專(zhuān)利名稱(chēng)：：改進(jìn)的芽孢桿菌rna酶抑制劑基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因和改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)能夠用于中和真核細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞中芽孢桿菌RNA酶的活性。因此可以將改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因用于生產(chǎn)可育的恢復(fù)系植物，所述植物能夠使雄性不育系植物恢復(fù)繁殖力，所述雄性不育植物在其細(xì)胞的核基因組中含有包括雄蕊選擇性啟動(dòng)子和編碼芽孢桿菌RNA酶的DNA的嵌合基因。本發(fā)明還涉及在其細(xì)胞的核基因組中含有改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的恢復(fù)系植物。
背景技術(shù)：
：在許多植物中，如果不是大多數(shù)植物，開(kāi)發(fā)雜種栽培品種是非常令人滿(mǎn)意的，因?yàn)橥ǔＳ捎陔s種優(yōu)勢(shì)，雜種栽培品種的生產(chǎn)能力增強(qiáng)與其親本相比雜種個(gè)體具有優(yōu)勢(shì)性能(參見(jiàn)例如Fehr,1987，栽培品種研制的原理，第一卷理論和技術(shù)，MacMillan出版公司，紐約；Allard,1960，植物育種原理，JohnWileyandSons,Inc.)。各個(gè)植物種類(lèi)的雜種栽培品種的研制取決于親本之間獲得幾乎完全的交叉授粉的能力。達(dá)到這一目的最簡(jiǎn)單的方法是通過(guò)去除花藥以手工的方式，或通過(guò)利用在一個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)或核基因中阻止花藥和/或花粉發(fā)育(植物雄性不育的綜述，參見(jiàn)例如Kaul,1988，‘高等植物的雄性不育’，SpringerVerlag)而從遺傳上使親本品系之一雄性不育(即使它們處于沒(méi)有花粉或花粉沒(méi)有功能的狀態(tài)下)。對(duì)于其種子是收獲的產(chǎn)品(例如玉米，油菜)的雜種植物，大多數(shù)情況下，確保完全恢復(fù)雜種植物的繁殖力也是必要的。在雄性不育處于遺傳控制下的系統(tǒng)，需要存在和應(yīng)用能夠恢復(fù)雄性不育的基因。雜種栽培品種的研制主要取決于是否可獲得合適的和有效的不育和恢復(fù)基因。對(duì)于大多數(shù)可能含有影響雄性不育的基因型的植物品系，內(nèi)源性核基因座是已知的，并且通常，對(duì)于特定的隱性等位基因這樣的基因座必須是純合的，以便產(chǎn)生雄性不育表現(xiàn)型。在這樣的基因座顯性“雄性能育”等位基因的存在導(dǎo)致產(chǎn)生雄性可育。近來(lái)，已經(jīng)證明通過(guò)給植物基因組提供包括編碼例如細(xì)胞毒性產(chǎn)物(例如RNA酶)的DNA序列(或雄性不育DNA)并且處于啟動(dòng)子控制下的嵌合雄性不育基因能夠在植物中誘導(dǎo)雄性不育，其中啟動(dòng)子在選定的雄性可再生器官的細(xì)胞中具有優(yōu)勢(shì)的活性。關(guān)于這一點(diǎn)，已經(jīng)證明雄蕊選擇性啟動(dòng)子，例如煙草的TA29基因的啟動(dòng)子特別適用于此目的(Mariani等人，1990，自然學(xué)347:737，歐洲專(zhuān)利公開(kāi)(EP0,344,029)。通過(guò)給植物的核基因組提供這樣的雄性不育基因，制備了人工的雄性不育基因座，它含有導(dǎo)致產(chǎn)生雄性不育植物的人工的雄性不育基因型。另外，已經(jīng)證明用包括另一個(gè)DNA序列的嵌合的能育性-恢復(fù)基因(或能育性-恢復(fù)DNA)能夠恢復(fù)雄性可育，所述能育性-恢復(fù)基因編碼例如在植物細(xì)胞中抑制細(xì)胞毒性產(chǎn)物的活性的蛋白質(zhì)或阻止細(xì)胞毒性產(chǎn)物的活化的蛋白質(zhì)(歐洲專(zhuān)利公開(kāi)(EP0,412,911)。例如解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶基因編碼RNA酶，芽孢桿菌RNA酶，該酶受蛋白質(zhì)，芽孢桿菌RNA酶抑制劑的抑制，它是由解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因編碼的。芽孢桿菌RNA酶基因可用于構(gòu)建一個(gè)不育的基因，而芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因可用于構(gòu)建可育-恢復(fù)基因。在不同的植物品系，例如油菜中進(jìn)行的試驗(yàn)已經(jīng)證明嵌合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因完全能夠恢復(fù)雄性不育系的雄性繁殖力，其中雄性不育系的雄性不育是由于存在嵌合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因(EP0,412,911,Mariani等人，1991,CCIRC油菜會(huì)議的會(huì)議錄，1991年，7月9-11日，Saskatoon,Saskatchewan，加拿大；Mariani等人，1992，自然學(xué)357:384)。通過(guò)偶合一個(gè)標(biāo)記基因，例如顯性的除草劑抗性基因(例如編碼膦蘇菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的bar基因，所述PAT將除草劑膦蘇菌素轉(zhuǎn)化為非毒性的化合物[DeBlock等人，1987，EMBOJ.6:2513])，利用嵌合的雄性不育和/或可育-恢復(fù)基因，可以給育種系統(tǒng)提供選擇雄性不育植物的均一的群體的方法(EP0,344,029；EP0,412,911)。任何植物種類(lèi)的特定的栽培品種的雜種種子的生產(chǎn)要求1)保持少量的各個(gè)自交系親本的純種子，和2)制備大量的各個(gè)自交系親本的種子。通常通過(guò)幾個(gè)(通常是兩個(gè))種子繁殖循環(huán)，從少量的純種子(“基本種子”)開(kāi)始，并且在各個(gè)繁殖循環(huán)中產(chǎn)生大量的自交系親本的純種子，最后產(chǎn)生自交系親本的母本種子(“親本種子”或“基本種子”)，能夠獲得這樣大量的種子，所述母本種子的量足以在種植以后產(chǎn)生所需量的雜種種子。當(dāng)然，在各個(gè)種子繁殖循環(huán)中需要較大的種植面積(大田)。芽孢桿菌RNA酶是一種由解淀粉芽孢桿菌分泌的核糖核酸酶，芽孢桿菌RNA酶抑制劑是由該相同的微生物產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶的抑制劑(Hartley,1988，分子生物學(xué)雜志202:913-915)。已經(jīng)有人描述了幾種突變的芽孢桿菌RNA酶和芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)(Hartley,1993，生物化學(xué)32:5978-5984；SchreiberandFersht,1993，生物化學(xué)32:5145-5150；Guillet等人，1993，現(xiàn)代生物學(xué)1:165-177；Hartley,1989,TIBS14:450-454；Axe等人，1996,PNAS93:5590-5594；Serrano,1993，分子生物學(xué)雜志233:305-312)。已證明其中某些突變體基本上保留了由解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶和芽孢桿菌RNA酶抑制劑的生物學(xué)活性。但是，至少已經(jīng)描述了兩種突變的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，它們沒(méi)有可檢測(cè)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑活性(Hartley,1993，生物化學(xué)32:5978-5984；Guillet等人，1993，現(xiàn)代生物學(xué)1:165-177)。還已知其他相關(guān)的微生物能夠產(chǎn)生與芽孢桿菌RNA酶抑制劑和芽孢桿菌RNA酶高度類(lèi)似的蛋白質(zhì)。因此，Bacillustntermedius產(chǎn)生binase和binstar(Schulga等人，1992,NAR20:2375；Guillet等人，1993，見(jiàn)上文)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，它編碼具有以Met-Xaa開(kāi)頭的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，其中Xaa是丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。優(yōu)選的是芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼具有下列氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，所述氨基酸序列是1)SEQIDNo2的氨基酸序列，其中第二個(gè)氨基酸不是賴(lài)氨酸，而是丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸；2)SEQIDNo4的氨基酸序列；或SEQIDNo4的氨基酸序列，其中第二個(gè)氨基酸不是丙氨酸，而是纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。本發(fā)明還提供了改進(jìn)的合成芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，它含有低于40％的A和T核苷酸和/或具有對(duì)油菜籽，棉花，玉米，水稻和小麥，優(yōu)選的是油菜籽，玉米，水稻最佳的慣用密碼子。優(yōu)選的是合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA含有不高于7％CG雙核苷酸和/或不高于9.5％的CNG三核苷酸。優(yōu)選的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼具有SEQIDNo4的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。特別優(yōu)選的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有SEQIDNo3的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了嵌合基因，其中改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA可操作連接到植物可表達(dá)啟動(dòng)子上，優(yōu)選的是選擇性地在雄蕊細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)和至少在氈絨層細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子；含有這些嵌合基因的植物細(xì)胞和植物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA和改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)在中和植物細(xì)胞中芽孢桿菌RNA酶中的應(yīng)用，特別是關(guān)于雄性可育恢復(fù)為雄性不育系的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了具有以Met-Xaa開(kāi)頭的氨基酸序列的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，其中Xaa是丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。發(fā)明詳述本文使用的雄性不育(“ms”)植物是給定的植物種類(lèi)的植物，它是由于一種整合到所述植物的核DNA的嵌合的雄性不育基因(S)的表達(dá)而導(dǎo)致的雄性不育植物，其中所述的嵌合基因包括下列可操作連接的DNA片段1)“不育性啟動(dòng)子”，它選擇性地在雄蕊細(xì)胞，優(yōu)選的是至少在氈絨層細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)，和2)“雄性不育DNA”，它編碼芽孢桿菌RNA酶(“芽孢桿菌RNA酶DNA”)。所述雄性不育基因的一個(gè)例子是包括處于來(lái)自于煙草的TA29基因的啟動(dòng)子，例如包含于質(zhì)粒pVE108(WO92/29696)中的啟動(dòng)子的控制下的芽孢桿菌RNA酶DNA的基因。本文描述的恢復(fù)系植物是相同植物種類(lèi)的雄性可育植物，它含有整合到其細(xì)胞的核DNA中的一個(gè)可育的恢復(fù)基因(R)，包括1)“恢復(fù)啟動(dòng)子”，它指導(dǎo)至少那些雄蕊細(xì)胞中的表達(dá)，其中不育性啟動(dòng)子指導(dǎo)ms植物的芽孢桿菌RNA酶DNA的表達(dá)，和，2)編碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑的“恢復(fù)DNA”(“芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”)。對(duì)于本發(fā)明的恢復(fù)系植物，芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA是改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，如下文所述。在含有雄性不育基因的雄性不育植物的那些子代植物中存在的可育性的恢復(fù)基因使那些子代植物恢復(fù)雄性繁殖力。當(dāng)然子代植物是從雄性不育植物和恢復(fù)系植物之間的雜交獲得的。本文使用的恢復(fù)系植物是指雄性可育的并且其基因組內(nèi)含有雄性不育基因和可育性-恢復(fù)基因，特別是包括本發(fā)明的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的可育性恢復(fù)基因的植物(其與雄性不育植物和恢復(fù)系植物是相同的植物種類(lèi))。品系是指給定的單個(gè)植物的子代。給定的品系的植物其一個(gè)或多個(gè)特定的遺傳和/或表現(xiàn)型特性是互相類(lèi)似的。如本文所述，雄性不育(ms)系是一組屬于一個(gè)植物種類(lèi)，特別是一個(gè)植物品種的植物，由于在相同的遺傳基因座存在特定的雄性不育基因，它們都是雄性不育的。類(lèi)似地，恢復(fù)系是指一組在相同的遺傳基因座都含有特定的可育性恢復(fù)基因的植物種類(lèi)的植物。優(yōu)選的是所有的ms品系的植物(各自的恢復(fù)系)就雄性不育基因座(各自的可育性恢復(fù)基因座)而言具有相同的基因型。通過(guò)在ms品系導(dǎo)入可育性恢復(fù)基因，例如通過(guò)將ms品系的植物與恢復(fù)系植物雜交以便至少某些子代植物是恢復(fù)的植物，可以使雄性不育系恢復(fù)為雄性可育。一個(gè)品種的品系的遺傳背景命名為存在于該品種中的基因的總數(shù)，所述基因總數(shù)決定該品種的特定的表現(xiàn)型特性。因此，可以將通過(guò)遺傳工程手段導(dǎo)入而產(chǎn)生一個(gè)品種的特定的品系的外源基因例如雄性不育基因或恢復(fù)基因?qū)氲讲煌钠贩N(或甚至不同的種類(lèi))中，各個(gè)品種具有不同的遺傳背景。為了生產(chǎn)雜種種子，也將雄性不育系稱(chēng)作為雌性或第一親系，還將雄性可育(恢復(fù))系稱(chēng)作為雄性或第二親系。本文所述的基因通常被理解為包括至少一個(gè)編碼RNA，蛋白質(zhì)或多肽的編碼區(qū)，該編碼區(qū)可操作連接到合適的啟動(dòng)子和3’調(diào)控序列上。為了本發(fā)明的目的，基因的表述例如嵌合基因的表達(dá)是指基因的啟動(dòng)子指導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)錄為具有生物學(xué)活性的RNA，即所述RNA能夠與另一個(gè)RNA或蛋白質(zhì)互相作用，或能夠被轉(zhuǎn)譯為生物學(xué)活性的多肽或蛋白質(zhì)。表現(xiàn)型是基因型即一個(gè)基因或一組基因的表達(dá)(或表達(dá)不足)的外部形態(tài)(例如雄性不育，在特定的植物組織存在蛋白質(zhì)或RNA等等)。本文使用的芽孢桿菌RNA酶是能夠降解單鏈RNA的任何蛋白質(zhì)，并且它包括由解淀粉芽孢桿菌分泌的芽孢桿菌RNA酶(分泌的芽孢桿菌RNA酶)的氨基酸序列(Hartley,1988，分子生物學(xué)雜志202:913)或包括與該序列至少具有80％，優(yōu)選的是至少85％的序列等同性的氨基酸序列。本文使用的芽孢桿菌RNA酶能夠通過(guò)一個(gè)反應(yīng)降解RNA，所述反應(yīng)涉及將一個(gè)核苷酸的5’核糖和結(jié)合到鄰近的3’核苷酸上的磷酸基團(tuán)之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行初始的裂解。該反應(yīng)的初始產(chǎn)物是2’,3’-環(huán)狀的磷酸中間體，隨后該中間體被水解為相應(yīng)的3’核苷磷酸。芽孢桿菌RNA酶也能夠?qū)⒕垡蚁┐枷佘樟姿嵋援a(chǎn)生高熒光團(tuán)的核苷酸類(lèi)似物1,N-乙烯醇腺苷(Fitzgerald和Hartley,1993，生化分析214:544-547)并且按照標(biāo)準(zhǔn)條件的測(cè)定，具有10％，優(yōu)選的是至少50％，特別是至少75％的分泌的芽孢桿菌RNA酶的活性(Fitzgerald和Hartley,1993，生化分析214:544-547；Hartley,1993，生物化學(xué)32:5978-5984)。芽孢桿菌RNA酶進(jìn)一步能夠特異性地結(jié)合到野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑(參見(jiàn)下文)，其離解常數(shù)為10-12M或更低，優(yōu)選的是離解常數(shù)為10-13M-10-14M的范圍內(nèi)(Schreiber和Fersht,1993，生物化學(xué)32:5145-5150；Hartley,1993，生物化學(xué)32:5978-5984)。Binase是由Bacillusintermedius分泌的胞外核糖核酸酶(Schulga等人，1992,NAR20:2375)并且還被認(rèn)為是用于本發(fā)明的芽孢桿菌RNA酶。為了方便起見(jiàn)，用于說(shuō)明書(shū)或下文的實(shí)施例中的芽孢桿菌RNA酶命名為具有由pVE108編碼的芽孢桿菌RNA酶的氨基酸序列(WO92/09696)。芽孢桿菌RNA酶抑制劑是能夠與分泌的芽孢桿菌RNA酶特異性結(jié)合的任何蛋白質(zhì)，其解離常數(shù)為10-12M或更低，優(yōu)選的是離解常數(shù)為10-13M-10-14M的范圍內(nèi)(Schreiber和Fersht,1993，生物化學(xué)32:5145-5150；Hartley,1993，生物化學(xué)32:5978-5984)。在標(biāo)準(zhǔn)條件以及等摩爾量的芽孢桿菌RNA酶抑制劑和分泌的芽孢桿菌RNA酶的混合物時(shí)，芽孢桿菌RNA酶抑制劑能夠抑制至少50％，特別是至少75％，更特別是至少90％的分泌的芽孢桿菌RNA酶的活性(Hartley,1993，生物化學(xué)32:5978-5984)。芽孢桿菌RNA酶抑制劑是包括SEQIDNo2的氨基酸序列或與具有該序列至少80％，優(yōu)選的是至少85％的序列等同性。野生型的芽孢桿菌RNA酶抑制劑是由解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑并且具有SEQIDNo2的氨基酸序列(也參見(jiàn)Hartley,1988，分子生物學(xué)雜志202:913)。不用置疑本文使用的芽孢桿菌RNA酶抑制劑包括例如由Hartley描述的生物學(xué)活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑突變體(1993，生物化學(xué)32:5978-5984)。本文使用的芽孢桿菌RNA酶DNA(或芽孢桿菌RNA酶編碼序列)是具有編碼芽孢桿菌RNA酶的核苷酸序列的任何DNA片段。特別優(yōu)選的芽孢桿菌RNA酶DNA是存在于pVE108的芽孢桿菌RNA酶DNA(WO92/09696)。芽孢桿菌RNA酶基因是植物可表達(dá)的嵌合基因，它包括可操作連接到合適的5’和3’調(diào)節(jié)區(qū)和包括植物聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’區(qū)域的芽孢桿菌RNA酶DNA，所述調(diào)節(jié)區(qū)即包括由植物細(xì)胞的聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子區(qū)域。本文使用的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(或芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列)是具有編碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑的核苷酸序列的任何DNA片段。野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA是編碼野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑的DNA，它具有SEQIDNo1的核苷酸序列(Hartley,1988，分子生物學(xué)雜志202:913)。芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因是植物可表達(dá)的嵌合基因，它包括可操作連接到合適的5’和3’調(diào)節(jié)區(qū)和包括植物聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’區(qū)域的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，所述調(diào)節(jié)區(qū)即包括由植物細(xì)胞的聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子區(qū)域。如本文使用的，遺傳基因座是在植物的核基因組，即在特定的染色體中的給定的基因的位置。兩個(gè)基因座可以是在不同的染色體上，并且將獨(dú)立分離。兩個(gè)基因座可以位于相同的染色體上，那么通常被認(rèn)為聯(lián)鎖(除非它們之間兩個(gè)出現(xiàn)足夠的重組)。內(nèi)源性基因座是天然存在于植物中的基因座。外源性基因座是由于借助于遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入外源DNA而在植物中形成的基因座。在二倍體植物中，如在任何其它二倍體生物體中，兩個(gè)拷貝的基因存在于任何常染色體的基因座。任何基因可以以幾個(gè)變異狀態(tài)存在于核基因組稱(chēng)作為等位基因。如果兩個(gè)相同的等位基因存在于一個(gè)基因座，該基因座被稱(chēng)作為純合子，如果存在不同的等位基因，該基因座稱(chēng)作為雜合子。一個(gè)基因座，或一套基因座的等位基因的組成是基因型。通常在一個(gè)基因座的任何等位基因以獨(dú)立的標(biāo)記表示(例如R和-,S和-,-代表沒(méi)有基因)。通常外源基因座的特征在于存在和/或沒(méi)有外源DNA。通常顯性等位基因的特征為以大寫(xiě)字母表示，通常與生物學(xué)活性基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))和可觀察到的表現(xiàn)型效果(例如R表示活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的產(chǎn)生)的存在相關(guān)。通過(guò)鑒別至少一個(gè)遺傳基因座的等位基因狀態(tài)能夠?qū)χ参锏倪z傳狀態(tài)進(jìn)行定性。由存在于該基因座的兩個(gè)等位基因的標(biāo)記(例如R/R或S/-)命名任何給定的基因座的基因型。兩個(gè)不連接的基因座的基因型能夠表示為各個(gè)基因座的基因型的序列(例如S/-,R/-)本文使用的術(shù)語(yǔ)雄性不育植物包含外源的“雄性不育基因座”，它含有雄性不育基因S，當(dāng)該基因在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，使植物雄性不育，基本上不影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。優(yōu)選的是雄性不育基因座在相同的遺傳基因座還包括至少一個(gè)第一標(biāo)記基因，所述基因至少包括1)編碼第一標(biāo)記RNA，蛋白質(zhì)或多肽的第一標(biāo)記DNA，當(dāng)至少存在于植物的特定的組織或特定的細(xì)胞中時(shí)，使植物易于與其它植物分離，所述其它植物至少在特定的組織或特定的細(xì)胞中不含有由第一標(biāo)記DNA編碼的第一標(biāo)記RNA，蛋白質(zhì)或多肽，和2)能夠指導(dǎo)第一標(biāo)記DNA至少在特定的組織或特定的細(xì)胞中表達(dá)的第一標(biāo)記啟動(dòng)子；第一標(biāo)記DNA是相同于第一標(biāo)記啟動(dòng)子和受其控制的轉(zhuǎn)錄單位。所述雄性不育基因在這樣的外源雄性不育基因座總是顯性等位基因。隱性等位基因?qū)?yīng)于在植物的核基因組中沒(méi)有存在雄性不育基因。以前已經(jīng)描述了在本發(fā)明的第一親代品系的雄性不育基因中可以使用的不育啟動(dòng)子(EP0,344,029和EP0,412,911)。不育啟動(dòng)子可以是任何啟動(dòng)子，但是它至少應(yīng)該在雄蕊細(xì)胞中是有活性的，特別是在氈絨層細(xì)胞中。特別有用的不育啟動(dòng)子是在雄蕊細(xì)胞中有選擇性活性的，例如煙草的TA29基因的特異于氈絨層的啟動(dòng)子(EP0,344,029)，該啟動(dòng)子可以用于煙草，油菜，萵苣，菊苣，棉花，水稻，小麥和其它植物種類(lèi)；來(lái)自于水稻的PT72,PT42和PE1啟動(dòng)子，它可以用于水稻，玉米，小麥和其它植物種類(lèi)(WO92/13956)；來(lái)自于玉米的PCA55啟動(dòng)子，它可以用于玉米，水稻，小麥和其它植物種類(lèi)(WO92/13957)；和鼠耳芥的特異于氈絨層的基因的A9啟動(dòng)子(Wyatt等人，1992，植物分子生物學(xué)，19:611-922)。本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)“恢復(fù)系能力”(恢復(fù)系有效地使各種各樣的ms品系恢復(fù)雄性可育的能力和效力)與在恢復(fù)系植物的雄蕊中，特別是在氈絨層細(xì)胞中產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量直接相關(guān)(并且由于包含于被恢復(fù)的植物的雄蕊，特別是氈絨層細(xì)胞)?；謴?fù)系的能力是重要的，因?yàn)橛行У幕謴?fù)系能夠用于使各種各樣的雄性不育系恢復(fù)雄性可育，其含量不同于在雄蕊中，特別是在氈絨層細(xì)胞中產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶的量(由于雄性不育基因的表達(dá))。在不同的ms品系中產(chǎn)生各種各樣的芽孢桿菌RNA酶的一個(gè)來(lái)源是由于位置的影響，即由于在不同的轉(zhuǎn)化體的核基因組中不同的插入位置ms基因的表達(dá)的變異。在不同的ms品系(在相同的遺傳基因座含有ms基因)中產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶的變異的另一個(gè)來(lái)源是不同的ms品系的不同的遺傳背景。因此，當(dāng)通過(guò)回交將來(lái)自于植物種類(lèi)的一個(gè)品種的一個(gè)雄性不育品系的ms基因?qū)氲较嗤?或密切相關(guān))的植物種類(lèi)的其它品種，以產(chǎn)生那些品種的ms品系時(shí)，ms基因被導(dǎo)入到不同的遺傳背景，這會(huì)影響表達(dá)ms基因的水平。當(dāng)考慮不同的恢復(fù)系植物中的恢復(fù)基因的表達(dá)的變異時(shí)-(所述變異可起源于如上文指出的相同來(lái)源，即在不同的恢復(fù)系品系中的可育性恢復(fù)系基因的位置影響和/或不同的恢復(fù)系品系的不同的遺傳背景)，進(jìn)一步增加了所觀察到的芽孢桿菌RNA酶產(chǎn)生的變異，和與此相關(guān)的可育性的恢復(fù)的問(wèn)題。因此，為了獲得具有良好的恢復(fù)系能力的恢復(fù)系品系，具有植物可表達(dá)嵌合芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因是令人滿(mǎn)意的，所述基因以高水平表達(dá)，以在植物的雄蕊細(xì)胞，特別是在花藥細(xì)胞，尤其是在氈絨層細(xì)胞中產(chǎn)生大量的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。因此本發(fā)明提供了改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，在其它各點(diǎn)都相同的情況下，該DNA更有效地在植物細(xì)胞中表達(dá)-從而在那些細(xì)胞中它比野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA產(chǎn)生更高水平的活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)，特別是改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)。因此，在至少一個(gè)植物種類(lèi)的植物中(和優(yōu)選的是在幾個(gè)植物種類(lèi)，特別是幾個(gè)單子葉植物種類(lèi)的植物中)以平均高于用類(lèi)似的包括野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復(fù)系基因觀察到的水平表達(dá)改進(jìn)的可育性恢復(fù)系基因。平均的較高水平的表達(dá)是指在不同的遺傳基因座和/或在不同的遺傳背景含有本發(fā)明的可育恢復(fù)基因的不同的恢復(fù)系品系的特定的器官(例如花藥)中產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量顯著地高于在不同的遺傳基因座和不同的遺傳背景含有包括野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的類(lèi)似的可育性恢復(fù)系基因不同的恢復(fù)系品系的雄蕊中產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量。通常本發(fā)明提供“改進(jìn)的”芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼區(qū)，該編碼區(qū)具有含有作為第二密碼子的一個(gè)密碼子的核苷酸序列，所述的密碼子編碼選自于下列組纈氨酸(Val)，丙氨酸(Ala)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)的一個(gè)氨基酸。特別優(yōu)選的是該第二密碼子編碼丙氨酸。這些密碼子以G起始，在位置+4(即芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列的第二密碼子的第一核苷酸)提供了最佳的轉(zhuǎn)譯起始位置。因此由改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的N-末端由Met-Xaa組成，其中Xaa是Ala,Val,Gly,Glu或Asp，并且優(yōu)選的是Ala(更優(yōu)選的是由GCC密碼子編碼的Ala)。優(yōu)選的是，改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼在包括SEQIDNo2的氨基酸殘基3和90之間的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的例子是1)編碼具有SEQIDNo2的序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，其中氨基酸序列的第二氨基酸(Lys)被上文定義的Xaa所替代，和2)編碼具有SEQIDNo4的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。發(fā)現(xiàn)以非保守的方式修飾芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的N-末端對(duì)芽孢桿菌RNA酶抑制劑的特定的生物學(xué)活性沒(méi)有產(chǎn)生負(fù)面影響。事實(shí)上當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)，特別是在單子葉植物(例如玉米，水稻和小麥)中表達(dá)時(shí)，這些改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA通常產(chǎn)生更多的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)，如通過(guò)雄蕊組織的Western印跡分析評(píng)估看到的。氈絨層細(xì)胞中產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的提高是由于芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯得到改進(jìn)，而且其穩(wěn)定性提高。還發(fā)現(xiàn)對(duì)芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列進(jìn)行修飾以使該序列的％AT降低到低于40％導(dǎo)致產(chǎn)生改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，這樣可以在植物細(xì)胞中，特別是在氈絨層細(xì)胞中大大提高產(chǎn)生的具有芽孢桿菌RNA酶抑制劑活性的蛋白質(zhì)的水平。本文中所述的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列通常被命名為“合成”的芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列。優(yōu)選的是合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有在大多數(shù)的植物種類(lèi)中為優(yōu)選的慣用的密碼子，其中例如可以在恢復(fù)系品系中使用。對(duì)于大多數(shù)N植物種類(lèi)X1,X2,……XN優(yōu)選的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的慣用的密碼子是指對(duì)于存在一個(gè)密碼子以上的各個(gè)氨基酸，在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中編碼該氨基酸的頻率最高的密碼子(該氨基酸的“芽孢桿菌RNA酶抑制劑密碼子”)，優(yōu)選的是編碼該氨基酸的每個(gè)密碼子是在各個(gè)N/2以上的植物種類(lèi)中，該密碼子具有綜合的頻率為1)至少是最少使用的密碼子的綜合頻率的兩倍和/或2)大于最多使用的密碼子的綜合頻率的一半。還優(yōu)選的是對(duì)于存在多個(gè)密碼子的19個(gè)氨基酸的至少17，優(yōu)選的是至少18，在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中使用頻率最高的密碼子，優(yōu)選的是每個(gè)密碼子是在各個(gè)N植物種類(lèi)中，該密碼子的綜合頻率為1)至少是最少使用的密碼子的綜合頻率的兩倍和/或2)大于最多使用的密碼子的綜合頻率的一半。實(shí)施例2描述了對(duì)于五個(gè)植物種類(lèi)(N=5)即油菜，棉花，玉米，小麥和水稻，用最佳化的慣用密碼子設(shè)計(jì)的特定的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。為了本發(fā)明的目的，使用了由Ikemura公開(kāi)的對(duì)于各個(gè)植物種類(lèi)的綜合的密碼子頻率(Ikemura,1993，在“植物分子生物學(xué)Labfax”,Croy,ed.,BiosScientificPublishersLtd.，第37-48頁(yè))。其中例如在恢復(fù)系中使用本發(fā)明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的優(yōu)選的植物種類(lèi)是油菜，棉花，玉米，水稻和小麥，特別是油菜，玉米和水稻，尤其是油菜和玉米。合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA優(yōu)選的是其進(jìn)一步特征在于具有低頻率的CG二核苷酸和CNG三核苷酸，它們是在植物細(xì)胞中甲基化的靶。因此本發(fā)明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的特征為具有不超過(guò)7％的CG二核苷酸，優(yōu)選的是具有不超過(guò)6％的CG二核苷酸，特別是具有5.5和6％之間的CG二核苷酸(在270-273堿基對(duì)的編碼序列中，它是約15或16的CG核苷酸)，和/或，不超過(guò)9.5％的CNG三核苷酸(其中N是任何核苷酸)，優(yōu)選的是具有不超過(guò)9％的CNG三核苷酸，特別是具有8.5％和9％之間的CNG三核苷酸(在270-273堿基對(duì)的編碼序列中，它是約23-25的CNG三核苷酸)。優(yōu)選的本發(fā)明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA進(jìn)一步的特征在于具有不超過(guò)7，優(yōu)選的是不超過(guò)5，特別是不超過(guò)3個(gè)的由僅一個(gè)種類(lèi)的核苷酸組成的四核苷酸(即AAAA,CCCC,GGGG,TTTT)和具有不超過(guò)2，優(yōu)選的是不超過(guò)1個(gè)的由僅一個(gè)種類(lèi)的核苷酸組成的五核苷酸(即AAAAA,CCCCC,GGGGG,TTTTT)。本發(fā)明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA包括編碼野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑(SEQIDNo2)的那些序列，例如具有由ATG引導(dǎo)的SEQIDNo3的位置7和273之間的核苷酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。但是，本發(fā)明的優(yōu)選的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA是合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列，該序列編碼具有以Met-Xaa起始的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，其中Xaa是纈氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或甘氨酸，并且優(yōu)選的是其中Xaa是丙氨酸。優(yōu)選的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA是由ATGGNN引導(dǎo)，優(yōu)選的是由ATGGCN引導(dǎo)(其中N是任何核苷酸)的SEQIDNo3的位置7和273之間的核苷酸序列的DNA。特別優(yōu)選的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA是具有SEQIDNo3的核苷酸序列的DNA。優(yōu)選的是，合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列和野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列編碼具有至少80％序列等同性的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)。為了本發(fā)明的目的，兩個(gè)相關(guān)的核苷酸序列(例如兩個(gè)芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA)或氨基酸序列(即兩個(gè)芽孢桿菌RNA酶抑制劑)的％序列等同性是指在兩個(gè)最佳化校正序列中具有相同殘基(×100)的位置的數(shù)量除以所比較的位置的數(shù)量。存在于一個(gè)序列但是不存在于另一個(gè)序列中的殘基的排列中的位置，即空缺被認(rèn)為具有非相同殘基的位置。包括本發(fā)明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復(fù)系基因可以用于在不同的植物種類(lèi)中產(chǎn)生恢復(fù)系，但是特別適用于在谷類(lèi)，尤其是在玉米，水稻和小麥中產(chǎn)生恢復(fù)系。因此本發(fā)明還提供了N-末端由Met-Xaa(其中Xaa如上文定義)組成的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選的改進(jìn)的本發(fā)明的芽孢桿菌RNA酶抑制劑包括SEQIDNo2的殘基3和90之間的序列，并且是例如1)具有SEQIDNo4的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，和2)具有SEQIDNo2的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，其中第二氨基酸(Lys)被如上定義的Xaa所替代。此外，不用說(shuō)，可以對(duì)對(duì)應(yīng)于SEQIDNo2的殘基3和90之間的序列的這些優(yōu)選的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑區(qū)域進(jìn)行修飾，只要總的氨基酸序列與SEQIDNo2至少具有80％，優(yōu)選的是至少具有85％，特別是至少具有90％的序列相似性，并且只要在標(biāo)準(zhǔn)條件下改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑能夠抑制至少50％，優(yōu)選的是至少75％，特別是至少90％的分泌的芽孢桿菌RNA酶的活性。如上說(shuō)明的，在芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的N-末端的修飾(即導(dǎo)入由Met-Xaa組成的N-末端)是非保守的修飾，但是當(dāng)在植物細(xì)胞中生產(chǎn)它們時(shí)它對(duì)本發(fā)明的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的特定的生物學(xué)活性沒(méi)有負(fù)面的影響。這由實(shí)施例6的SEQIDNo4的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑所舉證。因此本發(fā)明還提供了可育性恢復(fù)基因，其特征在于它們含有本發(fā)明的改進(jìn)的和/或合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，并且可以用于生產(chǎn)植物種類(lèi)的改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系植物，即具有良好的恢復(fù)能力的恢復(fù)系植物。不用說(shuō)，可育性恢復(fù)基因的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA與其它編碼序列融合在一起轉(zhuǎn)譯，以便作為融合蛋白的一部分進(jìn)行表達(dá)。原則上，在本發(fā)明的恢復(fù)系植物中可以使用任何啟動(dòng)子作為可育性恢復(fù)基因的恢復(fù)系啟動(dòng)子。唯一的前提是含有可育性，恢復(fù)系基因的這樣的恢復(fù)系植物能夠恢復(fù)雄性不育品系的可育性即能夠產(chǎn)生恢復(fù)的植物(包括雄性不育基因和可育性恢復(fù)基因)，所述植物的表現(xiàn)型是正常的并且雄性可育。這要求可育性恢復(fù)基因中的恢復(fù)啟動(dòng)子應(yīng)該至少是在植物的雄蕊細(xì)胞中具有活性的，所述植物中相應(yīng)的雄性不育基因的不育啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)芽孢桿菌RNA酶DNA的表達(dá)。關(guān)于這一點(diǎn)，優(yōu)選的是不育性啟動(dòng)子和恢復(fù)啟動(dòng)子是相同的(例如兩個(gè)TA29啟動(dòng)子或兩個(gè)CA55啟動(dòng)子)。但是，不育性啟動(dòng)子可以是僅在氈絨層細(xì)胞中有活性的，而恢復(fù)啟動(dòng)子在其它細(xì)胞中也是有活性的。例如，不育性啟動(dòng)子可以是雄蕊選擇性的(例如TA29啟動(dòng)子或CA55啟動(dòng)子)，而恢復(fù)啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子例如35S-tap啟動(dòng)子，它是被修飾后在氈絨層細(xì)胞中有活性的35S啟動(dòng)子(vanderMeer等人，1992，植物細(xì)胞4:253-262)。當(dāng)然，本發(fā)明的改進(jìn)的恢復(fù)系DNA除了用于恢復(fù)植物的雄性可育，還可以用于其它目的。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明的改進(jìn)和/或合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA可以在任何情況下使用，可以用于中和植物細(xì)胞的芽孢桿菌RNA酶活性，例如在EP0412911,WO93/19188,WO92/21757,WO93/25695和WO95/02157中描述的。為了上述應(yīng)用，可以將芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA置于更適合的其它啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下，可以使用類(lèi)似于35S啟動(dòng)子和農(nóng)桿菌T-DNA的煙脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子。還可以使用基本的啟動(dòng)子(即基本上僅含有TATA盒沒(méi)有其它調(diào)節(jié)增強(qiáng)子元件的植物啟動(dòng)子)，甚至可以使用本發(fā)明的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，完全沒(méi)有啟動(dòng)子(例如當(dāng)計(jì)劃在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中在內(nèi)源性啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)錄芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA時(shí))。用于恢復(fù)系植物中的可育性恢復(fù)基因R優(yōu)選的是還包括至少第二標(biāo)記基因，它至少包括1)編碼第二標(biāo)記RNA，蛋白質(zhì)或多肽的第二標(biāo)記DNA，當(dāng)至少存在于植物的特定的組織或特定的細(xì)胞中時(shí)，使植物易于與其它植物分離，所述其它植物至少在特定的組織或特定的細(xì)胞中不含有由第二標(biāo)記DNA編碼的第二標(biāo)記RNA，蛋白質(zhì)或多肽，和2)能夠指導(dǎo)第二標(biāo)記DNA至少在特定的組織或特定的細(xì)胞中表達(dá)的第二標(biāo)記啟動(dòng)子；第二標(biāo)記DNA是相同于第二標(biāo)記啟動(dòng)子和受其控制的轉(zhuǎn)錄單位。因此本發(fā)明的恢復(fù)系植物含有外源的“恢復(fù)系基因座”，它含有包括本發(fā)明的改進(jìn)的恢復(fù)系DNA的恢復(fù)系基因R。優(yōu)選的恢復(fù)系基因座在相同的遺傳基因座還包括至少一個(gè)第二標(biāo)記基因。優(yōu)選的本發(fā)明的恢復(fù)系植物是單子葉恢復(fù)系植物，優(yōu)選的是玉米，水稻或小麥植物，它們從其離體的花朵(例如水稻和小麥的圓錐花序，玉米的穗狀花序-參見(jiàn)實(shí)施例4)提取的每毫克總蛋白平均產(chǎn)生至少10納克，優(yōu)選的是至少20納克，特剮是至少40納克(且至多100至200納克)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。尤其優(yōu)選的本發(fā)明的恢復(fù)系植物將產(chǎn)生本發(fā)明的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，特別是具有SEQIDNo4的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑?？梢杂糜诒景l(fā)明的第一和第二標(biāo)記基因的第一和第二標(biāo)記DNA和第一和第二標(biāo)記啟動(dòng)子也是熟知的(EP0344029；EP0412911)。關(guān)于這一點(diǎn)，優(yōu)選的是第一和第二標(biāo)記DNA是不同的，盡管第一和第二標(biāo)記啟動(dòng)子可以是相同的。優(yōu)選的是提供的外源DNA例如可育性恢復(fù)系基因，雄性不育基因，或第一或第二標(biāo)記基因在它們的編碼序列的下游(即3’)具有合適的3’轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和聚腺苷酸化信號(hào)，即分別是可育性恢復(fù)系DNA，雄性不育DNA，或第一或第二標(biāo)記DNA。關(guān)于這一點(diǎn)，可以使用適用于獲得嵌合基因的表達(dá)的外源轉(zhuǎn)錄3’末端的形成和聚腺苷酸化信號(hào)。例如，可以使用基因例如基因7(Velten和Schell(1985)核酸研究13:6998)，章魚(yú)堿合成酶基因(DeGreve等人，1982,J.Mol.Appl.Genet.1:499；Gielen等人(1983)EMBOJ.3:835；Ingelbrecht等人，1989，植物細(xì)胞1:671)和根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域的煙脂堿合成酶基因(DePicker等人，1982,J.Mol.APPl.Genet.1:561)，或苯基苯乙烯酮合成酶基因(Sommer和Saedler,1986,Mol.Gen.Genet.202:429-434),或CaMV19S/35S轉(zhuǎn)錄單位(Mogen等人，1990，植物細(xì)胞2:1261-1272)的外源的3’未轉(zhuǎn)譯末端?？捎曰謴?fù)系基因，雄性不育基因，或本發(fā)明的第一或第二標(biāo)記基因通常是外源DNA，優(yōu)選的是外源嵌合DNA。關(guān)于這一點(diǎn)對(duì)于這樣的DNA的“外源”和“嵌合”具有相同于EP0344029和EP0412911描述的含義。利用去臂的并且由農(nóng)桿菌攜帶的Ti質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化植物細(xì)胞，特別是能夠被農(nóng)桿菌感染的植物例如大多數(shù)雙子葉植物(例如歐洲油菜)和一些單子葉植物，所述載體含有雄性不育基因或可育性恢復(fù)系基因。利用在EP0116718和EP0270822中描述的程序可以實(shí)施這樣的轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的Ti質(zhì)粒載體含有Ti質(zhì)粒的T-DNA的邊界序列之間的外源DNA，或至少定位于右邊界序列的左邊的外源DNA。當(dāng)然，利用例如直接的基因轉(zhuǎn)移(例如如EP0233247描述的)，花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如在EP0270356,PCT專(zhuān)利公開(kāi)“WO”85/01856，和美國(guó)專(zhuān)利4684611中描述的)，植物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如在EP0067553和美國(guó)專(zhuān)利4407956中描述的)和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如在美國(guó)專(zhuān)利4536475中描述的)，可以使用其它類(lèi)型的載體以轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。利用由此獲得的能夠形成堅(jiān)實(shí)的成胚愈傷組織(例如玉米的未成熟的胚)或成胚愈傷組織(例如玉米的I型愈傷組織)的受傷的或酶降解的完整組織，可以轉(zhuǎn)化(例如通過(guò)電穿孔)單子葉植物的細(xì)胞例如大多數(shù)谷類(lèi)包括玉米，水稻，小麥，燕麥和大麥，例如在WO92/09696中描述的。如果待轉(zhuǎn)化的植物是玉米，還可以使用其它近年來(lái)研制的方法，例如由Fromm等人，1990，生物/技術(shù)8:833；Gordon-Kamm等人，1990，生物/技術(shù)2:603和GoHld等人，1991，植物生理學(xué)95:426描述的對(duì)于某些玉米的品系的方法。如果待轉(zhuǎn)化的植物是水稻，還可以使用其它近年來(lái)研制的方法，例如由Shimamoto等人，1989，自然學(xué)338:274；Datta等人，1990，生物/技術(shù)8:736和Hayashimoto等人，1990，植物生理學(xué)93:857描述的對(duì)于某些水稻品系的方法。將待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生為成熟的植物，可以將獲得的轉(zhuǎn)化植物用于常規(guī)的育種計(jì)劃以產(chǎn)生多種具有相同特征的轉(zhuǎn)化植物或在相同的相關(guān)的植物種類(lèi)的其它品種中導(dǎo)入雄性不育基因，或可育性恢復(fù)系基因。從轉(zhuǎn)化的植物獲得的種子含有作為穩(wěn)定的基因組插入物的本發(fā)明嵌合基因。因此，當(dāng)導(dǎo)入到植物種類(lèi)的特定的品系或品種時(shí)，通過(guò)回交總是可以將本發(fā)明的雄性不育基因或可育性恢復(fù)系基因?qū)氲饺魏纹渌废祷蚱贩N。當(dāng)然當(dāng)使該編碼DNA的慣常密碼子對(duì)于一系列的植物種類(lèi)最佳化時(shí)，如用于制備本發(fā)明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，上面描述的用于降低編碼DNA的AT含量的方法也可以應(yīng)用到在許多植物種類(lèi)中需要其最佳表達(dá)的任何編碼序列。關(guān)于這一點(diǎn)，例如該方法可用于編碼殺蟲(chóng)蛋白的蘇云金芽孢桿菌的基因，例如全長(zhǎng)的和截?cái)嗟腃rylab和Cry9C基因(EP0193259；EP0654075)。除非另有說(shuō)明，通過(guò)在Sambrook等人，1989，“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，和Ausubel等人，1994，“當(dāng)前的分子生物學(xué)方案”，JohnWiley&amp;Sons描述的標(biāo)準(zhǔn)的程序?qū)嵤┎僮髦亟MDNA的所有實(shí)驗(yàn)程序。將聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)用于克隆和/或擴(kuò)增DNA片段。使用具有重疊延伸的PCR以構(gòu)建嵌合基因(Horton等人，1989，基因77:61-68；Ho等人，1989，基因77:51-59)。使用的PCR反應(yīng)都是在常規(guī)條件下，利用VentTM聚合酶完成的(Cat.No.254L-BiolabsNewEngland,Beverley,MA01915，美國(guó))，所述聚合酶是從Thermococcuslitoralis分離到的(Neuner等人，1990,Arch.Microbiol.153:205-207)。根據(jù)已知的由Kramer和Fritz概括的規(guī)則設(shè)計(jì)寡核苷酸(1987，酶學(xué)方法154:350)，在AppliedBiosystems380ADNA合成儀(AppliedBiosystemsB.V.,Maarssen,Netherlands)上采用phosphoramidite方法(Beaucage和Caruthers,1981,TetrahedronLetters22:1859)合成。在說(shuō)明書(shū)和下面的實(shí)施例中，參照下面的序列表和附圖序列表SEQIDNo1野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNASEQIDNo2野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑SEQIDNo3合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNASEQIDNo4改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑SEQIDNo5質(zhì)粒pMV71SEQIDNo6質(zhì)粒pLH43的相關(guān)部分SEQIDNo7質(zhì)粒pTTS24的T-DNASEQIDNo8寡核苷酸CASOLX1SEQIDNo9寡核苷酸CASOLX2SEQIDNo10質(zhì)粒pLH48在參照這些核苷酸和氨基酸序列時(shí)，應(yīng)該注意到位置X和Y之間的序列(或另一種可選的方法從位置X到位置Y的序列)是包括在位置X和Y的殘基的序列。利用在序列表中使用的縮寫(xiě)命名功能性DNA元件。實(shí)施例實(shí)施例1改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的制備通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變?cè)谝吧脱挎邨U菌RNA酶抑制劑的第一密碼子(ATG)和第二密碼子(AAA)之間插入丙氨酸密碼子GCC而制備改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。因此改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，當(dāng)與野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑比較時(shí)，改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑具有改變的N-末端，它由Met-Ala-Lys組成(而不是野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑中的Met-Lys)。N-末端的非保守修飾不會(huì)影響植物細(xì)胞中改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的生物學(xué)活性(參見(jiàn)實(shí)施例6)。實(shí)施例2合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的合成和制備根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)編碼實(shí)施例1的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA-在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑中A和T核苷酸的百分?jǐn)?shù)應(yīng)該低于40％(野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有51.6的％AT)。AT豐富的基因具有包括聚腺苷酸化信號(hào)和內(nèi)含子識(shí)別序列的較高的可能性，它能阻止或降低特別是長(zhǎng)編碼序列(例如Bt編碼序列)在植物細(xì)胞中的表達(dá)。-盡管C和G核苷酸的增加，CG二核苷酸和CNG三核苷酸的量應(yīng)該盡可能低。這是因?yàn)镃G二核苷酸和CNG三核苷酸是甲基化的靶，它可以在植物細(xì)胞中使基因失活。-慣用密碼子應(yīng)該盡可能地在許多種類(lèi)的植物中最佳化，特別是在油菜，棉花，玉米，水稻和小麥中。因此，對(duì)于各個(gè)氨基酸，選擇在芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中優(yōu)選使用的一個(gè)密碼子(或幾個(gè)密碼子)，在大多數(shù)植物種類(lèi)中，所述密碼子具有的頻率至少是最少使用的密碼子的頻率的兩倍以上和/或至少是最多使用的密碼子的頻率的一半以上。因此，對(duì)于各個(gè)植物種類(lèi)和對(duì)于各個(gè)氨基酸，制作一個(gè)密碼子表，其中具有的頻率至少是在所述植物種類(lèi)中最少使用的密碼子的頻率的兩倍以上和/或至少是在所述植物種類(lèi)中最多使用的密碼子的頻率的一半以上(將符合該標(biāo)準(zhǔn)的密碼子命名為所述植物種類(lèi)的最佳密碼子)。在大多數(shù)植物種類(lèi)中是最佳密碼子的密碼子稱(chēng)作為在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中所述氨基酸的優(yōu)勢(shì)密碼子，優(yōu)選的是唯一的密碼子。方便的是，在該分析中使用的密碼子的頻率是所列出的那些(上文)。-避免大于4個(gè)相同核苷酸以上的延伸。因此獲得了具有SEQIDNo.3的核苷酸序列的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。這種合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有38.4的％AT，不過(guò)僅含有16CG二核苷酸和24CNG三核苷酸。合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA不含有潛在的植物聚腺苷酸化信號(hào)或內(nèi)含子拼接位點(diǎn)。合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的慣用密碼子似乎適合于在至少油菜，棉花，玉米，水稻和小麥中表述(表1)。對(duì)于其中存在多個(gè)密碼子的18個(gè)氨基酸，在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中17個(gè)氨基酸優(yōu)選地被在這五個(gè)植物種類(lèi)的各個(gè)中是最佳密碼子的一個(gè)密碼子所編碼。事實(shí)上，在這五個(gè)植物種類(lèi)的至少三個(gè)中，所有的存在多個(gè)密碼子的氨基酸在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中優(yōu)選地被一個(gè)最佳密碼子所編碼。合成芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA只含有1CCCCC和1GGGG延伸。為了克隆的目的，SEQIDNo.3的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑使用下面的唯一的限制性位點(diǎn)NcoⅠ,BspE1和Kasl。實(shí)施例3改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA在玉米細(xì)胞中的表達(dá)用包被了質(zhì)粒pLH43或質(zhì)粒pMV71的微彈(金顆粒)，用Bio-RadPDS-1000/HE顆粒槍(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，Hercules，加里福尼亞，美國(guó))轟擊培養(yǎng)的BlackMexicanSweet(BMS)玉米細(xì)胞，如下所述。將BMS懸浮細(xì)胞置于合適的濾膜，并且用常規(guī)程序進(jìn)行轟擊(Kirihara.1994，“玉米手冊(cè)”，F(xiàn)reeling和Walbot,SpringerVerlag，第690-694頁(yè))，所述程序進(jìn)行了包括滲透壓預(yù)處理的修飾(Russel等人，1992，體外28:97-105)。利用由供應(yīng)商手冊(cè)描述的程序，用含有5∶1比例的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA和質(zhì)粒pAct1-D的合適的質(zhì)粒DNA的混合物包被金顆粒(McElroy等人，1990，植物細(xì)胞2:163-171)。pAct1-D是含有g(shù)us基因(編碼β-葡糖苷酸酶)的質(zhì)粒，所述基因處于水稻肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子的控制下，所述基因基本上具有描述于SEQIDNo.5的位置1999到3400之間的序列。對(duì)于各個(gè)質(zhì)粒，轟擊2-3個(gè)濾膜。轟擊以后24小時(shí)，收集來(lái)自于各個(gè)濾膜的細(xì)胞，通過(guò)在液氮中研磨捕獲。將各個(gè)濾膜的捕獲的細(xì)胞分為二等份，一份用于芽孢桿菌RNA酶抑制劑檢測(cè)，另一份用于GUS檢測(cè)。來(lái)自于各個(gè)轟擊的濾膜的被捕獲細(xì)胞的一半，在提取緩沖液(50mMTris/HClpH7.5,5％甘油，100mMKCl,1mMbenzamidin.HCl,5mMe-氨基-n-已酸，10mMEDTA,10mMEGTA,1微克/毫升抗蛋白酶，1微克/毫升亮抑蛋白酶肽，14mMβ-巰基乙醇，1.5％聚乙烯基聚吡咯烷酮，1mMPMSF)中提取總可溶性細(xì)胞蛋白質(zhì)。采用Bio-RadBradford檢測(cè)試驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。每個(gè)樣品的50微克的蛋白質(zhì)裝載于18％SDS-聚丙烯酰胺凝膠并且通過(guò)電泳進(jìn)行分離。將0.1,0.5,2.5，和5納克的純化的芽孢桿菌RNA酶抑制劑裝載于凝膠上作為陽(yáng)性對(duì)照。然后利用TGM-緩沖液(25mMTrispH8.3,192mM甘氨酸，20％v/v甲醇)，以60V進(jìn)行2小時(shí)，將蛋白質(zhì)電吸印到HybondC。然后將濾膜在0.5％PBS-吐溫20中首先保溫2小時(shí)，然后在一級(jí)抗體的溶液(在PBS-0.5％吐溫20中1/1000稀釋的多克隆兔IgG抗-芽孢桿菌RNA酶抑制劑抗體)中保溫過(guò)夜。然后將濾膜在PBS中洗滌4次，每次5分鐘，然后在驢抗兔IgG，辣根過(guò)氧化物酶連接(Amersham,Buckinghamshire，英國(guó))的在PBS-0.5％吐溫20中1/1000稀釋的溶液中保溫1小時(shí)。然后再將濾膜在PBS中洗滌4次，每次5分鐘，然后利用ECL檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham)檢測(cè)蛋白質(zhì)。通過(guò)放射自顯影的密度計(jì)掃描測(cè)定芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量。平行試驗(yàn)，采用熒光團(tuán)檢測(cè)方法，檢測(cè)在從各個(gè)轟擊的濾膜獲得的另一半捕獲細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)中β-葡糖苷酸酶的活性(Jefferson,1987，植物分子生物學(xué)報(bào)道5:387-405)。通過(guò)比較每(任意的)單位GUS活性中芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量確定特定的質(zhì)粒產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。pMV71是具有SEQIDNo.5的核苷酸序列的質(zhì)粒，并且含有實(shí)施例1的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。將該變異體芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA可操作連接到水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和農(nóng)桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶3’未轉(zhuǎn)譯末端。pLH43是具有SEQIDNo.5的核苷酸序列的質(zhì)粒，其中核苷酸3399和4021之間的序列被SEQIDNo.6的核苷酸序列替代。pLH43含有可操作連接到水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和農(nóng)桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶3’未轉(zhuǎn)譯末端的實(shí)施例2的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(SEQIDNo.3)。pTS410是具有SEQIDNo.5的核苷酸序列的質(zhì)粒，其中核苷酸3404到3406(即pMV71的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的第二密碼子)已被缺失。上面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于表2，其中顯示來(lái)自于各個(gè)轟擊試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果。當(dāng)與在pTS410的野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA導(dǎo)入后產(chǎn)生的(野生型)芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)相比，易于看到pMV71和pLH43的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的導(dǎo)入平均導(dǎo)致顯著高地產(chǎn)生(改進(jìn)的)芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)。另外，可以看到，當(dāng)與在pMV71的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA導(dǎo)入后產(chǎn)生的(也改進(jìn)的)芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)相比，在玉米細(xì)胞中導(dǎo)入pLH43的改進(jìn)的合成芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA導(dǎo)致在那些細(xì)胞中顯著高地產(chǎn)生(改進(jìn)的)芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)。實(shí)施例4改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA在水稻植物中的表達(dá)利用質(zhì)粒pTS172，基本上如WO92/13956描述的，獲得了四個(gè)轉(zhuǎn)基因的雄性不育水稻的栽培品種Kochihibiki品系。質(zhì)粒pTS172含有下面的嵌合基因P35S-bar-3’g7和PE1-芽孢桿菌RNA酶-3’nos并且可以通過(guò)將用BstEⅡ和MscⅠ消化的pTS173的大片段連接到pJVR2-E1的小BstEⅡ-MscⅠ片段上從pTS173(見(jiàn)下)獲得。這些品系被命名為K104,K107,K109和K111?；旧习凑誛O92/13956描述的方法，利用質(zhì)粒pTS173獲得7個(gè)轉(zhuǎn)基因的雄性可育的恢復(fù)系水稻植物Chiyonishiki栽培品種。所述質(zhì)粒含有下面的嵌合基因P35S-bar-3’g7和PE1-野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑-3’nos。通過(guò)用35S啟動(dòng)子和pTTS24的嵌合bar基因的3’未轉(zhuǎn)譯末端替代35S啟動(dòng)子和pJVR3-E1的嵌合bar基因的3’未轉(zhuǎn)譯末端，可從pJVR3-E1衍生pTS173(WO92/13956)。從質(zhì)粒pTTS24的T-DNA插入物(SEQIDNo.7)，利用寡核苷酸引物CASOLX1(SEQIDNo.8)，它重疊bar基因的KpnⅠ位點(diǎn)，和CASOLX2(SEQIDNo.9)，采用PCR擴(kuò)增含有T-DNA基因7的3’末端的DNA片段。用AatⅡ和KpnⅠ切割PCR產(chǎn)物，并且連接到用AatⅡ和KpnⅠ切割的質(zhì)粒pJVR3-E1的大片段上。從該獲得的質(zhì)粒，通過(guò)由來(lái)自于pTTS24(SEQIDNo.7的位置880到2281)的相應(yīng)的NcoⅠ-NotⅠ片段替代較小的NcoⅠ+NotⅠ片段(含有P35S)，導(dǎo)致產(chǎn)生pTS173。獲得的品系命名為C111,C113,C117,C118,C120,C121和C125。因此所有這些植物含有處于E1啟動(dòng)子控制下的SEQIDNo.1的野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(WO92/13956)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的受傷的堅(jiān)實(shí)的成胚愈傷組織(從水稻栽培品種Kochihibiki未成熟的胚獲得的)的轉(zhuǎn)化獲得32個(gè)另外的恢復(fù)系植物(WO92/09696)。用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株是從其野生型Ti-質(zhì)?；謴?fù)的并且含有質(zhì)粒pGV4000和pTTS24的Ach5菌株(Genetello等人，1977，自然學(xué)265:561-563)。pTTS24是中間體克隆載體，它在其必要的特性上類(lèi)似pGSC1700(Cornelissen和Vandewiele,1989,NAR17:19-29)，但是由于缺失β-內(nèi)酰胺酶基因和含有具有SEQIDNo.7的核苷酸序列的T-DNA，其主要部分不同于pGSC1700。pGV4000是去臂的Ti-質(zhì)粒，它來(lái)自于pMP90(Koncz和Schell,1986,Mol.Gen.Genet.204:383-396)并且含有允許與pTTS24的相應(yīng)的區(qū)域同源重組的區(qū)域。將所有含有實(shí)施例2的處于E1啟動(dòng)子的控制下的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(SEQIDNo.3)的這些植物命名為“OSC”數(shù)，如在表3中使用的。在所有恢復(fù)系品系中測(cè)定芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的量。每個(gè)品系在液氮中研碎單個(gè)植物的1-2個(gè)未成熟的圓錐花序(即圓錐花序，其中大多數(shù)的小穗約為3.5-4.5毫米長(zhǎng))。如實(shí)施例3描述的方法提取和檢測(cè)蛋白質(zhì)。結(jié)果概括于表3?？梢钥吹胶蠸EQIDNo.3的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復(fù)系品系產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑明顯高于含有SEQIDNo.1的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的那些品系。芽孢桿菌RNA酶抑制劑mRNA的量直接與圓錐花序中芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的量相關(guān)得到證實(shí)(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。進(jìn)一步證實(shí)芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的產(chǎn)生有效地限制到圓錐花序的花(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。選定的恢復(fù)系品系與四個(gè)雄性不育品系雜交。觀察到恢復(fù)系品系的恢復(fù)能力與所述花中產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的量相關(guān)。觀察到每毫克提取的蛋白質(zhì)產(chǎn)生4和10納克芽孢桿菌RNA酶抑制劑之間的品系能夠部分恢復(fù)微孢子的發(fā)育為雄性不育品系，在這種意義上，“恢復(fù)系植物”產(chǎn)生非存活的花粉(雄性不育植物完全不產(chǎn)生花粉)。對(duì)于所有檢測(cè)的雄性不育品系觀察到每毫克提取的蛋白質(zhì)產(chǎn)生50納克或更多的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的恢復(fù)系品系能夠完全恢復(fù)可育性，即在自我授粉后，所有恢復(fù)的子代植物產(chǎn)生完全存活的和有功能的花粉，和正常的種子。選定的恢復(fù)系品系也是自我授粉的并且從轉(zhuǎn)基因子代植物收集到未成熟的圓錐花序。如由所產(chǎn)生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量測(cè)定的表達(dá)水平至少等于，和在許多植物中大于在初級(jí)轉(zhuǎn)化中測(cè)定的量。通常，這些觀察結(jié)果證實(shí)芽孢桿菌RNA酶抑制劑表達(dá)水平穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移到子代植物。實(shí)施例5改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA在玉米植物中的表達(dá)基本上按照WO92/13956描述的方法，利用質(zhì)粒pVE108獲得命名為MS3的轉(zhuǎn)基因雄性不育玉米品系?；旧习凑誛O95/34634描述的方法獲得含有處于TA29啟動(dòng)子(EP344,029)或CA55啟動(dòng)子(WO92/13957)控制下的SEQIDNo1的野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的幾個(gè)轉(zhuǎn)基因雄性可育恢復(fù)系玉米植物。特別是，通過(guò)用質(zhì)粒pCOL100和pDE110(WO92/34634)轉(zhuǎn)化玉米獲得七個(gè)恢復(fù)系品系，pDE110含有可操作連接到如SEQIDNo1描述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA上的TA29啟動(dòng)子。當(dāng)與MS2植物雜交時(shí)，恢復(fù)是不完全的，因?yàn)樽疃?5％的花藥產(chǎn)生存活的花粉(這證明MS3品系特別難于恢復(fù)，因?yàn)橛闷渌坌圆挥废但@得了良好的恢復(fù)程度-數(shù)據(jù)未顯示)。類(lèi)似地，通過(guò)用質(zhì)粒pLH48(與選自于pCOL9S或PLH52或p35S-Bperu或pCOL11(WO92/34634)的質(zhì)粒一起)轉(zhuǎn)化玉米獲得了六個(gè)轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系玉米品系。這些恢復(fù)品系都至少含有處于TA29啟動(dòng)子控制下的實(shí)施例2的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(SEQIDNo3)。六個(gè)恢復(fù)品系與MS3植物雜交，對(duì)于四個(gè)恢復(fù)品系觀察到完全恢復(fù)。將這四個(gè)恢復(fù)系品系之一命名為RZM583-0101。由轉(zhuǎn)基因品系RZM583-0101給轉(zhuǎn)基因品系MS3授粉，通過(guò)PCR篩選識(shí)別含有嵌合芽孢桿菌RNA酶基因和嵌合芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的子代植物。將那些可育性恢復(fù)的子代植物用于給MS3植物授粉。在該最后的雜交的90個(gè)子代植物中，識(shí)別出15個(gè)植物(通過(guò)定量的Southern印跡分析)為MS3的嵌合芽孢桿菌RNA酶基因的純合子。在這些中，不含有RZM583-0101的嵌合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的植物是雄性不育的，而含有RZM583-0101的嵌合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的那些植物是完全雄性可育的。這證實(shí)了由包括改進(jìn)的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的嵌合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因可以完全恢復(fù)在純合條件下含有嵌合的芽孢桿菌RNA酶基因的植物的可育性。因此，可以總結(jié)出，含有改進(jìn)的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復(fù)品系具有顯著好的恢復(fù)能力?；旧习凑諏?shí)施例3描述的方法測(cè)定子代恢復(fù)系植物的未成熟穗狀雄花(包括單核階段的微孢子)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量。觀察到在含有改進(jìn)的合成芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復(fù)系植物的穗狀雄花中芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的量顯著地高于含有野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復(fù)系植物的穗狀雄花中芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的量。例如在含有野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的植物中，測(cè)定芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的量低于20納克芽孢桿菌RNA酶抑制劑/毫克總蛋白。相反，在含有改進(jìn)的合成芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的兩個(gè)品系中，測(cè)定未成熟的穗狀雄花的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的量分別是210和100納克芽孢桿菌RNA酶抑制劑/毫克總蛋白。實(shí)施例6在油菜的雄蕊細(xì)胞中生產(chǎn)時(shí)野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑和改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的活性利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，用質(zhì)粒pTHW118或pTTS139轉(zhuǎn)化油菜植物(栽培品種Drakkar)。質(zhì)粒pTHW118含有處于TA29啟動(dòng)子控制下的野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(SEQIDNo1)。質(zhì)粒pTTS139含有包括野生型的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的第一和第二密碼子之間的附加的GCC丙氨酸密碼子的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。因此，pTTS139中的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼SEQIDNo4的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)。用pTHW118轉(zhuǎn)化的兩個(gè)油菜品系，分別命名為DBN366-0011和DBN366-0029，用pTTS139轉(zhuǎn)化的兩個(gè)油菜品系分別命名為DBN342-1010和DNB367-0035，選擇上述品系進(jìn)行定量分析。從所述植物分離長(zhǎng)度約為3-4毫米的油菜花芽，并且在液氮中研碎。提取蛋白質(zhì)，基本上按照實(shí)施例3描述的方法，測(cè)定提取的總蛋白質(zhì)的量，以及采用Western印跡可檢測(cè)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量。表4顯示了在各個(gè)品系中存在可提取的總蛋白質(zhì)的量(欄4)和芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量(欄2)?；旧习凑誇itzgerald和Hartley描述的方法(1993，見(jiàn)上文)測(cè)定芽孢桿菌RNA酶抑制劑的活性。向600微升的TE緩沖液(10mMTris/HClpH8.0；1mMEDTA)中加入-20微升的含有10微克/毫升牛血清白蛋白和0.1微克/毫升的芽孢桿菌RNA酶的0.02M乙酸銨pH8.0溶液，-“X”微升的5倍稀釋的從花芽提取的蛋白質(zhì)(“X”分別是0,4,8,12,16,20)。在混合和等待約1分鐘之后，加入6微升的10倍稀釋的含有溶于TE緩沖液中的0.4微克/毫升的聚乙烯醇腺苷磷酸的原液。將最后的溶液混合并且立即轉(zhuǎn)移到透明小容器，記錄1-2分鐘內(nèi)熒光的增加。以起始時(shí)熒光的增加值/分鐘相對(duì)于“X”(含有芽孢桿菌RNA酶抑制劑溶液的體積)作圖。在各種情況下，如預(yù)期的獲得了線(xiàn)性關(guān)系。計(jì)算X-軸的隱性品系的截距(表4，欄3)這代表“X”的體積，它含有足夠的芽孢桿菌RNA酶抑制劑以完全中和2納克的芽孢桿菌RNA酶(即含有芽孢桿菌RNA酶抑制劑的摩爾量的體積，它相當(dāng)于2納克的芽孢桿菌RNA酶)。由此可以測(cè)定花芽中“活性”芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量(表4，欄5)，以及“活性”芽孢桿菌RNA酶抑制劑與由Western印跡測(cè)定的總芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的比例(表4，欄6)。根據(jù)這些比例，能夠推導(dǎo)出改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的活性至少相當(dāng)于野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量。但是，在用pTHW118轉(zhuǎn)化的品系(表達(dá)野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑)中，平均比例是0.27(標(biāo)準(zhǔn)偏差0.08)，而在用pTTS139轉(zhuǎn)化的品系中，平均比例是0.39(標(biāo)準(zhǔn)偏差0.08)。兩個(gè)品系類(lèi)型的平均比例之間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(t=-26,p＜0.005)。根據(jù)這一點(diǎn)，能夠總結(jié)出當(dāng)在油菜花芽中產(chǎn)生時(shí)，與野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑相比，改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑通常產(chǎn)生較高水平的活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑。本申請(qǐng)中引用的所有出版物均引入本文作為參考。表1a)+表示在選定的植物中，密碼子是該植物中的最佳密碼子，即在所述植物中該密碼子的頻率至少為該植物中最低頻率的密碼子的頻率的兩倍和/或至少是該植物中最多使用的密碼子的頻率的50％。在該植物種類(lèi)中密碼子的頻率是由Ikemura列出(千分之)的那些(見(jiàn)上文)-表示在選定的植物中，該密碼子在如上定義的植物中不是最佳密碼子b)存在多個(gè)密碼子的氨基酸(不是Trp,Met)c)在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中使用的編碼該氨基酸的SEQIDNo.3的密碼子d)由這種SEQIDNo.3的密碼子編碼的氨基酸的數(shù)目表2a)由Western印跡測(cè)定的50微克負(fù)載的蛋白質(zhì)中芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量b)Gus活性以任意單位計(jì)c)正確的芽孢桿菌RNA酶抑制劑納克芽孢桿菌RNA酶抑制劑/GUS活性單位。表3</tables>a)低于檢測(cè)限制值表41)由Western印跡測(cè)定的。2)X-截距3)從花芽提取的蛋白質(zhì)的總量(對(duì)于芽孢桿菌RNA酶抑制劑活性測(cè)定稀釋了5倍)4)評(píng)估的活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量(約16.36納克/毫升與20納克/毫升芽孢桿菌RNA酶等摩爾)5)活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑(參見(jiàn)上述4)與總芽孢桿菌RNA酶抑制劑(參見(jiàn)上述1))的比例序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)植物遺傳系統(tǒng)N.V.(B)街道Plateaustraat22(C)城市Ghent(E)國(guó)家比利時(shí)(F)郵編(ZIP):B-9000(G)電話(huà)3292358411(H)傳真3292231923(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng)恢復(fù)基因(ⅲ)序列數(shù)10(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBMPC相容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQIDNO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度270個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc=“芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”(ⅲ)推測(cè)不是(ⅳ)反義不是(ⅵ)原始來(lái)源(A)生物體解淀粉芽孢桿菌(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵CDS(B)位置1..270(D)其它資料/功能=“芽孢桿菌RNA酶抑制劑”/產(chǎn)物=“芽孢桿菌RNA酶抑制劑”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:1ATGAAAAAAGCAGTCATTAACGGGGAACAAATCAGAAGTATCAGCGAC48MetLysLysAlaValIleAsnGlyGluGlnIleArgSerIleSerAsp151015CTCCACCAGACATTGAAAAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAATACTACGGT96LeuHisGlnThrLeuLysLysGluLeuAlaLeuProGluTyrTyrGly202530GAAAACCTGGACGCTTTATGGGATTGTCTGACCGGATGGGTGGAGTAC144GluAsnLeuAspAlaLeuTrpAspCysLeuThrGlyTrpValGluTyr354045CCGCTCGTTTTGGAATGGAGGCAGTTTGAACAAAGCAAGCAGCTGACT192ProLeuValLeuGluTrpArgGlnPheGluGlnSerLysGlnLeuThr505560GAAAATGGCGCCGAGAGTGTGCTTCAGGTTTTCCGTGAAGCGAAAGCG240GluAsnGlyAlaGluSerValLeuGlnValPheArgGluAlaLysAla65707580GAAGGCTGCGACATCACCATCATACTTTCT270GluGlyCysAspIleThrIleIleLeuSer8590(2)SEQIDNO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度90個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:2MetLysLysAlaValIleAsnGlyGluGlnIleArgSerIleSerAsp151015LeuHisGlnThrLeuLysLysGluLeuAlaLeuProGluTyrTyrGly202530GluAsnLeuAspAlaLeuTrpAspCysLeuThrGlyTrpValGluTyr354045ProLeuValLeuGluTrpArgGlnPheGluGlnSerLysGlnLeuThr505560GluAsnGlyAlaGluSerValLeuGlnValPheArgGluAlaLysAla65707580GluGlyCysAspIleThrIleIleLeuSer8590(2)SEQIDNO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度273個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc=“改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”(ⅲ)推測(cè)不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵CDS(B)位置1..273(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:3ATGGCCAAGAAGGCTGTCATCAACGGGGAGCAGATCAGGAGCATCAGC48MetAlaLysLysAlaValIleAsnGlyGluGlnIleArGSerIleSer95100105GACCTCCACCAGACCCTCAAGAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAGTACTAC96AspLeuHisGlnThrLeuLysLysGluLeuAlaLeuProGluTyrTyr110115120GGTGAGAACCTCGACGCCCTCTGGGACTGCCTCACCGGCTGGGTGGAG144GlyGluAsnLeuAspAlaLeuTrpAspCysLeuThrGlyTrpValGlu125130135TACCCCCTCGTGTTGGAGTGGAGGCAGTTCGAGCAGAGCAAGCAGCTC192TyrProLeuValLeuGluTrpArgGlnPheGluGlnSerLysGlnLeu140145150ACCGAGAACGGCGCCGAGAGCGTGCTCCAAGTGTTCAGGGAGGCCAAG240ThrGluAsnGlyAlaGluSerValLeuGlnValPheArGGluAlaLys155160165170GCCGAGGGCTGCGACATCACCATCATCCTCTCC273AlaGluGlyCysAspIleThrIleIleLeuSer175180(2)SEQIDNO:4的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度91個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:4MetAlaLysLysAlaValIleAsnGlyGluGlnIleArgSerIleSer151015AspLeuHisGlnThrLeuLysLysGluLeuAlaLeuProGluTyrTyr202530GlyGluAsnLeuAspAlaLeuTrpAspCysLeuThrGlyTrpValGlu354045TyrProLeuValLeuGluTrpArgGlnPheGluGlnSerLysGlnLeu505560ThrGluAsnGlyAlaGluSerValLeuGlnValPheArgGluAlaLys65707580AlaGluGlyCysAspIleThrIleIleLeuSer8590(2)SEQIDNO:5的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度4032個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)狀(ⅱ)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc=“質(zhì)粒pMV71”(ⅲ)推測(cè)不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置1999..3400(D)其它資料/標(biāo)記=PRAC1/注解=“水稻肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)域-在引導(dǎo)序列中含有內(nèi)含子”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置3401..3676(D)其它資料/標(biāo)記=芽孢桿菌RNA酶抑制劑/注解=“芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置3677..4003(D)其它資料/標(biāo)記=3’nos/注解=“含有農(nóng)桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’未轉(zhuǎn)譯末端的區(qū)域”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置3399..3404(D)其它資料/標(biāo)記=NcoⅠ/注解=“NcoⅠ識(shí)別位點(diǎn)”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置4016..4021(D)其它資料/標(biāo)記=KpnⅠ/注解=“KpnⅠ識(shí)別位點(diǎn)”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:5CAAGCTTGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTAT60TTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTC120AATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCT180TTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAG240ATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTA300AGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTC360TGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCA420TACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGG480ATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGG540CCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACA600TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAA660ACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAA720CTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATA780AAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAAT840CTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGC900CCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATA960GACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTT1020ACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGA1080AGATCCTTTTTGGCTCGAGTCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACT1140GAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCG1200TAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATC1260AAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATA1320CTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTA1380CATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTC1440TTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGG1500GGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTAC1560AGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGG1620TAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGT1680ATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCT1740CGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG1800CCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATA1860ACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCA1920GCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGC1980GTTGGCCTGATCAGAATTTCGAGGTCATTCATATGCTTGAGAAGAGAGTCGGGATAGTCC2040AAAATAAAACAAAGGTAAGATTACCTGGTCAAAAGTGAAAACATCAGTTAAAAGGTGGTA2100TAAAGTAAAATATCGGTAATAAAAGGTGGCCCAAAGTGAAATTTACTCTTTTCTACTATT2160ATAAAAATTGAGGATGTTTTTGTCGGTACTTTGATACGTCATTTTTGTATGAATTGGTTT2220TTAAGTTTATTCGCTTTTGGAAATGCATATCTGTATTTGAGTCGGGTTTTAAGTTCGTTT2280GCTTTTGTAAATACAGAGGGATTTGTATAAGAAATATCTTTAAAAAAACCCATATGCTAA2340TTTGACATAATTTTTGAGAAAAATATATATTCAGGCGAATTCTCACAATGAACAATAATA2400AGATTAAAATAGCTTTCCCCCGTTGCAGCGCATGGGTATTTTTTCTAGTAAAAATAAAAG2460ATAAACTTAGACTCAAAACATTTACAAAAACAACCCCTAAAGTTCCTAAAGCCCAAAGTG2520CTATCCACGATCCATAGCAAGCCCAGCCCAACCCAACCCAACCCAACCCACCCCAGTCCA2580GCCAACTGGACAATAGTCTCCACACCCCCCCACTATCACCGTGAGTTGTCCGCACGCACC2640GCACGTCTCGCAGCCAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAAAAACAGCAG2700GTGGGTCCGGGTCGTGGGGGCCGGAAACGCGAGGAGGATCGCGAGCCAGCGACGAGGCCG2760GCCCTCCCTCCGCTTCCAAAGAAACGCCCCCCATCGCCACTATATACATACCCCCCCCTC2820TCCTCCCATCCCCCCAACCCTACCACCACCACCACCACCACCTCCACCTCCTCCCCCCTC2880GCTGCCGGACGACGAGCTCCTCCCCCCTCCCCCTCCGCCGCCGCCGCGCCGGTAACCACC2940CCGCCCCTCTCCTCTTTCTTTCTCCGTTTTTTTTTTCCGTCTCGGTCTCGATCTTTGGCC3000TTGGTAGTTTGGGTGGGCGAGAGGCGGCTTCGTGCGCGCCCAGATCGGTGCGCGGGAGGG3060GCGGGATCTCGCGGCTGGGGCTCTCGCCGGCGTGGATCCGGCCCGGATCTCGCGGGGAAT3120GGGGCTCTCGGATGTAGATCTGCGATCCGCCGTTGTTGGGGGAGATGATGGGGGGTTTAA3180AATTTCCGCCATGCTAAACAAGATCAGGAAGAGGGGAAAAGGGCACTATGGTTTATATTT3240TTATATATTTCTGCTGCTTCGTCAGGCTTAGATGTGCTAGATCTTTCTTTCTTCTTTTTG3300TGGGTAGAATTTGAATCCCTCAGCATTGTTCATCGGTAGTTTTTCTTTTCATGATTTGTG3360ACAAATGCAGCCTCGTGCGGAGCTTTTTTGTAGGTAGACCATGGCCAAAAAAGCAGTCAT3420TAACGGGGAACAAATCAGAAGTATCAGCGACCTCCACCAGACATTGAAAAAGGAGCTTGC3480CCTTCCGGAATACTACGGTGAAAACCTGGACGCTTTATGGGATTGTCTGACCGGATGGGT3540GGAGTACCCGCTCGTTTTGGAATGGAGGCAGTTTGAACAAAGCAAGCAGCTGACTGAAAA3600TGGCGCCGAGAGTGTGCTTCAGGTTTTCCGTGAAGCGAAAGCGGAAGGCTGCGACATCAC3660CATCATACTTTCTTAATACGATCAATGGGAGATGAACAATATGGAAACACAAACCCGCAA3720GCTAGCTTGGCTCTAGAGGATCCGAAGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCT3780TAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACG3840TTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGA3900TTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACT3960AGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAAGATCCCCGGGTAC4020CGAGCTCGAATT4032(2)SEQIDNO:6的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度563個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc=“質(zhì)粒pLH43的部分”(ⅲ)推測(cè)不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置1..6(D)其它資料/標(biāo)記=NcoⅠ/注解=“NcoⅠ識(shí)別位點(diǎn)”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置3..278(D)其它資料/標(biāo)記=synb*/注解=“改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置279..545(D)其它資料/標(biāo)記=3’nos/注解=“含有農(nóng)桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’未轉(zhuǎn)譯末端的區(qū)域”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置558.563(D)其它資料/標(biāo)記=KpnⅠ/注解=“KpnⅠ識(shí)別位點(diǎn)”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:6CCATGGCCAAGAAGGCTGTCATCAACGGGGAGCAGATCAGGAGCATCAGCGACCTCCACC60AGACCCTCAAGAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAGTACTACGGTGAGAACCTCGACGCCCTCT120GGGACTGCCTCACCGGCTGGGTGGAGTACCCCCTCGTGTTGGAGTGGAGGCAGTTCGAGC180AGAGCAAGCAGCTCACCGAGAACGGCGCCGAGAGCGTGCTCCAAGTGTTCAGGGAGGCCA240AGGCCGAGGGCTGCGACATCACCATCATCCTCTCCTGATGGATCCGAAGCAGATCGTTCA300AACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC360ATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTA420TTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAA480AACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTA540GATCGGGAAGATCCCCGGGTACC563(2)SEQIDNO:7的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度5349個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc=“質(zhì)粒pTTS24的T-DNA”(ⅲ)推測(cè)不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置補(bǔ)體(1..25)(D)其它資料/標(biāo)記=RB/注解=“T-DNA右邊界”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置補(bǔ)體(98..331)(D)其它資料/標(biāo)記=3’g7/注解=“含有農(nóng)桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’未轉(zhuǎn)譯末端的區(qū)域”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置補(bǔ)體(332..883)(D)其它資料/標(biāo)記=bar/注解=“編碼膦蘇菌素乙?；D(zhuǎn)移酶的區(qū)域”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置補(bǔ)體(884..2258)(D)其它資料/標(biāo)記=P35S/注解=“花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置2281..3969(D)其它資料/標(biāo)記=PE1/注解=“水稻的E1基因的啟動(dòng)子(WO92/13956)”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置3970.4245(D)其它資料/標(biāo)記=synb*/注解=“改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置4246..4577(D)其它資料/標(biāo)記=3’chs/注解=“含有苯基苯乙烯酮合成酶基因的3’未轉(zhuǎn)譯末端的區(qū)域”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置補(bǔ)體(5325..5349)(D)其它資料/標(biāo)記=LB/注解=“T-DNA左邊界”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:7AATTACAACGGTATATATCCTGCCAGTACTCGGCCGTCGAACTCGGCCGTCGAGTACATG60GTCGATAAGAAAAGGCAATTTGTAGATGTTAATTCCCATCTTGAAAGAAATATAGTTTAA120ATATTTATTGATAAAATAACAAGTCAGGTATTATAGTCCAAGCAAAAACATAAATTTATT180GATGCAAGTTTAAATTCAGAAATATTTCAATAACTGATTATATCAGCTGGTACATTGCCG240TAGATGAAAGACTGAGTGCGATATTATGTGTAATACATAAATTGATGATATAGCTAGCTT300AGCTCATCGGGGGATCCTAGAACGCGTGATCTCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGAC360GGGGCGGTACCGGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTCCCGT420GCTTGAAGCCGGCCGCCCGCAGCATGCCGCGGGGGGCATATCCGAGCGCCTCGTGCATGC480GCACGCTCGGGTCGTTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCT540CCAGGGACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTGGAGCCCAGTCCCGTCCGCTGGTGGCGGG600GGGAGACGTACACGGTCGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCGTGCCTTCCAGGGGC660CCGCGTAGGCGATGCCGGCGACCTCGCCGTCCACCTCGGCGACGAGCCAGGGATAGCGCT720CCCGCAGACGGACGAGGTCGTCCGTCCACTCCTGCGGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGT780TGACCGTGCTTGTCTCGATGTAGTGGTTGACGATGGTGCAGACCGCCGGCATGTCCGCCT840CGGTGGCACGGCGGATGTCGGCCGGGCGTCGTTCTGGGTCCATGGTTATAGAGAGAGAGA900TAGATTTATAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC960TTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGT1020GGAGATGTCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCAC1080GATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAAT1140GATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGAGCCACCTTCCTTTTCTACTGT1200CCTTTCGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGAAATTAT1260CCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGACATTTTT1320GGAGTAGACCAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTGACGAAGATTTTCTTCTTGTCATTGAG1380TCGTAAAAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTCACGGCGAGTTCTGTTAGATCCTC1440GATTTGAATCTTAGACTCCATGCATGGCCTTAGATTCAGTAGGAACTACCTTTTTAGAGA1500CTCCAATCTCTATTACTTGCCTTGGTTTATGAAGCAAGCCTTGAATCGTCCATACTGGAA1560TAGTACTTCTGATCTTGAGAAATATGTCTTTCTCTGTGTTCTTGATGCAATTAGTCCTGA1620ATCTTTTGACTGCATCTTTAACCTTCTTGGGAAGGTATTTGATCTCCTGGAGATTGTTAC1680TCGGGTAGATCGTCTTGATGAGACCTGCTGCGTAGGCCTCTCTAACCATCTGTGGGTCAG1740CATTCTTTCTGAAATTGAAGAGGCTAACCTTCTCATTATCAGTGGTGAACATAGTGTCGT1800CACCTTCACCTTCGAACTTCCTTCCTAGATCGTAAAGATAGAGGAAATCGTCCATTGTAA1860TCTCCGGGGCAAAGGAGATCTCTTTTGGGGCTGGATCACTGCTGGGCCTTTTGGTTCCTA1920GCGTGAGCCAGTGGGCTTTTTGCTTTGGTGGGCTTGTTAGGGCCTTAGCAAAGCTCTTGG1980GCTTGAGTTGAGCTTCTCCTTTGGGGATGAAGTTCAACCTGTCTGTTTGCTGACTTGTTG2040TGTACGCGTCAGCTGCTGCTCTTGCCTCTGTAATAGTGGCAAATTTCTTGTGTGCAACTC2100CGGGAACGCCGTTTGTTGCCGCCTTTGTACAACCCCAGTCATCGTATATACCGGCATGTG2160GACCGTTATACACAACGTAGTAGTTGATATGAGGGTGTTGAATACCCGATTCTGCTCTGA2220GAGGAGCAACTGTGCTGTTAAGCTCAGATTTTTGTGGGCCCGGGCCTAGGCTAGCGGCCG2280CAGATCCTTCTGTGTGATTGTTTTATTAAAATTTAATATTTATCTGGAATACCTACCAAT2340ATATAGTAGACTTGTCAAGCTGCAAGAACTTCCAATCGCCGACAATACCAATAGAGATCC2400AACCACCTTAATATCATAAACAATCTGATTGTTAGTCCAGAACTATATTGAGTAGTGAAC2460AACAATAGCACATTAACATTATGAGGATTATTGGCTAACTCTGCAATTCAATATTCTGAT2520GCGTCTAATCTGGTCAATTTTAGCGCTCCAGAAAGAATTGCACAATCCTTGGACAATGTT2580GGCACTGGAACTGTTGCATGTTTTTACATCTCTTATTAACGTAGCAAAGGAGTAGATTAT2640TATGTACCAGGAGAAATCTCTTCAGATCCTTTCCACATGCAATGTCGTAAAGAACAGATA2700CAGTGTACGTTAGTTTGTAATGGACGGTCAATGCCATTTCTCTGAAGGCATGTTCAGAGA2760TGATGATTTCTGGGATCCTTGGAGGGGCCCTGAAATTCGGAAACAGTTAGTTGAGTTTTA2820GTACCTAATGTCTTGCGTTATACTACGTGAAATGCCATTTCTGTAAGCTGAGTTTTCTAC2880CATCTCCACAGGAAATAAAGCTAATACCTGTCCAAGAGTGGTGCGGCATTTGACCAAATG2940AAGATCACAAGCATGGCAAGAATGGCAATCTGGCAAAGGAGCGGAATTATATTGTATTCT3000ACTACATCGAACAGGAACCATATCAATGTTGCCCCAGCAAGGACCCCCGCAGATAAGTTC3060CTGTTCTTCCACAGCAGAATATCCGCAACTGCATAGCTCCCAACAATGAAATCCAAAACC3120ACATCGGCTCAGAGAGAAGTTATGATAAAAGGCACTAATTCTGAATAATTTCCTAGAAAG3180CGAATAATAATAGCACACCTTGACCTCCACCAAGAAGCTTGTGGATCGACTTGTGCCCAT3240GAAATGGCATTCTGACATTCTGGTCACTGTCAGAATCTCTCGGAAAATGAGGAGGCATAG3300CTTCGTGTGTGTATGTGTGTGGGATATTACGCTGCTAAAACTTTGTGTTTCTGATCGATC3360TGGTTAGAGAGCATCGTCTTTATAAGCACTTAAAAATGGTAGTATAATCTCTCAAGGAGC3420CTATACTGCCAAGGAAAGGATAGCTTGGCCTGTGGGGATTGAGCCGTTGAAGGGAACAAA3480CGAATACAGTTACCTTACCAGATGTTTGCCACGACATGGGCAACGTCATTGCTAGACCAA3540GAAGGCAAGAAGCAAAGTTTAGCTGTCAAAAAAGATATGCTAGAGGCTTTCCAGAATATG3600TTCTATCTCAGCCAGACCAATGGGGGCAAAATTTACTACTATTTGCCATACATTAACCAC3660GTAAAAGTCCTACACTCAACCTAACTGTTGAACGGTCCTGTTCTGGCCAACGGTGAGAAT3720GCACCTAATGGACGGGACAACACTTCTTTCACCGTGCTACTGCTACATCCTGTAGACGGT3780GGACGCGTGAGGTGCTTTCGCCATGACCGTCCTTGGTTGTTGCAGTCACTTGCGCACGCT3840TGCACCGTGACTCACCTGCCACATTGCCCCCGCCGTCGCCGGCGCCTACAAAAGCCACAC3900ACGCACGCCGGCCACGATAACCCATCCTAGCATCCCGGTGTCCAGCAAGAGATCCATCAA3960GCCGTCGCGATGGCCAAGAAGGCTGTCATCAACGGGGAGCAGATCAGGAGCATCAGCGAC4020CTCCACCAGACCCTCAAGAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAGTACTACGGTGAGAACCTCGAC4080GCCCTCTGGGACTGCCTCACCGGCTGGGTGGAGTACCCCCTCGTGTTGGAGTGGAGGCAG4140TTCGAGCAGAGCAAGCAGCTCACCGAGAACGGCGCCGAGAGCGTGCTCCAAGTGTTCAGG4200GAGGCCAAGGCCGAGGGCTGCGACATCACCATCATCCTCTCCTGATGGATCTGGGGCCGC4260TCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGTCGGGTTGGGTTATTTTCTTATTTCCGTA4320ATAAAAAAGTGGACATGGTTACCTATTATTGTGATGTGTGCTGCATGTGAGCTATATTGG4380CGATTTCTCTCTTGTAACGCTTTGTACTTGTACCGTTTCGTTGTGATCATTGAAATAAAG4440GCCTATATAAAAATAATTTATGTTATTTGTTGGTTTATGTGTGTGTTTTTTTTTTTTTTT4500TTTAGTCAAAATATTTAAGTATTTCTATATAAATCTTTTGCAAGTTTTTTAAGTCATGGA4560GGAGATGTTATGAATTCTGTAATATAGTAAAAATATTACGTGAAAAACCAGAGGATCCGG4620GGAATTCCCAGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGA4680GAAGCAGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGACACCATGGC4740ATCACAGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAATGATT4800TTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTTTTATA4860ATGCCAACTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCATCCGGATTCTCTGAGCCCACCGTGTTCAC4920CACCACCGTGGTGCTGTTACGTCTGGCTTTCAGCTGAATGGTGCAGTTCTGTACCGGTTT4980TCCTGTGCCGTCTTTCAGGACTCCTGAAATCTTTACTGCCATATTCACCCCACAAAAAAG5040CCCACCGGTTCCGGCGGGCTGTCATAACACTGTGTTACCTGGCTAATCAGAATTTATAAC5100CGACCCCAACGATGAATCCGTCAGTACGCCAGTCGCCACTGCCGGAGCCTTCATAAGCAA5160TATCAACAACGACGGACGCTGCCGGATTAATCTGTATACCTGCACTCCACGCCACTGAGG5220TATGCCGCATTGCACTTTCGTCCCTGGCAGTGGTCGTCTCTTTCATATACCCGACTCTAG5280AGGATCCCCCGGGTACCGAGCTCTCCCCAGATCTGCATGGAGCCATTTACAATTGAATAT5340ATCCTGCCG5349(2)SEQIDNO:8的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸CASOLX1”(ⅲ)推測(cè)不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置10..15(D)其它資料/標(biāo)記=KpnⅠ/注解=“KpnⅠ識(shí)別位點(diǎn)”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:8的資料CAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCC24(2)SEQIDNO:9的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸CASOLX2”(ⅲ)推測(cè)不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置5..10(D)其它資料/標(biāo)記=AatⅡ/注解=“AatⅡ識(shí)別位點(diǎn)”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置30..50(D)其它資料/標(biāo)記=3’g7/注解=“含有農(nóng)桿菌T-DNA的3’未轉(zhuǎn)譯末端的部分”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:9CCCCGACGTCAAGCTTGAATTCGCGATACGTACATGGTCGATAAGAAAAG50(2)(2)SEQIDNO:10的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度5611個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)狀(ⅱ)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc=“質(zhì)粒pLH48”(ⅲ)推測(cè)不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置補(bǔ)體(39..317)(D)其它資料/標(biāo)記=3’nos/注解=“含有農(nóng)桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’未轉(zhuǎn)譯末端的區(qū)域”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置補(bǔ)體(318..869)(D)其它資料/標(biāo)記=bar/注解=“編碼膦蘇菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶的區(qū)域”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置補(bǔ)體(870..1702)(D)其它資料/標(biāo)記=P35S/注解=“花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置1740..2284(D)其它資料/標(biāo)記=PTA29/注解=“煙草TA29基因的啟動(dòng)子”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置2285..2560(D)其它資料/標(biāo)記=synb*/注解=“改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/鍵-(B)位置2561..2892(D)其它資料/標(biāo)記=3’chs/注解=“含有苯基苯乙烯酮合成酶基因的3’未轉(zhuǎn)譯末端的區(qū)域”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:10AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGACA60CCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTATTAAA120TGTATAATTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACA180TGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGAC240CGGCAACAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAAATGTTTGAACGATCTGCTTCGG300ATCCTAGACGCGTGAGATCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGTACCGGC360AGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTCCCGTGCTTGAAGCCGGCC420GCCCGCAGCATGCCGCGGGGGGCATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCGCACGCTCGGGTCG480TTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAGC540AGGTGGGTGTAGAGCGTGGAGCCCAGTCCCGTCCGCTGGTGGCGGGGGGAGACGTACACG600GTCGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCGTGCCTTCCAGGGGCCCGCGTAGGCGATG660CCGGCGACCTCGCCGTCCACCTCGGCGACGAGCCAGGGATAGCGCTCCCGCAGACGGACG720AGGTCGTCCGTCCACTCCTGCGGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCGTGCTTGTC780TCGATGTAGTGGTTGACGATGGTGCAGACCGCCGGCATGTCCGCCTCGGTGGCACGGCGG840ATGTCGGCCGGGCGTCGTTCTGGGTCCATGGTTATAGAGAGAGAGATAGATTTATAGAGA900GAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAG960GGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC1020AATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGG1080GTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAATGATAGCCTTTCCTT1140TATCGCAATGATGGCATTTGTAGGAGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTCGATGAAGT1200GACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGAAATTATCCTTTGTTGAAAAG1260TCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGACATTTTTGGAGTAGACCAGAG1320TGTCGTGCTCCACCATGTTGACGAAGATTTTCTTCTTGTCATTGAGTCGTAAAAGACTCT1380GTATGAACTGTTCGCCAGTCTTCACGGCGAGTTCTGTTAGATCCTCGATTTGAATCTTAG1440ACTCCATGCATGGCCTTAGATTCAGTAGGAACTACCTTTTTAGAGACTCCAATCTCTATT1500ACTTGCCTTGGTTTATGAAGCAAGCCTTGAATCGTCCATACTGGAATAGTACTTCTGATC1560TTGAGAAATATGTCTTTCTCTGTGTTCTTGATGCAATTAGTCCTGAATCTTTTGACTGCA1620TCTTTAACCTTCTTGGGAAGGTATTTGATCTCCTGGAGATTGTTACTCGGGTAGATCGTC1680TTGATGAGACCTGCTGCGTAGGAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCA1740TCTAGCTAAGTATAACTGGATAATTTGCATTAACAGATTGAATATAGTGCCAAACAAGAA1800GGGACAATTGACTTGTCACTTTATGAAAGATGATTCAAACATGATTTTTTATGTACTAAT1860ATATACATCCTACTCGAATTAAAGCGACATAGGCTCGAAGTATGCACATTTAGCAATGTA1920AATTAAATCAGTTTTTGAATCAAGCTAAAAGCAGACTTGCATAAGGTGGGTGGCTGGACT1980AGAATAAACATCTTCTCTAGCACAGCTTCATAATGTAATTTCCATAACTGAAATCAGGGT2040GAGACAAAATTTTGGTACTTTTTCCTCACACTAAGTCCATGTTTGCAACAAATTAATACA2100TGAAACCTTAATGTTACCCTCAGATTAGCCTGCTACTCCCCATTTTCCTCGAAATGCTCC2160AACAAAAGTTAGTTTTGCAAGTTGTTGTGTATGTCTTGTGCTCTATATATGCCCTTGTGG2220TGCAAGTGTAACAGTACAACATCATCACTCAAATCAAAGTTTTTACTTAAAGAAATTAGC2280TACCATGGCCAAGAAGGCTGTCATCAACGGGGAGCAGATCAGGAGCATCAGCGACCTCCA2340CCAGACCCTCAAGAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAGTACTACGGTGAGAACCTCGACGCCCT2400CTGGGACTGCCTCACCGGCTGGGTGGAGTACCCCCTCGTGTTGGAGTGGAGGCAGTTCGA2460GCAGAGCAAGCAGCTCACCGAGAACGGCGCCGAGAGCGTGCTCCAAGTGTTCAGGGAGGC2520CAAGGCCGAGGGCTGCGACATCACCATCATCCTCTCCTGATGGATCTGGGGCCGCTCTAG2580AACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGTCGGGTTGGGTTATTTTCTTATTTCCGTAATAAA2640AAAGTGGACATGGTTACCTATTATTGTGATGTGTGCTGCATGTGAGCTATATTGGCGATT2700TCTCTCTTGTAACGCTTTGTACTTGTACCGTTTCGTTGTGATCATTGAAATAAAGGCCTA2760TATAAAAATAATTTATGTTATTTGTTGGTTTATGTGTGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTAG2820TCAAAATATTTAAGTATTTCTATATAAATCTTTTGCAAGTTTTTTAAGTCATGGAGGAGA2880TGTTATGAATTCTGTAATATAGTAAAAATATTACGTGAAAAACCAGAGGATCCGGGGAAT2940TCCCAGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGAGAAGC3000AGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGACACCATGGCATCAC3060AGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAATGATTTTATT3120TTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTTTTATAATGCC3180AACTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCATCCGGATTCTCTGAGCCCACCGTGTTCACCACCA3240CCGTGGTGCTGTTACGTCTGGCTTTCAGCTGAATGGTGCAGTTCTGTACCGGTTTTCCTG3300TGCCGTCTTTCAGGACTCCTGAAATCTTTACTGCCATATTCACCCCACAAAAAAGCCCAC3360CGGTTCCGGCGGGCTGTCATAACACTGTGTTACCTGGCTAATCAGAATTTATAACCGACC3420CCAACGATGAATCCGTCAGTACGCCAGTCGCCACTGCCGGAGCCTTCATAAGCAATATCA3480ACAACGACGGACGCTGCCGGATTAATCTGTATACCTGCACTCCACGCCACTGAGGTATGC3540CGCATTGCACTTTCGTCCCTGGCAGTGGTCGTCTCTTTCATATACCCGACTCTAGAGGAT3600CCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCTGATCAGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGT3660ATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGG3720CGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAAC3780GCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCG3840TTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCA3900AGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGC3960TCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTC4020CCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAG4080GTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCC4140TTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCA4200GCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTG4260AAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTG4320AAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCT4380GGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA4440GAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAA4500GGGATTTTGGTCATGAGACTCGAGCCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAA4560AAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAA4620TGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCC4680TGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCT4740GCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCA4800GCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATT4860AATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTT4920GCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCC4980GGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGC5040TCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTT5100ATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACT5160GGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGC5220CCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATT5280GGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCG5340ATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCT5400GGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAA5460TGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGT5520CTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGC5580ACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCA561權(quán)利要求1．包括編碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的DNA，所述芽孢桿菌RNA酶抑制劑具有以Met-Xaa開(kāi)頭的氨基酸序列，其中Xaa是選自于丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的組。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼具有選自于下列組的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑(a)SEQIDNo.2的氨基酸序列，其中第二氨基酸不是賴(lài)氨酸，而是丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸；(b)SEQIDNo.4的氨基酸序列；和(c)SEQIDNo.4的氨基酸序列，其中第二氨基酸不是丙氨酸，而是纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA含有低于40％的A和T核苷酸。4．根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的DNA，它具有對(duì)油菜，棉花，玉米，水稻和小麥，優(yōu)選的是油菜，玉米，水稻最佳的慣用密碼子。5．根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA含有不高于7％CG雙核苷酸和含有不高于9.5％的CNG三核苷酸。6．根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼具有SEQIDNo.4的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有SEQIDNo.3的核苷酸序列。8．根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有核苷酸序列ATGGCC，后面連接SEQIDNo.1的位置7和270之間的核苷酸序列。9．根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA與指導(dǎo)植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子可操作連接。10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA，其中所述啟動(dòng)子是指導(dǎo)在植物的雄蕊細(xì)胞中選擇性地轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。11．根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的DNA，其中所述啟動(dòng)子是指導(dǎo)至少在植物的氈絨層細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的DNA，其中所述的啟動(dòng)子是煙草的TA29基因的啟動(dòng)子，玉米CA55基因的啟動(dòng)子或水稻的E1,T72或T42基因的啟動(dòng)子。13．根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的DNA，其中所述啟動(dòng)子是35S啟動(dòng)子。15．包括權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的DNA的植物細(xì)胞。16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的植物細(xì)胞，它也包括芽孢桿菌RNA酶DNA。17．包括權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的DNA的植物。18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的植物，它也包括芽孢桿菌RNA酶DNA。19．根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的植物，它是油菜，棉花，玉米，水稻或小麥植物。20．根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的植物，它是單子葉植物，優(yōu)選的是玉米，水稻或小麥植物，特別是玉米或水稻植物。21．根據(jù)權(quán)利要求20所述的植物，從其花序可提取的每毫克的總蛋白質(zhì)產(chǎn)生至少20納克芽孢桿菌RNA酶抑制劑。22．具有以Met-Xaa開(kāi)頭的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，其中Xaa是選自于丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的組。23．根據(jù)權(quán)利要求22所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，具有選自于下列組的氨基酸序列(a)SEQIDNo.2的氨基酸序列，其中第二氨基酸不是賴(lài)氨酸，而是丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸；(b)SEQIDNo.4的氨基酸序列；和(c)SEQIDNo.4的氨基酸序列，其中第二氨基酸不是丙氨酸，而是纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，具有SEQIDNo.4的氨基酸序列。25．包括權(quán)利要求22-24任一項(xiàng)所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的植物。26．包括芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有低于40％的AT含量。27．根據(jù)權(quán)利要求26所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有對(duì)油菜，棉花，玉米，水稻和小麥，優(yōu)選的是油菜，玉米，水稻最佳的慣用密碼子。28．根據(jù)權(quán)利要求26-27任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA含有不高于7％CG雙核苷酸和含有不高于9.5％的CNG三核苷酸。29．根據(jù)權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有SEQIDNo.3的位置7和273之間的核苷酸序列，它是由ATG引導(dǎo)的。30．包括權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)所述的DNA的植物細(xì)胞。31．包括權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)所述的DNA的植物。32．權(quán)利要求1-14或權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)所述的DNA的應(yīng)用，用以恢復(fù)雄性不育品系的可育性。全文摘要在真核細(xì)胞中,特別是在植物細(xì)胞中,和尤其是在雄蕊細(xì)胞例如氈絨層細(xì)胞中,高產(chǎn)量地產(chǎn)生芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)的改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA,例如合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有低于40%的A和T核苷酸。其他改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì),所述蛋白質(zhì)具有以Met－Xaa開(kāi)頭的N－末端,其中Xaa是丙氨酸,纈氨酸,甘氨酸,天冬氨酸或谷氨酸。植物細(xì)胞和植物含有改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA和/或表達(dá)改進(jìn)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(zhì)。文檔編號(hào)C12N15/55GK1218509SQ97191341公開(kāi)日1999年6月2日申請(qǐng)日期1997年9月1日優(yōu)先權(quán)日1996年9月3日發(fā)明者F·米基爾斯,M·威廉斯申請(qǐng)人:植物遺傳系統(tǒng)公司