專利名稱：用于直接讀取試劑試驗條的化學定時器的制作方法
本申請是申請?zhí)枮?60,579、申請日為1992年10月13日的美國申請的部分后續(xù)申請，此部分后續(xù)申請是已放棄的、申請?zhí)枮?91,192、申請日為1991年4月25日的美國申請的后續(xù)申請，該已放棄的申請是申請?zhí)枮?99,055、申請日為1989年8月28日、已放棄的美國申請的后續(xù)申請，而這后續(xù)申請是申請?zhí)枮?36,537、申請日為1991年7月26日、專利號為5,306,623的美國申請的部分后續(xù)申請。
本發(fā)明涉及一種化學測定時間間隔的裝置，尤其是涉及一種化學測定在試驗條測定生物溶液中分析物濃度期間的間隔的裝置。
業(yè)已開發(fā)出許多可視的試驗裝置用于測定生物溶液中分析物的濃度。這些裝置例如已經(jīng)測定了血液、尿液或唾液中的葡萄糖、膽固醇、蛋白質(zhì)、酮、苯丙氨酸或酶類。
結合有以酶為主要成分的組合物的干態(tài)試劑條被廣泛地用于臨床實驗室、醫(yī)生辦公室、醫(yī)院以及家庭，來化驗生物液體樣品以便測定葡萄糖的濃度。實際上，試劑條已經(jīng)變成許多國家?guī)装偃f糖尿病人每天的必需品。由于糖尿病能引起血液化學方面危險的反常，因此它們會導致視力喪失、腎衰竭和其它嚴重的醫(yī)學后果。為了使這些后果的危險性減到最小，絕大多數(shù)糖尿病人必須定期進行化驗，然后據(jù)此例如通過控制飲食和/或注射胰島素來調(diào)節(jié)他們的葡萄糖濃度。一些病人甚至必須每天化驗四次或更多次血糖濃度。
對于那些必須控制飲食以便控制糖的攝入和/或給予胰島素注射的糖尿病人和那些必須通過頻繁地化驗血糖濃度來指導治療的糖尿病人來說，具有快速、廉價和準確的用于葡萄糖測定的試劑條是非常重要的。
眾所周知，試劑條含有一種指示劑，這種指示劑可根據(jù)已經(jīng)施加到條上的生物液體中葡萄糖的濃度變成不同的顏色。雖然其中一些試條利用的是還原化學，但是這些試條更普遍地含有一種可氧化染料或染料對。一些試條包括一種能將葡萄糖氧化成葡糖酸和過氧化氫的酶(例如葡糖氧化酶)。它們還含有一種可氧化染料和具有過氧化活性的物質(zhì)，該物質(zhì)在有過氧化氫存在時可選擇性地催化可氧化染料的氧化(例如參見美國專利No.5,306,623)。
美國專利No.3,964,871(公告日1976年6月22日，發(fā)明人Hochstrasser)公開了一種用于直接測定生物液體中諸如葡萄糖這些物質(zhì)的一次性指示條。該指示條利用包含的指示劑和″對抗物(antagonist)″來記錄物質(zhì)的濃度，其中所述指示劑在與物質(zhì)反應時被氧化并變色，而所述″對抗物″在某種程度上可阻止被氧化指示劑的凝聚直到這些指示劑被完全消耗掉。
Palmer等人在1989年5月24日公開的歐洲專利申請No.0317070(也可參見1991年7月30日公開的美國專利No.5,036,000)中公開了一種用于葡萄糖和其它分析物的″數(shù)字″定量分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)可通過首先利用特異于底物的氧化酶氧化生物液體中的有機物以產(chǎn)生過氧化氫來測定該有機物的濃度。這個系統(tǒng)包括一種作為過氧化氫的還原劑的發(fā)色團和一種具有較大還原電位在空氣中穩(wěn)定的過氧化氫還原劑。較大的還原電位通過發(fā)色團可推遲任何可檢測的顏色變化直到在空氣中穩(wěn)定的第一過氧化氫還原劑已被消耗掉。這樣，如果待測的過氧化氫比對應于在空氣中穩(wěn)定的過氧化物還原劑的濃度的預測水平低，則不會產(chǎn)生顏色變化。結果，該系統(tǒng)不依賴顏色變化的強度也可定量測定濃度。
Ismail等人在1987年3月10日公開的美國專利No.4,649,122中公開了一種有效性測試裝置來確認用于測定分析物濃度的試驗組合物的有效性。通過弄濕裝置可測定有效性。當裝置用水弄濕時，會發(fā)生顏色變化或產(chǎn)生一些其它變化來向使用者證實該試條是有效的。
無論化驗是在家里、醫(yī)生辦公室、門診部還是在醫(yī)院進行，葡萄糖測定的準確性和重復性都是相當重要的。在指示顏色的試劑條中，需要表示出顏色變化并且對生物液體中所含的除葡萄糖之外的化合物的變化不敏感。在目測讀取的試劑條中，雖然用給定波長處吸收度的變化表示的顏色變化對于計量器讀取試條的準確性是重要的，但是對于那些視力不佳的糖尿病人，具有一種能夠根據(jù)葡萄糖濃度表示出顯著的顏色變化的檢驗試劑也是相當重要的。
由于顏色變化涉及一系列的化學反應，因此它不是瞬時發(fā)生的。這樣，使用者必須等待一段時間(典型的是1分鐘或更短)來發(fā)生反應。當計器讀取試條時，計時器電路可給出一個表示反應完成的信號。然而，當目測讀取試條時，沒有計量器，使用者可低估所需的時間，過早地讀取試條，而得到一個不正確的結果。另外，使用者在讀取試條之前感到需要等待一段過長的時間以確保反應完全，從而導致不必需的延遲，令使用者不滿意。這樣，就需要一種″化學″計時器即試條上的一個單元，該單元將無視樣品中葡萄糖(或其它感興趣的分析物)的濃度而發(fā)生顏色變化，但是只有在經(jīng)過充足的時間以便與樣品完成顏色形成反應之后才會這樣做。
按照本發(fā)明，直接讀取用于測定生物液體中分析物濃度的試劑試驗條的化學計時器可使試劑試驗條的使用者確信他或她已經(jīng)等了足夠長的時間，可得到合適的讀數(shù)，而無需使用者等待過長的時間。該計時器包括一個具有以下組分的干涂覆層a)一種指示劑組合物；b)一種當水合時能與葡萄糖反應以使指示劑變色的試劑；c)一種能夠抑制指示劑變色的抑制劑，以及d)葡萄糖，其中可選擇干涂覆層中的抑制劑和葡萄糖的濃度以便在生物液體樣品被施加到試條上之后經(jīng)過一段預定時間葡萄糖能與試劑反應以改變指示劑的顏色。
在本發(fā)明另一實施例中，一種制備直接讀取用于測定被施加到試條上的生物液體中分析物濃度的試劑試驗條的化學計時器的方法包括如下步驟a)將當水合時能與葡萄糖反應的試劑溶液涂覆到多孔膜上；b)干燥涂覆層以形成第一層；
c)將含有以下組分的第二層施加到第一層上i)葡萄糖，ii)一種能與試劑和葡萄糖的反應產(chǎn)物發(fā)生反應以產(chǎn)生顏色變化的指示劑，以及iii)一種能抑制指示劑變色的抑制劑。
在操作中，一種用于測定生物液體中分析物的濃度的方法包括如下步驟a)將液體施加到包括以下單元的試驗條上(i)若干個結果段，當其與至少含有預定量分析物的液體接觸時每個段的顏色變化所對應的分析物的量不同于導致其它段顏色變化的分析物的量，以及(ii)一個在一段基本上與液體中分析物的量無關的時間之后發(fā)生顏色變化的定時段，以及(b)當定時段發(fā)生顏色變化時觀察最后變色的結果段。
該試條的類型是那種可目測指示分析物濃度的試條，其中分析物包含在被施加到試條的″樣品面″上的生物液體中。目測指示出現(xiàn)在試條的反(″檢驗″)面。通常在液體樣品被施加到樣品面上的時間與相應的目測指示(典型的是顏色變化)出現(xiàn)在檢驗面上的時間兩者之間有一延遲。因此，如果使用者在讀取之前不等待至少最短的一段時間，則讀數(shù)會給出不正確的值。而且，合適的最小延遲時間受到環(huán)境或試條化學(例如環(huán)境溫度或老化效應)的影響。本發(fā)明的化學計時器當從液體樣品被施加到試條上的時候起經(jīng)過足夠的時間后可向使用者提供一個目測指示。
當然，試驗條的化學組成取決于待測的分析物/生物液體?？梢詫⒃囼炍⒂嫵赡軌驒z測生物液體(例如血液、尿液和唾液)以及水中的諸如葡萄糖或其它糖類、膽固醇、蛋白質(zhì)、酮、尿酸、苯丙氨酸或酶類這些分析物的形式。用于試劑試驗條的化學計時器通常(但不是必需的)宜于響應和試劑試驗條本身相同的分析物/生物液體組合?；瘜W計時器組合物在干態(tài)時必須是穩(wěn)定的，并且計時器化學的任何老化最好與試劑和指示劑化學的老化同步。為了方便和簡潔起見，可用本說明書最為詳細公開的這種計時器和試劑試驗條來檢測血液中的葡萄糖。本領域的普通技術人員可容易地采納此公開文本中的資料來檢測其它分析物/生物液體組合。
本發(fā)明的指示條可相對簡單和快速地測定未測血樣中的葡萄糖的濃度。該試條包括一種具有一個樣品面和一個檢驗面的多孔基質(zhì)。這種基質(zhì)通常是一種膜并且在本發(fā)明的說明書和所附的權利要求書中這兩個詞可以交換使用。檢驗試劑被施加到基質(zhì)上并且更深或更淺程度地浸到基質(zhì)的孔內(nèi)。為了簡單起見，在本說明書和所附的權利要求書中我們將基質(zhì)上的試劑描述成″涂覆層″，認為試劑涂覆層一定程度地滲入基質(zhì)。該基質(zhì)宜于接收被施加到樣品面上、含有紅細胞和葡萄糖的未測全血樣品。基質(zhì)的孔隙度允許液體例如通過毛細作用從樣品面流向檢驗面。這樣，檢驗試劑可與血中的葡萄糖反應，從而在檢驗面上或其附近產(chǎn)生顏色變化。由于顏色深的紅細胞使得顏色變化難于檢測，因此基質(zhì)的孔隙大小是從樣品面上的大孔逐漸過渡到檢驗面上的小孔，以便將紅細胞阻擋在檢驗面之外。各種材料都可用于本發(fā)明的指示條和計時器的不同組分，kiser等人在1994年4月26日公開的美國專利No.5,306,623中公開了其中一些材料，在此可一同作為參考。
檢驗試劑包括一種將葡萄糖轉化成過氧化氫的組分(例如葡萄糖氧化酶)以及一種或多種用于檢測由樣品中存在的葡萄糖生成的過氧化氫的組分。用于檢測過氧化氫的組分可以是過氧化物酶(最好是辣根過氧化物酶)以及在反應中變色的″指示劑″。這種指示劑是一種可氧化染料或染料對。過氧化物酶在過氧化氫的存在下催化指示劑的氧化。試劑試驗條涂覆層的最后一個單元是一種可阻止指示劑氧化變色的抑制劑。
在這個優(yōu)選的實施例中，指示條沿其長度以這樣的方式被分成幾段即相鄰段具有不同的指示劑/抑制劑平衡。我們將這些段稱作“結果段”。如果有足夠的葡萄糖存在則一個特定的結果段只變色，并且當足夠的葡萄糖存在時首先使所有的抑制劑消耗掉，然后再氧化指示劑并借此產(chǎn)生特征性顏色變化。這樣，一個特定結果段的顏色變化表明原始血樣中的閾值葡萄糖濃度。每個后續(xù)的結果段以特定的方向沿試條具有一個與閾值葡萄糖濃度的逐漸增加相對應的抑制劑/指示劑平衡。例如，如果對于所有段指示劑的濃度是相同的，而每個后續(xù)段具有比前一段逐漸增大的抑制劑濃度，那么就可以得到這樣的結果。顯然，其它的抑制劑/指示劑平衡也是可以的。
如果對于一個特定試樣結果段具有合適范圍的指示劑/抑制劑濃度，那么相鄰段可與分析物反應，從而使一個結果段有顏色，而相鄰的段無色。這個結果表明樣品中的葡萄糖濃度最少等于一個段變色所需的閾值濃度，但沒有相鄰段變色所需的閾值濃度那么大。為了監(jiān)測血糖，計時單元涂覆層包括指示條的單元——其上涂有檢驗試劑的多孔基質(zhì)以及還有葡萄糖。試劑化學在干態(tài)時沒有被葡萄糖激活，但是當將樣品施加到試條上時，計時器涂覆層被水合并且涂覆層中的葡萄糖在一段預定的時間之后使指示劑變色。計時器中存在的葡萄糖的量最好大于克服抑制劑所需的葡萄糖的量。那時，所需時間的長短取決于所存在的抑制劑的多少。既可直接用眼睛也可用檢測反射度變化的光學儀器來觀察試條和計時器中的變色。
出現(xiàn)計時器指示所需的時間還會受到試驗條參數(shù)的影響，而這些參數(shù)類似地還會影響出現(xiàn)葡萄糖濃度的目測指示所需的時間。這樣，如果環(huán)境溫度低或試條組分老化，則會延長葡萄糖濃度的有效測定所需的時間，還會延長化學計時器指示所需的時間。最好，如果試驗條保管不好例如暴露在濕氣中，那么在使用試驗條之前就會產(chǎn)生標志著化學計時器反應完成的變色，使用者就會意識到該試條已經(jīng)不準確，因此知道不會去使用它。


圖1是本發(fā)明的直接讀取試劑試驗條的基質(zhì)的透視圖。
圖2是本發(fā)明的直接讀取試劑試驗條的檢驗面的平面圖。
圖3是圖2的試條的樣品面的平面圖。
本發(fā)明的計時器可化學測定預定的時間間隔。它尤其適于包括在用于測定生物液體中分析物濃度的直接讀取試劑試驗條上。這種試條包括具有一種檢驗試劑的多孔基質(zhì)，該檢驗試劑可產(chǎn)生與被施加到試條上的生物液體樣品中的分析物相對應的變色。
基質(zhì)可以是一種均勻的組合物或被涂覆的襯底，既可以是各向同性的，也可以是各向異性的。它具有一個可將樣品施加到其上的樣品面以及一個可觀察變色的檢驗面?；|(zhì)是一種各向異性膜時較為可?。欢鼮榭扇〉氖蔷哂休^大范圍孔尺寸的各向異性膜。例如，整個基質(zhì)的孔尺寸的梯度是從大約0.1毫米到大約150毫米。在大孔的那一端，孔尺寸的范圍最好在大約30毫米至大約40毫米之間。在孔最小的基質(zhì)那一端，空隙容積相對較小，并且在構成直到10％-20％膜厚的一層內(nèi)膜材料通常是非常密的。在這一層內(nèi)，孔尺寸的范圍最好在大約0.1至大約0.8毫米之間，而公稱孔尺寸最好大約為0.3毫米。當將生物液體施加到樣品面上時，樣品在穿透膜時遇到逐漸更小的孔。結果，固體(例如紅血細胞)到達膜中不能再穿透的位置。而還含有溶解的葡萄糖的余量樣品穿透到檢驗面。膜的各向異性的性質(zhì)和/或使用基質(zhì)中的分離組分(以下將討論)可使通過膜的流速相對較快，甚至同時進行固體過濾。
當樣品通過基質(zhì)時，與試劑的反應使得吸收光的染料在檢驗面附近的空隙容積內(nèi)形成或分解，借此基本上影響了來自基質(zhì)的反射度。
例如聚砜類和聚酰胺類(尼龍)是合適的基質(zhì)材料。也可以使用其它具有類似性質(zhì)的聚合物。可改進聚合物以引進其它具有帶電結構的官能團，從而使基質(zhì)表面呈中性、陽性或陰性。
一種制備形成基質(zhì)的多孔材料的優(yōu)選方法是澆注聚合物而不用支撐芯。這種基質(zhì)的例子是從Memtec，Inc.，Timonium，MD購買的各向異性聚砜膜。通常使用厚度少于大約200毫米的基質(zhì)，而優(yōu)選的是厚度大約在115至155毫米之間。厚度在大約130至140毫米之間最為可取，尤其當基質(zhì)是尼龍或各向異性聚砜時。為了得到實體形式并堅硬，基質(zhì)可選擇地附著到一個襯底上，雖然這不是必需的。選優(yōu)的是，通過將基質(zhì)夾在熱塑性薄片之間來得到支撐。樣品面上的薄片包括一個開口，可由此加入樣品。檢驗面上的薄片可使基質(zhì)的檢驗面上的顏色被觀察到。
通過將檢驗試劑滴到組分的混合物中來處理膜，借此飽和膜基質(zhì)。多余的試劑可用機械裝置例如醫(yī)用刀片或玻璃棒除去。然后干燥膜。
檢驗試劑包括(i)一種可將葡萄糖轉化成過氧化氫的組分(ii)一種可檢測過氧化氫的組分以及(iii)一種可抑制檢測過氧化氫的組分。該試劑可選擇地還包括一種可使固體(例如紅血細胞)附著或包容在基質(zhì)中以便有效地將固體從生物液體中除去的分離組分。還可以包括如下所述和實施例中的其它組分。
將葡萄糖轉化成過氧化氫的組分最好是葡糖氧化酶一種通?？蓮暮谇够蚯嗝咕玫降拿?。葡糖氧化酶與葡萄糖和氧反應，生成葡糖酸內(nèi)酯和過氧化氫。最佳的葡糖氧化酶的濃度決定于指示劑系統(tǒng)的組合物。例如，如果指示劑系統(tǒng)是MBTHSB-ANS(以下所述)，那么適宜的葡糖氧化酶的濃度范圍是大約500至10，000U./mL，更為可取的是700至2000U./mL，最為可取的是1000U./mL。通常，較高的葡糖氧化酶的濃度可使反應進行得更迅速、徹底。
如此生成的過氧化氫與檢測過氧化氫的組分反應，該組分是一種可選擇性地催化過氧化氫和指示劑之間反應的過氧化物酶。這種過氧化物酶利用過氧化氫作為能從不同的作用物中除去氫原子的氧化劑。適宜的過氧化物酶含有從植物中得到的正鐵血紅素和紅色氧化血紅素。從動物例如從動物的甲狀腺中得到的過氧化物酶也是適用的。辣根過氧化物酶(HRPO)是特別優(yōu)選的構成檢測過氧化氫的組分的成分。
過氧化氫最好由過氧化物酶催化，直接或間接反應，形成或分解吸收預定波長范圍內(nèi)光的指示劑染料。指示劑染料強烈吸收的波長最好不同于檢驗試劑強烈吸收的波長。指示劑的氧化形式可以是能表明基質(zhì)的檢驗面變色的有色、弱色或無色最終產(chǎn)物。即，檢驗試劑可以利用被漂白的有色區(qū)或者可選擇地利用顯色的無色區(qū)來指示樣品中分析物的存在。
用于本發(fā)明的指示劑包括(a)與3，3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)結合的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氫氯化物(MBTH)；(b)與3，5-二氯-2-羥基苯-磺酸(DCHSS)結合的MBTH；(c)4-氨基安替比林(4-AAP)(4mg/mL)和5-氧代-1-(對-磺苯基)-2-吡唑啉-3-羧酸(OPSP)；(d)4-AAP(4mg/mL)和N-(間-甲苯基)-二乙醇胺(NDA)；(e)2，2′-連氮基-二(3-乙基苯噻唑啉)磺酸(ABTS)；(f)4AAP(4mg/mL)和4-甲氧基萘酚；(g)焦棓酚紅(PGR)；(h)溴代焦棓酚紅(BPR)；(i)酸性綠25(AG)；或(j)與8-苯胺基-1-萘磺酸銨(ANS)結合的[3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺酰基苯磺酸單鈉(MBTHSB)。優(yōu)選的是MBTHSB-ANS。1994年9月8日申請的、申請?zhí)枮?02,575的同樣在審查中的美國專利公開了關于MBTHSB-ANS的其它資料，在此一起作為參考。
抑制組分例如通過還原過氧化氫或者還原被氧化的染料來阻止過氧化氫和染料或染料前體之間的反應。對于抑制劑原則上有兩種不同的作用方式。第一種是，抑制劑與指示劑競爭，借此減慢了指示劑的變色速度。第二種是，抑制劑是非競爭性的，從而在指示劑發(fā)生任何實質(zhì)性變色之前就基本上消耗掉了所有的抑制劑。本發(fā)明的抑制劑采用后一種機制起作用較為可取。
適宜的抑制劑包括2，3，4-三羥基苯甲酸、棓酸丙酯、3，4-二羥基肉桂酸、3，4-二羥基苯甲醛、棓酸、5，6-二氨基尿嘧啶、抗壞血酸和異抗壞血酸。優(yōu)選的是抗壞血酸；然而，抗壞血酸是在溶液中起氧化作用并且必須是穩(wěn)定的，以便涂覆試劑。優(yōu)選的穩(wěn)定劑是伯醇例如乙醇、甲醇或丙醇?？扇〉氖且掖肌⑻貏e是濃溶液即50％或更濃的乙醇溶液。
雖然作為較佳基質(zhì)的各向異性膜能濾出紅血細胞并阻它們到達檢驗面，但是檢驗試劑可選擇地還含有分離組分。該分離組分能夠通過將紅血細胞螯合在基質(zhì)中而能產(chǎn)生由含有紅血細胞的液體例如全血生成相對純凈的無色液體。用于本發(fā)明的分離組份包括但并不限于聚乙二醇、聚(甲基·乙烯基醚/馬來)酐、聚丙二醇、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚乙烯醇及PH值在約4.0至8.0之間的聚乙烯磺酸。這種存在于基質(zhì)中的分離組分的量決定于它們所帶的電荷、分子量、嵌入基質(zhì)中的其它組分、基質(zhì)的PH值以及孔的大小，還有基質(zhì)在干燥以后殘余的濕度。本領域的普通技術人員可容易地測定這些參數(shù)。例如，當聚乙二醇(例如來自BASF，Wyandotte，MI的PPG-410)用作分離組分時，其濃度大約為2-30％重量比體積(W/V)較為可取，濃度為8-10％W/V則更為可取。其它的分離組分也能以大約2-30％W/V的濃度來使用。聚合分離組分可滲透或埋入到基質(zhì)中。一些水溶性鹽也能起到這樣的分離作用。適于分離血液組分的鹽包括檸檬酸鹽、甲酸鹽和硫酸鹽以及某些酸類例如檸檬酸、氨基酸、植酸和蟻酸(例如參見1971年1月5日公開的、發(fā)明人為M.C.Fetter的美國專利3,552,928)。包含分離組分的優(yōu)點是，基本上可以將一些固體，例如紅血細胞從生物液體中除去，在檢驗位置幾乎沒有背景顏色可以遮掩由檢驗試劑所產(chǎn)生的顏色變化。
其它組分也可以埋入到基質(zhì)中以增強試劑條的顏色和可讀性并保護基質(zhì)的均勻性和完整性。例如，檢驗試劑可包括有助于基質(zhì)中染料的分離的鹽類和/或緩沖劑。這種緩沖劑可含有例如檸檬酸，其以大約0.01M至大約1.0M、最好以大約0.1M的濃度存在于溶液中。還可利用其它的酸性緩沖劑。
還可以使用使基質(zhì)親水的化合物或用作穩(wěn)定劑的化合物，例如水解蛋白質(zhì)。這些化合物包括(但不局限于)例如牛血清白蛋白、多肽類以及商品名為Crotein SPA(CRODA，Inc.New York，N.Y.)的低分子量蛋白質(zhì)。這種化合物以例如大約1.0mg/mL至大約100.0mg/mL的濃度來使用。對于Crotein，濃度大約為20mg/mL較為可取。
其它穩(wěn)定劑和保護劑也可包含在用于基質(zhì)的涂覆層中。例如可以大約0.01mg/mL至大約10.0mg/mL的濃度使用諸如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)以及相關化合物。保護劑的目的之一是有助于穩(wěn)定抑制劑。
一些指示劑(例如BPR)在基質(zhì)中具有不希望有的遷移傾向。當使用這樣的指示劑時，可加入一種離子對劑來阻止這種遷移。例如特別適用的是商品名為Polyquart(H)(Henkel，Inc.Ambler，PA)的聚乙二醇衍生物，因為它們有助于指示劑和其它基質(zhì)取代基之間的離子配對。
當用顏色形成物(例如MBTHSB-ANS)指示分析物的存在時，可加入表面活性劑以使顏色發(fā)亮并增強與無色環(huán)境的對比。
在本發(fā)明的實踐中還可使用有機溶劑并且它們包括在用于基質(zhì)的檢驗試劑的配方中，當然，只要這些溶劑可與基質(zhì)和檢驗試劑組合物相匹配?？赡苓m宜的有機溶劑可包括氯仿、丙酮、醇類、二氯甲烷、乙醚和石油醚、乙腈以及這些溶劑的混合物。在本發(fā)明的實踐中，70％的乙醇水溶液是特別優(yōu)選的。
被涂覆或滲透到基質(zhì)中的檢驗試劑在試驗條的表面上是不均勻的。因此，最好將試劑以一串平行條或″結果段″的形式施加到基質(zhì)上，其中相鄰結果段中的組合物的抑制劑濃度逐漸增加。這樣每個后續(xù)段都需要樣品中的葡萄糖濃度逐漸增大，以使該段變色。
用一種組合物涂覆或滲透基質(zhì)的定時段，這種組合物由檢驗試劑和葡萄糖組成。由于檢驗試劑的目的是產(chǎn)生與葡萄糖相對應的變色，因此混合這兩種試劑時要注意，不要導致變色。除了所要求的定時功能外，必須存在一定量的抑制劑，以補償這種作用。在施加含有溶液的葡萄糖之后，要控制定時段的干燥速度。實際上，首先用含有緩沖劑、穩(wěn)定劑和酶的溶液涂覆膜并干燥涂覆層，形成第一層。然后，第二次涂覆是施加含有指示劑、抑制劑和葡萄糖的溶液而形成第二層。可預先確定諸如織速、爐溫、氣流和沉積的涂覆溶液的量這些參數(shù)并適當調(diào)整抑制劑和/或葡萄糖的濃度?？扇〈扛残问绞┘拥诙拥牧硪环N方法(較不可取)包括在另一織物上制備第二涂覆層，然后將其層疊在第一層上。
當將樣品施加到試條上時，定時段組合物的水合使得顏色形成反應開始進行。然后利用溫度以及檢驗試劑的性質(zhì)特別是抑制劑濃度、葡萄糖的量、水合與氧擴散速率來測定定時段變色所花費的時間。
定時器變色所需的時間可取決于樣品中葡萄糖的濃度，或可選擇地，也可與此濃度無關。通過在定時器中摻入非常過量的葡萄糖，使得定時器變色所需的時間基本上與樣品的葡萄糖濃度無關。反之，如果摻入定時器中的葡萄糖很少，則時間取決于樣品中的葡萄糖，即如果樣品中的葡萄糖濃度較大，則定時器變色較快。定時器中的葡萄糖濃度多于大約1500mg/dL較為可取，因為這個濃度可使定時器基本上與范圍在大約40-400mg/dL濃度的樣品葡萄糖無關。定時段組合物包括過量的可將葡萄糖轉化成過氧化氫的組分(例如葡糖氧化酶)和過量的葡萄糖。定時器還應該包括至少比具有最高抑制劑濃度(對應于最高葡萄糖讀數(shù))的結果段所包括的還要多的抑制劑。
定時器還具有重要的質(zhì)量控制功能，即當試驗條由于暴露到濕氣中而被污染時定時器可使其更顯而易見。試驗條必須保持干燥直到開始使用時，因為將葡萄糖轉化成過氧化氫的組分(通常是酶)在暴露到濕氣中時會趨于降解。這樣，試條如果過早地暴露到濕氣中，則被污染而不能使用。但是試驗條的污染對于使用者是不明顯的，因此使用者用了這樣的試條，會得到錯誤結果。然而，如果試條包括一個定時段，那么暴露到濕氣中會使定時器變色，從而令使用者意識到試條被污染的事實。
現(xiàn)在參考附圖對本發(fā)明作進一步的描述。圖1示出了本發(fā)明的用于測定生物液體中分析物的量的基質(zhì)10。雖然基質(zhì)10是以拱形被示出的，但是它是軟性的并且在使用時通常是一平板。基質(zhì)包括一個生物液體樣品可施加到上面的樣品面12和一個表示分析物存在的變色可出現(xiàn)在其上或其附近的檢驗面14。由分析物和滲透到孔16中的試劑的相互作用可導致變色。為了測定血糖濃度，較為可取的是孔尺寸在樣品面12附近相對大些而接近檢驗面14時尺寸減小。這個孔尺寸的梯度可用于在樣品面12附近包容紅血細胞，從而使紅血細胞的顏色不會干擾對表示分析物存在的變色的觀察。
本發(fā)明示意性地示出了四個結果段a，b，c和d。每個后序段比前一段具有逐漸多的抑制劑。這樣，例如，如果樣品使段a，b和c變色，而d不變色(如圖1所示)，則表明樣品中的葡萄糖濃度至少與消耗段c的抑制劑所需的葡萄糖濃度一樣大，但不足以克服段d的抑制劑。一旦測定這些結果段，則產(chǎn)生一個葡萄糖濃度的定量測定結果。段t(計時器)摻有高濃度的葡萄糖以及滲入結果段中的檢驗試劑。段t中的抑制劑至少與結果段中的一樣多，并且消耗段t中的抑制劑所需的時間至少與消耗其它段中的抑制劑所需的時間一樣。這樣，當段t產(chǎn)生變色時(如圖1所示)，已經(jīng)經(jīng)過的時間足以在所有的結果段中產(chǎn)生變色，這些結果段的抑制劑濃度低得足以被樣品中的葡萄糖濃度消耗掉，并且無需再延遲即可作出正確的測定。
在實際的試驗條中，圖1的膜基質(zhì)被夾在兩個覆蓋片之間，這兩個覆蓋片可以是本領域公知的任何適宜的熱塑性膜。圖2和圖3分別是試驗條20的樣品面22和檢驗面24的平面圖。在使用中，血樣被施加到樣品面22上的開口26中。樣品通過毛細作用縱向擴散到試條的頂部和底部并朝著檢驗面24滲透基質(zhì)?？蛇x擇的透氣孔28有助于樣品沿試條的擴散。通過可選擇的清潔窗口30對樣品進行觀察可確認已經(jīng)提供了充足的樣品用于測定。檢驗面24上的指示劑圈接納顏色形成反應所需的氧并被標記以表示血糖濃度。在檢驗進行中，如果樣品中的血糖濃度等于或超過與指示劑圈對應的量，則檢驗面24上的指示劑圈依次變色。這樣，圖3中描繪的結果表示樣品葡萄糖濃度至少為120mg/dL，但少于150mg/dL。在定時圈32變色之后的任何時間都可得到讀數(shù)。注意在附圖中由與葡萄糖的反應所產(chǎn)生的變色是從無色到有色。然而，該系統(tǒng)還可選擇地與一種指示劑染料一起作用，這種染料被葡萄糖誘導的氧化作用所破壞，相應的變色是從有色到無色。
為了更好地理解本發(fā)明，以下的例子將進一步闡述本發(fā)明的不同實施例。這些例子無論如何不能被認為是對本發(fā)明的限定。
例1——BPR指示劑制備下述溶液酶溶液蒸餾水83.5g 0.2M烏頭酸 27.0g1％(W/W)EDTANa223.8g 葡糖氧化酶 165,000U烏頭酸6.0g HRPO 340,000UNaOH(固體)2.2gCrotein SPA 4.2q咪唑 0.6g甘露糖醇 3.0g5％(W/W)Surfactol Q1 3.0g將pH值調(diào)到4.80乙醇 40.0gPPG-410 5.6g酶溶液 28.0g將Memtec BTSH55膜浸入此溶液中并涂覆，然后用玻璃棒摻混掉過量的溶液。在中速氣流下于浮選干燥器中以180F干燥被涂覆的膜，以使織物在20秒鐘內(nèi)基本干燥。卷好織物以待制備第二涂覆層，如下所述。制備下述溶液抗壞血酸(抑制劑)儲備液 稀釋劑蒸餾水190g 370g1％EDTANa255g107gBPR 0.36g 0.71gPolyQuartH 6g 11.8gPPG-4014.2g 27.8g抗壞血酸 1.37g --乙醇 243g 477g定時器溶液稀釋劑(根據(jù)上述配方) 120g抗壞血酸 0.885g葡萄糖溶液*17.25g*葡萄糖溶液是變旋24小時、冷凍保存的16,000mg/dL葡萄糖水溶液。如下稀釋儲備液0.0405∶1，0.108∶1，0.236∶1，0.369∶1，0.569∶1，1.260∶1。逐漸增大的抑制劑濃度與結果圈報告的逐漸增大的葡萄糖濃度相對應。這些溶液以及定時器溶液并排涂覆在載有酶的膜的大孔的那一面，從而每平方毫米膜沉積大約1.15×10-4mL。膜在經(jīng)歷與上述用于涂覆酶的步驟相同的干燥條件之前先潤濕大約15分鐘。結果表明定時器在大約70秒的時候反應，而大約95％的結果是在64到79秒鐘這段時間。
例2——MBTHSB-ANS指示劑制備下述溶液高效液相水 1500mL檸檬酸 16.92g檸檬酸鈉20.88g甘露糖醇15gEDTANa21.26gGantrez S95 6.75gCrotein SPA 36g葡糖氧化酶 1.69MUHRPO1.5MUCarbopol 910*75mL檸檬酸二鈉**225mL*11％乙腈溶液**0.1M，pH5.0在一槽中涂覆Memtec BTS35膜以使孔大的那一面接觸涂覆液；如上所述用玻璃棒除去過量溶液。象在例1中那樣干燥膜并卷起。制備下述溶液溶液A(指示劑) 溶液B(濕潤劑)70％(V/V)乙醇2819mLMaphos60A 41gMBTHSB 2.98g 70％(V/V)乙醇 205mL(NH4)ANS25.83g溶液B205mL2％DTPA 51.25mL溶液C(抗壞血酸儲備液) 溶液D(計時器)水 115mL 水 53mL抗壞血酸 4.58g 抗壞血酸8.75g乙醇 267mL 乙醇123mL加入70％的乙醇使體積達到175mL葡萄糖溶液 40.5mL對于每種抑制劑溶液，溶液A的體積都固定為263mL。對于不同的結果圈，70％的乙醇與溶液C的比率為58.9-0.200，以使加入到溶液A中的70％乙醇＋溶液C的體積對于所有抑制劑溶液都是87.5mL。這只是為了有效地改變每種溶液中的抑制劑濃度。將含有濃度逐漸增加抑制劑的溶液與定時器溶液(溶液D)并排涂覆在膜的大孔的那一面。調(diào)節(jié)沉積速率以達到每平方毫米膜涂覆～8×10-5mL抑制劑。如上所述干燥膜，只是涂覆和干燥之間的延遲時間大約為1.6分鐘。結果表明定時器大約在60秒的時候開始反應，而同時30-55％的血球比率或78-420mg/dL的葡萄糖對其幾乎不起作用。
本領域的普通技術人員將認識到上述的描述和例子只是為了實施本發(fā)明而進行的說明，而決非限定本發(fā)明。在此所做的各種詳細變型都不脫離本發(fā)明的范圍和精髄。
權利要求
1.一種用于直接讀取試劑試驗條的化學定時器，所述試條用于測定施加到其上的生物液體中分析物的濃度，所述定時器包括一個具有以下組分的干涂覆層a)一種指示劑組合物，b)一種當水合時能與葡萄糖反應以使指示劑變色的試劑，c)一種能夠抑制指示劑變色的抑制劑，以及d)葡萄糖，其中可選擇干涂覆層中的抑制劑和葡萄糖的濃度以便在將生物液體施加到試條上之后經(jīng)過一段預定時間葡萄糖能與試劑反應而使指示劑變色。
2.權利要求1的定時器，其特征在于所述分析物是葡萄糖。
3.權利要求1的定時器，其特征在于所述生物液體是血液。
4.權利要求1的定時器，其特征在于所述指示劑可從以下組合中選擇(a)與3，3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)結合的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氫氯化物(MBTH)；(b)與3，5-二氯-2-羥基苯-磺酸(DCHBS)結合的MBTH；(c)4-氨基安替比林(4-AAP)(4mg/mL)和5-氧代-1-(對-磺苯基)-2-吡唑啉-3-羧酸(OPSP)；(d)4-AAP(4mg/mL)和N-(間-甲苯基)-二乙醇胺(NDA)；(e)2，2′-連氮基-二(3-乙基苯噻唑啉)磺酸(ABTS)；(f)4AAP(4mg/mL)和4-甲氧基萘酚；(g)焦棓酚紅(PGR)；(h)溴代焦棓酚紅(BPR)；(i)酸性綠25(AG)；或(j)與8-苯胺基-1-萘磺酸銨(ANS)結合的[3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺?；交撬釂吴c(MBTHSB)。
5.權利要求4的定時器，其特征在于所述染料是MBTHSB-ANS。
6.權利要求1的定時器，其特征在于所述抑制劑包括抗壞血酸。
7.一種用于測定施加到其上的生物液體中分析物濃度的直接讀取試劑試驗條，包括權利要求1的化學計時器。
8.一種用于直接讀取試劑試驗條的化學計時器的制備方法，所述試驗條用于測定施加到其上的生物液體中分析物的濃度，所述制備方法包括如下步驟a)將一種當水合時能與葡萄糖反應的試劑溶液涂覆在一多孔膜上；b)干燥涂覆層以形成第一層；c)將含有以下組分的第二層施加到第一層上i)葡萄糖，ii)一種能與試劑和葡萄糖的反應產(chǎn)物發(fā)生反應以產(chǎn)生變色的指示劑，以及iii)一種能抑制指示劑變色的抑制劑。
9.權利要求8的方法，其特征在于所述分析物是葡萄糖，而所述試劑包括葡糖氧化酶。
10.一種用于測定生物液體中分析物的濃度的方法，包括如下步驟a)將液體施加到試驗條上，所述試驗條包括(i)若干個結果段，當其與至少含有預定量分析物的液體接觸時每個顏色變化所對應的分析物的量不同于導致其它段顏色變化的分析物的量，以及(ii)一個在一段基本上與液體中分析物的量無關的時間之后發(fā)生顏色變化的定時段，以及(b)當定時段發(fā)生顏色變化時觀察最后變色的結果段。
全文摘要
一種用于直接讀取試劑試驗條的化學定時器，該定時器在將生物液體施加到試條上之后經(jīng)過一段預定的時間可產(chǎn)生變色。所述試條用于測定液體中分析物的濃度。定時器是一具有以下組分的干涂覆層一種指示劑；一種當水合時能與葡萄糖反應使指示劑變色的試劑；一種抑制指示劑變色的抑制劑；以及葡萄糖。優(yōu)選的是有過量的試劑和葡萄糖存在于涂覆層中，并且定時器變色所需的時間可由抑制劑的濃度來控制。
文檔編號C12Q1/54GK1143763SQ9610805
公開日1997年2月26日 申請日期1996年3月27日 優(yōu)先權日1995年3月27日
發(fā)明者E·J·吉澤, M·F·托馬斯科 申請人:生命掃描有限公司