專利名稱：血管活性胺結(jié)合分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管活性胺結(jié)合分子(VABM)及其在調(diào)節(jié)血管活性胺類作用中的用途。本發(fā)明特別涉及來源于寄生蟲蛋白或其衍生物的VABM。本發(fā)明還涉及血管活性胺的檢測(cè)與定量以及對(duì)由動(dòng)物和人類中的寄生蟲引起，尤其是那些由家畜的外寄生蟲引起的疾病或損傷的控制。也涉及到血管活性結(jié)合分子在疾病和變態(tài)反應(yīng)治療中的用途。本發(fā)明也涉及運(yùn)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)VABM。
血管活性胺類如組胺和5-羥色胺是動(dòng)物中(包括人類)炎癥的介質(zhì)及特定生理過程的調(diào)節(jié)物。組胺存在于肥大細(xì)胞及嗜堿細(xì)胞的分泌顆粒中并經(jīng)組氨酸脫羧作用形成。它還存在于麥角及植物中并可從組氨酸或枸櫞酸合成。
在人類中組胺的主要作用是刺激胃的分泌、收縮大多數(shù)平滑肌、刺激心臟、舒張血管以及增強(qiáng)血管通透性。除它在免疫反應(yīng)及炎癥過程中的調(diào)節(jié)作用外，組胺還調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)許多細(xì)胞因子(包括那些調(diào)節(jié)炎癥的的細(xì)胞因子)的產(chǎn)生，并能夠干擾細(xì)胞因子受體的表達(dá)。另外，組胺促進(jìn)傷口愈合。
組胺最主要的病理生理作用是作為胃酸分泌的刺激物以及作為Ⅰ型超敏反應(yīng)(例如蕁麻疹及枯草熱)的介質(zhì)。組胺或其受體也可以直接或間接地參與自身免疫病，如關(guān)節(jié)炎或與腫瘤生長(zhǎng)(Falus,1994)。
組胺通過作用于特定的組胺受體(其三個(gè)主要類型H1、H2、H3可通過選擇性拮抗物以及激動(dòng)劑來鑒別)而產(chǎn)生作用。組胺H1和H2受體拮抗物在臨床上有用，但在目前主要用組胺H3受體拮抗物作為研究工具。
H1受體拮抗物(抗組胺類)被廣泛用于治療包括變應(yīng)性鼻炎(枯草熱)、蕁麻疹、昆蟲叮咬以及藥物過敏性在內(nèi)的變態(tài)反應(yīng)。優(yōu)選缺乏鎮(zhèn)靜藥或毒蕈堿性受體拮抗藥活性的藥物。H1受體拮抗藥還被用作預(yù)防暈動(dòng)病或其它惡心原因(包括嚴(yán)重的孕婦晨吐)的抗催吐藥。一些抗組胺類的毒蕈堿性受體拮抗作用也許有助于療效，但也引起副反應(yīng)。一些H1受體拮抗藥是十分有力的鎮(zhèn)靜藥因此或可用于這種作用。
H1受體拮抗物具有許多不良作用。當(dāng)純粹用于抗組胺作用時(shí)，所有的CNS效應(yīng)均是不希望有的。當(dāng)用于其鎮(zhèn)靜藥或抗催吐作用時(shí)，一些CNS效應(yīng)如頭暈、耳鳴以及疲倦是不想要的。多余劑量能夠引起興奮并可在兒童中產(chǎn)生抽搐。外周抗毒蕈堿作用一直是不受歡迎的。這些中最普通的是口干，但視力模糊、便秘以及尿潴留也可能發(fā)生。也已觀察到與藥物的藥理學(xué)功能無關(guān)的不想要的作用。因此雖然局部應(yīng)用這些藥物后可以發(fā)生變應(yīng)性皮炎，但胃腸紊亂也相當(dāng)普遍。
H2受體拮抗物被頻繁用作胃酸分泌抑制劑。它們被用作治療消化性潰瘍的選擇藥物，用作佐林格-埃利森綜合癥的二線藥物以及用于治療回流性食管炎。據(jù)報(bào)道不想要的效應(yīng)包括腹瀉、頭暈、肌痛、一過性疹子以及血胃泌素過多癥。一些H2受體拮抗物可在男性中引起男性女性型乳房，并在老年人中引起精神混亂。
除這些非期望的效應(yīng)以外，一些組胺拮抗物如果與酒精或藥物共同服用會(huì)造成麻煩。例如，將抗組胺特非那定與抗生素、抗真菌藥聯(lián)用可能引起危及生命的副反應(yīng)。
用于控制組胺作用的藥物并非常常奏效。它們的功效有限的原因也許與這些藥物的專一性僅僅針對(duì)一個(gè)亞類的組胺受體有關(guān)，特別是在某些疾病要求干擾廣譜受體時(shí)。組胺結(jié)合分子(HBM)可以與所有的受體競(jìng)爭(zhēng)組胺結(jié)合，因此也許更適于治療某些疾病。
激素血清素(也稱為5-羥色胺)不但是血管收縮劑還是神經(jīng)遞質(zhì)。它也能夠增強(qiáng)血管通透性，誘導(dǎo)毛細(xì)管擴(kuò)張并導(dǎo)致非血管性平滑肌收縮。5-羥色胺存在于大腦和腸組織，并由松果體和血小板產(chǎn)生。涉及5-羥色胺的病理學(xué)方面包括血壓異常、偏頭痛、精神失常、呼吸系統(tǒng)疾病以及冠狀心臟病。5-羥色胺的激動(dòng)劑和拮抗物用于治療一部分這些疾病，但也常常存在人們不希望的副反應(yīng)。
因此，十分需要血管活性胺類的有效拮抗物，其中所述拮抗物不產(chǎn)生偏離其治療人類及動(dòng)物疾病適用性的副反應(yīng)。
也需要在例如食品、各種體液(如血漿或尿)或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中定量檢測(cè)組胺，以便監(jiān)測(cè)如特定變應(yīng)原的作用，或?qū)δ撤N變態(tài)反應(yīng)確定特定的拮抗治療。目前所運(yùn)用的系統(tǒng)(放射免疫測(cè)定和ELISA)采用抗組胺或?qū)菇M胺衍生物的抗體。但是，組胺的免疫原性并不十分強(qiáng)，使得難以產(chǎn)生對(duì)其高親和性的抗體，并且大多數(shù)目前所運(yùn)用的定量系統(tǒng)并非十分靈敏，或者需要對(duì)待測(cè)組胺進(jìn)行修飾(例如?；饔没蚣谆饔?。在類似這些的檢測(cè)中用HBM取代抗體將為未修飾組胺的測(cè)定提供一個(gè)高靈敏度系統(tǒng)。
HBM優(yōu)于抗組胺抗體的另一優(yōu)點(diǎn)在于，在研究某些生物學(xué)過程時(shí)，它們能夠用作例如從細(xì)胞培養(yǎng)物中去除游離(未結(jié)合)組胺形式的研究工具。由于在大多數(shù)細(xì)胞上存在抗體受體，因此抗體可能干擾這些細(xì)胞發(fā)揮正常功能。
眾所周知，例如蜱的吸血性外寄生蟲可產(chǎn)生許多生物活性蛋白，這類蛋白免疫調(diào)節(jié)宿主對(duì)寄生蟲嗜食反應(yīng)的并因此促進(jìn)寄生蟲吸血。這些免疫調(diào)節(jié)蛋白包括產(chǎn)生于蜱血淋巴和唾液中并結(jié)合于有脊椎動(dòng)物宿主免疫球蛋白上的免疫球蛋白結(jié)合蛋白(IGBP)(Wang和Nuttall,1995)。它們還包括錐蝽長(zhǎng)紅獵蝽的唾液攜帶一氧化氮血的血紅素蛋白(nitrophorin)，該蛋白除攜帶一氧化氮外，還能夠結(jié)合組胺(Ribeiro和Walker,1994)。免疫調(diào)節(jié)蛋白還可由其它吸血性寄生蟲產(chǎn)生，這些寄生蟲例如為蚊子和水蛭以及產(chǎn)生毒液的動(dòng)物，如蛇和蜘蛛。
我們已發(fā)現(xiàn)例如蜱的吸血性外寄生蟲產(chǎn)生能夠結(jié)合于血管活性胺類、特別是組胺和5-羥色胺的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)在下文中稱為血管活性胺結(jié)合蛋白(VABP)。
我們已從蜱中分離到四種VABP，在此將其命名為MS-HBP1、FS-HBP1、FS-HBP2和D.RET6，它們彼密切相關(guān)。這些蛋白質(zhì)是全新的，并未顯示與任何以前所描述的蛋白質(zhì)有明顯相同之處。編碼這些蛋白質(zhì)或其片段的DNA序列可被用來從相同或不同種中分離相同家族中的其它相關(guān)蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供血管活性胺結(jié)合蛋白(VABP)，其解離常數(shù)小于10- 7M，它們特異性結(jié)合于血管活性胺類，且與MS-HBP1、FS-HBP1、FS-HBP2及D.RET6屬于同一蛋白家族。
如果在單獨(dú)的四種VABP序列對(duì)比中作為相似殘基完全保守的40％或更多氨基酸，在該蛋白被包括在該序列對(duì)比中時(shí)仍然作為相同殘基完全保守，則該蛋白被認(rèn)為屬于該家族，所述VABP的序列對(duì)比采用GCG’S堆集法則(威斯康辛軟件包程序手冊(cè)，1994；間隙產(chǎn)生補(bǔ)償值=2.50；間隙擴(kuò)張補(bǔ)償值=0.05)獲得]。作為VABP家族成員的還包括那些來源于吸血節(jié)肢動(dòng)物的以親和力結(jié)合于組胺的蛋白質(zhì)，其特征在于其解離常數(shù)小于10-7M，并含有序列基元D/EAWK/R及Y/CE/DL/IW。
本發(fā)明的VABP包括天然的生物學(xué)變異體(如衍生VABP的種內(nèi)的等位基因變異體或在地域性變異體)。
本發(fā)明還包括與血管活性胺結(jié)合蛋白、或與VABP屬于同一蛋白家族的蛋白質(zhì)功能相當(dāng)?shù)钠溲苌锘蚱淦?。本發(fā)明的VABP，衍生物及片段在下文中稱為血管活性胺結(jié)合分子(VABM)。
根據(jù)本發(fā)明的VABP是強(qiáng)的特異性血管活性胺結(jié)合物，其解離常數(shù)低于10-7M。先前所描述的高親和性組胺或5-羥色胺受體是形成組胺或5-羥色胺靶細(xì)胞膜部分的蛋白質(zhì)(Falus 1994)。因此它們與本發(fā)明的非膜結(jié)合蛋白不同。
本發(fā)明的VABP與以上所討論的已知免疫調(diào)節(jié)蛋白無關(guān)，而是具有不同的作用方法。本發(fā)明的VABP從外源器官中分泌至哺乳動(dòng)物宿主動(dòng)物中，并作為該宿主炎癥和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)物發(fā)揮功能。在吸血性外寄性蟲中，這樣的炎癥和免疫應(yīng)答反而會(huì)抑制寄生蟲吸血。這種功能獲自VABP特異性結(jié)合于血管活性胺類的能力。
本發(fā)明的VABP可來源于吸血性寄生蟲以及產(chǎn)生毒液的動(dòng)物，如毒蛇和毒蜘蛛。本發(fā)明VABP優(yōu)選來源于吸血性外寄生蟲。最優(yōu)選的是，它們來源于蜱類。
如前所述，本發(fā)明還包括功能性相當(dāng)?shù)腣ABP衍生物和片段。用于此處的“功能性相當(dāng)”是表明所述衍生物和片段保留結(jié)合血管活性胺類的能力，或者它們含有可以用于導(dǎo)向膜的疫苗開發(fā)的如上所定義的VABP蛋白家族的表位?？梢酝ㄟ^單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加、插入和/或缺失，或者通過例如以去糖基化或糖基化方式化學(xué)修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸，從天然VABP獲得這些衍生物和片段。
例如，一種衍生物可以包括其氨基端或羧基端與VABP相融合或者已添加到VABP內(nèi)部的額外蛋白質(zhì)或多肽。額外多肽的目的可以是有助于所述VABM的檢測(cè)、表達(dá)、分離或純化，或者可以是賦予所述VABP所期望的額外特性。潛在的融合伙伴的例子包括β-半乳糖苷酶、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶、熒光素酶、多組氨酸標(biāo)記、T7聚合酶片段以及分泌信號(hào)肽。
本發(fā)明的VABM可以采用公知的分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)來制備。例如，所述VABM可用化學(xué)肽合成法制備。該技術(shù)對(duì)于生成用作免疫原的VABP來源的短肽特別有用。VABM也可以用公知的基因工程技術(shù)如Sambrook等1989等所述的定點(diǎn)誘變或隨機(jī)誘變制備。VABM還可以用合成法制備，即運(yùn)用有機(jī)化學(xué)技術(shù)，產(chǎn)生在結(jié)構(gòu)和功能上模仿任何VABP家族成員的組胺結(jié)合位點(diǎn)的分子。
本發(fā)明的VABM可以通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)以重組形式制備。這類表達(dá)方法本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且Sambrook等人(1989)對(duì)其中的許多方法都進(jìn)行了詳述?？蔀樗x擇的宿主挑選適合的表達(dá)載體。該載體可以包含一個(gè)操作性地連接于表達(dá)控制序列的編碼VABM的重組DNA分子，所述表達(dá)控制序列由宿主轉(zhuǎn)錄機(jī)制所識(shí)別。
適合的宿主包括常用的如大腸桿菌的原核生物種類、或者能夠使之表達(dá)高水平重組蛋白且能夠容易大量生長(zhǎng)的真核酵母。體外生長(zhǎng)的細(xì)胞系也合適，特別是運(yùn)用病毒驅(qū)動(dòng)的表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，如涉及使用昆蟲細(xì)胞為宿主的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。VABM也可以在體內(nèi)表達(dá)，例如在昆蟲幼蟲或哺乳動(dòng)物組織中。
按照再一方面，本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物中這種VABM的用途，以結(jié)合于組胺并由此調(diào)節(jié)其作用并控制其病理效應(yīng)。
本發(fā)明還包括將本發(fā)明的VABM作為抗炎藥物的用途。首先，所述VABM可作為包括一種或多種惰性載體的藥用組合物提供。所述VABM可以組成該藥用組合物的唯一活性成分，或者可以形成治療包的部分，如作為針對(duì)昆蟲、蛇或蝎子叮咬，或針對(duì)皮炎引起的皮膚表面用藥的乳膏的一個(gè)組分。所述蛋白還可用作乳膏、油類、粉劑或丸劑中組胺或組胺相關(guān)化合物的載體分子，以供接合組分緩釋。
本發(fā)明還包括本發(fā)明VABM在組胺水平(例如在血、鼻灌洗液、組織或食品中)定量方面的用途。所述VABM可以與檢測(cè)工具一起作為試劑盒的一部分，所述檢測(cè)工具(例如放射標(biāo)記的組胺、抗VABM抗體或如堿性磷酸酶、過氧化物酶或熒光素酶的酶類)允許準(zhǔn)確定量待測(cè)樣品中的組胺。這種試劑盒與放射免疫測(cè)定、閃爍親近測(cè)定或ELISA試劑盒相類似，將VABM作為結(jié)合分子取代直接導(dǎo)向組胺或?qū)蚪M胺類似物的抗體。本發(fā)明的一個(gè)方面包括加入本發(fā)明VABM的這種試劑盒。
本發(fā)明VABM還能夠用于血管活性胺類的檢測(cè)。任何本領(lǐng)域常用的技術(shù)均可用于這種檢測(cè)方法，可以包括印跡技術(shù)(Towbin等，1979)，凝膠阻滯或親和層析的運(yùn)用?？梢允褂猛暾腣ABP，或?yàn)榱颂綔y(cè)低物只用活性結(jié)合片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為了有助于檢測(cè)，將所述VABM與另一種蛋白質(zhì)(如堿性磷酸酶、熒光素酶或過氧化物酶)以基因工程方式或合成方式相融合。
本發(fā)明還包括將本發(fā)明VABM作為結(jié)合在支持體上的組胺結(jié)合實(shí)體的用途，所述組合接合實(shí)體可用來去除、分離或提取組胺(從機(jī)體組織、血液或食品)。該支持物可以包括任何適合的惰性材料，如凝膠、磁珠或其它小珠、微球體、結(jié)合柱或樹脂。
本發(fā)明也包括VABP用作研究炎癥、炎癥相關(guān)過程或其它血管活性胺類生理學(xué)效應(yīng)的工具的用途，所述生理學(xué)效應(yīng)如在胃潰瘍形成過程中組胺的作用或組胺在免疫反應(yīng)中的作用。例如，為了研究組胺或5-羥色胺在細(xì)胺培養(yǎng)物或有炎癥的動(dòng)物組織中的重要性，可將所述VABM用于這些系統(tǒng)中組胺或5-羥色胺的排除。
后生動(dòng)物寄生蟲，特別是節(jié)肢動(dòng)物和蠕蟲，也是傳染病及在人類醫(yī)學(xué)藥和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)中具有主要影響的其它有害效應(yīng)的來源。對(duì)節(jié)肢動(dòng)物和蠕蟲寄生蟲的控制主要依賴于化學(xué)藥品如殺螨劑和抗蠕蟲劑的運(yùn)用。也曾試圖使用通過運(yùn)用疫苗技術(shù)的免疫學(xué)控制方法。在鑒別某些保護(hù)性抗原為潛力疫苗候選者方面已取得一些成功，但是迄今僅有幾種最終形成了商業(yè)化成果，最值得注意的是用于牛肺蠕蟲胎生網(wǎng)尾線蟲和牛蜱微小牛蜱的疫苗。盡管取得了這些發(fā)展，然而還繼續(xù)需要用于后生動(dòng)物寄生蟲的疫苗以及特別是用于可以跨越節(jié)肢動(dòng)物和/或蠕蟲屬的大范圍而使用的疫苗。
因此本發(fā)明還提供了按以上所定義的VABP作為后生動(dòng)物寄生蟲疫苗的免疫原、特別是在控制節(jié)肢動(dòng)物和其它后生動(dòng)物寄生蟲引起的疾病中用作保護(hù)性免疫原的用途。適用于接種疫苗的候選者包括如牛、山羊、綿羊、狗、貓的家畜及需要受保護(hù)抵抗后生動(dòng)物寄生蟲(特別是蜱類)的其它動(dòng)物。所述疫苗可以包括在本領(lǐng)域技術(shù)中所熟知類型的佐劑。
含有本發(fā)明VABM編碼核苷酸序列的核酸分子構(gòu)成本發(fā)明的又一方面。這些分子包括DNA、cDNA和RNA，以及合成的核酸種類。
編碼四種特定VABP的cDNA通過實(shí)施例在本文中公開，它們的氨基酸序列示于

圖1至圖4(核苷酸和氨基酸以其標(biāo)準(zhǔn)的單子母縮字形式給出)。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選核酸分子含有與圖1至圖4和圖6的核苷酸序列中的任何一個(gè)VABM或任何VABM編碼部分、任何一個(gè)序列相同或互補(bǔ)的核苷酸序列，或含有簡(jiǎn)并的或與其大致同源的或與所述序列相雜交的序列。“大致同源”的意思是序列顯示至少60％序列同源性。根據(jù)本發(fā)明的核酸序列可以是單鏈或雙鏈DNA、cDNA或RNA。所述核酸序列最好是DNA。
包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的“雜交序列”是指那些雜交序列，它們?cè)诜菄?yán)格條件下(6×SSC/50％甲酰胺，室溫)結(jié)合并在低嚴(yán)格條件下(2×SCC，室溫；或2×SSC,42℃)或高嚴(yán)格條件下(如2×SSC,65℃(其中SSC=0.15M NaCl、0.015M枸櫞酸鈉，pH7.2))漂洗。
本發(fā)明還包括含有本發(fā)明DNA序列的克隆載體和表達(dá)載體。這種表達(dá)載體將加入在框架內(nèi)與本發(fā)明的核酸分子連接的適合的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，例如增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子-操縱子區(qū)、終止序列、mRNA穩(wěn)定序列、起始密碼子和終止密碼子或核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
另外，使得重組蛋白從特定宿主中分泌也許是便利的。據(jù)此，這種載體的其它組分可以包括編碼分泌信號(hào)及加工序列的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的載體包括質(zhì)粒和病毒(包括噬菌體和真核病毒)。許多這類載體和表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域所熟知的并有所報(bào)道。尤其適合的病毒載體包括基于桿狀病毒、腺病毒及牛痘病毒的載體。
多種技術(shù)已公知并可用來將根據(jù)本發(fā)明的載體導(dǎo)入原核細(xì)胞或真核中。文獻(xiàn)(Sanbrook等，1989)中已充分描述了適合的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)。在真核細(xì)胞中，根據(jù)所述系統(tǒng)的需要，表達(dá)系統(tǒng)或者為瞬時(shí)的(如附加體)或者為長(zhǎng)久的(染色體整合)。
根據(jù)本發(fā)明的核酸分子也可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這可通過在修飾體細(xì)胞或通過種系治療加入可遺傳的修飾而局部進(jìn)行。
因此本發(fā)明也包括經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞或含有如上所定義的本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)基因生物體。
本發(fā)明的再一方面提供制備本發(fā)明VABM的方法，包括在表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)含本發(fā)明核酸分子的宿主細(xì)胞，并將由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)回收。
所有在文章中提到的資料均通過引用結(jié)合到本文中。
現(xiàn)在通過實(shí)施例，具體參考從蜱、尤其是從具尾扇頭蜱中分離的VABP，將本發(fā)明的各方面及實(shí)施方案加以詳述。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可以修改細(xì)節(jié)而不偏離本發(fā)明范圍。
附圖簡(jiǎn)述圖1是FS-HBP1的序列，表明測(cè)序引物及所采用的測(cè)序策略。
圖2是FS-HBP2的序列，表明測(cè)序引物及所采用的測(cè)序策略。
圖3是MS-HBP1的序列，表明測(cè)序引物及所采用的測(cè)序策略。
圖4是D.RET6的序列，表明測(cè)序引物及所采用的測(cè)序策略。
圖5是經(jīng)考馬斯染色的12％SDS-PAGE凝膠，顯示已經(jīng)在組胺結(jié)合柱上純化的蜱唾液腺提取物。純化之前(泳道A)和純化之后(泳道B；1=FS-BHP1,2=FS-HBP2)的雌性蜱的唾液腺提取物；純化之前(泳道C)和純化之后(泳道D；3=MS-HBP1)的雄性蜱唾液腺提取物。標(biāo)明了分子量標(biāo)記。
圖6表明用GCG威斯康辛軟件包的堆集(pileup)命令和整齊描繪(prettyplot)命令產(chǎn)生的所述VABP的四種cDNA推導(dǎo)氨基酸序列的序列對(duì)比。
圖7是經(jīng)考馬斯染色的12％SDS-PAGE凝膠，顯示用重組法產(chǎn)生的VABP。泳道A，為rMS-HBP1；泳道B，為rFS-HBP2；泳道C，為rFS-HBP1。從頂部至底部，分子量標(biāo)記標(biāo)明為66、48.5、29、18.4及14.2kDa。
圖8是取自雌性及雄性蜱的唾液腺提取物的蛋白質(zhì)印跡。
圖9顯示描繪純化VABP的組胺結(jié)合特性的飽和曲線和Scatchard圖。
圖10是描述在豚鼠回腸上進(jìn)行的收縮-抑制試驗(yàn)的圖。所用的縮寫H=組胺(1.25nmol)；漂洗=Krebs溶液。加入約2nmol FS-HBP2；使用約4nmol(單體的量)MS-HPB1。
實(shí)施例蜱按Jones等(1988)的方法飼養(yǎng)蜱。除成年網(wǎng)紋革蜱(Dermacenterreticularis)在兔身上飼養(yǎng)以外，所有三個(gè)發(fā)育階段的具尾扇頭蜱和網(wǎng)紋革蜱均在Dunkin Hartley豚鼠身上飼養(yǎng)。在不進(jìn)食時(shí)，所有的蜱均保持在21℃和85-90％的相對(duì)溫度下。實(shí)施例1蛋白質(zhì)鑒別從已在豚鼠上飼養(yǎng)3天的雌性成年具尾扇頭蜱樣品中切取唾液腺。雄性蜱飼養(yǎng)4天。在磷酸緩沖鹽溶液(PBS；pH7.4)中均漿腺體，以10,000g離心3分鐘去除細(xì)胞碎片，然后將上清液上含有400ml組胺-瓊脂糖懸浮液(Sigma)的柱。未結(jié)合的蛋白質(zhì)用含有5％甘油的10mlPBS從柱上洗出，然后用含100mM組胺的PBS(2ml)洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。用centricon 3超濾裝置(Amicon)濃縮洗脫液。
將提取物在12％SDS-PAGE凝膠上電泳，鑒別來自雌性蜱的兩種主要蛋白質(zhì)和來自雄性蜱的一種主要蛋白質(zhì)(見圖5)。這些蛋白質(zhì)被稱作磁性特異性組胺結(jié)合蛋白1和2(FS-HBP1和FS-HBP2)及雄性特異性組胺結(jié)合蛋白1(MS-HBP1)。從未在雌性組織中檢測(cè)到MS-HBP1，但在雄性唾液腺和蛹及幼蟲整個(gè)身體勻漿中清楚地存在MS-FBP1。實(shí)施例2基因克隆1)cDNA文庫的構(gòu)建為了克隆編碼實(shí)施例中三種蛋白質(zhì)的cDNA，構(gòu)建了一個(gè)cDNA文庫。從已在豚鼠上飼養(yǎng)2天的20個(gè)雄性及20個(gè)雌性成年具尾扇頭蜱樣本中切取唾液腺。在干冰中將腺體收集在Eppendorf管中。用FastTrack mRNA分離試劑盒(2nvitrogen)分離信使RNA。
為了合成cDNA及將其單向插入λZapⅡ載體，使用了Zap cDNA合成試劑盒(Stratagene)。在插入λ載體之前，在Sephacryl S-400(Pharmacia)柱上分級(jí)分離cDNA。用低分子量cDNA(大約100bp至2,000bp)構(gòu)建DNA文庫(命名為d2-Ⅰ)。較高分子量組分被用于構(gòu)建第二個(gè)文庫(d2-Ⅱ)。用Packagene(Promega)包裝提取物，按廠商的說明進(jìn)行包裝。每個(gè)文庫的大約1.5×106個(gè)噬菌斑形成單位(PFU)在XL-1藍(lán)(XL-1 Blue)細(xì)胞(stratagene)上擴(kuò)增。
用來自已在兔上飼養(yǎng)3天的成年雌性網(wǎng)紋革蜱的唾液腺mRNA構(gòu)建其文庫。分離mRNA，按用于以上所述的d2-Ⅱ文庫的方法分離mRNA和構(gòu)建cDNA文庫，不同之處在于采用了Zap表達(dá)(預(yù)消化載體)克隆試劑盒(Stratagene)代替λZapⅡ試劑盒。2a)d2-ⅡcDNA文庫的篩選從該文庫的一個(gè)組分中體內(nèi)切下噬菌粒，并按Short等(1988)所述，將其用于在XLl-藍(lán)細(xì)胞(Stratagene)中產(chǎn)生雙鏈pBluescript SK(-)質(zhì)粒。將菌落鋪在補(bǔ)充有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal,Melford實(shí)驗(yàn)室，英國(guó))和異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG,Novabiochem)的含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，進(jìn)行藍(lán)色/白色菌落選擇。選擇來自白色克隆的大約75個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。通過用PvuⅡ消化并在1％瓊脂糖凝膠上電泳測(cè)定，插入的DNA大小的范圍為250個(gè)堿基對(duì)至1000個(gè)堿基對(duì)。
獲得了克隆FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1并進(jìn)行了部分測(cè)序。然后通過噬斑影印膜(Sambrook等，1989)與洋地黃毒苷標(biāo)記探針(Boehringer Mannheim)的DNA雜交，篩選d2-Ⅱ文庫的其它克隆。用來自原始克隆的純化插入片段以隨機(jī)引物標(biāo)記法構(gòu)建探針，并用與堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim)綴合的抗洋地黃毒苷抗血清檢測(cè)。對(duì)于每個(gè)原始克隆，分離并測(cè)序了3個(gè)額外的克隆。2b)網(wǎng)紋革蜱cDNA文庫的篩選首先，構(gòu)建DNA探針。不是將革蜱屬文庫的一個(gè)組分插入Zap表達(dá)載體，而是用簡(jiǎn)并引物5’-AAYGGNGARCAYCARGAYGCNTGGAA(正向)及5’-KTRTMRTCNGTNRYCCANARYTCRTA(反向)進(jìn)行PCR。這些引物基于FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1的cDNA和蛋白質(zhì)的保守域。
該P(yáng)CR包括35個(gè)循環(huán)，于95℃30秒的解鏈步驟，于50℃30秒的引物-退火步驟及于72℃30秒的延伸步驟(Taq聚合酶購自PerkinElmet，脫氧核苷購自Pharmacia)。獲得了預(yù)期不小(400堿基對(duì)左右)的單個(gè)DNA條帶，用洋地黃毒苷將其標(biāo)記，以篩選該文庫(如上所述)。D.RET6是幾個(gè)陽性克隆之一。3)測(cè)序?qū)S-HBP1、FS-HBP2及D.RET6插入片段的整個(gè)編碼鏈或非編碼鏈進(jìn)行測(cè)序。按Good和Feinstein(1992)的方法從過夜培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒，經(jīng)堿變性(Mierendorf和Pfeffer,1987)并用Sanger的雙脫氧介導(dǎo)的鏈終止反應(yīng)法(Sanger和Coulson,1975)測(cè)序。測(cè)序策略示于圖1-4。3a)FS-HBP1如圖1所示，從鄰接pBluescript SK(-)多接頭區(qū)的T3(正向)和T7(反向)引物位點(diǎn)對(duì)原始克隆進(jìn)行測(cè)序。另外，從T3位點(diǎn)處對(duì)亞克?、鴄(包含原始插入片段的核苷酸221-770)及亞克隆ⅩⅧb(核苷酸509-770)進(jìn)行測(cè)序(由圖中的T3a和T3b標(biāo)明的反應(yīng))。從T7位點(diǎn)處對(duì)亞克?、鴆(核苷酸1-221)和亞克?、鴇(核苷酸1-509)進(jìn)行測(cè)序(T7c和T7d)。
通過用PstⅠ消化原始克隆(在插入片段221位及上游多接頭區(qū)中切割)，然后將其重新連接產(chǎn)生Ⅹⅷa；通過用XbaⅠ消化(在插入片段509位及上游切割)產(chǎn)生Ⅹⅷb。用EcoRⅠ(在插入片段上游切割)分別與PstⅠ和XbaⅠ消化，并將切下的片段重新連接回pBluescript(SK-)質(zhì)粒中，獲得Ⅹⅷc及Ⅹⅷd。信號(hào)序列在圖中以粗體字母給出，信號(hào)切割位點(diǎn)以豎直箭頭(↑)標(biāo)出。下劃線序列也是通過對(duì)所表達(dá)蛋白進(jìn)行氨基端測(cè)序而獲得。3b)FS-HBP2圖2顯示FS-HBP2克隆的cDNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列。從T3(正向)及T7(反向)引物位點(diǎn)處對(duì)原始克隆進(jìn)行測(cè)序，同樣通過用HincⅡ?qū)?2-1進(jìn)行消化(在254位切割，所示反應(yīng)由T3b及T7a表示)獲得兩個(gè)亞克隆(52a和52b)。HincⅡ與XhoⅠ(在插入片段的多接頭下游切割)聯(lián)用，構(gòu)成52a(包含核苷酸1-254),HinclⅡ與SmaⅠ(在上游切割)聯(lián)用構(gòu)成52b(含有核苷酸254-793)。消化后用T4聚合酶(NewEngland Biolabs)平端化，并重新連接質(zhì)粒。最后，我們使用與圖中下劃線序列相同或互補(bǔ)的正向(→)及反向(←)插入片段特異性引物。
聚腺苷酸尾以斜體表示，推定的聚腺苷酸化信號(hào)以下加雙線表示。信號(hào)序列以粗體字母給出，信號(hào)切割用豎直箭頭(↑)標(biāo)明。下劃線序列也是通過對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行氨基端測(cè)序而獲得的。3c)MS-HBP1圖3顯示MS-HBP1克隆的cDNA序列及所推導(dǎo)的氨基酸序列。從鄰接pBluescript SK(-)多接頭區(qū)的T3(正向)及T7(反向)引物位點(diǎn)對(duì)該克隆進(jìn)行測(cè)序。另外，我們使用與圖中下劃線序列相同或互補(bǔ)的正向(→)及反向(←)插入片段特異性引物。
三線表示推定的N-糖基化位點(diǎn)。斜體表示聚腺苷酸尾，雙線標(biāo)明推定的聚腺苷酸化信號(hào)。信號(hào)序列以粗體字母給出，信號(hào)切割以豎直箭頭(↑)標(biāo)明。下劃線序列也是通過對(duì)所表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基端測(cè)序而獲得。3d)D.RET6圖4給出克隆D.RET6的cDNA序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。從鄰接pBK-CMV多接頭區(qū)的T3(正向)和T7(反向)引物位點(diǎn)及從與圖中下劃線序列相同或互補(bǔ)的正向(→)及反向(←)插入片段特異性引物對(duì)所述DNA插入片段進(jìn)行測(cè)序。用粗體字母表示推定的信號(hào)序列，用豎直箭頭(↑)標(biāo)明信號(hào)切割。3e)序列分析用GCG序列分析軟件(威斯康辛軟件包程序手冊(cè)，1994)分析序列數(shù)據(jù)。在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)運(yùn)用BLAST網(wǎng)絡(luò)服務(wù)對(duì)蛋白數(shù)據(jù)資料庫進(jìn)行檢索。
從cDNA推導(dǎo)出的VABP氨基酸序列的序列對(duì)比示于圖6。這通過運(yùn)用GCG軟件的堆集命令和整齊描繪命令而產(chǎn)生。通過對(duì)所分泌的VABPS進(jìn)行N末端測(cè)序測(cè)定，所述成熟蛋白起始于下劃線氨基酸(見下文)，提示其前面的區(qū)域代表信號(hào)序列。除去信號(hào)序列之后，對(duì)于計(jì)算的分子量，F(xiàn)S-HBP1為19,442,FS-HBP2為19,471,MS-HBP1為21,026,D.RET6為21,025。計(jì)算的等電點(diǎn)分別為4.0、3.9、5.0及4.6。
MS-HBP1與FS-HBP1有40％的同一性(57％相似性)，與FS-HBP2的同一性為43％(62％)，與D.RET6的同一性為32％(50％)。FS-HBP1與FS-HBP2有66％的同一性(78％相似性)，與D.RET6的同一性為32％(49％)。FS-HBP2與D.RET6有39％的同一性和56％的相似性。這些百分比用GCG軟件的最佳擬合命令(使用的間隙權(quán)為3，長(zhǎng)度權(quán)為0.1)獲得。
所預(yù)期的四種蛋白質(zhì)的二極結(jié)構(gòu)相同，即在所述分子的氨基端一半以α-螺旋為主，而在羧基端一半β-折疊和轉(zhuǎn)角相對(duì)較多。FS-HBP1(帶正電荷)與組胺的親和性較低提示在這些位置處的殘基可能組成結(jié)合位點(diǎn)的一部分。實(shí)施例3重組蛋白的表達(dá)1)克隆的構(gòu)建FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1在草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞(Sf21)中作為組氨酸標(biāo)記蛋白(rFS-HBP1、rFS-HBP2及rMS-HBP1)表達(dá)。
為了加進(jìn)His6標(biāo)記，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)首先對(duì)FS-HBP1的編碼區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增。該P(yáng)CR包括20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為于95℃30秒的解鏈步驟，于50℃30秒的引物-退火步驟，及于72℃30秒的延伸步驟。所用的正向引物為5’-GCAGGAGCTCGGCACGAG；反向引物為5’-TTTACTAGTGATGGTGATGATGATGGATCCCTTCTGGGAGGCAATCACTT。
設(shè)計(jì)所述引物使得在起始密碼子上游加進(jìn)一個(gè)SacⅠ位點(diǎn)，而將終止密碼子用一個(gè)BamHⅠ位點(diǎn)所取代，之后是6個(gè)組氨酸密碼子和含有TAG終止密碼子的一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn)。用SacⅠ和SpeⅠ切割該P(yáng)CR產(chǎn)物。后一種酶產(chǎn)生與XbaⅠ匹配的突出端，使該片段連接在pAcC129.1轉(zhuǎn)移載體(Livmgstone和Jones,1989)的SacⅠ位點(diǎn)和XbaⅠ位點(diǎn)之間，產(chǎn)生質(zhì)粒pACC129.1-FS1.HIS。因此這個(gè)質(zhì)粒含有加在FS-HBP1翻譯產(chǎn)物羧基端的序列Gly-Ile-(His)6。
質(zhì)粒pACC129.1-FS1.HIS也被用于表達(dá)組氨酸標(biāo)記的FS-HBP2和MS-HB3P1。用SacⅠ和BamHⅠ使FS-HBP1 cDNA缺失，從而使氨酸密碼子保持完整。將上游SacⅠ位點(diǎn)及下游BglⅡ位點(diǎn)(BglⅡ和BamHⅠ產(chǎn)生匹配突出端)通過PCR加到FS-HBP2和MS-HBP1的編碼區(qū)。該P(yáng)CR包括20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)有于95℃30秒的解鏈步驟，于50℃30秒的引物-退火步驟及于72℃30秒的延伸步驟。對(duì)于FS-HBP2，正向引物為5’-AAGGAGCTCAGCATGAAGCTTCTCAT；反向引物為5’-TATAGATCTCTAGGCAAGCACTTGTG。
對(duì)于MS-HBP1，正向引物為5’-GCAGGAGCTCGGCACGAG，反向引物為5’-TATAGATCTGGTTCTGAGCTGGTGCTG。
PCR之后，將所得到的cDNA插入所述載體。然后將Gln-Ile-(His)6序列加到MS-HBP1翻譯產(chǎn)物的羧基端，并將Ile-(His)6加到FS-HBP2的翻譯產(chǎn)物上。
用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)三種標(biāo)記的多肽。用所述轉(zhuǎn)化載體和桿狀病毒(BacPak6；Clontech)轉(zhuǎn)染斜紋夜蛾(Sf21)細(xì)胞。按Kitts和Possee(1993)的方法擴(kuò)增重組病毒。所述VABP顯然是分泌產(chǎn)物，因?yàn)樗鼈冎饕l(fā)現(xiàn)于被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基及唾液腺中。
將(成熟)FS-HBP2的編碼區(qū)也克隆進(jìn)pET-23a(+)表達(dá)載體中。將圖7中從位置(a)至(b)以及從位置(c)至(d)的序列在大腸菌所表達(dá)的截短形式的FS-HBP2中缺失。通過在含有FS-HBP2的pACC129.1-HIS質(zhì)粒上進(jìn)行PCR而獲得N-末端截短的蛋白質(zhì)，PCR所用的正向引物為5’-TATGGATCCTTCACTTGCGTGGGTGTT，反向引物為5’-TATAGCGGCCGCCCGGGCTAGTGATGGTGATGATGAT。用BamHⅠ和NotⅠ酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物，并將其插入pET-23a(+)載體的BamHⅠ位點(diǎn)和NotⅠ位點(diǎn)之間。
在羧基端截短的情況下，將完整的FS-HBP2編碼區(qū)插入pET 23a(+)載體中，所用的正向引物為5’-TATAGGATCCGGGAGCTCCAATCAGCCAGATTGGGC；反向引物為5’-TATAGCGGCCGCCCGGGCTAGTGATGGTGATGATGAT。用BamHⅠ和NotⅠ酶切該P(yáng)CR方法，并將其插入pET-23a(+)載體的BamHⅠ位點(diǎn)和NotⅠ位點(diǎn)之間。然后將該質(zhì)粒(以及插入片段)作為模板用反向引物進(jìn)行PCR，所述反向引物為5’-TATATGGTACCCATCATCATCACCATCAC及5’-ATATATGGTACCGTTGTCGTAATCCGTAGTC。這就產(chǎn)生了減去待缺失區(qū)的完整的質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物。用KpnⅠ(引物含有KpnⅠ位點(diǎn))酶切之后進(jìn)行重新連接。最初的未擴(kuò)增質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化之前通過用DpnⅠ消化而將其破壞。所有的PCR均包括20個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)有于95℃30秒的解鏈步驟，于50℃30秒的引物-退火步驟及于72℃30秒的延伸步驟。2)蛋白質(zhì)純化及抗血清的產(chǎn)生Sf21細(xì)胞轉(zhuǎn)染60小時(shí)之后，收集培養(yǎng)基，離心除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片(2,000g,10分鐘)，用(NH4)2SO4沉淀法分級(jí)分離上清液。rFS-HBP1和rFS-HBP2在50-80％(NH4)2SO4組分中沉淀，MS-HBP1-His在65-100％組分中沉淀。在重溶解于PBS的100％(NH4)2SO4中漂洗沉淀，并按Janknecht等(1991)的方法在Ni-瓊脂糖柱(Qiager)上純化。用咪唑洗脫帶組酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。用Centricon 10濃縮器(Amicon)濃縮洗脫液并用來更換緩沖液。將純化蛋白在PBS中貯存于-20℃。
為產(chǎn)生多克隆抗血清，將純化的重組蛋白(在150μlPBS中約2μg)與等體積的Montanide ISA 50佐劑(Seppic，法國(guó))相混合，并皮下注射到Dunkin Hartley豚鼠體內(nèi)。每隔10天重復(fù)該過程。第4次注射10天之后收集血清。3)電泳及蛋白質(zhì)印跡法于飼養(yǎng)期從不同時(shí)間點(diǎn)切取蜱的唾液腺(及其它組織)，并在PBS中將其勻漿。于10,000g離心勻漿液5分鐘，并將上清液進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE；Laemmli,1970)。
圖7顯示rFS-HBP1、rFS-HBP2及rMS-HBP1電泳的12％SDS-PAGE凝膠。rFS-HBP1和rFS-HBP2在瓊脂糖上分別以～21kDa和～24kDa的表觀分子量泳動(dòng)，而rMS-HBP2則以～22kDa泳動(dòng)。
為進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，用AE-6675水平印跡裝置(Atto Corporation,日本)，通過半干電印跡(Kyhse-Anderson,1984)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝化纖維素(Gelman Sciences)上。將豚鼠中產(chǎn)生的抗血清(見上文)與綴合于堿性磷酸酶(Sigma)的山羊抗豚鼠免疫球蛋白聯(lián)用，鑒別FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1。用氮藍(lán)四咪鹽及磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚酯(Blake等，1984)顯現(xiàn)激酶活性。
通過遷移率變動(dòng)分析研究最終天冬酰胺連接的蛋白質(zhì)糖基化作用。在用水解所有普通類型的糖蛋白Asn-聚糖鏈的酶切糖苷酶(Maley等，1989)N-糖苷酶F(PNGase F,New England Biolabs)處理之前和之后，用唾液腺提取物和重組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡。用N-糖苷酶F處理時(shí)，在SDS-PAGE凝膠上只有MS-HBP1顯示出遷移率下降，表明它是一個(gè)糖蛋白。下降值相應(yīng)于分子量2-3kDa的變動(dòng)。
圖8顯示蛋白質(zhì)印跡，包含在飼養(yǎng)期的不同時(shí)間點(diǎn)從雌性蜱(A和B)及雄性蜱(C)獲取的唾液腺提取物，并在12％SDS-PAGE凝膠上分離?？笷S-HBP1(A)和抗FS-HBP2(B)血清從附著后(p.a.)第1天至第3天起顯示陽性反應(yīng)。從附著后第一天一直到飼養(yǎng)期結(jié)束，抗-MS-HBP1血清(C)可檢測(cè)到MS-HBP1。4)N-端測(cè)序在牛津大學(xué)生物化學(xué)系的MRC免疫化學(xué)裝置上測(cè)定純化的rFS-HBP1、rFS-HBP2和rMS-HBP1的氨基端序列。按Schger和VonJagow(1987)的方法在SDS-PAGE凝膠上電泳樣品，并電印跡至Pro-Blott膜上(Applied Biosystems,Warrington，英國(guó))。用考馬斯亮藍(lán)染色所述膜，并將目的條帶切下，按Matsudaira(1987)法進(jìn)行測(cè)序。用Applied Biosystems的“小型印跡”軟片(cartridge)(所述膜片已插至其上)，在Applied Biosystems的494A型“Procise”蛋白測(cè)序儀(Perkin-Elmer,Applied Biosystems Division,Warrington，英國(guó))上電泳電印跡的樣品。采用廠商推薦的膜結(jié)合樣品程序進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例4蛋白的特征記述1)組胺結(jié)合分析將純化的重組蛋白按Warlow和Bernard(1987)提出的方法進(jìn)行組胺結(jié)合試驗(yàn)。這種方法通過加入聚乙二醇(Mw 8000)和離心法，運(yùn)用蛋白質(zhì)沉淀從結(jié)合配體分離游離配體(放射標(biāo)記的組胺)。在所有實(shí)驗(yàn)中，在溫育4個(gè)小時(shí)確保無組胺代謝發(fā)生后，在醋酸銨溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行薄層層析。
用全部3種rVABP獲得3H-組胺的飽和結(jié)合(圖9Aⅰ、9Bⅰ和9Cⅰ)。Scatchard圖(圖9Aⅱ、9Bⅱ和9Cⅱ)顯示rMS-HBP(Kd=1.2×10-9M；SD=0.4；3次測(cè)量)及rFS-HBP2(Kd=1.7×10-8M；SD=0.9)的高親和性，但rFS-HBP1的親和性較低(Kd=7.8×10-8M；SD=1.5)，提示結(jié)合組胺可能不是該蛋白的首要功能。
對(duì)于rMS-HBP1，存在協(xié)同結(jié)合的證據(jù)。當(dāng)含有3H-組胺(～0.3pmol；11,200cpm)和過量rMS-HBP1(～100pmol)的樣品補(bǔ)充有少量組胺(0.5pmol)時(shí)，檢測(cè)到結(jié)合放射性配體明顯增加(7,560±110cpm，比之于6,840±150cpm；5次測(cè)定)，表明結(jié)合容量有所增強(qiáng)。協(xié)同結(jié)合與MS-HBP1的二聚體或多聚體的性質(zhì)相一致。事實(shí)上，MS-HBP1似乎形成分子間二硫橋；當(dāng)在SDS凝膠的上樣緩沖液中不包括還原劑時(shí)，它在SDS凝膠上的遷移率較低。看來FS-HBPS只具有分子內(nèi)二硫鍵，正如缺少還原劑時(shí)較高遷移率所提示的。
在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中(一式三份進(jìn)行)，將一系列組胺樣化合物[組胺、咪唑、5-羥色胺、多巴胺、H1受體激動(dòng)劑β-組氨酸、H1拮抗物氯苯那根及新胺替根、H2激動(dòng)劑dimaprit及H2拮抗物糠硝烯二胺和西咪替丁]以1000倍的量加到每種rVABPS中，在1000倍量下冷組胺可以從結(jié)合位點(diǎn)置換95％以上的3H-組胺。組胺樣化合物幾乎不引起或不置換放射性配體，表明VABP特異性地并以不同于H1受體和H2受體的方式結(jié)合組胺。
將FS-HBP2在AD494(DE3)pLysS細(xì)菌(Novagen)中的pET-23a(+)載體上表達(dá)。細(xì)菌表達(dá)的FS-HBP2與在桿狀系統(tǒng)中所表達(dá)的FS-HBP2相比，與組胺結(jié)合的親和性略低(Kd=0.6-0.9×10-8M)。缺乏45個(gè)N-端氨基酸或28個(gè)C-端氨基酸的截短形式的蛋白質(zhì)(見上文)根本不與組胺結(jié)合。這提示FS-HBP2的完整結(jié)構(gòu)對(duì)于結(jié)合組胺是重要的，并且結(jié)合位點(diǎn)更可能由分散的殘基所決定，而不是由α-螺旋或β-折疊上某處的一段連續(xù)氨基酸序列所決定。2)收縮-抑制在懸于含有充氧Krebs溶液的10ml室中的豚鼠回腸上進(jìn)行收縮-抑制試驗(yàn)(圖10)。通過向該室中加入1.25nmol組胺(H)來誘導(dǎo)收縮(記錄為峰形)。達(dá)峰值后再用Krebs溶液洗去組胺(W)，使回腸松弛。通過加入～2nmol rFS-HBP2(F2)和組胺實(shí)際上減少收縮?！?nmol rFS-HBP1未產(chǎn)生明顯效應(yīng)(數(shù)據(jù)未示)。甚至在加入超量組胺(XH)之后，～4nmol(單體量)rMS-HBP1(M)與組胺一起加入后完全抑制了收縮。
rMS-HBP1蛋白和rFS-HBP2蛋白是強(qiáng)結(jié)合物，足以與組胺競(jìng)爭(zhēng)豚鼠回腸的H1受體(見圖10)。與它們相對(duì)較低的親和性一致的是，用rFS-HBP1幾乎沒有或沒有觀察到對(duì)回腸收縮的抑制。
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權(quán)利要求
1．血管活性胺結(jié)合蛋白(VABP)，它以小于10-7M的解離常數(shù)與血管活性胺類特異性地結(jié)合，并且與MS-HBP1、FS-HBP1、FS-HBP2和D.RET6屬于同一蛋白家族。
2．根據(jù)權(quán)利要求1中的VABP，它來源于吸血性外寄生蟲、蜘蛛、蝎、蛇或有毒動(dòng)物。
3．根據(jù)權(quán)利要求1中的VABP，它來源于蜱類。
4．根據(jù)權(quán)利要求1中的VABP，它來源于蜱類具尾扇頭蜱或網(wǎng)紋革蜱(Dermacenter reticularis)。
5．根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的VABP，它與組胺特異性地結(jié)合。
6．FS-HBP1、FS-HBP2、MS-HBP1及D.RET6中的任何一種VABP。
7．權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的任一種VABP的功能相當(dāng)?shù)难苌锘蚱巍?br> 8．根據(jù)任一前述權(quán)利要求的VABP、衍生物或片段(VABM)，它以重組形式表達(dá)。
9．根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的VABM，其中已將VABP以基因工程方式或化學(xué)方式與一個(gè)或多個(gè)肽或多肽相融合。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的VABM，它結(jié)合到如樹脂的支持物上。
11．核酸分子，它編碼根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的VABM，或與這種VABM編碼分子相雜交。
12．權(quán)利要求11的核酸，它包括DNA、cDNA或RNA。
13．權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的核酸，它包括DNA。
14．包含根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的核酸分子的克隆載體或表達(dá)載體。
15．權(quán)利要求14的載體，它基于病毒。
16．權(quán)利要求15的載體，它基于桿狀病毒。
17．用權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
18．已經(jīng)用根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的核酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
19．制備根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的蛋白方法，包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)的載體，并在表達(dá)所述蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞及回收如此產(chǎn)生的所述蛋白。
20．適用于在人類或動(dòng)物體液中檢測(cè)組胺水平的試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的VABM及檢測(cè)工具。
21．根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的用于治療的VABM。
22．根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的VABM，用于在人類或動(dòng)物中結(jié)合血管活性胺類。
23．根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的VABM，用于在人類或動(dòng)物中結(jié)合組胺。
24．根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的VABM的用途，用于在人類或動(dòng)物中探測(cè)血管活性胺類。
25．根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的VABM的用途，用于在人類或動(dòng)物中探測(cè)組胺。
26．根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的VABM在疫苗的用途。
27．根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的VABM，用作抗組胺劑。
28．根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的VABM，用作抗炎藥。
29．根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的VABM的用途，與藥學(xué)上可接受載體結(jié)合用于治療人類或動(dòng)物炎癥的藥物的生產(chǎn)中。
全文摘要
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文檔編號(hào)C12N15/12GK1225683SQ9719631
公開日1999年8月11日 申請(qǐng)日期1997年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月18日
發(fā)明者G·C·佩森, P·A·納托爾 申請(qǐng)人:牛津瓦克斯有限公司