.一種分泌產(chǎn)生分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素的方法，所述的分泌產(chǎn)生包括將分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素分泌到宿主大腸桿菌的周質(zhì)中，該方法包括在同一宿主大腸桿菌中人工同時(shí)表達(dá)谷胱甘肽還原酶和分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素。
6.按照權(quán)利要求5的分泌產(chǎn)生方法，其中的人工表達(dá)的谷胱甘肽還原酶源于大腸桿菌。
7.按照權(quán)利要求5或6的分泌產(chǎn)生方法，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素的基因位于同一復(fù)制子中。
8.按照權(quán)利要求5或6的分泌產(chǎn)生方法，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素的基因分別位于不同的復(fù)制子中。
9.按照權(quán)利要求5或6的分泌產(chǎn)生方法，其中的有關(guān)分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素的分泌的信號(hào)肽是SEQ ID NO1所描述的氨基酸序列。
10.一種在其中靶重組蛋白質(zhì)能被分泌到周質(zhì)中的重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌能人工同時(shí)表達(dá)谷胱甘肽和靶重組蛋白質(zhì)。
11.按照權(quán)利要求10的重組大腸桿菌，其中的被人工表達(dá)的谷胱甘肽還原酶源于大腸桿菌。
12.按照權(quán)利要求10或11的重組大腸桿菌，其中的谷胱甘肽還原酶基因與編碼靶重組蛋白質(zhì)的基因位于同一復(fù)制子中。
13.按照權(quán)利要求10或11的重組大腸桿菌，其中的谷胱甘肽還原酶基因與編碼靶重組蛋白質(zhì)的基因分別位于不同的復(fù)制子中。
14.一種在其中分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素能被分泌到周質(zhì)中的重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌能人工同時(shí)表達(dá)谷胱甘肽還原酶和分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素。
15.按照權(quán)利要求14的重組大腸桿菌，其中的人工表達(dá)的谷胱甘肽還原酶得自大腸桿菌。
16.按照權(quán)利要求14或15的重組大腸桿菌，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素的基因位于同一復(fù)制子中。
17.按照權(quán)利要求14或15的重組大腸桿菌，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素的基因分別位于不同的復(fù)制子中。
18.按照權(quán)利要求14或15的重組大腸桿菌，其中的有關(guān)分子量約為20,000的人生長(zhǎng)激素的分泌的分泌信號(hào)肽是SEQ ID NO1中描述的氨基酸序列。
19.按照權(quán)利要求18的重組大腸桿菌，其中的重組大腸桿菌是FERM BP-5020。
全文摘要
在從大腸桿菌周質(zhì)中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法中，通過人工共表達(dá)谷胱甘肽還原酶和靶重組蛋白質(zhì)，可以提高靶重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1148626SQ9610805
公開日1997年4月30日 申請(qǐng)日期1996年3月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月29日
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