專利名稱：登革病毒基因表達(dá)的方法
技術(shù)分支本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域并涉及重組DNA技術(shù)，具體地，涉及在畢赤酵母屬甲基營養(yǎng)酵母中表達(dá)編碼血清型2和4登革病毒包膜蛋白的基因的方法。
現(xiàn)有技術(shù)技術(shù)目的是使用稱為MP-36的巴斯德畢氏酵母菌株BMK90的自養(yǎng)型突變株his3(歐洲專利申請EP43 8200)作為宿主來開發(fā)有效表達(dá)編碼血清型2和4登革病毒包膜蛋白的基因的系統(tǒng)以得到用于人類接種的免疫原。
開發(fā)重組疫苗主要關(guān)心的是得到此病毒包膜蛋白的適當(dāng)集合體，并且所用表達(dá)系統(tǒng)是此問題的最重要方面(Mason P W，Mc Ada P C，Dalrymple JM，F(xiàn)ournier M J y Mason T L，大腸桿菌中日本腦炎病毒抗原的表達(dá)，病毒學(xué)，1987；158361)。
為此目的，已實(shí)施了幾種表達(dá)系統(tǒng)以生產(chǎn)此黃病毒的不同重組蛋白，包括結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白如C-prM-DE-NS1-NS2A-NS2B(Tolou H，Pisano MR，Deubel V y Nicloe J.Problemes et perspectives en matiere devaccination contre les Flavivirus.bull Inst Pasteur 1992；9011-29；ZhangY M，Hayes E P，Mc Carthy T C y col.用桿狀病毒重組體表達(dá)的登革病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1免疫小鼠誘導(dǎo)對登革病毒腦炎的抗性，病毒學(xué)雜志1988；623027-3031)。為選擇適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)因素如重組產(chǎn)物表達(dá)和加工的可能性、翻譯后修飾、糖基化作用、蛋白水解、分泌至培養(yǎng)基、保留二級結(jié)構(gòu)的能力以獲得與天然產(chǎn)物相似的產(chǎn)品?？紤]系統(tǒng)提供抗原產(chǎn)品的百分比即產(chǎn)量是很重要的。
用于重組黃病毒蛋白表達(dá)的第一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)是細(xì)菌，特別是大桿菌。這些蛋白表達(dá)容易并且達(dá)到高產(chǎn)量(細(xì)胞總蛋白的10～20％)，但是這種表達(dá)系統(tǒng)有一些局限性。主要問題是幾種重組蛋白以活性不溶形式聚積形成內(nèi)含體。使這樣的蛋白恢復(fù)的必需的變性和重折疊技術(shù)昂貴并且復(fù)雜(Marston FAO，大腸桿菌中表達(dá)的真核動物多肽的純化，生物化學(xué)雜志1986；2401-12)。當(dāng)表達(dá)小分子肽時(shí)出現(xiàn)另一困難，肽迅速降解并且以融合蛋白合成，必須在體外進(jìn)行包括另一套純化的后切割(Itakura等，1978)。然而不能進(jìn)行重組產(chǎn)物的翻譯后加工是主要的限制。雖然已認(rèn)為與其它不同表達(dá)系統(tǒng)相比，這些蛋白作為免疫原不是非常有用的，但是一些表達(dá)蛋白表現(xiàn)誘導(dǎo)中和抗體(ACS)的同種型(Mason P W，Zogel MV，Semproni A R，F(xiàn)ournier MJ y Mason T L.大腸桿菌中表達(dá)的1型登革病毒包膜和NS1蛋白的抗原結(jié)構(gòu)，J Gen Virol.，1990；712107-2114)。
昆蟲細(xì)胞是獲得幾個(gè)病毒來源基因(包括需要蛋白水解加工、糖基化作用或分泌作用的那些基因)高水平表達(dá)的有效表達(dá)系統(tǒng)。此系統(tǒng)使用Autographa Californian核型多角體病毒(AcNPV)(Feighny R，Burrous J y Putnak R，用重組桿狀病毒制備的2型登革熱包膜蛋白保護(hù)小鼠免受病毒攻擊，Am J Trop Med Hyg，1994，50(3〕322-328〕。
除了用它們免疫的小鼠封閉了中和ACS，所得重組蛋白還表現(xiàn)與天然蛋白相似的大小、糖基化狀態(tài)和抗原性(Matswra Y，Miyamoto M，soto T y col，重組桿狀病毒表達(dá)的日本腦炎病毒包膜蛋白的特征鑒定，病毒學(xué)1989；173674-682)。小鼠中的保護(hù)水平依賴于所用重組抗原的劑量，但是具有天然抗原性并含有保護(hù)性表位的重組蛋白用作免疫原時(shí)并不總是保護(hù)免受病毒感染(Shiu SYW，Reid HW y Gould EA，重組桿狀病毒和痘苗病毒表達(dá)的羊跳躍病病毒包膜蛋白不能刺激保護(hù)性免疫，病毒研究1992；26213)。用重組桿狀病毒對D1(E)和日本腦炎病毒(VEJ-E)的研究表明存在抗病毒的中和Acs與保護(hù)作用之間的正相關(guān)(Zhao B，Prince G，Horswood R，Eckels K，Summer P，ChanockR，Lai C-J，由重組痘苗病毒表達(dá)登革病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，病毒學(xué)雜志1987；614019-4022)。因?yàn)槭褂貌皇侨祟惒≡w的昆蟲病毒并具有進(jìn)行真核動物蛋白正確加工的能力，此表達(dá)系統(tǒng)有望用于亞單位疫苗的生產(chǎn)。
使用哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)的另一優(yōu)勢是通過增加抗原接觸在感染期間擴(kuò)增外源基因產(chǎn)物。因此考慮到腺病毒、皰疹病毒和痘病毒具有高潛在致癌性，它們已作為疫苗候選者用于基因構(gòu)建(Green M，轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生DNA病毒，病毒學(xué)，F(xiàn)ield，B.N編輯，Raven Press，New York，1985183)。痘苗病毒(VV)由于其清楚定義的生物學(xué)特征及其用作免疫原的歷史而成為理想選擇。使用W如桿狀病毒表達(dá)的蛋白是強(qiáng)免疫原(Behbehami AM，天花的故事疾病的生存與死亡，Microbiol.Rev.，1983，47455)。
然而，對于登革熱，痘苗病毒中蛋白表達(dá)未得到預(yù)期的結(jié)果，因?yàn)橐勋@得針對痘苗病毒蛋白而不是登革熱蛋白的高滴度抗體。另一難點(diǎn)是它不產(chǎn)生足夠量的蛋白以實(shí)現(xiàn)有效的純化過程(Zhao B，Prince G，Horswood R，Eckels K，Summer P，Chanock R，Lai C-J，重組痘苗病毒表達(dá)登革病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，病毒學(xué)雜志1987，614019-4022)。
其它一些表達(dá)系統(tǒng)提供用作疫苗相當(dāng)潛力。先進(jìn)的方法學(xué)如病毒樣微粒的使用因?yàn)樗苡米鼽S病毒抗原表位的載體而具有廣闊前景，例如polyovirus缺陷微粒、表面抗原和乙型肝炎病毒核心抗原的使用(Belyaev等1992)。相似地，可以使用已用作更加針對結(jié)核的免疫原的Mycobacterium bovis減毒菌株，著名的Bacillus Calmette-Guerin(BCG)。此系統(tǒng)已在HIV的蛋白表達(dá)中成功地得到證實(shí)(Aldovini A yYoung R A，對肝重組BCG-HIV疫苗的體液和所有介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，自然，1991，351479)。
考慮到乙型肝炎病毒和足口病病毒(FMDV)已在轉(zhuǎn)基因植物系統(tǒng)中得到表達(dá)，用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)低成本的疫苗已不是遙遠(yuǎn)展望(MasonH S，Lam D M y Arntzen CJ，乙型肝炎表面抗原在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，美國國家科學(xué)院院報(bào)，1992，8911475；Usha R，Rohll JB，SpallVE y col，在植物病毒顆粒表面表達(dá)動物病毒抗原位點(diǎn)，病毒學(xué)1993，197366)。目前，此系統(tǒng)還不是有人類中免疫原目的的蛋白表達(dá)的可選擇系統(tǒng)，因?yàn)檫€沒有對其基本方法的足夠了解，此系統(tǒng)正在發(fā)展中。
發(fā)明詳述本發(fā)明的創(chuàng)新是使用巴斯德畢赤酵母作為D2和D4病毒蛋白E的表達(dá)系統(tǒng)。將此系統(tǒng)與其它原核系統(tǒng)比較時(shí)，這個(gè)系統(tǒng)表現(xiàn)一些優(yōu)勢，例如以高密度生長的能力因而使培養(yǎng)物適應(yīng)連續(xù)系統(tǒng)(授予PhillipsPetroleum Co.的美國專利4414329)。此外，酵母可以以大于大腸桿菌的量向培養(yǎng)基分泌蛋白，并且用于發(fā)酵的培養(yǎng)基一般比細(xì)菌的更經(jīng)濟(jì)(Lemoine Y，“酵母中的異源表達(dá)”，第8屆國際生物技術(shù)大會，巴黎，1988年7月17-22日)。這些系統(tǒng)也可進(jìn)行翻譯后修飾如在細(xì)菌系統(tǒng)中不存在的糖基化作用(Fiers W.“微生物中異源基因的最大工程表達(dá)”，第8屆國際生物技術(shù)會，巴黎，1988年7月17-22日)并可以表明對高等生物細(xì)胞所用密碼子的偏愛性，由此帶來哺乳動物基因的高表達(dá)(Kigsman S M y col.，釀酒酵母中的異源基因表達(dá)，生物技術(shù)&遺傳工程評論1990，(3)，Russell G.E編輯)。
最近，甲基營養(yǎng)酵母，具體地巴斯德畢赤酵母已成功地用于克隆和表達(dá)異源基因(Phillips Petroleum Co.的專利申請581107)，因?yàn)槠湟愿呒?xì)胞密度生長的能力并使用從廢料得來的廉價(jià)碳源作為誘導(dǎo)克隆基因的底物而成為有吸引力的宿主。
除此之外，巴斯德畢赤酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)比所述的酵母系統(tǒng)更易于調(diào)控，這對于所得產(chǎn)物可能引起合成它們的宿主中有害效應(yīng)的情況是一個(gè)優(yōu)勢。
DV2的起始點(diǎn)是編碼毒株A15的病毒蛋白E的基因序列，此毒株是1981年古巴登革熱和出血登革熱流行期間分離的。
將此序列用于獲得酵母載體表達(dá)。使用質(zhì)粒pNAO-407，啟動子是巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1(AOX)轉(zhuǎn)錄的啟動子，終止子是釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP-T)的轉(zhuǎn)錄終止子，選擇標(biāo)記物是使酵母在組氨酸缺陷型基本培養(yǎng)基中生長的HIS-3和巴斯德畢赤酵母的信號3 AOX。此質(zhì)粒是以前已報(bào)道的質(zhì)粒pTAO-10的變更(歐洲專利申請EP 480525A2)。
對于使用質(zhì)粒pNAO-407，第一步是用酶NcoI和EcoRI消化，然后用LGT方法純化，分離編碼肝炎病毒表面抗原的0.678kb條帶。
然后用修飾酶Klenow處理末端以補(bǔ)平末端，并使末端補(bǔ)平以利于通過PCR克隆片段。最后用堿性磷酸酶(CIP)處理。
一旦質(zhì)粒得到純化，就在T4 DNA連接酶的參與下開始質(zhì)粒pNAO-407/NcoI/EcoRI/LGT/Klenow/CIP與純化PCR條帶的連接反應(yīng)。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞菌株k-12/XL-1 Blue并在含氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基上鋪板；重組子的篩選通過菌落雜交方法進(jìn)行。用限制性酶檢測法分析陽性克隆，使用蛋白的1.485kb條帶。這就是得到質(zhì)粒pDE2-21的方法。
對巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞進(jìn)行電穿孔并根據(jù)其在基本培養(yǎng)基中的生長篩選重組子。對克隆進(jìn)行鑒定時(shí)，選擇克隆14(YDE 221-14)用于表達(dá)研究。此克隆的D2病毒蛋白E產(chǎn)物通過ELISA和免疫技術(shù)如DOT-ELISA和蛋白印跡觀察。Robert Shope博士從編碼病毒蛋白E的基因序列開始研究D4，此病毒來自1981年多米尼加共和國登革熱流行期間分離的毒株814669并于1992年11月24日由美國耶魯大學(xué)慷慨贈予。
進(jìn)行已截短了其最后53個(gè)氨基酸的登革熱A包膜的1202bp的擴(kuò)增并用于酵母表達(dá)載體(pFAO)的克隆。此載體與以前已報(bào)導(dǎo)的載體pPS-7(歐洲專利申請EP 438200)基本上相同，但分泌信號是釀酒酵母α因子。
對于使用pFAO，第一步是用酶EcoRI消化，然后用LGT方法純化。然后用修飾酶Klenow處理末端以補(bǔ)平末端，并使末端補(bǔ)平以利于通過PCR克隆片段。最后用堿性磷酸酶(CIP)處理。
一旦質(zhì)粒得到純化，就在T4 DNA連接酶的參與下開始質(zhì)粒pFAO/EcoRI/LGT/Klenow/CIP與純化PCR條帶的連接反應(yīng)。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞菌株k-12/XL-1 Blue并在含氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基上鋪板；重組子的篩選通過菌落雜交方法進(jìn)行。用限制性酶檢測法分析陽性克隆，使用蛋白的1.202kb條帶。這就是得到質(zhì)粒pDFE4-47的方法。
在測試后，測定兩種蛋白在細(xì)胞破碎液的上清中的存在，并在培養(yǎng)物上清中檢測到更少量的D4蛋白E。可以說蛋白是以非溶解形式得到的，并且在培養(yǎng)基中得到的D4是作為分泌蛋白并且含量更少。
定量研究已表明，所得蛋白為總蛋白的1％至2％。
表達(dá)載體pDE2-21是得到包含截短的血清型2病毒包膜基因的酵母表達(dá)載體的起點(diǎn)。表達(dá)載體pDE2-21已在前面描述并且包含在甲基營養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的遺傳信息。
為此目的，進(jìn)行包膜基因的修飾。修飾包括在1407位EcoRI位點(diǎn)切割基因。
如果測定修飾區(qū)序列，就可以證實(shí)EcoRI位點(diǎn)的缺失和在基因1407位中止密碼子TTA的插入，然后包膜在79堿基對和其最后27個(gè)氨基酸處截?cái)?。用Klenow酶補(bǔ)平末端并最終用T4連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞菌株K-12/XL-1 Blue。這就是得到質(zhì)粒pDE2-21DEcoRL-7的方法。
然后用10個(gè)單位的EcoRI酶消化10微克質(zhì)粒以得到如所述的完整的但功能上截短的包膜。在用LGT方法純化此片段后，將其克隆入載體以便在8.5kb的酵母pPS-7中表達(dá)(歐洲專利申請EP 438200)。此質(zhì)粒包含巴斯德畢赤酵母醇氧化酶的基因啟動子、隨后的釀酒酵母SacarosaInvertasa(Sucll)的分泌信號、釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP-T)基因轉(zhuǎn)錄的終止子和選擇標(biāo)記物HIS-3。
然后取100納克pPS-7/Nco1/MB/CIB，在T4 DNA連接酶的參與下與30納克pDE2-21DEcoRI-7的EcoRV條帶一起溫育。
這就是得到質(zhì)粒pDSE2-34的方法，然后大量純化質(zhì)粒并保存以在隨后的酵母電穿孔中使用。
得到此質(zhì)粒后，步驟基本上按對于登革熱2和登革熱4所述的進(jìn)行。在電穿孔和特征鑒定后，選擇克隆1，2，3和4用于發(fā)酵，得到酵母克隆YDSE234-1，2，3，4。之后，將這些克隆用于表達(dá)研究。
特異重組蛋白的表達(dá)用特異免疫分析法(ELISA)檢測。
實(shí)施例實(shí)施例1如果沒有特別的參考文獻(xiàn)，遺傳材料的操作按照Sambrook等，1989(Sambrook J，F(xiàn)rissch EF，Maniatis T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，1989)進(jìn)行。
使用1981年古巴DHF/DSS流行期間分離的菌株A15(Kouri G，MasP，Guzman MG，Soler M，Gonenechea A，Morier L.古巴登革熱出血熱，1981，病原體的快速診斷，Bull Pan Am Health Organ，1982，93414-420)來分離要表達(dá)的基因。最近已公開了編碼此毒株蛋白E基因的部分核苷酸序列(Guzman MG，Rosario D，Marrero M，pelegrino J，Sariol C，Kouri G.1981年DHF/DSS古巴流行期間分離的四種登革熱2毒株的包膜基因接合點(diǎn)的部分核苷酸和氨基酸序列，Am J Trop MedHyg，1995，25(3)45-50)。此序列以m＝1-5UFP/毫升于L-15培養(yǎng)基中在小鼠腦中繁殖四次、在AP61(Aedes pseudoscutellaris)中繁殖一次直至細(xì)胞表現(xiàn)大于70％的細(xì)胞病變效應(yīng)并且使用超免疫腹水對D2的特異免疫熒光超過細(xì)胞的50％。
根據(jù)其他作者的方法提取感染細(xì)胞的RNA(Deubel V，Laille M，Hugnot J，Chungue E，Gueston J，Drovet Mt，Bassot S，Chevrier D，通過基因組擴(kuò)增鑒定登革熱序列外周血中登革病毒血清型的快速診斷，病毒學(xué)方法雜志，1990，3041-54)。簡要地說，用TNE緩沖液沖洗細(xì)胞，并在含0.5％NP40和0.5％sodium deoxicalato的0.1×TNE中裂解細(xì)胞，于2000rpm離心10分鐘沉淀核酸細(xì)胞并在1％SDS存在時(shí)用酚處理胞質(zhì)提取物二次去蛋白。RNA用乙醇和乙酸銨沉淀。
cDNA合成如下進(jìn)行約使用10微升RNA(100納克)，然后加入32納克引物，于95℃變性2分鐘并放在冰中1分鐘以上。然后加入5mM(1微升)dNTP混合物、10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液(2微升)，40單位(1微升)RNAsin，12單位(1微升)逆轉(zhuǎn)錄酶和水至20微升總體積，于42℃放置1個(gè)小時(shí)。
用來得到cDNA的引物的反義基因組序列是2421 5′GGCCTGCTCCATA GCTCC 3′2403。
根據(jù)Saiki等，1988的方法(Saiki PK，Grifand DH，Stoffel S，ScharfSJ等。用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行DNA的引物指導(dǎo)的酶擴(kuò)增，科學(xué)，1988，239487-491)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。
對于PCR，使用5微升合成cDNA，終體積達(dá)50微升，包含10×TAQ聚合酶緩沖液(5微升)，dNTP(5微升)，320納克每種引物(+/-)和雙蒸水。引物序列是正向引物 928 5′TCAGATATCATGCGTTGCATAGGAATATC3′956反向引物2432 5′CAGATATATCTTAAGCCTCCACCATAGCTCCC3′2403每個(gè)引物中包含限制性內(nèi)切酶(RE)EcoRV(GATATC)的切割位點(diǎn)，在正向引物中包括起始密碼子或ATG，在反向引物中包括終止密碼子或TTA。對應(yīng)于核苷酸序列中位置的每個(gè)引物的數(shù)字參考以前公開的結(jié)果(Deubel V，Kinney RM，Trent DW.，牙買加2型基因型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列和推測的氨基酸序列全長基因組的比較分析，病毒學(xué)，1988，165234-244)。擴(kuò)增序列有1485個(gè)堿基對，并且除了以前描述的和引物中包括的修飾外，與包膜基因序列精確匹配。
首先，DNA-cDNA雜交體于95℃變性5分鐘，然后加入2.5單位TAQ聚合酶(Bohering Mamnhein)。反應(yīng)在72℃保持45秒。進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的如下擴(kuò)增變性(95℃，45秒)，退火(55℃，90秒)，延伸(72℃，45秒)。最后一個(gè)循環(huán)后，于72℃保持10分鐘。
PCR檢測取5微升每種反應(yīng)混合物，加入4微升水和4微升溴酚藍(lán)并上樣到在含2微升溴乙錠(10毫克/毫升)的TBE緩沖液中的0.8％瓊脂糖凝膠上，用HindIII酶消化的λDNA用作標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記物。
在100微升體積中用蛋白激酶K處理擴(kuò)增產(chǎn)物以消除先前PCR中所用的殘余Taq聚合酶。然后，用酚/氯仿處理并于-70℃過夜進(jìn)行乙醇沉淀。接著，在4℃于7200rpm離心(Hettich，D-7200)15分鐘，用70％乙醇沖洗沉淀并以相似條件離心。將此物質(zhì)重新懸浮于30微升1×0.1MTE緩沖液中，然后通過低熔點(diǎn)瓊脂糖法(LGT)純化。
使用10kb質(zhì)粒pNAO-407以獲得酵母表達(dá)載體。此質(zhì)粒包含巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1(AOX)的轉(zhuǎn)錄啟動子、釀酒酵母甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAP-T)的轉(zhuǎn)錄終止子、使酵母在組氨酸缺乏的基本培養(yǎng)基上生長的選擇標(biāo)記HIS-3和巴斯德畢赤酵母的信號3 AOX。在啟動子之后和終止子之前的Nco1和EcoRI位點(diǎn)間克隆對應(yīng)于乙型肝炎病毒表面抗原的條帶(歐洲專利申請E.P.480525A2)。第一步是用酶NcoI和EcoRI消化，然后用LGT方法純化。用此方法，將載體與0.678kb條帶分離。
然后用修飾酶Klenow處理末端以補(bǔ)平末端，制備平末端以利于PCR條帶的克隆。最后用堿性磷酸酶脫磷酸。
一旦質(zhì)粒得到純化，就在T4 DNA連接酶的參與下使100納克質(zhì)粒PNAO407/NcoI/EcoRI/LGT/Klenow/CIP與300納克先前純化的PCR條帶一起溫育進(jìn)行連接反應(yīng)。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞菌株k-12/XL-1 Blue(BullokWO，F(xiàn)ernandez TM，Shote JM.XL-Blue質(zhì)粒，用β一半乳糖苷酶選擇轉(zhuǎn)化recA的大腸桿菌菌株的高效質(zhì)粒，生物技術(shù)，1987，5376-379)，然后在含氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基上生長。挑取獨(dú)立生長的菌落，用雜交方法篩選重組子。選擇陽性克隆進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析。對于此最后步驟，使用對應(yīng)于E的1.485kb條帶。用LGT法純化條帶后，用Amersham International，Amersham，英國的α-32P ATP標(biāo)記。這就是得到質(zhì)粒pDE2-21(見

圖1)的方法，然后用堿性方法純化質(zhì)粒并保存以便以后使用。
對兩個(gè)基因的連接進(jìn)行測序以確定條帶插入在AOX啟動子下。使用商用試劑盒(2.0版測序酶，DNA試劑盒，USB，USA)對純化質(zhì)粒pDE2-21進(jìn)行測序。此步所用引物序列是1241 5′CCCCATCCTCTGTCTACCATG 3′1220
以前一些作者已用過此引物(Deubel V，Laille M，Hugnot J，Chungue E，Gueston J，Drovet MT，Bassot S，Chevrier D.，通過基因組擴(kuò)增鑒定登革熱序列外周血中登革病毒血清型的快速診斷，病毒學(xué)方法雜志，1990，3041-54)。測序結(jié)果證實(shí)了基因構(gòu)建體中條帶E的正確方向。
基本上根據(jù)Martinez等，1993的方法(Martinez等，1993)進(jìn)行電穿孔操作。
從-70℃保存的甘油菌種重新活化巴斯德畢赤酵母后，使其在YPG培養(yǎng)基中生長并在于28℃培養(yǎng)72小時(shí)。此后在無菌條件下挑取20個(gè)3毫米的菌落并將其重新懸浮在1.5毫升Eppendorf管中的1毫升無菌蒸餾水中。細(xì)胞于4℃冷凍微量離心機(jī)(Hettich D-7200 Tuttligen，Japan)中以3200rpm離心3分鐘。丟棄上清并將沉淀重新懸浮于200微升1M山梨醇中用于電穿孔并轉(zhuǎn)移至0.2厘米電穿孔杯(Gene-PulserCuvette，Bio-Rad，USA)中。
每杯中加入5微升，含有500納克用10微升酶Pvull(Amersham，UK)消化的質(zhì)粒pDE2-21。在冰上操作此過程。
使用商用電穿孔儀(基因脈沖轉(zhuǎn)染儀，Bio-Rad，USA)。此過程的參數(shù)是電阻200w；電容125uf；電壓2kv；放電時(shí)間3.4ms，這些條件根據(jù)生產(chǎn)商的說明來調(diào)整。
將電穿孔細(xì)胞重新懸浮于1毫升冷山梨醇中。取500μl體積在含2％葡萄糖無氨基酸的YNB(酵母氮基，Difco，美國)基本培養(yǎng)基上鋪板。此板于28℃培養(yǎng)96小時(shí)。分離生長的菌落將其放入含2％葡萄糖的YNB新鮮平板中并于28℃再培養(yǎng)72小時(shí)。
按照Ferbeyre等，1993所述的進(jìn)行DNA印跡分析(Ferbeyre G，Villareal A，Morales-Grillo J.從酵母制備高分子量DNA用于DNA分析的快速方法，生物技術(shù)，1993，14386)。用EcoRV消化DNA并用2型登革病毒E基因條帶作為探針(圖2)。
然后，隨機(jī)挑選克隆，5毫升YPG培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物在搖床(Blanc-LaBo S.A.，Ch-1131，Switzerland)中以250rpm振蕩于28℃培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)。
生長的細(xì)胞在4℃于3200rpm離心3分鐘(Jouan，Gr 41-11，F(xiàn)rance)并倒掉上清液。用無菌水洗后在相似條件下再離心。沉淀重新懸浮于溶解緩沖液中(annex 1)并加入25微升Zimolaze至20毫克/毫升(Seikagaku Corporation，Japan)；25微升鏈霉蛋白酶至20毫克/毫升(Merck，Germany)和10微升Rnase至16毫克/毫升(Boehringen，Gmbh，Germany)。此混合物于37℃培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)。
接著，用酚/氯仿抽提(Sambrook J，F(xiàn)rissch EF，Maniatis T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，1989)，收集上相并用無水乙醇(Merck，Germany)在-70℃沉淀1小時(shí)。此后樣品在冷凍微量離心機(jī)中在4℃于12000rpm離心15分鐘。然后用70℃乙醇沖洗抽提的DNA并在相同條件下再次離心。將DNA真空干燥(Speed-VacAlpha，Switzerland)15分鐘，然后重新懸浮于100微升的TE緩沖液中，再測試抽提質(zhì)量。
將20微克DNA與10單位限制性內(nèi)切酶EcoRV(Amershan，UK)于37℃反應(yīng)12小時(shí)以確定整合特征。
消化后進(jìn)行DNA印跡。根據(jù)雜交和核酸印跡方法(Hybond-N+方法，Amersham，UK)進(jìn)行雜交。以前通過LGT純化的用限制性酶EcoRV消化質(zhì)粒pDE2-21得到的條帶作為探針。此探針對應(yīng)于毒株A15登革病毒蛋白E的基因序列。
用限制性酶HindIII消化的λ噬菌體DNA用作分子量標(biāo)記物。
從沒有經(jīng)過電穿孔的相同巴斯德畢赤酵母菌株提取的質(zhì)粒pDE2-21和DNA分別用作陽性和陰性對照。
一旦克隆得到鑒定，挑選克隆14(YDE221-14)用于表達(dá)研究。克隆YDE221-14的表達(dá)研究從用克隆YDE447-61的小份甘油菌種接種的YPG固體培養(yǎng)基平板中挑取一個(gè)菌落并用于接種10毫升鹽水培養(yǎng)基中，然后于250rpm在30℃培養(yǎng)12小時(shí)。500微升此培養(yǎng)物用于接種裝有50毫升與克隆甘油菌種相同的培養(yǎng)基的錐形瓶中。在搖床上于250rpm、30℃培養(yǎng)12小時(shí)。此體積用于接種至含2％酵母提取物的5升鹽水培養(yǎng)基中。發(fā)酵條件如下于30℃、500rpm、3vvm通風(fēng)條件培養(yǎng)24小時(shí)。當(dāng)生長培養(yǎng)物用完作為碳源的甘油時(shí)，用甲醇(BDH，Germany)誘導(dǎo)AOX1啟動子，當(dāng)濕重達(dá)到約70克/升時(shí)通過pH升高記錄生長。用以往表達(dá)HBsAg的巴斯德畢赤酵母克隆的發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)(歐洲專利申請EP 480525A2)，考慮培養(yǎng)物濕重的增加來調(diào)整甲醇流量。同時(shí)振蕩和通風(fēng)分別增加至750rpm和5vvm。在發(fā)酵48小時(shí)時(shí)加入與培養(yǎng)基中相同百分含量的維生素添加劑和鹽，90℃時(shí)再次補(bǔ)充鹽但用量為先前所用百分含量的一半。在發(fā)酵120小時(shí)時(shí)通過在1升試管中于3000rpm、4℃離心30分鐘收集生物質(zhì)，倒掉培養(yǎng)基上清液。用PBS緩沖液(pH7.2)洗所得濕生物質(zhì)，并稱重以確定發(fā)酵過程的產(chǎn)量(克/升)，約為170克/升。接著，將沉淀重新懸浮于得到培養(yǎng)物凈重體積的2倍裂解緩沖液中。
通過機(jī)械研磨法進(jìn)行破碎，通過纖維素膜(Dynomill，USA)過濾6次，所得物質(zhì)于3000rpm離心30分鐘。上清在超速離心機(jī)(HitachiCSP7OH，RP 45T轉(zhuǎn)頭，Japan)中于15000rpm再離心30分鐘。除去沉淀并用1×裂解緩沖液洗2次。
用60克/升的抽提緩沖液(PBS，8M尿素)處理沉淀并于4℃振蕩培養(yǎng)過夜以使蛋白溶解以便檢測其中的蛋白。所得物質(zhì)于15000rpm離心30分鐘，除去上清液并用1×PBS緩沖液脫鹽以使蛋白重折疊。通過還原條件和非還原條件下10％含SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳可微弱地觀察到此蛋白(圖3)。
用抗D2V超免疫小鼠腹水，通過蛋白印跡技術(shù)檢測此沉淀中的D2病毒重組蛋白。檢測到的蛋白大小(約38kDa)不是預(yù)期的那個(gè)。來自質(zhì)粒pNAO-407轉(zhuǎn)化的酵母克隆等量制品用作負(fù)對照(圖4)。
抽提后對剩余沉淀進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白印跡。分子量估計(jì)表明比野生型包膜蛋白更低的蛋白大小(38kd)。用與辣根過氧化酶偶聯(lián)的抗小鼠抗體作為三抗檢測固定平板中作為二抗的抗DV2超免疫腹水中人血清(次級感染)Ig，通過擴(kuò)增的三明治ELISA也可得到此結(jié)果。此系統(tǒng)在50微克脫鹽提取物中檢測到DV特異的活性。來自帶有PNAO-407載體的酵母克隆的破碎物的等量制品用作負(fù)對照，那些O.D.大于或等于陰性對照樣品O.D.的2倍的樣品認(rèn)為是陽性樣品。實(shí)施例2為獲得D4包膜基因，起點(diǎn)是編碼病毒蛋白E的序列，病毒來自1981年多米尼亞共和國登革熱流行期間分離的菌株814669并由美國德克薩斯大學(xué)Robert Shope博士慷慨贈予。
使用菌株814669分離要表達(dá)的基因。此序列以m＝1-5UFP/ml于L-15培養(yǎng)基中在小鼠腦中繁殖四次、在AP61(Aedes pseudoscutellaris)中繁殖一次直至細(xì)胞表現(xiàn)大于70％的細(xì)胞病變效應(yīng)并且使用超免疫腹水對D2的特異免疫熒光超過細(xì)胞的50％。
根據(jù)其他作者的方法提取感染細(xì)胞的RNA(Deubel V，Laille M，Hugnot J，Chungue E，Gueston J，Drovet Mt，Bassot S，Chevrier D，通過基因組擴(kuò)增鑒定登革熱序列外周血中登革病毒血清型的快速診斷，病毒學(xué)方法雜志，1990，3041-54)。簡要地說，用TNE緩沖液沖洗細(xì)胞，并在含0.5％NP40和0.5％sodium deoxicalato的0.1×TNE中裂解細(xì)胞，于2000rpm離心10分鐘沉淀核酸細(xì)胞并在1％SDS存在時(shí)用酚處理胞質(zhì)提取物二次去蛋白。RNA用乙醇和乙酸銨沉淀。
cDNA合成如下進(jìn)行約使用10微升RNA(100納克)，然后加入32納克引物，于95℃變性2分鐘并放在冰中1分鐘以上。然后加入5mM(1微升)dNTP混合物、10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液(2微升)，40單位(1微升)RNAsin，12單位(1微升)逆轉(zhuǎn)錄酶和水至20微升總體積，于42℃放置1個(gè)小時(shí)。
用來得到cDNA的引物的反義基因組序列是5′AAACATCCTGCCAATGGA 3′根據(jù)Saiki等，1988的方法(Saiki PK，Grifand DH，Stoffel S，ScharfSJ等。用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行DNA的引物指導(dǎo)的酶擴(kuò)增，科學(xué)，1988，239487-491)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。
在其最后53個(gè)氨基酸截短的D4包膜的1202bp通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增并用于克隆酵母表達(dá)載體(pFAO)。此載體基本上與先前已報(bào)導(dǎo)的載體pPS-7(歐洲專利申請EP 438200)相同，但它包含釀酒酵母的α因子分泌信號。這就是得到質(zhì)粒pDFE4-47的方法。
根據(jù)Saiki等，1988的方法(Saiki PK，Grifand DH，Stoffel S，ScharfSJ等。用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行DNA的引物指導(dǎo)的酶擴(kuò)增，科學(xué)，1988，239487-491)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，使用下列引物正向引物5′GGGAATTCT ATG CGA TGC TTA GGA GTA GGA 3′負(fù)向引物5′GGGAATTCTTAAAACATCCTGCCAATGGAACT 3′對于PCR，使用5微升合成cDNA，終體積達(dá)50微升，包含10×TAQ聚合酶緩沖液(5微升)，dNTP(5微升)，320納克每種引物(+/-)。
每個(gè)引物中包含限制性內(nèi)切酶(RE)EcoRV(GATATC)的切割位點(diǎn)，在正向引物中包括起始密碼子或ATG，在反向引物中包括終止密碼子或TTA。對應(yīng)于核苷酸序列中位置的每個(gè)引物的數(shù)參考以前公開的結(jié)果并美國德克薩斯大學(xué)Robert Shope博士慷慨提供。
擴(kuò)增序列有1202bp，并且除了以前描述的和引物中包括的修飾外，對應(yīng)于在其側(cè)翼末端截短了53個(gè)氨基酸的D4病毒包膜基因的序列。
首先，DNA-cDNA雜交體于95℃變性5分鐘，然后加入2.5單位TAQ聚合酶(Bohering Mamnhein)，于72℃保持45秒。進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的如下擴(kuò)增變性(95℃，45秒)，退火(55℃，90秒)，延伸(72℃，45秒)。最后一個(gè)循環(huán)后，于72℃保持10分鐘。
PCR檢測取5微升每種反應(yīng)混合物，加入4微升水和4微升染料并上樣到在含2微升溴乙錠(10毫克/毫升)的TBE緩沖液中的0.8％瓊脂糖凝膠上，用HindIII酶消化的λDNA用作標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記物。
在100微升體積中用蛋白激酶K處理擴(kuò)增產(chǎn)物以消除先前PCR中所用的殘余Taq聚合酶。然后，用酚/氯仿處理并于-70℃過夜進(jìn)行乙醇沉淀。接著，在4℃于7200rpm離心(Hettich，D-7200)15分鐘，用70％乙醇沖洗沉淀并以相似條件離心。將此物質(zhì)重新懸浮于30微升1×0.1MTE緩沖液中，然后用LGT純化。
使用10kb質(zhì)粒pFAO以獲得酵母表達(dá)載體。此質(zhì)粒包含巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1(AOX)的轉(zhuǎn)錄啟動子、釀酒酵母甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAP-T)的轉(zhuǎn)錄終止子和選擇標(biāo)記HIS-3。第一步是用酶EcoRI消化載體，然后用堿性磷酸酶脫磷酸。隨后進(jìn)行連接，在T4 DNA連接酶的參與下使用100ng質(zhì)粒PFAO/EcoRI/CIP與100ng純化的條帶E一起溫育。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞Mc-1061菌株。使用條帶E的1.202kb條帶通過菌落雜交選擇陽性克隆。這就是得到質(zhì)粒pDFE4-47(圖5)的方法，純化質(zhì)粒并保存以便以后使用。進(jìn)行測序以確定條帶插入在AOX啟動子下。使用如下引物序列ACTATTGCCAGCATTGCT 3′1220此引物在載體條帶連接點(diǎn)的上游鏈α因子區(qū)域雜交。電穿孔基本上根據(jù)Martinez等，1993的方法(Martinez E，Garcia C yMorales-Grillo J.，通過電穿孔快速轉(zhuǎn)化非酵母，Biotech techn，1993；7895-896)進(jìn)行電穿孔過操作。
從-70℃保存的甘油菌種重新活化巴斯德畢赤酵母后，使其在YPG培養(yǎng)基中生長并在于28℃培養(yǎng)72小時(shí)。此后在無菌條件下挑取20個(gè)3毫米的菌落并將其重新懸浮在1.5毫升Eppendorf管中的1毫升無菌蒸餾水中。細(xì)胞于4℃冷凍微量離心機(jī)(Hettich D-7200 Tuttligen，Japan)中以3200rpm離心3分鐘。丟棄上清并將沉淀重新懸浮于200微升1M山梨醇中用于電穿孔，然后將其轉(zhuǎn)移至0.2厘米電穿孔杯(Gene-Pulser Cuvette，Bio-Rad，USA)中。
每杯中加入5微升，含有500納克用Clal酶(Promega)和10微升SalI酶消化的質(zhì)粒。
使用商用電穿孔儀(基因脈沖轉(zhuǎn)染儀，Bio-Rad，USA)。此過程的參數(shù)是電阻200w；電容125uf；電壓2kv；放電時(shí)間3.4ms，這些條件根據(jù)生產(chǎn)商的說明來調(diào)整。
將電穿孔細(xì)胞重新懸浮于1毫升冷山梨醇中并放在含2％葡萄糖無氨基酸的YPG基本培養(yǎng)基平板上。此板于28℃培養(yǎng)96小時(shí)。
然后，隨機(jī)挑選90個(gè)克隆，接種5毫升YPG培養(yǎng)基中的預(yù)培養(yǎng)物并在搖床中以250rpm旋轉(zhuǎn)振蕩于28℃培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)。
生長的細(xì)胞在4℃于3200rpm離心3分鐘(Jouan，Gr 41-11，F(xiàn)rance)并倒掉上清液。用無菌水洗后在相似條件下再離心。沉淀重新懸浮于溶解緩沖液中(annex 1)并加入25微升Zimolaze至20毫克/毫升(Seikagaku Corporation，Japan)；25微升鏈霉蛋白酶至20毫克/毫升(Merck，Germany)和10微升Rnase至16毫克/毫升(Boehringen，Gmbh，Germany)。此混合物于37℃培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)。
接著，用酚/氯仿抽提(Sambrook J，F(xiàn)rissch EF，Maniatis T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，1989)，收集上相并用無水乙醇(Merck，Germany)在-70℃沉淀1小時(shí)。此后樣品在冷凍微量離心機(jī)中在4℃于12000rpm離心15分鐘。
然后用70℃乙醇沖洗抽提的DNA并在相同條件下再次離心。將DNA真空干燥(Speed-Vac Alpha，Switzerland)15分鐘，然后重新懸浮于100微升的TE緩沖液中，再測試抽提質(zhì)量。
根據(jù)Amersham方法用來自D4的蛋白E作為探針進(jìn)行點(diǎn)印跡分析以確定重組質(zhì)粒。
將20微升(10微克)DNA用10單位限制性內(nèi)切酶EcoRI(Amershan，UK)于37℃消化12小時(shí)以確定整合特征。用含AOX1基因、α因子和D4 E基因序列(圖6)的質(zhì)粒pDFE4-47的ClaI/SacI條帶作為探針。克隆得到鑒定時(shí)，挑選克隆61(YDE447-61)用于表達(dá)研究。克隆YDFE447-61的表達(dá)研究從用克隆YDE447-61的小份甘油菌種接種的YPG固體培養(yǎng)基平板中挑取一個(gè)菌落。用此克隆接種50毫升鹽水培養(yǎng)基[22克/升(NH4)2SO4，18.2克/升K2HPO4，7.5克/升MgSO4·7H2O，0.5克/升CaCl2，3％甘油，400×5毫升維生素溶液，1毫升微量鹽溶液，pH調(diào)節(jié)至5.0]中的預(yù)培養(yǎng)物，并在搖床上于30℃、250rpm培養(yǎng)12小時(shí)。此體積用作500毫升相同培養(yǎng)基中的接種物，然后此體積用作裝有含20％酵母提取物的鹽水培養(yǎng)基的5升發(fā)酵物的接種物。發(fā)酵條件是于28℃、500rpm、3vvm通風(fēng)條件培養(yǎng)24小時(shí)。當(dāng)生長培養(yǎng)物用完作為碳源的甘油時(shí)，用甲醇(BDH，Germany)誘導(dǎo)AOX1啟動子，當(dāng)濕重達(dá)到約70克/升時(shí)通過pH升高記錄生長。用以往表達(dá)HBsAg的巴斯德畢赤酵母克隆的發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)(歐洲專利申請EP 480525A2)，考慮培養(yǎng)物濕重的增加來調(diào)整甲醇流量。同時(shí)振蕩和通風(fēng)分別增加至750rpm和5vvm。在發(fā)酵48小時(shí)時(shí)加入與培養(yǎng)基中相同百分含量的維生素添加劑和鹽，90℃時(shí)再次補(bǔ)充鹽但用量為先前所用百分含量的一半。在發(fā)酵120小時(shí)時(shí)通過在1升試管中于3000rpm、4℃離心30分鐘收集生物質(zhì)，倒掉培養(yǎng)基上清液。用PBS緩沖液(pH7.2)洗所得濕生物質(zhì)，并稱重以確定發(fā)酵過程的產(chǎn)量(克/升)，約為200克/升。接著，將沉淀重新懸浮于1倍體積裂解緩沖液中以得到40％終濃度。通過機(jī)械研磨法進(jìn)行破碎，通過纖維素膜(Dynomill，USA)過濾6次，所得物質(zhì)于3000rpm離心30分鐘。上清在超速離心機(jī)(Hitachi CSP7OH，RP 45T轉(zhuǎn)頭，Japan)中于15000rpm再離心30分鐘。合并兩次沉淀并用裂解緩沖液洗兩次。
用抗DV4超免疫鼠腹水(MIAF)，通過蛋白印跡技術(shù)檢測此沉淀中的DV4重組包膜蛋白。來自質(zhì)粒pFAO轉(zhuǎn)化的酵母克隆相似制品用作負(fù)對照(圖7)。
用60克/升的抽提緩沖液(PBS，8M尿素)處理沉淀并于4℃振蕩培養(yǎng)過夜以使蛋白溶解。所得物質(zhì)于15000rpm離心30分鐘，除去上清液并用1×PBS緩沖液脫鹽以使蛋白復(fù)性。通過還原條件和非還原條件下10％含SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳可微弱地觀察到此蛋白(圖8)。
分子量估計(jì)表現(xiàn)60Kda大小，這是根據(jù)低分子量模式(Pharmacia，UK)在還原條件下計(jì)算的。通過使用相同的抗DV4 MIAF進(jìn)行脫鹽提取物的蛋白印跡分析再次證實(shí)重組蛋白的存在，使用已被登革病毒次級感染的人個(gè)體的血清也觀察到此相同反應(yīng)。
通過ELISA也得到這些結(jié)果。
用人類血清免疫球蛋白(二次感染)作為覆蓋并與過氧化酶偶聯(lián)的三明治樣檢測法觀測到至多8微克脫鹽提取物的登革熱病毒特異活性。
用人血清(二次感染)免疫球蛋白作為覆蓋，MIAF和小鼠單抗作為次級抗體的擴(kuò)增三明治樣檢測方通過與過氧化酶偶聯(lián)的抗小鼠抗體三抗來檢測。通過用抗登革熱復(fù)合物和抗血清特異型登革病毒單抗，可觀測到500納克脫鹽提取物中的特異登革病毒活性。使用抗DV4和抗DV2 MIAF，可獲得低敏感性。
來自帶有載體pFAO的酵母克隆的裂解液沉淀的相同制品用作陰性對照。
陽性標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)那些陽性樣品的O.D.值大于或等于陰性對照樣品OD值的2倍而建立的。
通過SDS-PAGE估測重組蛋白產(chǎn)量，其中條帶的相對濃度對應(yīng)于凝膠所包含的谷氨酸脫氫酶蛋白(55.4Kda)曲線(Deubel V，Laille M，Hugnot J，Chungue E，Gueston J，Drovet Mt，Bassot S，Chevrier D，通過基因組擴(kuò)增鑒定登革熱序列外周血中登革病毒血清型的快速診斷，病毒學(xué)方法雜志，1990，3041-54)；同時(shí)可根據(jù)BSA蛋白曲線由Amidoblack技術(shù)確定其濃度。
在每一次過程中，相對于從沉淀提取的蛋白總濃度，可得到產(chǎn)量的1.2％的重組蛋白。重組蛋白用作免疫原每個(gè)方案中我們使用一組20只小鼠(Balb，雌性，四周齡)。使用由對照酵母獲得的相同濃度提取物，檢測每單位200微克和400微克的兩種濃度免疫原，包括免疫接種方案中陰性對照小鼠。三周內(nèi)每周向肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)和皮下注射一個(gè)劑量的免疫原和弗氏完全佐劑(I)及弗氏不完全佐劑(II和III)。通過ELISA觀測小鼠血清中抗體抗DV4的水平(以前描述的擴(kuò)增的三明治樣系統(tǒng))，通過用更明確的蛋白樣品在第四次用量時(shí)抗體水平提高(用50％飽和硫酸銨沉淀原提取物)。在1/500和1/1000稀釋液間可得到血清反應(yīng)性。蛋白印跡技術(shù)顯示天然登革病毒4包膜蛋白具有特異反應(yīng)性(圖9)。
給小鼠施用10LD50登革病毒菌株H 241 MP-24，保護(hù)作用的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示用400微克重組蛋白免疫接種的小鼠的保護(hù)作用為53％，這是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的結(jié)果p＝0.0025。
在新的實(shí)驗(yàn)中用明確的樣品所得到更好的結(jié)果。所用方案相同，在這些方案中ELISA測試的抗DV4抗體滴度較高。一些個(gè)體的血清顯示haemagglutination抑制和中和抗體。與所述測試相似的保護(hù)測試達(dá)到85％的保護(hù)作用，p＝0.0001。
實(shí)際上，因?yàn)閺奈磮?bào)道過在任何表達(dá)系統(tǒng)中E基因作為單基因表達(dá)，所以顆粒形成是有趣的現(xiàn)象。一旦顆粒以此方式純化，這應(yīng)可以在激活免疫應(yīng)答中起重要作用。事實(shí)上巴斯德畢赤酵母已成為引人注目的這種蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。
也可以通過電鏡和免疫顯微鏡來檢測重組蛋白產(chǎn)量。通過這些技術(shù)，蛋白表面為兩種主要形式，大的胞質(zhì)內(nèi)集合物(圖10a)和顆粒形式(圖10b)。實(shí)施例3表達(dá)載體pDE2-21是獲得含血清型2病毒包膜基因的酵母表達(dá)載體的起點(diǎn)。實(shí)施例1中已描述了表達(dá)載體pDE2-21并且此載體包括表達(dá)代表血清型2登革病毒的甲基營養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母菌株A/15包膜基因產(chǎn)物的遺傳信息，并且此菌株是從1981年發(fā)生在古巴的登革熱流行病中分離的。
為此，對包基因進(jìn)行修飾。它包括在位點(diǎn)1407處用EcoRI切割此處的基因。用klenow酶填補(bǔ)末端并最終與T4連接酶相連。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞菌株K12/XL-1 Blue，然后將其鋪在含氨芐霉素的LB培養(yǎng)基上。隨機(jī)挑取20個(gè)菌落。并通過微堿法抽提DNA(Guilles，1989)。一旦提取DNA，就開始有EcoRV和EcoRI酶進(jìn)行限制性酶分析。挑取陽性克隆以證實(shí)修飾后的核苷酸序列區(qū)。為此，使用商業(yè)用試(sequenase version 2.0 DNA測序試劑盒，USB，USA)和兩個(gè)引物，一個(gè)位于修飾區(qū)的5′端，另一個(gè)位于修飾區(qū)的3′端，如實(shí)施例1中所述的后者以前已用來擴(kuò)增包膜條帶。5′引物的序列是2290 5′TCATGGACTATGAAAATCCT 3′23093′引物是2432 5′CAGATATCTTAAGCCTGCAACCATAGCTCCC 3′2403如前面實(shí)施例所述的，根據(jù)以前公開的結(jié)果引物兩側(cè)序列數(shù)目對應(yīng)于核苷酸序列位點(diǎn)((Deubel V，Kinney RM，Trent DW.，牙買加2型基因型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列和推測的氨基酸序列全長基因組的比較分析，病毒學(xué)，1988，165234-244)。
當(dāng)已確定修飾區(qū)序列時(shí)，就可以證實(shí)EcoRI位點(diǎn)的缺失，以及基因1407位點(diǎn)的終止密碼子TTA的插入，包膜在79堿基對和最后27個(gè)氨基酸處截?cái)?。就這樣可得到質(zhì)粒pDE2-21 EcoRI-7(圖11)，初步純化此質(zhì)粒并保存以備今后使用。
然后用10單位EcoRI酶消化10微克質(zhì)粒以得到如所述的完整但功能上截短的包膜。
通過LGT方法純化此片段后，將其在載體中克隆以便在酵母中表達(dá)8.5kb的pPS-7(歐洲專利申請EP 438200)。
此質(zhì)粒包含巴斯德畢赤酵母乙醇氧化酶基因啟動子，接著是用于Sacarosa invertasa(Sucll)的釀酒酵母分泌信號，釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP-T)基因轉(zhuǎn)錄的終止子，允許生長在組氨酸缺陷型基本培養(yǎng)基的選擇標(biāo)記物HIS-3，以及巴斯德畢赤酵母的信號3AOX。接著Sucll，Ncol位點(diǎn)是唯一的克隆位點(diǎn)。
用Mung-Bean核酸酶(Biolabs)在37℃消化10微克pPS-71小時(shí)以完成克隆。
為此，取5微克pPS-7/Nco1并在25℃與每1.14pmol的5′末端有10單位酶培養(yǎng)1小時(shí)。一旦末端被修飾，就用堿性磷酸酶(CIP)處理。
接著，取100納克pPS-7/NcoI/MB/CIB并在T4 DNA連接酶存在時(shí)與30納克的pDE2-21(EcoRI-7)的EcoRV條帶一起培養(yǎng)(圖11)。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞菌株k-12/XL-1 Blue(BullokWO，F(xiàn)ernandez TM，Shote JM.XL-Blue質(zhì)粒，用β一半乳糖苷酶選擇轉(zhuǎn)化recA的大腸桿菌菌株的高效質(zhì)粒，生物技術(shù)，1987，5376-379)，然后將其鋪在含氨芐霉素的LB培養(yǎng)基上。所有菌落獨(dú)自生長利于通過菌落雜交方法來篩選重組子。挑選陽性克隆進(jìn)行限制性檢測分析。如實(shí)施例1所述，使用由LGT方法以前純化的質(zhì)粒pDE2-21的1.485kb條帶來實(shí)行此方法。用放射性同位素32P標(biāo)記此條帶(32P，Amersham International，Amersham，UK)。
通過微堿法(Guilles，1989)從陽性克隆提取DNA并用EcoRI酶進(jìn)行限制性分析以確定含正確條帶方向的克隆。
挑選正確克隆時(shí)使用商業(yè)用試劑盒(sequenase version 2.0 DNA測序試劑盒，USB，USA)對包膜5′和Suc連接處3′端測序。此方法所用引物序列是1241 5′CCCCATCCTCTG TCTACCATG 3′1220就這樣可得到質(zhì)粒pDSE2-34(圖12)，此質(zhì)粒經(jīng)大規(guī)模純化并保存用于今后的酵母電穿孔中。電穿孔基本上根據(jù)Martinez等，1993的方法(Martinez E，Garcia C yMorales-Grillo J.，通過電穿孔快速轉(zhuǎn)化非酵母，Biotech techn，1993；7895-896)進(jìn)行電穿孔過操作。
在重新激活-70℃甘油保存的巴斯德畢赤酵母菌株后，使其生長在YPG培養(yǎng)基上并于28℃培養(yǎng)72小時(shí)。此后，在無菌條件下選取20個(gè)3毫米大小的菌落并使其重新懸浮在1.5毫升eppendorf試管的1毫升雙蒸水中。細(xì)胞在微量離心機(jī)中4℃3200rpm離心3分鐘，然后溶于200微升的1M山梨醇緩沖液進(jìn)行電穿孔，然后轉(zhuǎn)移至0.2厘米的電穿孔杯中(Gene-Pulser Cuvettes，Bio-Rad，USA)。
每個(gè)杯中加入5微升溶液，溶液包含先前用Cla1酶和40微升SaLI酶(Amersham，UK)切割的500納克質(zhì)粒pPDSE234(圖13)。此方法在低溫條件下進(jìn)行。使用商業(yè)用電穿孔儀(基因脈沖轉(zhuǎn)染儀，Bio-Rad，USA)。此方法的參數(shù)是電阻200w；電宣傳品25μF；電壓2kv；放電時(shí)間3.4ms?？筛鶕?jù)生產(chǎn)商的說明書些條件。
將電穿孔細(xì)胞重新懸浮于1毫升冰山梨醇中。取500微升鋪在含2％葡萄糖的無氨基酸的YNB(酵母氮基，Difco，USA)基本培養(yǎng)基上。28℃培養(yǎng)96小時(shí)。所長出的菌落被分離至含2％葡萄糖的YNB新鮮培養(yǎng)基平板上，28℃再培養(yǎng)72小時(shí)。根據(jù)Ferbeyre等1993年的方法進(jìn)行DNA印跡分析(Ferbeyre G，Villareal A，Morales-Grillo J.一種快速制備用于DNA分析的高分子量酵母DNA的方法生物技術(shù)1993；14386)。
隨機(jī)挑取15個(gè)克隆，接種5毫升YPG培養(yǎng)基的培養(yǎng)物并在28℃250rpm循環(huán)搖動的搖床(Blanc-LaBo S.A.，Ch-1131，Switzerland)上培養(yǎng)16小時(shí)。
將生長細(xì)胞在4℃3200rpm離心32分鐘(Jouan，GR 41-11，F(xiàn)rance)，倒掉上清液，多面手用無菌水沖洗并在4℃次離心3分鐘。沉淀重新重新懸浮于溶解緩沖液(Annex 1)中，并加入25微升Zimolaze使其濃度為20毫克/毫升(Seikagakn Corporation，Japan)，加入25向升鏈霉蛋白酶使其濃度為16毫克/毫升(Merck，Germany)和10微升Rnasa使其濃度為16毫克/毫升(Boehringer，Gmbh，Germany)。此混合物在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。接著在-70℃用無水乙醇(Merck，Germany)抽提1小時(shí)。
4℃樣品在微量離心機(jī)中12000rpm離心15分鐘。然后用70％乙醇沖洗抽提的DNA并在相似條件下再次離心。對溶于100微升TE的DNA真空干燥(Speed-Vac ALPHA，Switzerland)15分鐘，并測試抽提質(zhì)量。
37℃用10單位限制性內(nèi)切酶EcoRI(圖14)和15微克EcoRI和EcoRV(圖15)(Amersham，UK)消化15微克DNA以確定整合特征。
消化后，根據(jù)Sambrook等1989年的方法進(jìn)行DNA印跡分析(Sambrook J，F(xiàn)rissch EF，Maniatis T，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港1989)。根據(jù)雜交和核酸印跡方法進(jìn)行雜交反應(yīng)(Hyubond-N+Protocols，Amershan，UK)。先前由LGT方法的用限制性酶ClaI/SALI消化的質(zhì)粒pDE2-21產(chǎn)物條帶用作探針。此用此探針與兩種酶消化的DNA進(jìn)行雜交，而含AOX1啟動子序列的由LGT方法純化的質(zhì)粒pPS-7的Nco1/Clal條帶與用EcoRI酶切割的DNA雜交。
用限制性酶HindIII和EcoRI消化的入噬菌體DNA作為分子量標(biāo)記物。
用限制性酶Clal/SALI消化的質(zhì)粒pDSE2-34和實(shí)施例1中所述的酵母菌株YDE221-14作為實(shí)驗(yàn)的陽性對照，其中DNA被雙位消化或消化兩次。
沒有外推(MP-36)的相同巴斯德畢赤酵母菌株提取的DNA作為陰性對照。菌株MP-36和克隆YDE221-14作為DNA印跡的對照物，其中DNA儀被EcoRI消化，入噬菌體的DNA被限制性酶HindIII消化。鑒定克隆時(shí)，選取克隆1，2，3和4，命名為YDSE234-1、2、3、4用于表達(dá)研究。克隆YDSE234的表達(dá)研究從用克隆YDSE234-1，2，3和4的小份甘油菌種接種的YPG固體培養(yǎng)基平板中挑取一個(gè)菌落。用此克隆接種50毫升鹽水培養(yǎng)基[22克/升(NH4)2SO4，18.2克/升K2HPO4，7.5克/升MgSO4·7H2O，0.5克/升CaCl2，3％甘油，400×5毫升維生素溶液，1毫升微量鹽溶液，pH調(diào)節(jié)至5.0]中的預(yù)培養(yǎng)物，并在搖床上于30℃、250rpm培養(yǎng)12小時(shí)。此體積用作500毫升相同培養(yǎng)基中的接種物，然后此體積用作裝有含20％酵母提取物的鹽水培養(yǎng)基的5升發(fā)酵物的接種物。發(fā)酵條件是于28℃、500rpm、3vvm通風(fēng)條件培養(yǎng)24小時(shí)。當(dāng)生長培養(yǎng)物用完作為碳源的甘油時(shí)，用甲醇(BDH，Germany)誘導(dǎo)AOX1啟動子，當(dāng)濕重達(dá)到約70克/升時(shí)通過pH升高記錄生長。用以往表達(dá)HBsAg的巴斯德畢赤酵母克隆的發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)(歐洲專利申請EP 480525A2)，考慮培養(yǎng)物濕重的增加來調(diào)整甲醇流量。同時(shí)振蕩和通風(fēng)分別增加至750rpm和5vvm。在發(fā)酵48小時(shí)時(shí)加入與培養(yǎng)基中相同百分含量的維生素添加劑和鹽，90℃時(shí)再次補(bǔ)充鹽但用量為先前所用百分含量的一半。在發(fā)酵120小時(shí)時(shí)通過在1升試管中于3000rpm、4℃離心30分鐘收集生物質(zhì)，倒掉培養(yǎng)基上清液。用PBS緩沖液(pH7.2)洗所得濕生物質(zhì)，并稱重以確定發(fā)酵過程的產(chǎn)量(克/升)，約為200克/升。接著，將沉淀重新懸浮于1倍體積裂解緩沖液中以得到40％終濃度。通過機(jī)械研磨法進(jìn)行破碎，通過纖維素膜(Dynomill，USA)過濾6次，所得物質(zhì)于3000rpm離心30分鐘。上清在超速離心機(jī)(Hitachi CSP7OH，RP 45T轉(zhuǎn)頭，Japan)中于15000rpm再離心30分鐘。合并兩次沉淀并用裂解緩沖液洗兩次。
按如下方法通過特異ELISA檢測發(fā)酵上清液發(fā)現(xiàn)有特異反應(yīng)性擴(kuò)增的三明治樣檢測，用人血清(二次感染)免疫球蛋白作為覆蓋，MIAF作為由偶聯(lián)過氧化酶的三極抗小鼠抗體觀測到的二極抗體。
從這些檢測中發(fā)現(xiàn)所有克隆都有良好反應(yīng)性(圖16)。所用溶液的優(yōu)點(diǎn)釀酒酵母由于其自身優(yōu)勢而傳統(tǒng)上用作以酵母為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)，例如易操作，突變異源蛋白的基因構(gòu)建和表達(dá)，易操作原核生物與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的結(jié)合，以及生化組成與其它真核生物相近。后者允許像形成二硫鍵切割，ENDOPROTEOLYTICS糖基化作用和ENSAMBLAJE MULTIM*RICO的基因產(chǎn)物翻譯后加工。此外，它們優(yōu)選可引起哺乳運(yùn)動基因高表達(dá)的高等生物細(xì)胞密碼子。酵母通過與動物和高等植物相似的機(jī)理(Kigsman S M y col.釀酒酵母的異源基因表達(dá)生物技術(shù)和遺傳工程評論1990；(3版)Russell G.E)。除了它們對人類無害外，相反它們用來制備飲料和食品及獲得代謝物(Hadfield C，Raina KK，Shashi-Menon K y col.酵母克隆基因的表達(dá)和施行Mycol Res1993；97(8)897-944.16-Itakura K，Hirose T，Crea R y col.在大腸桿菌中表達(dá)化學(xué)合成的生長激素抑制素基因科學(xué)1978；1981056-1063)。
除了已知釀酒酵母的遺傳和重量知識及其優(yōu)點(diǎn)外，有時(shí)因?yàn)樗x的表達(dá)啟動子是弱啟動子，作為接種物不易調(diào)控或難以調(diào)控所以酵母不是蛋白表達(dá)的理想宿主(Shuster J R.酵母中異源蛋白的調(diào)控基因表達(dá)EnG G Stewart，I Russel，R D Klein y R R Hiebsch(Ed)工業(yè)酵母的生物研究1987；CRC Press，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)la，Vol(2)19-25)。此外，因?yàn)楦咛腔饔煤图?xì)胞壁的大小一起阻遏分泌產(chǎn)物釋放到培養(yǎng)中，所以產(chǎn)物滯瘤在酵母外周胞質(zhì)。釀酒酵母分泌蛋白的水平低。此外，高糖基化作用增加分泌產(chǎn)物的硬度，這可能影響其天然特征及生物活性(Lemoine Y“酵母的異源表達(dá)“，第8次國際生物技術(shù)大會，巴黎，1988年7月17-22日；Schultz L D，Tanner J，Hofman K J y col.來自EB病毒的400Kda包膜糖蛋白在酵母中的表達(dá)和分泌基因1987；54-113-123)。
這就是為什么近來二次生產(chǎn)酵母的表達(dá)系統(tǒng)使用甲基營養(yǎng)型酵母。在這些系統(tǒng)中，巴斯德畢赤酵母已成功地用來克隆和表達(dá)異源基因(Cregg J M，Digan M E，Tschopp J F y col.巴斯德畢赤酵母中外源基因的表達(dá)EnC L Hershberger S W Gueener y Hegeman G(Eds)工業(yè)微生物的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)1989343-352)。由于其它優(yōu)越的特征，使之比釀酒酵母更引人注目。
它具有在酵母基因組中以穩(wěn)定受控的方式表達(dá)整合DNA序列的能力。它含有可以調(diào)控非常精確的乙醇氧化酶(AOX1)基因啟動子，這是一個(gè)優(yōu)勢，可以獲得對宿主產(chǎn)生有害效應(yīng)的產(chǎn)物(Cregg JM，Ischopp Jf，Stillman C y col.乙型肝炎病毒表面抗原在甲基營養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母中的高水平表達(dá)和有效組裝生物技術(shù)1987；5479-485)。
本系統(tǒng)的另一重要方面是具有重組子生長的方法，可發(fā)醇產(chǎn)生大體積、高細(xì)胞密度，無毒和無病原體，高產(chǎn)量異源蛋白。如鹽混合物所定義的使用廉價(jià)的培養(yǎng)基，TRAZAS元素，生物素和廉價(jià)碳源用作克隆基因?qū)氲牡孜?，例如甲?Wegner EH.高細(xì)胞密謀時(shí)通過酵母發(fā)酵的生化轉(zhuǎn)變美國專利4414329，1983)。
具體的優(yōu)點(diǎn)是巴斯德畢赤酵母的分泌特征，盡管向培養(yǎng)基分泌少量天然蛋白，但是在細(xì)胞外培養(yǎng)基中可觀測到高百分含量的異源蛋白，這一系統(tǒng)也允許蛋白的純化(Cregg JM，Vedvick T y Paschke W C.巴斯德畢赤酵母中外源基因表達(dá)的最新進(jìn)展Bio/Tech 1993；11905-910)。
目前，巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成功地用來獲得幾種商業(yè)用異源蛋白，包括乙型肝炎病毒表面抗原(EP 480525A2)，破傷風(fēng)毒素片段C，這些可用作免疫原(Cregg JM，Ischopp JF，Stillman C y col.乙型肝炎病毒表面抗原在甲基營養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母中的高水平表達(dá)和有效組裝，生物技術(shù)1987；5479-485)。
考慮到本發(fā)明目標(biāo)是獲得抗登革病毒的疫苗制品，巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)由于自身的優(yōu)勢及以前用它得到過另一種病毒疫疫苗而成為引人注目的新系統(tǒng)。
附圖描述圖1質(zhì)粒構(gòu)建的總Sc方法圖2已用EcoRV消化的D2酵母克隆的DNA印跡。MP-36作為陰性對照。D2包膜基因條帶作為探針。所有克隆都顯示1485bp附近的一條帶。
圖3使用抗DV2小鼠免疫腹水(MIAF)通過蛋白印跡在沉淀中觀測到DV2重組包膜蛋白。用載體pNAO轉(zhuǎn)化的酵母克隆的相似制品作為陰性對照。
A陰性對照酵母克隆的沉淀，B酵母克隆pDYE2-14的沉淀，C低分子量方式。
圖4使用抽提緩沖液(8M尿素，PBS)，通蛋白印跡用抗DV2MIAF觀測到沉淀中所溶的DV2重組包膜蛋白。A陰性對照的可溶蛋白，B酵母克隆pDYE2-14的可溶蛋白(還原)，C酵母克隆pDYE2-14的可溶蛋白(非還原)，D低分子量標(biāo)記物。
圖5質(zhì)粒pDE4-47構(gòu)建總表。
圖6克隆YDFE447-61的DNA印跡。用EcoRI消化DNA并用質(zhì)粒pDFE4-47的ClaI/SacI條帶。在所有克隆中都觀察到1.203kb條帶。在MP-36中顯示了預(yù)測的5.5kb條帶。
圖7通過抗DV4小鼠免疫腹水(MIAF)在沉淀中用蛋白印跡觀測到DV4重組包膜蛋白。用載體pFAO轉(zhuǎn)化的克隆的相似制品作為陰性對照。
圖8用抽提緩沖液(8M尿素，PBS)溶解的DV4重組包膜蛋白形成沉淀，在發(fā)酵不同時(shí)間取不同樣品。通過蛋白印跡用抗DV4 MIAF進(jìn)行檢測。
圖9用50％的飽和硫酸銨沉淀原提取物。在1/500和1/1000稀釋液間可獲得血清反應(yīng)性。蛋白印跡技術(shù)顯示登革病毒的天然包膜蛋白有特異反應(yīng)性。
圖10通過免疫電鏡觀測的重組抗原?？乖诩?xì)胞內(nèi)胞質(zhì)(a)形成集合物并是以顆粒形式存在(b)。黑點(diǎn)標(biāo)記特異的免疫檢測。用箭頭表示顆粒。
圖11質(zhì)粒pDE2-21(EcoRI-7)構(gòu)建的總表。
圖12質(zhì)粒pDSE2-34構(gòu)建的總表。
圖13質(zhì)粒pDSE2-34的細(xì)表。
圖14克隆YDSE234-1，2，3，4的DNA印跡。用EcoRI消化DNA。用質(zhì)粒pPS-7的Nco1/Clal條帶作為探針。用HindIII/EcoRI消化的入噬菌體DNA作為分子量。在克隆1中兩條帶(11kb附近和4.6kb與4.9kb間的條帶)證實(shí)可能存在多整合。在其它克隆中顯示9.5kb(AOX1-SucII-Env-Gapt-His3-3′AOX和AOX1基因座兩側(cè)的基因組片段)。在MP36中顯示預(yù)測的5.5kb條帶。
圖15克隆YDSE234-1，2，3，4的DNA印跡。用EcoRI/EcoRV消化的DNA。質(zhì)粒pDSE234的ClaI/Sal I條帶作為探針。用D2包膜的同一個(gè)質(zhì)粒ClaI/SalI序列作為對照。用HindIII/EcoRI消化的入噬菌體DNA作為分子量。條帶從上至下是8.1kb(AOX1-SucII-Env-Gapt-His 3-3′AOX)，克隆1的3kb(由于多整合造成的未預(yù)測條帶)MP36(預(yù)測)，克隆1的1.1kb(如先前條帶)和MP36(預(yù)測)。
圖16用人血清免疫球蛋白檢測發(fā)酵上清液中DV2-包膜蛋白的擴(kuò)增三明治樣檢測法。
序列表(1)基本信息(i)申請人(A)名稱CENTRO DE INGENIERIA GENETICA YBIOTECNOLOGIA(B)街道Ave.31 entre 158 y 190(C)城市Ciudad de La Habana(E)國家Cuba(F)郵政編號(Zip)10600(G)電話53 7 218466(H)傳真53 7 218070/336008(A)名稱INSTITUTO DE MEDICINA TROPICALPEDRO KOURI(B)街道Autopista Novia del Mediodia Km 6(C)城市Ciudad de La Habana(E)國家Cuba(F)郵政編號(Zip)11100(G)電話53 7 220633/220657(H)傳真53 7 335061(ii)發(fā)明名稱登革病毒基因表達(dá)的方法(iii)序列數(shù)12(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“得到D2 cDNA所用引物的反義序列”(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO1GGCCTGCTCC ATAGCTCCC 19(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“擴(kuò)增D2病毒包膜所用正向引物的序列”(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO2TCAGATATCA TGCGTTGCAT AGGAATATC 29(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“擴(kuò)增D2病毒包膜所用的反義引物”(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO3CAGATATCTT AAGCCTGCAC CATAGCTCCC30(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“D2病毒包膜測序所用的引物”(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO4CCCCATCCTC TGTCTACCAT G 21(2)關(guān)于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度1492個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(vi)原始來源(A)生物登革病毒2(B)株系A(chǔ)15(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵misc特征(B)位置1..1492(D)其它信息/備注＝“血清2型登革病毒毒株A15的包膜序列”(xi)序列描述SEQ ID NO5ATGACAATGC GTTGCATAGG AATATCAAAT AGAGACTCTG TAGAAGGGGT TTCAGGAGGA60AGCTGGGTTG ACATAGTCTT AGAACATGGA AGCTGTGTGA CGACGATGGC AAAAAACAAA 120CCAACATTGG ATTTTGAACT GATAAAAACA GAAGCCAAAC AACCTGCCAC TCTAAGGAAG 180TACTGTATAG AGGCAAAGCT GACCAACACA ACAACAGAAT CTCGCTGCCC AACACAAGGA 240GAACCCAGCC TAAATGAAGA GCAGGACAAA AGGTTCGTCT GCAAACACTC CATGGTAGAC 300AGAGGATGGG GAAATGGATG TGGACTATTT GGAAAAGGAG GCATTGTGAC CTGTGCTATG 360TTCACATGCA AAAAGATCAT GAAAGGAAAA GTCGTGCTGC CAGAAAACTT GGAATACACC 420ATTGTGATAA CACCTCACTC AGGGGAAGAG CATGCAGTCG GAAATGATAC AGGAAAACAT 480GGCAAGGAAA TCAAAATAAC ACCACAGAGT TCCATCACAG AAGCAGAGTT GACAGGCTAT 540GGCACTGTCA CGATGGAGTG CTCTCCGAGA ACGGGCCTCG ACTTCAATGA GATGGTGTTG 600CTGCAAATGG AAAATAAAGC TTGGCTGGTG CAAAGGCAAT GGTTCCTAGA CCTGCCGTTG 660CCATGGCTGC CCGGAGCGGA CACACAAGGA TCAAATTGGA TACAGAAAGA GACATTGGTC 720ACTTTCAAAA ATCCCCACGC GAAGAAACGA GATGTTGTTG TTTTGGGATC CCAAGAAGGG 780GCCATGCACA CAGCACTCAC AGGGGCCACA GAAATCCAGA TGTCATCAGG AAACGTACTG 840TTCACAGGAC ATCTCAAGTG CAGGCTGAGG ATGGACAAAC TACAGCTCAA AGGAATGTCA 900TACTCTATGT GCACAGGAAA GTTTAAAGTC GTGAAGGAAA TAGCAGAAAC ACAACATGGA 960ACAATAGTTA TCAGAGTACA ATATGAAGGG GACGGCTCTC CATGTAAGAT CCGTTTTGAG 1020ATAATGGATT TGGAAAAAAG ACATGTTTTA GGTCGCCTGA TTACAGTCAA CCCAATCGTA 1080ACAGGAAAAG ATAGCCCAGT CAACATAGAA GCAGAACCTC CATTCGGAGA CAGCTACATC 1140ATCATAGGAG TAGAGCCGGG ACAATTGAAG CTCAACTGGT TTAAGAAAGG AAGTTCTATC 1200GGCCAAATGT TTGCGACAAC AATGAGGGGA GCGAAGAGAA TGGCCATTTT AGGTGACACA 1260GCTTGGGATT TTGGATCCCT GGGAGGAGTG TTTACATCTA TAGGAAAGGC TCTCCACCAA 1320GTTTTCGGAG CAATCTATGG GGCTGCCTTC AGTGGGGTCT CATGGACTAT GAAAATCCTC 1380ATAGGAGTCA TTATCACATG GATAGGAATG AATTCACGCA GCACCTCACC GTCTGTGTCA 1440CTAGTATTGG TGGGAGTCGT AACGCTGTAT TTGGGAGTTA TGGTGCAGGC CG 1492(2)關(guān)于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“擴(kuò)增D4病毒包膜所用正向引物的序列”(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO6GGGAATTCTA TGCGATGCTT AGGAGT 30(2)關(guān)于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“擴(kuò)增D4病毒包膜所用的反義引物”(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO7GGGAATTCTT AAAACATCCT GCCAATGGAA CT 32(2)關(guān)于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“對D4蛋白表達(dá)載體中載體—包膜接合點(diǎn)進(jìn)行測序所用的引物”(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO8ACTATTGCCA GCATTGCT 18(2)關(guān)于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度1203個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(vi)原始來源(A)生物登革病毒4(B)株系814669(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵misc特征(B)位置1..1203(D)其它信息/備注＝“所用D4病毒的包膜序列”(xi)序列描述SEQ ID NO9ATGCGATGCG TAGGAGTAGG AAACAGAGAC TTTGTGGAAG GAGTCTCAGG TGGAGCATGG 60GTCGACCTAG TGCTAGAACA TGGAGGATGC GTCACAACCA TGGCCCAAGG AAAACCAACC 120TTGGATTTTG AACTGACTAA GACAACAGCC AAGGAAGTGG CTCTGTTAAG AACCTATTGC 180ATTGAAGCCT CAATATCAAA CATAACTACG GCAACAAGAT GTCCAACGCA AGGAGAGCCT 240TATCTGAAAG AGGAACAGGA CCAACAGTAC ATTTGCCGGA GAGATGTGGT AGACAGAGGG 300TGGGGCAATG GCTGTGGCTT GTTTGGAAAA GGAGGAGTTG TGACATGTGC GAAGTTTTCA 360TGTTCGGGGA AGATAACAGG CAATTTGGTC CGAATTGAGA ACCTTGAATA CACAGTGGTT 420GTAACAGTCC ACAATGGAGA CACCCATGCA GTAGGAAATG ACACATCCAA TCATGGAGTT 480ACAGCCATGA TAACTCCTAG GTCACCATCG GTGGAAGTCA AATTGCCGGA CTATGGAGAA 540CTAACACTCG ATTGTGAACC AGGTCTGGAA TTGTACTTTA ATGAGATGAT TCTGATGAAA 600ATGAAAAAGA AAACATGGCT CGTGCATAAG CAATGGTTTT TGAATCTGCC TCTTCCATGG660ACAGCAGGAG CAGACACATC AGAGGTTCAC TGGAATTACA AAGAGAGAAT GGTGACATTT720AAGGTTCCTC ATGCCAAGAG ACAGGATGTG ACAGTGCTGG AATCTCAGGA AGGAGCCATG780CATTCTGCCC TCGCTGGAGC CACAGAAGTG GACTCCGGTG ACGGAAATCA CATGTTTGCA840GGACATCTTA AGTGCAAAGT CCGTATGGAG AAATTGAGAA TCAAGGGAAT GTCATACACG900ATGTGTTCAG GAAAGTTTTC AATTGACAAA GAGATGGCAG AAACACAGCA TGGGACAACA960GTGGTGAAAG TCAAGTATGA AGGTGCCGGA GCTCCGTGTA AAGTCCCCAT AGAGATAAGA 1020GATGTAAACA AGGAAAAAGT GGTTGGGCGT ATCATCTCAT CCACCCCTTT GGCTGAGAAT 1080ACCAACAGTG TAACCAACAT AGAATTAGAA CGCCCTTTGG ACAGCTACAT AGTGATAGGT 1140GTTGGAAACA GCGCATTAAC CTCCATTGG TTCAGGAAAG GGAGTTCCAT TGGCAAGATG 1200TTT 1203(2)關(guān)于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“檢查D2病毒包膜中EcoRI位點(diǎn)處正確修飾所用的引物”(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO10TCATGGACTA TGAAAATCC 20(2)關(guān)于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度1416個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(vi)原始來源(A)生物登革病毒2(B)株系A(chǔ)15(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵misc特征(B)位置1..1416(D)其它信息/備注＝“血清2型登革病毒毒株A15截短的包膜序列”(xi)序列描述SEQ ID NO11ATGACAATGC GTTGCATAGG AATATCAAAT AGAGACTCTG TAGAAGGGGT TTCAGGAGGA60AGCTGGGTTG ACATAGTCTT AGAACATGGA AGCTGTGTGA CGACGATGGC AAAAAACAAA 120CCAACATTGG ATTTTGAACT GATAAAAACA GAAGCCAAAC AACCTGCCAC TCTAAGGAAG 180TACTGTATAG AGGCAAAGCT GACCAACACA ACAACAGAAT CTCGCTGCCC AACACAAGGA 240GAACCCAGCC TAAATGAAGA GCAGGACAAA AGGTTCGTCT GCAAACACTC CATGGTAGAC 300AGAGGATGGG GAAATGGATG TGGACTATTT GGAAAAGGAG GCATTGTGAC CTGTGCTATG 360TTCACATGCA AAAAGATCAT GAAAGGAAAA GTCGTGCTGC CAGAAAACTT GGAATACACC 420ATTGTGATAA CACCTCACTC AGGGGAAGAG CATGCAGTCG GAAATGATAC AGGAAAACAT 480GGCAAGGAAA TCAAAATAAC ACCACAGAGT TCCATCACAG AAGCAGAGTT GACAGGCTAT 540GGCACTGTCA CGATGGAGTG CTCTCCGAGA ACGGGCCTCG ACTTCAATGA GATGGTGTTG 600CTGCAAATGG AAAATAAAGC TTGGCTGGTG CAAAGGCAAT GGTTCCTAGA CCTGCCGTTG 660CCATGGCTGC CCGGAGCGGA CACACAAGGA TCAAATTGGA TACAGAAAGA GACATTGGTC 720ACTTTCAAAA ATCCCCACGC GAAGAAACGA GATGTTGTTG TTTTGGGATC CCAAGAAGGG 780GCCATGCACA CAGCACTCAC AGGGGCCACA GAAATCCAGA TGTCATCAGG AAACGTACTG 840TTCACAGGAC ATCTCAAGTG CAGGCTGAGG ATGGACAAAC TACAGCTCAA AGGAATGTCA 900TACTCTATGT GCACAGGAAA GTTTAAAGTC GTGAAGGAAA TAGCAGAAAC ACAACATGGA 960ACAATAGTTA TCAGAGTACA ATATGAAGGG GACGGCTCTC CATGTAAGAT CCGTTTTGAG 1020ATAATGGATT TGGAAAAAAG ACATGTTTTA GGTCGCCTGA TTACAGTCAA CCCAATCGTA 1080ACAGGAAAAG ATAGCCCAGT CAACATAGAA GCAGAACCTC CATTCGGAGA CAGCTACATC 1140ATCATAGGAG TAGAGCCGGG ACAATTGAAG CTCAACTGGT TTAAGAAAGG AAGTTCTATC 1200GGCCAAATGT TTGCGACAAC AATGAGGGGA GCGAAGAGAA TGGCCATTTT AGGTGACACA 1260GCTTGGGATT TTGGATCCCT GGGAGGAGTG TTTACATCTA TAGGAAAGGC TCTCCACCAA 1320GTTTTCGGAG CAATCTATGG GGCTGCCTTC AGTGGGGTCT CATGGACTAT GAAAATCCTC 1380ATAGGAGTCA TTATCACATG GATAGGAATG AATTAA1416(2)關(guān)于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“對D2包膜5’-3’SUCII接合點(diǎn)測序所用的序列”(xi)序列描述SEQ ID NO12CCCCATCCTC TGTCTACCAT G2權(quán)利要求
1.重組多核苷酸，其特征在于它們基本上具有包含至少部分黃病毒蛋白E的核苷酸序列，酵母表達(dá)載體克隆的核苷酸序列的部分。
2.重組多核苷酸，其特征在于具有或基本上是鑒定為序列表中Id.No.9的4型登革病毒毒株814669和鑒定為No.5和No.11的2型登革病毒毒株A15的蛋白E的編碼序列的核苷酸序列或至少其部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組多核苷酸，其特征在于它們是載體pDE2-21和pDFE4-47及pDSE2-34。
4.轉(zhuǎn)化的微生物，其特征在于它們具有根據(jù)權(quán)利要求1，2，3所述的重組多核苷酸并分別表達(dá)重組的1，2，3，4型登革病毒的蛋白E。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化的微生物，其特征在于它是帶有表達(dá)載體pDE2-21的巴斯德畢赤酵母菌株MP-36。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化的微生物，其特征在于它是用表達(dá)載體pDE4-47轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化的微生物，其特征在于它是用表達(dá)載體pDSE2-34轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母菌株MP-36。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化的微生物，其特征在于它是表達(dá)2型登革病毒蛋白E的酵母菌株YDE2-21克隆13，14，21和22。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化的微生物，其特征在于它是表達(dá)4型登革熱病素蛋白E的酵母菌株YDFE4-47克隆61，74和75。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化的微生物，其特征在于它是表達(dá)截短形式的2型登革病毒蛋白E的酵母菌株YDSE2-34克隆1，2，3，4。
11.蛋白酶底物，其特征在于它是根據(jù)權(quán)利要求8所述的酵母菌株YDE2-21克隆13，14，21，22的表達(dá)產(chǎn)物。
12.蛋白酶底物，其特征在于它來自根據(jù)權(quán)利要求9所述的酵母菌株YDEF4-47克隆61，74，75的表達(dá)。
13.蛋白酶底物，其特征在于它來自根據(jù)權(quán)利要求10所述的酵母菌株YDSE2-34克隆1，2，3，4的表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的蛋白酶底物，其特征在于它具有或基本上是對應(yīng)于通過重組方式得到的并鑒定為序列表中Id.No.5的2型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的蛋白酶底物，其特征在于它具有或基本上是對應(yīng)于通過重組方式得到的并鑒定為序列表中Id.No.9的4型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的蛋白酶底物，其特征在于它具有或基本上是對應(yīng)于通過重組方式得到的并鑒定為序列表中Id.No.11的2型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的微粒蛋白酶底物，其特征在于它具有或基本上是對應(yīng)于通過重組方法得到的并鑒定為序列表中Id.No.5的2型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的微粒蛋白酶底物，其特征在于它具有或基本上是對應(yīng)于通過重組方式得到的并鑒定為序列表中Id.No.9的4型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的微粒蛋白酶底物，其特征在于它具有或基本上是對應(yīng)于通過重組方式得到的并鑒定為序列表中Id.No.11的2型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
20.含適當(dāng)載體、稀釋劑或佐劑的藥物溶液，其特征在于它含有權(quán)利要求14，15，16，17，18和/或19的一個(gè)或幾個(gè)蛋白酶底物。
21.含適當(dāng)載體或稀釋劑的診斷溶液，其特征在于它含有權(quán)利要求14，15，16，17，18和/或19的一個(gè)或幾個(gè)蛋白酶底物。
22.制備權(quán)利要求14-19的重組蛋白酶底物的方法，其特征在于它具有用權(quán)利要求1的任何重組多核苷酸轉(zhuǎn)化酵母，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物以獲得這樣的蛋白表達(dá)并純化這樣的表達(dá)產(chǎn)物的步驟。
23.分離和表達(dá)編碼完整的或截短的2型登革病毒蛋白的E基因的方法，其特征在于使用鑒定為序列表中Id.No.1的引物從2型登革病毒毒株A15的總RNA分離編碼此蛋白的基因，并且使用鑒定為序列表中Id.No.2和Id.No.3的引物從PCR反應(yīng)擴(kuò)增該基因，然后將其克隆以得到重組DNA，將重組DNA轉(zhuǎn)化入先前所述的宿主中。
24.分離和表達(dá)編碼完整的或截短的4型登革病毒蛋白的E基因及將其用于疫苗制品的方法，使用鑒定為序列表中Id.No.6和Id.No.7的探針通過按照已描述的分離編碼該蛋白的基因的PCR反應(yīng)從毒株814669分離編碼此蛋白的基因，然后將其克隆以得到重組DNA，將重組DNA轉(zhuǎn)化入先前所述的宿主中。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域并涉及重組DNA技術(shù),具體地,涉及在畢赤酵母屬甲基營養(yǎng)酵母中表達(dá)編碼血清型2和4登革病毒包膜蛋白的基因的方法。技術(shù)目的是開發(fā)有效表達(dá)編碼血清型2和4登革病毒包膜蛋白的基因的系統(tǒng)以得到用于人類接種的免疫原。編碼病毒蛋白E的基因序列是血清2型登革病毒的起點(diǎn),來自1981年古巴登革熱和出血登革熱流行期間分離的毒株A15。對于血清4型登革病毒,起點(diǎn)是編碼病毒蛋白E的基因序列,病毒來自1981年多米尼加共和國登革熱流行期間分離的毒株814669。
文檔編號C12N1/21GK1258317SQ97181246
公開日2000年6月28日 申請日期1997年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月25日
發(fā)明者C·A·薩里奧庫貝羅, M·穆恩紀(jì)邁尼茲, M·G·古茲曼提拉多, G·E·古蘭尼托, V·瓦茲奎茲維拉蘇索, R·羅德里古茲狄亞茲, S·瓦茲奎茲拉穆多, R·瓦茲奎茲卡姆波斯, G·J·馬奎茲派里拉, J·加西亞蘇亞里茲, D·E·羅薩里奧多明古茲, A·阿爾瓦里茲阿科斯塔 申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心, 彼德羅擴(kuò)利熱帶醫(yī)學(xué)院