專利名稱：高靈敏性銀染的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及高靈敏性銀染的方法，更具體地，本發(fā)明涉及DNA銀染的改進(jìn)方法，該方法包括將DNA與一種聚合物連接，并且將許多銀離子與DNA-聚合物復(fù)合物結(jié)合的步驟，所述的聚合物與DNA具有高親和性。現(xiàn)有技術(shù)描述通常銀染是通過利用化學(xué)或光將與感興趣靶材料連接的銀離子選擇性還原(見Beidler,J.L.等，分析生物化學(xué)，126:374(1982)；Goldman,D.和Merril,C.R.,電泳，3:24(1982))并檢測由此產(chǎn)生的銀顆粒的光散射色(見Merril,C.R.,美國科學(xué)院院刊，85:453(1988))。
目前使用的銀染方法大致可分為以下幾種堿法，其是將硝酸銀的二胺復(fù)合物置于含甲醛的弱酸溶液中以還原在強(qiáng)堿條件下形成的該復(fù)合物；酸法，其是在甲醛溶液中還原硝酸銀(見Bassam,B.J.等，應(yīng)用生物化學(xué)及生物工程，42:181(1993))。
盡管銀染技術(shù)最初是開發(fā)用來檢測丙烯酰胺凝膠電泳的痕量蛋白(見Switzer,R.C.等，分析生物化學(xué)，98:231(1979))，經(jīng)持續(xù)的改進(jìn)，該方法已廣泛用于檢測脂多糖(見Tsai,C.和Frash,C.E.,分析生物化學(xué)，119:115(1982))和核酸(見Somerville,L.L.和Wang.K.,生物化學(xué)和生物物理研究通迅，102:54(1981))及蛋白質(zhì)。
直至目前已開發(fā)了如下幾種用于檢測DNA的銀染方法二胺復(fù)合物銀染法(見Wary,W.等，分析生物化學(xué)，118:197(1981))；酸性銀染法(見Heukeshoven,J.和Dernick,R.,電泳，6:103(1985)；Gottlieb.M.和Chavco,K.,分析生物化學(xué)98:231(1979))；銅-銀法(見Switzer,R.C.等，分析生物化學(xué)，98:231(1979))，等等。然而已證明這些銀染方法仍是令人不滿意的，因為它們不能檢測納克級的DNA，并且精度和重復(fù)性不可靠。
因此，強(qiáng)烈需要開發(fā)一種高靈敏的檢測DNA的改進(jìn)方法。發(fā)明概述本發(fā)明人基于Bassam等的DNA銀染方法(見Bassam B.J.等，分析生物化學(xué)，196:80(1991))，開發(fā)了一種改進(jìn)的銀染方法，與傳統(tǒng)的將銀離子與DNA分子直接連接的銀染方法相比，本發(fā)明方法能以更高的靈敏性和重復(fù)性檢測DNA。
因此本發(fā)明的一個主要目的是提供一種改進(jìn)的高靈敏的DNA分子銀染方法。附圖的簡要說明本發(fā)明的上述及其它目的和特征通過參照附圖的下列描述將更加清楚。


圖1(A)是一張硝酸纖維素膜的照片，其中銀染是通過傳統(tǒng)的Bassam等的方法進(jìn)行。
圖1(B)是一張硝酸纖維素膜的照片，其中銀染是通過本發(fā)明方法進(jìn)行。
圖2(A)是一張硝酸纖維素膜的照片，其中銀染是通過Bassam等的方法進(jìn)行。
圖2(B)、2(C)、2(D)和2(E)是硝酸纖維素膜的照片，其中銀染是根據(jù)本發(fā)明用0.05％(v/v),0.1％(v/v),0.2％(v/v)和0.4％(v/v)聚丙烯酸處理而進(jìn)行。
圖3(A)是顯示用于核苷酸測序的丙烯酰胺凝膠電泳的照片，其中銀染是通過Bassam等的方法進(jìn)行。
圖3(B)是顯示用于核苷酸測序的丙烯酰胺凝膠電泳的照片，其中銀染是根據(jù)本發(fā)明用0.2％(v/v)聚丙烯酸處理而進(jìn)行。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明人改善了Bassam等的用于DNA檢測的銀染方法(見Bassam,B.J.等，分析生物化學(xué)196:80(1991))的靈敏性，該銀染方法已知是一種簡便的高靈敏的方法，改進(jìn)是將含DNA的凝膠浸入含一種聚合物的水溶液中，并使銀離子與DNA-聚合物復(fù)合物結(jié)合。據(jù)此將對于DNA分子具有高親和性的聚合物，優(yōu)選聚丙烯酸或聚乙烯亞胺，與DNA連接以誘導(dǎo)銀離子顯色。水溶液(例如水)中聚合物的濃度可根據(jù)聚合物的種類而變化，但若采用聚丙烯酸，濃度范圍為0.2％(v/v)-0.4％(v/v)。
根據(jù)本發(fā)明的銀染方法，當(dāng)將DNA以5mm直徑的圓形點到硝酸纖維素膜上時，甚至是納克級的DNA也可以較高的重復(fù)性被檢測出，而相比之下，Bassam等的方法檢測的是微克級的DNA。
本發(fā)明的銀染方法可以用于核苷酸測序和檢測痕量DNA分子。
本發(fā)明經(jīng)下述實施例進(jìn)一步描述，這些實施例不是限制本發(fā)明范圍。實施例1聚丙烯酸對銀染靈敏性的影響為研究聚丙烯酸對DNA銀染靈敏性的影響，將稀釋至一定濃度的λDNA以5mm直徑的圓形點到硝酸纖維素膜上。將膜置于溫度保持在65℃的干燥箱中12小時后，令其吸收0.2％(v/v)聚丙烯酸溶液10分鐘。然后根據(jù)Bassam等的方法(見Bassam等，分析生物化學(xué)，196:80(1991))進(jìn)行銀染通過用聚丙烯酸處理硝酸纖維素膜并令其在含1g/L硝酸銀溶液和1.5ml/L甲醛的水溶液中吸收20分鐘而使銀離子與聚丙烯酸結(jié)合。用蒸餾水潤洗上述硝酸纖維素膜5秒鐘以除去未結(jié)合的銀離子并置于含30g/L碳酸鈉、3ml/L甲醛和2mg/L硫代硫酸鈉的顯色溶液中。然后當(dāng)顯色充分后加入7.5％乙酸終止反應(yīng)。另外使用根據(jù)Bassam等的方法用硝酸銀染色的DNA樣品作為對照。
圖1(A)示出了經(jīng)Bassam等的方法用硝酸銀染色的硝酸纖維素膜，該方法是目前為止所報道的最好的銀染方法。圖1(B)示出了用本發(fā)明方法經(jīng)聚丙烯酸處理的硝酸纖維素膜。在圖1(A)和圖1(B)中，泳道1-9分別含1μg、500ng、250ng、125ng、60ng、40ng、2ng、1ng和100pgλDNA。如圖1(A)和圖1(B)所示，與能檢測1μg DNA的傳統(tǒng)Bassam等的方法相比，采用聚丙烯酸的本發(fā)明的方法具有更高的靈敏性，能檢測1ng DNA。這些結(jié)果表明新開發(fā)的銀染方法改進(jìn)了DNA檢測的靈敏性。實施例2聚丙烯酸濃度對銀染靈敏性的影響為研究最佳聚丙烯酸濃度，以與實施例1類似的方式分別用0.05％(v/v),0.1％(v/v),0.2％(v/v),0.4％(v/v)聚丙烯酸進(jìn)行銀染(見圖2(A)-2(E))。圖2(A)顯示用Bassam等的方法進(jìn)行銀染的硝酸纖維素膜，圖2(B)-2(E)示出分別用0.05％(v/v),0.1％(v/v),0.2％(v/v)和0.4％(v/v)聚丙烯酸處理而進(jìn)行銀染的硝酸纖維素膜。在圖2(A)-2(E)中，泳道1-9分別含1μg、500ng、250ng、125ng、60ng、40ng、12ng、1ng和100pgλDNA。
如圖2(B)-2(E)所示，隨著聚丙烯酸濃度的增加，靈敏性也增加，但是當(dāng)濃度超過0.4％(v/v)時背景信號也增加。因此，確定了銀染的最佳聚丙烯酸濃度是約0.2％(v/v)。實施例3 DNA測序凝膠的銀染為了研究聚丙烯酸對DNA測序聚丙烯酰胺凝膠的銀染的靈敏性的影響，分別用200ng、100ng、40ng、20ng和10ng模板DNA進(jìn)行DNA測序反應(yīng)，在6％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離并用硝酸銀染色。
如下所述用TopTMDNA測序試劑盒(Bioneer公司，韓國)進(jìn)行DNA測序反應(yīng)。首先將模板DNA(497bp PCR產(chǎn)物)與30pmole引物(5’-GTTTTGGCTTCCAGTTCCACC-3’)混合，用蒸餾水調(diào)至終體積為40μl。然后將10μl一份的樣品加到4個獨立的反應(yīng)管中，每個反應(yīng)管含TopTMDNA聚合酶、50mM Tris-HCl緩沖液(含2mMMgCl2,pH8.3),和G(20μM ddGTP/6μM dNTP),A(170μM ddATP/6μM dNTP),T(300μM ddTTP/6μM dNTP)和C(200μM ddCTP/6μM dNTP)，如下進(jìn)行40輪PCR循環(huán)94℃5分鐘(預(yù)變性)，94℃30秒(變性)，55℃30秒(退火)和72℃1分鐘(延伸)。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時，向每個反應(yīng)管中加入4μl終止溶液，其含有98％甲酰胺，10mM EDTA,0.025％二甲苯青和0.025％溴酚藍(lán)。95℃加熱5分鐘后，在6％聚丙烯酰胺凝膠上分析每一反應(yīng)。
圖3(A)和3(B)示出了用Bassam等的方法和用0.2％(v/v)聚丙烯酸處理后本發(fā)明方法對DNA測序聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染的結(jié)果。在圖3(A)和3(B)中，泳道1-5分別含有200ng、100ng、40ng、20ng和10ng的模板DNA。
如圖3(A)和3(B)所示，與能檢測100ng級DNA的傳統(tǒng)Bassam等的方法相反，本發(fā)明的伴有聚丙烯酸處理的方法甚至在采用10ng模板DNA時亦能檢測到DNA。因此，可以清楚地確定本發(fā)明的銀染方法也能高靈敏性和高重復(fù)性地用于DNA測序。
如以上所清楚表明的，本發(fā)明提供了具有高靈敏性的用于DNA分子的高靈敏性銀染的改進(jìn)的方法，其甚至能檢測納克級的DNA分子。因此，本發(fā)明的銀染方法可以用于檢測和測序痕量DNA。序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱百奧聶爾公司等(B)街道124,Cheokbuk-Ri,Namee-Myun(C)城市Cheongwon-Kun,Choongcheongbuk-Do(D)州(E)國家韓國(F)郵編363-810(G)電話0431-60-6060(H)傳真0431-60-2009(ⅱ)發(fā)明名稱高靈敏性銀染的方法(ⅲ)序列數(shù)1(ⅳ)計算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release＃1.0,Version＃1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA-mRNA(ⅶ)直接來源(B)克隆PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1GTTTTGGCTT CCAGTTCCAC C
權(quán)利要求
1.一種高靈敏性銀染的方法，包括如下步驟通過將含DNA的凝膠浸入含一種聚合物的水溶液中而將DNA與該聚合物連接以形成DNA-聚合物復(fù)合物，所述的聚合物與DNA具有高親和性；以及，將銀離子與DNA-聚合物復(fù)合物結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的高靈敏性銀染方法，其中聚合物是聚丙烯酸或聚乙烯亞胺。
3.權(quán)利要求1的高靈敏性銀染方法，其中水溶液中采用的溶劑是水。
4.權(quán)利要求1的高靈敏性銀染方法，其中聚合物在水溶液中的濃度范圍是0.2％(v/v)-0.4％(v/v)。
5.權(quán)利要求1的高靈敏性銀染方法，其中含DNA的凝膠是DNA測序凝膠。
6.權(quán)利要求1的高靈敏性銀染方法，其中含DNA的凝膠是用于DNA檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的DNA銀染方法,該方法包括將DNA與一種聚合物連接,并將許多銀離子與DNA－聚合物復(fù)合物結(jié)合的步驟,所述的聚合物與DNA具有高親和性。本發(fā)明的銀染方法能用于檢測和測序痕量DNA。
文檔編號C12Q1/68GK1208441SQ97191718
公開日1999年2月17日 申請日期1997年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月31日
發(fā)明者樸翰浯, 金載鐘, 俞在亨 申請人:百奧聶爾公司