專利名稱：糖核苷酸的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及合成低聚糖的重要底物—糖核苷酸的制備方法。
背景技術：
近年，對糖鏈的研究進展迅速，隨著對其機能的明確了解，作為具有生理活性的低聚糖的醫(yī)藥品或功能性材料的用途開發(fā)正倍受矚目。但是，目前市售的低聚糖僅限于幾個種類，而且價格極高。此外，這些低聚糖僅能夠達到試劑水平制備，還不能夠進行大量制備。
以往，可通過天然物萃取法、化學合成法或酶合成法，或并用上述方法來制備低聚糖，一般認為其中的酶合成法為適于大量制備的方法。這是因為酶合成法在(1)不需要化學合成法中所謂的保護、脫保護等繁雜的步驟，能夠快速地合成目的產物低聚糖；(2)利用酶的底物的特異性，能夠合成結構特異性高的低聚糖等方面優(yōu)于其他方法的緣故。而且，由于近年的重組DNA技術的發(fā)展，使合成酶能夠以較低的成本大量生產，這樣就更顯示出酶合成法的優(yōu)越性。
作為利用酶合成法制備低聚糖的方法，一般包括以下2種，利用低聚糖加水分解酶的逆反應的方法以及利用糖轉移酶的方法。前一種方法由于使用的底物為單價便宜的單糖，所以在價格上占優(yōu)，但反應本身利用的是分解反應的逆反應，所以，從合成收率和用于制備具有復雜結構的低聚糖方面考慮，就不一定是最佳的方法。
另一方面，后一種方法為使用糖轉移酶的合成法，在合成收率和用于制備具有復雜結構的低聚糖方面比前一種方法有優(yōu)勢，此外，由于近年的重組DNA技術的進步，各種糖轉移酶的量化也隨著該技術的發(fā)展而發(fā)展。
但是，使用糖轉移酶的合成法中所用的供糖體糖核苷酸除了一部分之外，其余的價格仍很高，仍然維持其量只能夠達到試劑水平的供給量的現狀。例如，報道了由尿苷酸(UMP)和葡萄糖1-磷酸(G-1-P)通過化學合成獲得包含在大多數具有生理活性的糖鏈核心部分的葡萄糖供體尿核苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的方法，或以UMP和葡萄糖為底物的酵母菌體法(T.Tochikura et al.，J.Ferment.Technol.，46，957(1968)，S.Shirota，et al.，Agric，Biol.Chem.，35，325(1971)，S.Watanabe and ITakeda，Agric，Biol.Chem.，36，2265(1972))等，但在用于工業(yè)生產上還存在繼續(xù)探討的余地。
本發(fā)明者們研究了通過以UMP和葡萄糖為底物的以往的酵母菌體法制得UDPG的方法，但UDPG的生成量極少，添加的60％以上的UMP都轉變?yōu)榱四蜍杖姿?UTP)或尿苷二磷酸(UDP)，因此，還不能夠成為真正的UDPG生產方法，徹底達到實用化目的。
所以，本發(fā)明的目的就是改善以往的酵母菌體法，提供能夠有效地制備UDPG等糖核苷酸的方法。
發(fā)明的揭示本發(fā)明者們?yōu)榱诉_到上述目的而進行的研究的結果是利用酵母合成UDPG方法中最為重要的是由UMP合成UTP的反應體系；由葡萄糖合成G-1-P的反應體系和由UTP和G-1-P合成UDPG的反應體系這3個反應體系的有效的共同作用，相對于由UMP合成UTP的反應能夠較順利的進行，G-1-P的合成活性和由UTP與G-1-P獲得UDPG的合成活性較小，而且，如果上述反應體系不能夠有效地共同作用，其結果就是導致UDPG的產量降低。
為了解決上述問題進行了更進一步的研究，其結果是酵母中UDPG并不是合成的關鍵，關鍵在于UTP的合成，反應體系中使UDP葡萄糖焦磷酸化酶和G-1-P共存，能夠使各自的酶反應有效地進行，而且，能夠以高收率獲得目的產物UDPG。此外，該方法不僅限于UDPG的合成，還適用于其他糖核苷酸的合成，從而完成了本發(fā)明。
即，在利用酵母菌體由核苷酸制備糖核苷酸的方法中，本發(fā)明是以反應體系中使核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶和糖1-磷酸共存為特征的糖核苷酸的制備方法。
對圖的簡單說明

圖1表示UDPG的經時生成量。
圖2表示GDP甘露糖的經時生成量。
實施發(fā)明的最佳狀態(tài)本發(fā)明的糖核苷酸為公知的糖核苷酸，對其沒有特別的限定。具體來講包括UDPG、UDP半乳糖、UDP葡糖醛酸等UDP糖，GDP甘露糖、GDP巖藻糖、GDP葡萄糖等GDP糖，ADP葡萄糖等ADP糖，dTDP葡萄糖、dTDP半乳糖等dTDP糖，CDP葡萄糖等CDP糖等。
反應所用的酵母為以往制備核苷酸和糖核苷酸等時使用的酵母，對其沒有特別的限定。具體來講可使用屬于接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、酵母屬(saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、圓酵母屬(Torulopsis)、漢遜酵母屬(Hansenula)、德巴利酵母屬(Debarylmyces)等屬的酵母。這些酵母可以是鮮酵母，也可以是干酵母，從反應收率考慮較好的是使用干酵母。
對共存于反應體系的核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶的來源沒有特別的限定，可以來源于動物、植物和微生物等，可使用所有來源的物質，但從制備酶的簡便性等方面考慮，較好的是使用來源于微生物的核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶。而且，如果所用的核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶基因被克隆時，使用該被克隆的核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶基因，利用常用的方法以大腸菌為宿主可大量生產，由該重組菌可制備該酶。
這種核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶只要具有相應的活性，可以任何一種形態(tài)存在。具體來講可以是微生物的菌體、該菌體的處理物或由該處理物獲得的酶制劑。
制備微生物的菌體是通過使用可培養(yǎng)出該微生物的培養(yǎng)基，利用常用的方法培養(yǎng)后，再用離心分離等集菌方法進行的。具體來講，以屬于桿菌屬或大腸菌類的細菌為例進行說明，培養(yǎng)基可使用肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(1％胰酶水解胨、0.5％酵母提取物、1％食鹽)或2×YT培養(yǎng)基(1.6％胰酶水解胨、1％酵母提取物、0.5％食鹽)等。將菌種接種在該培養(yǎng)基中后，如有必要可在約30～50℃的范圍內，攪拌約10～50小時進行培養(yǎng)，然后，離心分離所得的培養(yǎng)液，通過微生物菌體的集菌制得具有核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶活性的微生物菌體。
微生物菌體的處理物是指通過機械破壞(組織搗碎器、壓榨機、勻漿機、乳缽等)、冷凍溶解、自身消化、干燥(冷凍干燥、風干等)、酶處理(使用溶菌酶等)、超聲波處理、化學處理(酸、堿處理等)等常用方法處理上述微生物菌體后獲得的菌體破壞物或菌體細胞壁或細胞膜的變性物。
酶制劑可使用通過通常的酶精制方法，例如，鹽析處理、等電點沉淀處理、有機溶劑沉淀處理、透析處理、各種色譜法處理等處理由上述菌體處理物獲得的具有核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶活性的部分所得的粗酶或精制酶。
對應于作為目的產物的糖焦磷酸化酶，反應液中添加的糖1-磷酸及核苷酸(核苷單磷酸)可從已知的物質中選擇，可使用市售品，也可使用利用公知的方法調制而成的物質。使用濃度較好的是約1～200mM，特別好的是約10～100mM。
合成糖核苷酸時使用的核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶、核苷酸及糖1-磷酸組成的具體例子如表1所示。
表1

此外，用糖1-磷酸的生成系統代替糖1-磷酸共存于反應液中也可以。例如，可利用蔗糖和蔗糖磷酸化酶組合形成的G-1-P生成系統(E.J.Vandamme et al.，Appl.Microbiol.，32，163-201(1987))，糖原和糖原磷酸化酶組合形成的G-1-P生成系統(P.H. Strausbauch et al.，Methods in Enzymology，11，671-675)等。
除了上述酶及底物之外，較好的是還在反應系統中添加無機磷酸和能量源。
所用的無機磷酸可以是未加處理的磷酸鉀等磷酸鹽，但較好的是使用磷酸緩沖液。使用濃度較好的約為10～500mM，特別好的約為100～300mM。此外，磷酸緩沖液的pH可設定在約6.0～9.0的范圍內。
所用的能量源包括葡萄糖、果糖、蔗糖等糖類，乙酸、檸檬酸等有機酸。
糖核苷酸的合成反應通過在磷酸緩沖液中添加酵母、核苷酸、糖1-磷酸、作為能源的糖類或有機酸，再添加核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶，其添加量較好的約在0.001單位/ml以上，更好的約在0.01～100單位/ml的范圍內，如有必要較好的是在約30℃以下，更好的是在約5～20℃的范圍內攪拌約1～50小時，使反應進行。
此外，糖1-磷酸和核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶可在反應開始前添加，但較好的是在反應開始后，對應于添加的核苷酸產生最大量核苷三磷酸時，在約60℃以上對反應液進行5分鐘以上的熱處理等使酶源失活的處理后，添加糖1-磷酸和核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶，繼續(xù)進行酶反應。
用糖核苷酸的常用分離精制方法(離子交換色譜法、吸附色譜法、鹽析等)分離精制所得的糖核苷酸。
實施例以下，通過實施例對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明并不僅限于此。
以下實施例中的DNA調制、通過限制酶的切斷、通過T4DNA連接酶的連接，以及大腸菌的轉化法都是根據《Molecular Cloning》(Maniatis等編，Cold springHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1982))進行的。而且，限制酶、AmpliTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶是寶酒造株式會社生產的。利用HPLC法進行反應液中糖核苷酸的定量。具體來講，進行分離時采用YMC株式會社制造的ODS-AQ312柱，洗脫液為0.5M磷酸-鉀溶液系統，或采用YMC株式會社制造的ODS-AM303柱，洗脫液為0.2M三乙胺-乙酸(pH8.0)系統。
實施例1UDPG的合成1(1)大腸菌UDP葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆用齊藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta.，72，619(1963))調制大腸菌12株JM109菌(寶酒造株式會社生產)的染色體DNA。將該DNA作為模板，通過常用的方法合成以下所示的2種引物DNA，再通過PCR法擴增大腸菌UDP葡萄糖焦磷酸化酶(galU)基因(Weissborn et al.，J.Bacteriol.，176，2611 91994))。
引物(A)5′-GCGAATTCTGATATACTGGGATGCGATAC-3′引物(B)5′-ACGTCGACACCGATACGGATGTATCTT-3′通過PCR進行的galU基因的擴增是將50mM氯化鉀、10mM Tris-鹽酸(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠和0.1μgDNA模板、引物DNA(A)(B)各0.2mM、2.5單位AmpliTaqDNA聚合酶組成的反應液100μl裝入DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制)，以熱變性(94℃，1分鐘)、退火(55℃，1.5分鐘)、聚合(72℃，1.5分鐘)的順序循環(huán)25次而進行的。
基因擴增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應液，在水溶性部分中添加2倍容量的乙醇，使DNA沉淀。按照文獻(Molecular Cloning，前述)所述方法通過瓊脂糖凝膠電泳分離沉淀回收的DNA，精制相當于1.0kb的DNA片段。通過限制酶EcoRI及SalI切斷該DNA，使用經過同樣的限制酶EcoRI及SalI消化的質粒pTrc99A(Pharmacia Biotech.社制)和T4DNA連接酶進行連接。用連接反應液進行大腸菌JM109菌的轉化，通過所得的氨芐青霉素耐性轉化體分離質粒pTrc-galU。pTrc-galU是在pTrc99A的trc啟動區(qū)下游的EcoRI-SalI切口部位插入含有大腸菌galU基因的EcoRI-SalIDNA片段而獲得的。
(2)大腸菌UDP葡萄糖焦磷酸化酶的調制將保持了質粒pTrc-galU的大腸菌JM109菌接種在300ml含有100mg/L氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中，于37℃振蕩，培養(yǎng)。當達到4×108菌/ml的狀態(tài)時，在培養(yǎng)液中添加IPTG，使其最終濃度達到1mM，然后，于37℃振蕩2.5小時，繼續(xù)培養(yǎng)。
懸浮在mM Tris-鹽酸(pH7.5)、5mMEDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶組成的60ml緩沖液中。在37℃保溫1小時后，進行超聲波處理，破壞菌體，再次進行離心分離(20,000×g，10分鐘)除去菌體殘渣。將所得的上清部分作為酶標準品。酶標準品中的UDP葡萄糖焦磷酸化酶活性和對照菌(保持pTrc99A的大腸菌JM109菌)的活性如表2所示。
表2

此外，UDP葡萄糖焦磷酸化酶活性單位(unit)可用以下所示方法測定，計算。即，在含有5mM的氯化鎂、6mMUTP、6mMG-1-P的50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)中添加酶標準品，將溫度保持在37℃進行反應，在100℃進行5分鐘熱處理使酶失活后，通過HPLC法對反應液中的UDPG進行定量，將37℃時1分鐘內生成1μ摩爾UDPG的活性計為1個單位(unit)。
(3)使用了干面包酵母的UDPG-UTP液的調制在容量為100ml的燒杯中調制由40mM UMP、100mM葡萄糖、200mM磷酸鈉(pH8.0)、10mM氯化鎂組成的反應液20ml，在其中懸浮2g干面包酵母(Oriental酵母工業(yè)株式會社)，于20℃攪拌9小時進行反應。反應結束后，于100℃對反應液處理5分鐘，通過離心分離(2,000×g，10分鐘)除去酵母菌體。用HPLC分析回收的上清部分后，可確認生成了7.9mM UDPG和21.9mM UTP。
(4)在UDPG-UTP液中添加UDP焦磷酸化酶及G-1-P合成UDP在100ml上述UDPG-UTP液中添加G-1-P，使其最終濃度達到30mM，然后，再添加實施例2所述的酶標準品，使UDP葡萄糖焦磷酸化酶達到0.5單位/ml，于30℃反應30小時。用HPLC對反應液中的UDPG濃度進行分析后，可確認生成了30.9mM UDPG。
實施例2UDPG的合成2用與實施例1的(3)和(4)相同的方法合成UDPG。但是，添加的UDP葡萄糖焦磷酸化酶分別為酶單位為0單位、0.5單位或5單位的酶。
UDPG的經時生成量如圖1所示。
實施例3UDPG的合成3(1)大腸菌麥芽糊精磷酸化酶基因的克隆用齊藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Atca.，72，619(1963))調制大腸菌12株JM109菌(寶酒造株式會社生產)的染色體DNA。將該DNA作為模板，通過常用的方法合成以下所示的2種引物DNA，再用PCR法擴增大腸菌麥芽糊精磷酸化酶(malP)基因(Nature，313(6002)，500～502(1985))。
引物(C)5′-TAGAATTCAACTCCTCCCTGCCTAATCCCCC-3′引物(D)5′-TTGGATCCCGGCATTATCCAGACGTTTGCTT-3′通過PCR進行的malP基因的擴增是將50mM氯化鉀、10mM Tris-鹽酸(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠和0.1μgDNA模板、引物DNA(C)(D)各0.2mM、2.5單位AmpliTaqDNA聚合酶組成的反應液10μl裝入DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制)，以熱變性(94℃，1分鐘)、退火(60℃，1.5分鐘)、聚合(72℃，3分鐘)的順序循環(huán)25次而進行的。
基因擴增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應液，在水溶性部分中添加2倍容量的乙醇，使DNA沉淀。按照文獻(Molecular Cloning，前述)所述方法通過瓊脂糖凝膠電泳分離沉淀回收的DNA，精制相當于2.0kb的DNA片段。通過限制酶EcoRI及BamHI切斷該DNA，使用經過同樣的限制酶EcoRI及BamHI消化的質粒pTrc99A(Pharmacia Biotech.社制)和T4DNA連接酶進行連接。用連接反應液進行大腸菌JM109菌的轉化，通過所得的氨芐青霉素耐性轉化體分離質粒pTrc-malP。pTrc-malP是在pTrc99A的trc啟動區(qū)下游的EcoRI-BamHI切口部位插入含有大腸菌malP基因的啟動區(qū)和結構基因的EcoRI-BamHIDNA片段而獲得的。
(2)大腸菌麥芽糊精磷酸化酶的調制將保持了質粒pTrc-malP的大腸菌JM109菌接種在300ml含有100mg/L氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中，于37℃振蕩8小時，進行培養(yǎng)。當達到4×108菌/ml的狀態(tài)時，在培養(yǎng)液中添加IPTG，使其最終濃度達到1mM，然后，于37℃振蕩5小時，繼續(xù)培養(yǎng)。
培養(yǎng)結束后，通過離心分離(9,000×g，10分鐘)回收菌體，將其懸浮在60ml由50mM Tris-鹽酸(pH7.5)、5mMEDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶組成的緩沖液中。在37℃保溫1小時后，進行超聲波處理，破壞菌體，再次進行離心分離(9,000×g，10分鐘)除去菌體殘渣。將所得的上清部分作為酶標準品。酶標準品中的麥芽糊精磷酸化酶活性和對照菌(保持pTrc99A的大腸菌JM109菌)的活性如表3所示。
表3

此外，本發(fā)明的麥芽糊精磷酸化酶活性單位(unit)可用以下所示方法測定，計算。即，在含有5mM的氯化鎂、6mMUTP、0.5％糊精(W/V)、1U/ml底物UDPG焦磷酸化酶的50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)中添加麥芽糊精磷酸化酶標準品，將溫度保持在30℃進行反應，添加與反應量等量的70％乙醇使酶失活，通過HPLC法對反應液中的UDPG進行定量，將30℃時1分鐘內生成1μ摩爾UDPG的活性計為1個單位(unit)。
(3)在UDPG-UTP酵母反應液中添加UDP焦磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶及糊精合成UDPG在100ml實施例1的(3)調制的UDPG-UTP液中添加糊精(Difico公司制)使最終濃度達到2％(W/V)，然后，添加UDP葡萄糖焦磷酸化酶及麥芽糊精磷酸化酶標準品，使其濃度達到0.5單位/ml，于30℃反應30小時。用HPLC分析反應液中的UDPG濃度，可以確認生成了31.0mM UDPG。
實施例4GDP甘露糖的合成(1)大腸菌GDP甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆用齊藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Atca.，72，619(1963))調制大腸菌ATCC4157的染色體DNA。將該DNA作為模板，通過常用的方法合成以下所示的2種引物DNA，再用PCR法擴增大腸菌GDP甘露糖焦磷酸化酶(manC)基因(Gordon Stevenson et al.，J.Bacteriol.，178，4885(1996))。
引物(E) 5′-ATGCCGAATTCCCGTCGAAACTGA-3′引物(F) 5′-GGAATTCCGTTGGGGAAATTGCCG-3′通過PCR進行的manCP基因的擴增是將50mM氯化鉀、10mM Tris-鹽酸(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠和0.1μgDNA模板、引物DNA(E)(F)各0.2mM、2.5單位AmpliTaqDNA聚合酶組成的反應液10μl裝入DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制)，以熱變性(94℃，1分鐘)、退火(55℃，2分鐘)、聚合(72℃，3分鐘)的順序循環(huán)25次而進行的。
基因擴增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應液，在水溶性部分中添加2倍容量的乙醇，使DNA沉淀。按照文獻(Molecular Cloning，前述)所述方法通過瓊脂糖凝膠電泳分離沉淀回收的DNA，精制相當于1.8kb的DNA片段。通過限制酶EcoRI切斷該DNA，使用經過同樣的限制酶EcoRI消化的質粒pUC18(寶酒造株式會社制)和T4DNA連接酶進行連接。用連接反應液進行大腸菌JM109菌的轉化，通過所得的氨芐青霉素耐性轉化體分離質粒pUC18-manC。pUC18-manC是在pUC18的lac啟動區(qū)下游的EcoRI切口部位插入含有大腸菌manC基因的EcoRI DNA片段而獲得的。
(2)大腸菌GDP甘露糖焦磷酸化酶的調制將保持了質粒pUC18-manC的大腸菌JM109菌接種在300ml含有100mg/L氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)。當達到4×108菌/ml的狀態(tài)時，在培養(yǎng)液中添加IPTG，使其最終濃度達到1mM，然后，于37℃振蕩5小時，繼續(xù)培養(yǎng)。
培養(yǎng)結束后，通過離心分離(9,000×g，10分鐘)回收菌體，將其懸浮在60ml由50mM Tris-鹽酸(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶組成的緩沖液中。在37℃保溫1小時后，進行超聲波處理，破壞菌體，再次進行離心分離(20,000×g，10分鐘)除去菌體殘渣。將所得的上清部分作為酶標準品。酶標準品中的GDP甘露糖焦磷酸化酶活性和對照菌(保持pUC18的大腸菌JM109菌)的活性如表4所示。
表4

此外，本發(fā)明的GDP甘露糖焦磷酸化酶活性單位(unit)可用以下所示方法測定，計算。即，在含有1mM的氯化鎂、5mM GTP、5mM甘露糖-1-P的50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.6)中添加酶標準品，將溫度保持在37℃進行反應，于100℃熱處理5分鐘使酶失活，通過HPLC法對反應液中的GDP甘露糖進行定量，將37℃時1分鐘內生成1μ摩爾GDP甘露糖的活性計為1個單位(unit)。
(3)使用了干面包酵母的GDP甘露糖-GTP液的調制在容量為100ml的燒杯中調制20ml由40mM GMP、200mM葡萄糖、200mM磷酸鉀(pH8.0)、10mM氯化鎂組成的反應液，在其中懸浮2g干面包酵母(Oriental酵母工業(yè)株式會社)，于20℃攪拌7小時進行反應。反應結束后，于100℃對反應液處理5分鐘，通過離心分離(2,000×g，10分鐘)除去酵母菌體。用HPLC分析回收的上清部分后，可確認生成了11.2mM GDP甘露糖和10.1mMGTP。
(4)在GDP甘露糖-GTP液中添加GDP甘露糖焦磷酸化酶及甘露糖-1-P合成GDP甘露糖在200μl上述GDP甘露糖-GTP液中添加甘露糖-1-P，使其最終濃度達到20mM，然后，再添加上述酶標準品，使GDP甘露糖焦磷酸化酶達到0.1單位/ml，加水使總體積達到400μl，于37℃反應8小時。用HPLC對反應液中的GDP甘露糖濃度進行分析后，可確認生成了10.5mM GDP甘露糖。
實施例5用與實施例4的(3)及(4)相同的方法合成GDP甘露糖。但是，添加的GDP甘露糖焦磷酸化酶分別為酶單位為0、0.025、0.05或0.1單位的酶。GDP甘露糖的經時生成量如圖2所示。
產業(yè)上利用的可能性利用本發(fā)明能夠有效地制備用以往的酵母菌體法產率較低的各種糖核苷酸。
權利要求
1.一種糖核苷酸的制備方法，是使用了酵母菌體，由核苷酸制備糖核苷酸的方法，其特征在于，使核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶和糖1-磷酸共存于反應體系中。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征還在于，糖核苷酸選自UDP糖、GDP糖、ADP糖、dTDP糖及CDP糖。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征還在于，糖核苷酸選自以下A群的(1)～(5)(1)UDP糖、UDP葡萄糖、UDP半乳糖及UDP葡糖醛酸(2)GDP糖GDP甘露糖、GDP巖藻糖及GDP葡萄糖(3)ADP糖ADP葡萄糖(4)dTDP糖dTDP葡萄糖及dTDP半乳糖(5)CDP糖CDP葡萄糖。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征還在于，用糖1-磷酸生成體系代替糖1-磷酸共存于反應體系中。
5.如權利要求4所述的制備方法，其特征還在于，糖1-磷酸生成體系使用了磷酸化酶。
6.如權利要求4所述的制備方法，其特征還在于，糖1-磷酸生成體系為葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)的生成體系。
7.如權利要求4所述的制備方法，其特征還在于，糖1-磷酸生成體系為蔗糖和蔗糖磷酸化酶形成的G-1-P生成體系，糖原和糖原磷酸化酶形成的G-1-P生成體系或糊精和麥芽糊精磷酸化酶形成G-1-P生成體系。
全文摘要
本發(fā)明是使用了酵母菌體,由核苷酸制備糖核苷酸的方法,其特征是使核苷二磷酸－糖焦磷酸化酶和糖1－磷酸共存于反應體系中。利用該方法能夠有效地制備用以往的酵母菌體法產率較低的各種糖核苷酸。
文檔編號C12P19/00GK1200765SQ97191233
公開日1998年12月2日 申請日期1997年8月29日 優(yōu)先權日1996年9月11日
發(fā)明者竹之內健治, 浜本智樹, 野口利忠 申請人:山佐醬油株式會社