專利名稱：：用固相法檢測生物活性物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般來說涉及檢測、鑒定有生物活性的物質(zhì)的性質(zhì)、含量和分子活性的方法。更具體地說，本發(fā)明是關(guān)于用固相法測量酶活性、酶抑制劑、凝集素、受體和其它具有生物活性分子的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：配位結(jié)合測定，在已知的免疫檢測中常用，它基于抗體鑒別原理，對物質(zhì)進行定量(參閱Stitesetal，《基礎臨床免疫》，第8版Appleton&lange出版社，第170-176頁，綜述)。然而，免疫檢驗有兩個缺點第一個缺點是，它需要大量抗體與相應物質(zhì)結(jié)合。第二個缺點是，即使物質(zhì)被鑒定有生物活性，例如酶，此方法也只能鑒定它的存在，而不能測量其活性水平。雖然有許多檢測酶活性、受體功能等方法，但應用此固相法技術(shù)不但能精確測量極少量的組份，而且可以省去物理分離步驟，還可以對大批樣品進行常規(guī)檢驗。例如，酶在生化反應中起關(guān)鍵性的作用，在有關(guān)生物學領(lǐng)域，如醫(yī)藥，食品，制藥業(yè)方面測定酶活性都顯得十分重要。現(xiàn)在通用的酶檢測方法，其原理都基于酶催化底物過程中產(chǎn)物的形成(Loround,1981；Rossomando,1990)。盡管這些方法是許多生物研究中的主流，但是研究不僅要測量其活性的存在，還要將其量化。這一點對于那些不遵守米氏運動常數(shù)的酶，如別構(gòu)酶和那些活潑的共價修飾酶尤為重要。另外，需要定量可能存在于生物系統(tǒng)中的酶抑制劑含量。這一點在醫(yī)藥領(lǐng)域受到極大重視，在研究愛滋病過程中發(fā)現(xiàn)一些酶的抑制劑(Milleretal1989)或抑制劑的生長控制血壓(Ondettietal1982)或包括象青霉素這些抗生素的水解(Cullman,1990)。急需一種能夠自動檢測酶的方法，特別是在制藥業(yè)，在此，酶通常用做發(fā)現(xiàn)新藥的靶物質(zhì)。在探求一種新藥的過程中，需要過濾掉成千上萬的混合物。這一新方法的改進不僅為自動高效過濾提供方便，而且在許多其他應用上將大大降低成本。另外，對于酶來說高效自動分離對于測定受體和凝集素也是必須的。例如，有一個簡便可信的檢測β-葡聚糖酶的方法，該酶對釀酒和家禽養(yǎng)殖中所需的大麥β-葡聚糖的水解過程中起著重要作用。對于該檢測據(jù)報道有好多種，如粘度計法(BoumeandPierce,1970)，蔗糖還原法(Denaltetal,1978)，徑向膠擴散法(Edneyetal,1986；MartinandBamforth1983)和偶氮-大麥葡聚糖法(McClearlyandShameer,1987)。迄今為止，任何對成品飼料中的酶檢測和定量都面臨克服儀器的靈敏度和飼料自身復雜性的技術(shù)問題。若有一個改進的高度靈敏的光度計法，特別是它能使檢測高水平的自動化，將十分受歡迎，微量滴定技術(shù)采用微量滴定板和微量滴定板讀取器將大大方便檢驗工作。在這個研究方向上有兩個分支一個是(Wirth和Wolf1992)應用微量滴定板比色法，這一實驗方法的原理與偶氮-大麥葡聚糖法一樣，只是它在微量滴定板孔內(nèi)讀取吸收值，這個操作過程與偶氮-大麥葡聚糖法的缺點一樣需要沉淀和離心步驟，其靈敏度也未達到很高水平；另一個方向是利用酶的免疫特性對酶的含量進行定量(Buhler,1991；Rafaeletal1995)，這一技術(shù)的主要缺點是它不能夠評估特殊酶的活性。免疫檢測估計的是酶蛋白的含量，而不是酶的生物活性，所以這一檢測方法只能用于抗體高度特異性的種間關(guān)系十分近的酶檢測。在近期Headon(1993)的綜述中，得出這樣結(jié)論迄今為止還沒有報道過一個合適的檢測和定量酶的方法，這可能部分原因是通常無法檢測低水平的酶。所以說，獲得一個簡便靈敏和有效的檢測蛋白酶活性的方法將對于重組蛋白工業(yè)測試內(nèi)源水解蛋白酶的活性，以及新藥發(fā)現(xiàn)過程中過濾蛋白酶抑制劑以及診斷和常規(guī)研究有極大幫助。然而，用現(xiàn)在通用的方法由于有靈敏度不高(例如酪蛋白膠)，繁瑣的操作步驟(例如三氯乙酸沉淀，離心和加熱)，同位素輻射的危險(例如放射性標記底物)以及需要昂貴的儀器(例如熒光極化分析儀)等缺陷，所以不能滿足需要而且這些方法既費時又無法自動化。發(fā)明簡述根據(jù)本發(fā)明，公開了一種應用固相法檢測生物活性量和/或生物活性物質(zhì)量的方法。該方法是提供應用物質(zhì)自身生物活性進行檢驗的方法。在本發(fā)明的實施方案中，公開了一種方法，即通過固相法檢測具有生物活性物質(zhì)的生物活性量。組份1結(jié)合到一個表面上，在此表面上組份1與指示劑1偶聯(lián)。樣品與組份1接觸。樣品中含有待測的未知生物活性的組份2。這些組份反應條件控制在生物活性使組份1與組份2反應將解離出組份1的范圍內(nèi)。反應完成后，去除樣品，測出殘留在表面的組份1的量。生物活性的含量與組份1的殘留量之間呈反比關(guān)系。在本發(fā)明的另一個方案中，公開了一種方法，即通過固相法檢測有生物活性物質(zhì)的生物活性抑制劑的量。組份1結(jié)合到一個表面上，在此表面上組份1與指示劑1偶聯(lián)。樣品與組份1接觸。樣品中不僅包含組份2，且已知其含量并有生物活性，而且還含有組份3，含量未知，且組份3是組份2的抑制劑。各種組份需在預定時間內(nèi)反應，其條件控制在生物活性使組份1與組份2反應解離出組份1，組份3將干擾組份1與組份2之間的反應。反應完成后，去除樣品。測出殘留表面的組份1的量，此量與樣品中組份3的量有正比關(guān)系。本發(fā)明還提供一種方法，利用生物抑制性活性，通過固相法鑒定生物活性物質(zhì)的特性的方法。組份1偶聯(lián)指示劑1結(jié)合到一表面上，樣品與組份1接觸。樣品中含有組份2，已知其具有一般生物活性，但不知道它的特殊活性。樣品中還包含有已知量的組份3，它可能是組份2的抑制劑。此試驗包括一組這樣潛在的抑制劑。反應需控制在以下條件，生物活性使組份1與組份2反應解離出組份1。如果組份3對組份2特異性的話，它能夠干擾組份1與組份2之間的反應。預定時間結(jié)束后，如已知技術(shù)那樣，一般需要清洗除去樣品。測定殘留表面的組份1的量，假如此量減少，那么說明組份3干擾了組份1與組份2之間的反應，以此鑒定組份2。假如殘留表面的組份1量沒有明顯減少，那所選擇的特殊抑制劑沒有干擾反應，組份2不能被鑒定。此技術(shù)確切的標準曲線按已知的技術(shù)操作。本發(fā)明還提供了基于組份2具有生物活性，做了組份1與組份2之間競爭性試驗。第一套試驗第一組用固相競爭性檢測法，利用物質(zhì)的生物活性定量有生物活性物質(zhì)。組份1的量已知，它與有生物活性的組份2結(jié)合，并結(jié)合到反應容器的表面。加入樣品或者抽提物，其中含有有生物活性的組份2，其量未知。樣品中還含有另一部分與指示劑1偶聯(lián)的組份2，其量已知。反應條件依據(jù)生物活性，達到組份1與組份2結(jié)合為好。預定時間結(jié)束后，將樣品移去。測出結(jié)合到組份1，與指示劑1偶聯(lián)的組份2的含量，此量與樣品中有生物活性但量未知的那部分組份2之間存在反比關(guān)系。通過已知的確切標準曲線，可對其進行定量。在另一個檢測試驗中，第二組中樣品含有未知量的組份1和已知量的與指示劑1偶聯(lián)的組份2。結(jié)合到組份1并與指示劑1偶聯(lián)的組份2的量與樣品中組份1的未知量之間呈反比關(guān)系。第二套試驗固相競爭性檢測試驗，即利用物質(zhì)的生物活性檢測有生物活性物質(zhì)量的方法。在這套試驗中，具有生物活性的組份2，其量已知，結(jié)合到反應容器的表面。加入的樣品中含有未知量的組份2；已知量的組份1(與指示劑1偶聯(lián))?？刂品磻獥l件，依據(jù)生物活性，恰使組份1與組份2結(jié)合。反應結(jié)束后，將樣品去除。測定結(jié)合到組份2上的與指示劑1偶聯(lián)的組份1的量，它與樣品中組份2的未知量呈反比關(guān)系。在第二套第二組的另一試驗中，樣品只含有組份1，但分兩部分，已知量的一部分與指示劑1偶聯(lián)，另一部分組份1的量未知。反應結(jié)束后，測定結(jié)合組份2并與指示劑1偶聯(lián)的組份1的量，它與樣品中未知組份1的量呈反比關(guān)系。在這些競爭性檢測試驗中，組份2可以是酶，組份1是酶的抑制劑。另一種選擇，組份2可以是凝集素，而組份1是凝集素結(jié)合物。此外，這些試驗可用受體作為組份2，而組份1是受體結(jié)合物。附圖的簡要說明本發(fā)明其他優(yōu)點是，結(jié)合附圖使本發(fā)明清晰易懂。下面參考附圖對本發(fā)明進行詳細說明，本發(fā)明附圖有圖1是合成生物素(酰)化β-葡聚糖的框架圖。β-葡聚糖的羥基基團被高碘酸鈉(NaIO4)部分氧化為醛基(A)，隨后反應液中加入乙二胺[NH2(CH2)2NH2](B)。希夫堿被四氫硼化鈉(NaBH4)還原(C)，緊接著β-葡聚糖-乙二胺復合物的自由氨基基團與N-羥基琥珀酰亞氨酯生成生物素(酰)化β-葡聚糖(D)。圖2是用ELSA檢測β-葡聚糖酶過程的框架圖。底物是生物素?；摩?葡聚糖(B-βG)，它與β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)作用，通過清洗(A)將水解的底物去除。然后用過量堿性磷酸酶-鏈霉抗生物素蛋白復合物(SA-SP)與水解的(B-βG)作用，隨即洗去未反應的SA-SP(B)。SA-SP結(jié)合到水解的底物B-βG的量，用pNPP(C)與之作用來對其定量。箭頭指的是被β-葡聚糖酶水解的鍵。圖3是生物素-葡聚糖底物被β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)水解后，未水解的β-葡聚糖用第二種酶進行定量的曲線。0.002生物素-葡聚糖的兩個濃度分別稀釋50倍和100倍[1∶50(■)和1∶100(□)稀釋液]，而0.2生物素-葡聚糖復合物分別稀釋50,000倍和100,000倍[1∶50,000(▲)和1∶100,000(Δ)稀釋液]包被在微量滴定板上(如何制備作為材料與方法在例1中詳細描述)。β-葡聚糖酶(100μl)按照指定濃度加入孔中并混勻，在22℃，反應保持15分鐘。用PBS-T緩沖液沖洗以結(jié)束反應。然后在每個孔里加堿性磷酸酶-鏈霉抗生物素蛋白復合物(SA-SP)，下一步洗去未結(jié)合的復合物。結(jié)合上去的堿性磷酸酶加上硝基苯磷酸在1M的二乙醇胺緩沖液中溫育在22℃，反應保持30分鐘，以此進行定量。其值是三次試驗分析的平均值即(mean±SD)。圖4是對木聚糖蛋白酶檢測的標準曲線圖。生物素(BNHS)與阿拉伯木聚糖的比率是0.2，底物稀釋1至10000倍。加入每一孔中的酶量，由橫坐標指示。其它條件在圖3和實施例1的材料方法中已經(jīng)述及。其值是三次試驗分析的平均值(mean±SD)。圖5是生物素-β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)的水解時間-反應曲線圖。0.2生物素-葡聚糖稀釋50,000倍，酶的6個濃度分別是0.032(1)、0.16(2)、0.8(3)、4(4)、20(5)和100(6)mU/孔，反應溫度22℃，作用時間是0、1、3、9、27分鐘。顯色反應溫度在22℃，時間30分鐘。其它操作過程在圖3和實施例1的材料方法中已經(jīng)述及。β-葡聚糖酶的凈活性值通過包含酶的吸收值(ODi)減去不包含酶的吸收值(ODo)獲得。圖6是β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)的濃度對生物素-葡聚糖水解的影響圖。圖中指示檢測的時間和酶濃度。其它條件在圖5中述及。圖7是預先水解(Δ)的和未水解(O)的β-葡聚糖對β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)活性影響的曲線圖。圖中顯示將兩種形式不同量的β-葡聚糖加入含有生物素-β-葡聚糖的孔中，再在每孔中加的0.5mU的β-葡聚糖酶50μl，其它條件在實施例1的材料方法和圖5中述及。圖8是比較偶氮-大麥葡聚糖法和ELSA法對β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)檢測的標準曲線的曲線圖。ELSA(■)偶氮一大麥葡聚糖(▲)，請參閱實施例1的材料與方法和圖5，可詳細了解兩個檢測。圖9是胰蛋白酶濃度的典型的劑量-反應曲線圖(實施例2)。圖10A-B是劑量-反應曲線圖，分別是測定卵類粘蛋白(A)濃度或抑蛋白酶醛肽(B)濃度決定的劑量-反應曲線。這一檢測的操作過程與圖9中的一樣，只是用卵類粘蛋白和抑蛋白酶肽醛代替了未標記的胰蛋白酶作為可變的競爭劑。三次試驗分析的平均值，即吸收值±SD，陽性對照其值是2.0±0.01(A)和1.95±0.002(OD)光密度單位。圖11是胰蛋白酶抑制劑(卵類粘蛋白)與其他不同的蛋白酶交叉反應圖的曲線圖。用于這一試驗的蛋白酶有胰蛋白酶(EC3.4.21.4)■---■,；膠原酶(EC3.4.24.3)---；組織蛋白酶D(EC3.4.23.5)●---●；彈性酶(EC3.4.21.11)Δ---Δ；嗜熱菌蛋白酶(EC3.4.24.27)--；胃蛋白酶(EC3.4.23.1)|--|；木瓜蛋白酶(E)··C3.4.22.2)_--_；蛋白酶ⅩⅢ(EC3.4.23.18)----；蛋白酶ⅩⅩⅪ+-+；和蛋白酶Ⅳ除了那些作為可變競爭劑取代未標記的胰蛋白酶的蛋白酶，其余鑒定過程在圖9中給出。這些值是三次試驗的平均值。陽性對照的吸收值±SD是1.85±0.007光密度(OD)單位。圖12是用胰蛋白酶水解生物素?；摩?酪蛋白的曲線圖。得出的值是三次反應分析的平均值SD±0.005OD單位(請參閱例3的材料與方法)。圖13是用木瓜蛋白酶水解生物素酰化的α-酪蛋白的曲線圖。得出的值是三次反應分析的平均值SD±0.005OD單位。圖14是用蛋白酶Ⅳ(streptomycescaespitosus)水解生物素?；摩?酪蛋白的曲線圖。得出的值是三次反應分析的平均值SD±0.005OD單位。圖15是關(guān)于檢測卵類粘蛋白(胰蛋白酶抑制劑)抑制胰蛋白酶活性的抑制性圖。得出的值是三次反應分析的平均值SD±0.002OD單位。胰蛋白酶活性100％受抑制得到的最高光密度值ODmax是1.056。最高光密度值ODmax等于孔板中包括胰蛋白酶和抑制劑的所得的OD值，減去另一孔板中只含有胰蛋白酶所得的OD值。優(yōu)選實施方式的詳細說明根據(jù)本發(fā)明，公開了一種應用固相法測定生物活性的量(比例和程度)和/或?qū)τ猩锘钚缘奈镔|(zhì)進行定量或鑒定。其原理是利用物質(zhì)自身的生物活性，進行自我鑒定。本方法不需要抗體。已知的固相法檢測，組份1結(jié)合到反應器皿表面，樣品與反應容器中的組份1(含有指示劑分子)接觸。樣品中包含具有生物活性的組份2。相反的若組份2結(jié)合到反應器皿表面，樣品中包含組份1也是可行的。由于具有生物活性是組份1和2之間發(fā)生相互作用。這種作用使指示劑分子發(fā)生改變。生物活性和/或具有生物活性的物質(zhì)，意思是說，任何生物分子作用另一個分子上，要么改變，要么結(jié)合到其分子(配體)上。可以作用在其中，也可作用其一部分，或派生出一個生命系統(tǒng)/有機體。例如象這一類分子，如酶、凝集素、受體、細胞粘和分子等就屬于上面所述。固相法檢測，對競爭性和非競爭性都適用，它一般包括兩種組份。其中一個具有生物活性組份(本文一般指組份2)對另一個組份(一般指組份1)起作用。由于組份2具有生物活性，結(jié)合或干擾(抑制劑)組份2。例如這兩種組份可以是酶及其底物、酶及其抑制劑、凝集素和凝集素結(jié)合物質(zhì)、受體和受體結(jié)合物質(zhì)、以及粘著分子和細胞表面分子。檢測試驗需要將其中一個物質(zhì)結(jié)合到反應容器表面。一般將組份1結(jié)合上去，相反，本發(fā)明也提供將組份2結(jié)合到容器表面的試驗方法。在本發(fā)明的各種實施方式中詳細描述了用試驗中的一個組份結(jié)合(或包被)反應容器表面的方法。一般來說，結(jié)合方法不同，結(jié)合到表面的組份所起的作用就不同。方法中包括已知的酶免疫技術(shù)(EIA)，采用“三明治”法。例如，抗體即可以作為結(jié)合到表面的物質(zhì)，反過來又結(jié)合該組份。選擇試驗方法要使硬脂對組份的影響達到最小，對于試驗的實施方式各組份的量要最合適。在這一優(yōu)選的實施方式中用微量滴定板作為反應容器。另外，檢測試驗中需要將一個組份進行標記，試驗中所指的標記物是一個用于定量分析結(jié)果的指示劑分子。組份可以通過隨機標記或只是一端標記在合適的酶切位點，結(jié)合位點或其它活性位點?？赏ㄟ^直接或間接進行測量。如果是間接測量，指示劑分子可以是一個偶聯(lián)的系統(tǒng)，象生物素-親和素(或鏈霉抗生物素蛋白)。系統(tǒng)中的一個組份被生物素標記。偶聯(lián)到親和素上的標記物可以是堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、顏色染料、熒光分子、發(fā)光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘化。不僅親和素(或鏈霉抗生物素蛋白)標記的指示劑可用于檢測生物素?；牡孜?。其它互相結(jié)合偶聯(lián)的一對也可使用。這些偶聯(lián)的物質(zhì)需具有這些性質(zhì)低結(jié)合常數(shù)，在反應條件下穩(wěn)定，有特異性，不增加背景值，不干擾檢測。其它偶聯(lián)的一對組份之間的反應，可以發(fā)生在抑制劑和其具有生物活性的靶物質(zhì)之間，也可在碳水化合物和凝集素之間反應。例如用甘露糖或葡萄糖代替生物素，相對應的用標記的凝集素代替親和素，即甘露糖-凝集素或葡萄糖-凝集素，就是一個偶聯(lián)對。測量這些標記的技術(shù)方法對于本專業(yè)人員都熟悉，在本發(fā)明的實施例中也有涉及。從另一方面說，可利用直接測量被標記的組份，可用的指示劑(標記物)如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、顏色染料、熒光分子、發(fā)光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘化。如本文所述，保持各組份間的生物活性是各組份之間混合反應的條件。通常，當有生物活性的物質(zhì)和其它組份發(fā)生反應，就會改變可用于測量的標記物的量。例如，當生物上的活性物質(zhì)是酶，它將解離或酶切它的底物(結(jié)合到反應容器表面的組份1)。這些條件已經(jīng)成熟，在本發(fā)明中對于每一個具有生物活性的組份都做了描述。受體一般結(jié)合到它們的配體上，如細胞粘著分子和凝集素的競爭性試驗，測量它們的量是必要的。凝集素曾定義為無免疫球蛋白特性的蛋白(糖蛋白)。它能特異的識別和可逆的結(jié)合到碳水化合物復合物的碳水化合物部分而不改變所識別糖基配體的共價鍵。另一個定義是凝集素是不具備免疫原性的蛋白(或糖蛋白)它聚集細胞和/或沉淀復合糖(糖綴復合物)。凝集素通常作用在寡糖或多糖的非還原性末端，可作用的范圍很小C-3或C-4但C-2就是臨界。(1989Pusztai，關(guān)于凝集素有一個詳細的綜述)，試驗檢測可獲得的凝集素或它們結(jié)合的復合物，樣品可以是某一產(chǎn)品的抽提物，其中可能含有需要鑒定的具有生物活性的物質(zhì)，或是鑒定其活性含量或?qū)ζ浣M份進行定量。就本發(fā)明介紹，應用固相檢測法，樣品/抽提物不需要純化而直接應用，抽提物中所謂影響因素不用去掉，洗滌。而且介紹的方法不需要對要測量的物質(zhì)進行物理抽提。反應后去除樣品，通常據(jù)我們所知，在EIA技術(shù)中采用從反應容器(微量滴定板孔)沖洗掉。測定組份(結(jié)合了指示劑)的殘留量。推薦使用比色檢測法，它用酶標(ELISA)板讀出器和相關(guān)技術(shù)。本發(fā)明提供一種應用固相法，利用生物活性的特征，檢測具有生物活性物質(zhì)的生物活性量。在此方法中組份1偶聯(lián)指示劑1并結(jié)合到反應容器表面。樣品與結(jié)合到容器表面的接觸。樣品中包含組份2。組份2具有生物活性，但其含量(比率)未知，這就是試驗中要測定的量。這些組份混合狀態(tài)下反應，條件控制在組份1與組份2之間保持活性。在這個試驗中，活性作用結(jié)果是從表面上解離下組份1或其分子的一部分，也就是說組份2水解被標記的組份1，或從表面將其移去。樣品在允許反應的限定時間后去除。在反應結(jié)束后，如何測定組份1結(jié)合在表面的殘留量，在本文前面有述。生物活性的量與依舊結(jié)合在表面的組份1的殘留量之間有一個反比關(guān)系。也就是說，組份2的活性越大，依舊結(jié)合在表面的組份1的量就越少。這一方法中組份2可以是酶，而組份1是酶的作用底物。酶能夠?qū)Ω叻肿雍头歉叻肿拥牡孜镏羞x擇降解。高分子底物是那些至少具有兩個酶切位點的蛋白、多肽、碳水化合物、DNA和RNA。可選的非高分子底物也可以是的肽、碳水化合物分子以及核酸序列，它們只有一個被酶作用的位置(位點)。例如，對某一選定的蛋白酶，它的蛋白底物可以是酪蛋白、白蛋白、膠原和明膠。在另一選擇的實施例中，選定的酶是β-葡聚糖酶，它的底物是葡聚糖。若酶是木聚糖酶，它的底物是阿拉伯木聚糖。如果酶是纖維素酶，它的底物是纖維素。如上述討論，測量與指示劑偶聯(lián)的組份1殘留量，可用間接標記物，如生物素-親和素(親和素偶聯(lián)到堿性磷酸酶上)，若直接標記物，就用堿性磷酸酶，優(yōu)選的比色法也可以用。對于檢測來說，本文中已給出一個適合的校準曲線或標準曲線，使測量結(jié)果得以定量。標記高分子底物(組份1)，生物素或其它標記物偶聯(lián)到分子各部分。酶在多酶切位點上作用分子，很多標記物被移走，說明了酶的活性。對于非高分子底物來說，只有一個酶切位點。組份1直接或間接地結(jié)合到表面，分子的其它部分直接或間接地被適當?shù)闹甘緞擞?。組份2將底物分解，在此例中，它是酶。組份2將指示劑分子釋放到介質(zhì)中，隨后被去除，一般采用清洗。被標記分子的殘留量和生物活性物質(zhì)的活性是相關(guān)的。例如作為一個酶的底物，肽，通過肽的末端羧基結(jié)合到表面，無論采用直接測量法還是間接測量法，其另一末端氨基基團與指示劑1分子結(jié)合。反應結(jié)束后，可以定量測定含有標記物的未水解的底物，它的量與相對應的酶的活性成反比。本發(fā)明同時提供一種方法，通過固相法，利用物質(zhì)的生物抑制活性，檢測抑制劑(一種有生物活性的物質(zhì))的生物活性。在這個試驗中，組份1結(jié)合到反應容器表面，組份1與指示劑1偶聯(lián)。隨后在反應容器中加入含有已知含量組份2的樣品，已知組份2具有生物活性。樣品中同時含有未知含量的組份3，它是組份2的抑制劑。這些組份在規(guī)定時間內(nèi)反應，反應條件控制在，生物活性使組份1與組份2的作用過程中把組份1解離，組份3干擾了組份1與2之間的反應。反應結(jié)束后，將樣品去除。如上所述，測定反應后依然在表面上結(jié)合的組份1的量。依然與表面偶聯(lián)的組份1的量與樣品中組份3的量呈正比關(guān)系。也就是說，反應中抑制劑越少，組份1與2之間的反應解離下來的標記物就越少。樣品中抑制劑越多，可用于檢測的標記物就越多。如上所述，高分子或非高分子的組份1(底物)可用于檢測和被標記。在本發(fā)明的第三個實施方式中，公開了一種檢測方法，利用生物活性的抑制作用通過固相法鑒定有生物活性物質(zhì)。如上述前兩個試驗，組份1偶聯(lián)指示劑1結(jié)合到表面。樣品與組份1接觸，樣品中含有組份2，知道它有一般生物活性，但不知道它的特異性。例如，組份2是一個蛋白酶，但不能明確它是哪一種蛋白酶。樣品中含已知量的組份3，它可能是組份2的抑制劑。作了一組幾個試驗，來檢測潛在抑制劑。反應在如下條件進行，組份1與2在生物活性作用下，解離出組份1。如果組份2是特定的話，組份3干擾組份1與2之間的反應。過了反應規(guī)定時間，將樣品除去，通常用本文已知的方法清洗。測定結(jié)合在表面的組份1的殘留量。如果結(jié)合在表面的組份1的量減少，則說明組份3干擾了組份1與2之間的反應，組份2就可被鑒定。若結(jié)合在表面的組份1的量沒有明顯減少，則說明所選擇的特殊抑制劑沒有干擾組份2，組份2就不能被鑒定。本文中已給出標準曲線。本發(fā)明基于組份2具有生物活性，同時提供了組份1與2的競爭性試驗。在這一套試驗中是應用固相競爭法，即利用物質(zhì)的生物活性來確定具有生物活性物質(zhì)的量。已知量的組份1結(jié)合到反應容器表面，組份1能與有生物活性的組份2結(jié)合。樣品或抽提物既包括一部分未知量的組份2，還包括一部分已知量的組份2(已與指示劑偶聯(lián))。由于具有生物活性，反應控制在組份1與2能夠結(jié)合。在規(guī)定時間之后，用本文前述方法，去除樣品，測定的組份2(偶聯(lián)指示劑1)與組份1結(jié)合的量。這個量與樣品中具有生物活性的組份2的未知含量之間，呈反比關(guān)系。也就是說，標記物越多，組份2的未知含量就越少。本文中已給出適當?shù)臉藴是€，供定量使用。這套試驗的另外一組，樣品中含有其量未知的組份1，還含有與指示劑1偶聯(lián)的已知含量的組份2。與表面結(jié)合的組份1結(jié)合了組份2(已與指示劑偶聯(lián))。測定這個組份2的量，其結(jié)果與樣品組份1的未知含量成反比。在這些試驗中，組份2可以是酶，而組份1是酶的抑制劑。在一個實施例中，酶選用胰蛋白酶和它的抑制劑是卵類粘蛋白或抑蛋白酶醛肽。另外可用凝集素作為組份2，組份1是凝集素結(jié)合物質(zhì)。這個試驗還可用受體作為組份2，受體結(jié)合物質(zhì)作為組份1。以及細胞粘和分子與細胞表面結(jié)合分子如CD2和細胞表面分子LFA-3也可用。受體和它的特殊結(jié)合基團(配體)的相互作用，與酶和酶的抑制劑，凝集素和凝集素結(jié)合物質(zhì)之間的作用一樣。無論是配體或是受體包被在微量滴定板上，配體或受體的定量分析采用競爭型試驗。在此條件下，無論是配體或是受體都會被適當?shù)闹甘緞┓肿訕擞洠克颗潴w或受體。第二套競爭性試驗應用固相競爭法是利用物質(zhì)的生物活性，來確定具有生物活性物質(zhì)的量。在這些試驗中，具有生物活性的組份2，其量已知，結(jié)合到反應容器表面。加入的樣品中既含有組份2又含有組份1，其中組份2含量未知，組份1(已與指示劑1偶聯(lián))，其量已知。反應在以下條件下進行，由于有生物活性，使組份1與組份2結(jié)合。在反應完全結(jié)束后，去除樣品。測定組份1(已與指示劑1偶聯(lián))結(jié)合到組份2(與表面結(jié)合的)上的量，此量與樣品中組份2的未知量呈反比。這套試驗的另一組樣品中的組份1分為兩部分，一部分與指示劑1偶聯(lián)，它的量已知。另一部分組份1的量未知。反應完全結(jié)束后，測定組份1(與指示劑偶聯(lián))結(jié)合到組份2上的量，此量與樣品中組份1的未知量呈反比。在這些試驗中組份2可以是酶，而組份1是酶的抑制劑。在一個實施例中，酶選用胰蛋白酶和它的抑制劑是卵類粘蛋白或抑蛋白酶醛肽。另外可用凝集素作為組份2，組份1是凝集素結(jié)合物質(zhì)。這個試驗還可用受體作為組份2，受體結(jié)合物質(zhì)作為組份1。也可用細胞粘著分子與細胞表面結(jié)合分子。本發(fā)明可同時提供試劑盒做上述試驗。另外試劑盒含有各個組份適合的緩沖液。如酶、底物或/和抑制劑、凝集素和凝集素結(jié)合物質(zhì)、(配體)受體和受體結(jié)合物質(zhì)(配體)、細胞粘著分子與細胞表面結(jié)合分子的適合的緩沖液。提供標準的反應容器，容器可事先包被符合試驗用途的組份1或組份2，不局限于酶、受體、凝集素、凝集素結(jié)合物質(zhì)或受體結(jié)合物質(zhì)。另外，試劑盒還包括已標記好的組份和抑制劑，包括但并不局限于酶、受體、凝集素、凝集素結(jié)合物質(zhì)或受體結(jié)合物質(zhì)。試劑盒中還包括用于比色或其它方法的必要材料，這些材料用來測定試驗過程中，留在反應容器上的標記物(指示劑)的含量。在實施例1中應用本發(fā)明介紹的方法，一個簡便、靈敏的親和素-生物素酶聯(lián)吸收法(ELSA)，即利用氨基化和生物素酰化的葡聚糖作為底物(圖1)，檢測β-葡聚糖酶。在這個試驗中，底物與β-葡聚糖酶一起溫育，殘留在滴定板上的β-葡聚糖-生物素，加堿性磷酸酶-鏈霉抗生物素蛋白復合物到未反應的底物復合物(圖2)中，通過酶促反應定量。由結(jié)合上去的堿性磷酸酶的活性產(chǎn)生的顏色反應，間接的與原滴定板孔中的酶的活性有關(guān)。應用第二個酶，不僅可以放大信號，而且以此為基礎，提供了進一步簡便監(jiān)測β-葡聚糖酶活性的方法。β-葡聚糖酶部分水解底物顯示從未水解的底物分離出的生物素和堿性磷酸酶-鏈霉抗生物素蛋白復合物反應，即最終用堿性磷酸酶定量留在板上的β-葡聚糖。在試驗中，結(jié)合上去的指示劑酶即堿性磷酸酶的活性，與樣品中的β-葡聚糖酶的活性呈一定比例關(guān)系。ELSA是一個簡便的方法，水解的β-葡聚糖片段，很容易用清洗的方法從未水解的底物中分離。它最適合于大批樣品的常規(guī)檢驗(可達200人/日)，有很好的精確度(CV=4.0％到6.4％)，高的靈敏度(可檢測如0.001mU的β-葡聚糖酶/每個試驗)。一個相似類型的試驗，用生物素酰化的阿拉伯木聚糖檢測木聚糖酶。在實施例1中應用本發(fā)明的ELSA方法步驟檢測β-葡聚糖酶和木聚糖酶，證明既簡便且靈敏度高。在實施例2中，介紹本發(fā)明的一個具體方法，它不僅對樣品中的酶進行定量，而且能定量它抑制劑的濃度。這個方法涉及生物素?；拿敢种莆談┓?BEISA)，它的原理是生物素標記的酶與之相對應的抑制劑特異性結(jié)合。在此試驗中抑制劑被包被在塑料表面上，這里介紹的是微量滴定板孔。已知含量的生物素標記的酶和未知含量待測的酶混合，通過競爭固定化的抑制劑進行定量。酶-生物素復合物被抑制劑結(jié)合，也就可以定量的結(jié)合指示劑酶，即鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶偶聯(lián)物。親和素-磷酸酶復合物既已經(jīng)被固定化，就可以與磷酸酶的一個底物發(fā)生反應，生成一個有顏色的溶液。此反應的顏色強度與樣品中未知量的酶呈反比關(guān)系。酶在溶液中的精確含量，通過已知酶濃度做出的標準曲線上估計出來。樣品中抑制劑用同樣的方法定量。在此過程中，要被定量的抑制劑與被固定在塑料表面的抑制劑相互競爭溶液中的生物素(酰)化酶。親和素-磷酸酶復合物可定量的和已經(jīng)偶聯(lián)在固化抑制劑上的酶-生物素復合物反應，隨后顏色顯示。未知濃度的抑制劑可通過已知濃度的抑制劑所做的標準曲線測定，其濃度與親和素-磷酸酶復合物生成的顏色強度呈反比。實施例3是固相生物素?；睦业鞍自囼灒C實本發(fā)明采用固相法檢測蛋白酶和蛋白酶抑制劑的正確性。將底物與固相的結(jié)合極大的簡化了此試驗接下去的反應步驟，象當清洗去除水解產(chǎn)物和未反應的試劑后，殘留底物的量就可用標記的底物直接分析。若與固相上的生物素結(jié)合，它是一個相對較小分子。底物應避免硬脂(N-羥基琥珀酰亞酯)可能與較大的指示劑分子發(fā)生反應的干擾，所用的指示劑要有靈活性，即生物素要和任何指示劑發(fā)生反應，指示劑要偶聯(lián)親和素蛋白與生物素之間要具有較高的親和性(格林，N.M.,1963)。另外，用堿性磷酸酶作為指示劑分子，比有色的分子好，因為堿性磷酸酶可明顯放大信號，每個堿性磷酸酶分子可產(chǎn)生許多有顏色的分子。全部過程采用滴定板以及連接電腦的ELISA讀出器，讀取吸收值，可在相對較短的時間內(nèi)十分方便地計算分析大量的樣品。此外，本方法需要的試劑少，靈敏度高而且精確，在較短時間內(nèi)即可完成。此方法最適合自動化的分析大量樣品。生物素?；睦业鞍自囼灧椒ǖ撵`敏度，根據(jù)實施例3的條件，比放射性實驗的結(jié)果低(Sevier,E.D.,1976),FTC-酪蛋白法(Twining,S.S.,1984),FITC25白蛋白法(Voss等1976)，F(xiàn)P方法(Bolger等1994)。但是此方法能夠滿足大多數(shù)蛋白酶檢測基本需要，可以在很大范圍內(nèi)測蛋白酶活性(10-106ng胰蛋白酶/100μl/樣品)。就試驗結(jié)果指出，在其設計上有些靈活性，然而卻是相對靈敏的。申請人已證實，檢測的靈敏度可通過增加底物生物素酰化的程度，降低底物包被在滴定板孔上的量，增加水解的持續(xù)時間等方法，這些變化能使靈敏度顯著提高。但有時為獲得一個滿意的吸收值，就要相應延長時間。解決后面的問題，可用不同的指示劑酶，象辣根過氧化物酶可高度轉(zhuǎn)化或采用親和素復合物，它含有多個指示劑分子結(jié)合的單位。在這樣的條件下，檢測蛋白酶不僅有可能提高靈敏度，而且可在相對較短的時間內(nèi)完成。盡管此試驗中選擇α-酪蛋白作為底物，若其它蛋白被證明更適合特殊檢測或一組檢測的話，也可采用。同時試驗結(jié)果也指出，如果在試驗中偶聯(lián)一組不同的抑制劑，每個都可抑制不同種類的蛋白酶，那么樣品中蛋白酶的種類就可以容易鑒定。另外，測定特殊蛋白酶抑制劑的濃度，該試驗還要修改。綜上所述，這份報告是關(guān)于檢測蛋白酶和蛋白酶抑制劑的新方法的進展情況，也就是對其靈敏、精確、簡便、快速且容易適合待測試驗樣品的特異性作出說明。開展此試驗并不昂貴，所使用的儀器大多數(shù)實驗室都有，而且能自動檢測。上述討論為通過固相法(無論是競爭性的還是非競爭性的)，不包括抗體在內(nèi)的，為檢測生物活性的量和/或具有生物活性物質(zhì)的量和/或它的抑制劑和試劑盒的檢測提供事實的基礎。下面就本發(fā)明的應用方法，展示以下非局限的實施例和相應的附圖。實施方式一般方法試驗技術(shù)和一般操作技術(shù)請參閱斯泰茲等人(Stitesetal.)著的《基礎臨床免疫學》，第8版，Appleton&Lange出版社出版，也可參閱凱米尼和查拉康比(KemenyetChallacombe)著的《親和素一生物素酶聯(lián)合吸收法及其他固相免疫法的理論與實踐》，WileyandSons出版社，紐約，1988年。實施例1親和素-生物素酶聯(lián)合吸收法(ELSA)檢測β-葡聚糖和木聚糖的活性材料以下材料從澳大利亞悉尼N.S.W.2102MegazymePty.Ltd.獲得，地衣淀粉酶(內(nèi)-1,3-1,4-β-葡聚糖-D-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.73)從bacillussubtilis(batchMLI82001)(細菌分類名)，外-1,3-β-葡聚糖酶(EC3.21.58)Trichodermasp(EBG00703)，大麥β-葡聚糖(lotBBG30108)黑麥粉阿拉伯木聚糖(pentosan,batchMRP90801)，木聚糖酶(內(nèi)-1,4-β-D木聚糖木聚糖水解酶，EC3.2.1.32)從Trichodermav/ride(batchMXY80202)和偶氮-大麥葡聚糖獲得。纖維素酶(1,4-β-D-葡聚糖-D-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4)從Aspergillusniger(2型)，支鏈淀粉酶(限制性葡聚糖酶，支鏈淀粉酶6-葡聚糖水解酶，EC3.2.141)從Enterobacteraerogenes,α-淀粉酶(1,4-D-葡聚糖葡聚糖水解酶EC3.2.1.1)從豪豬胰臟(1-4A型)，生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯-硬脂(BNHS),1,2-乙二二胺，對硝基苯磷酸，二乙醇胺和吐溫-20(從希格瑪化學試劑公司，圣路易斯，美國密蘇里州)獲得高碘酸鈉和氫硼化物(從美國新澤西州Fairlawn的Fisher科學公司獲得)，堿性磷酸酶-鏈霉抗生物素蛋白(從美國加州舊金山市的Zymed實驗室獲得)；微量滴定板(Falcon3911,MicrotestⅢ)(從美國加州Oxnard的BectonDickinsonLabware獲得)，二甲基業(yè)砜(DMSO)(從新澤西州菲律斯堡市的J.T.BakerChemicalCo.獲得)，以及雀巢牌方便脫脂奶粉。RM-1是一種粗制的酶由FinnfeedsInternationalLtd制備的，還包括高β-葡聚糖酶，木聚糖酶和其它酶活性物質(zhì)。所有的溶劑和試劑都是分析級的。制備生物素-葡聚糖偶聯(lián)物這一技術(shù)的原理是基于高碘酸鈉氧化多糖上的羥基產(chǎn)生活潑的醛基基團，反應中加入乙二胺分離出一個有氨基的多糖。希夫堿與硼氫化鈉作用形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(汪，1996)。用生物素-羥基琥珀酰亞胺酯-硬脂(BNHS)使生物素偶聯(lián)到氨基基團上。簡言之，1．75mg的β-葡聚糖溶于2ml蒸餾水中；2．加0.1ml,100mM的高碘酸鈉，反應需避光，室溫下混勻半小時；3．加1ml乙二胺處理反應混合物，混勻反應2小時；4．乙醇沉淀去掉未反應的試劑(95％的乙醇8ml加到3ml反應液中)混勻樣品，0℃下離心，10000g10分鐘；5．沉淀用2ml蒸餾水溶解，制劑要清洗三遍，最后洗好的沉淀用2ml蒸餾水溶解；6．將5mg硼氫化鈉加入反應液，4℃，保持4小時。清洗步驟如同上述，清洗三遍。用生物素-羥基琥珀酰亞胺酯-硬脂(BNHS,15mg或0.15mg)稀釋到0.2ml二甲基亞砜(DMSO)中，可在室溫反應3小時。然后如上所述，用乙醇沉淀三次。最終沉淀溶于3ml蒸餾水中，分成若干份，每一份生物素-羥基琥珀酰亞胺酯-硬脂-β-葡聚糖復合物(BNHS-β-glucan)放到聚丙烯管中，密封保存在0℃。復合物中BNHS與β-葡聚糖的比是0.2和0.002，也就是說，復合物的組份分別是15mgBNHS與75mgβ-葡聚糖，0.15mgBNHS與75mg的β-葡聚糖。緩沖液和包被孔板含有0.3％(W/V)脫脂乳的磷酸鹽緩沖液[PBS,NaCl4.39,Na2HPO4,8.19NaH2PO42.45(g/l)；pH7.2]含有0.3％(W/V)脫脂乳的用于稀釋堿性磷酸酶-鏈霉抗生物素蛋白復合物。用于清洗滴定板的緩沖液是PBS(pH7.2)含有0.05％(V/V)吐溫-20,(PBS-T)。磷酸鈉緩沖液(20mM,pH6.5)用于稀釋所有的酶制劑，除了木聚糖酶用25mM的乙酸鹽緩沖液(pH4.7)稀釋外。堿性磷酸酶底物溶液在1M的二乙醇胺緩沖液(pH9.8)中含有1mg/ml對硝基苯甲酸。用0.01M的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)稀釋生物素-葡聚糖復合物，用0.1ml/孔的量直接包被微量滴定板。然后，在室溫下放1小時，再在4℃下過夜。通常，0.2生物素-葡聚糖復合物(BNHS-β-glucan)的儲存液稀釋50,000倍，而0.002稀釋100倍。微量滴定板用PBS-T清洗3遍，去掉液體，放在密封器皿中，在0℃下可存放數(shù)月。測試過程β-葡聚糖酶(地衣淀粉酶)用磷酸鈉緩沖液(20mM,pH6.5)稀釋到所需濃度。取100μl酶加到已被生物素-葡聚糖包被的滴定板孔中，將板封一個不易蒸發(fā)的蓋，混勻，在適當?shù)臏囟认?通常22-24℃)，溫育一段時間(1-30分鐘)，傾空板使停止反應，然后用pH7.2的PBS-T將孔清洗3遍?？瞻讓φ蘸袦赜彌_液，不含酶。堿性磷酸酶-鏈霉抗生物素蛋白(100μg)已用pH7.2的PBS稀釋1000倍，加到每一孔中，室溫下溫育30分鐘。滴定板用pH7.2的PBS-T清洗6遍。在室溫空氣中，涼10到20分鐘。然后把堿性磷酸酶底物溶液每個孔加100μl，室溫下溫育30分鐘?；蛘咧敝撩靠椎墓饷芏任罩祻?.5-2.0不再因酶產(chǎn)生而變化為止。用微量滴定板讀出器，在450nm處讀取數(shù)據(jù)(Bio-RadLaboratoriesLtd.,Mississauga,ON,Canada,Model450)。其它操作流程制備阿拉伯木聚糖底物與β-葡聚糖一樣，只是底物是阿拉伯木聚糖而不是β-葡聚糖。BNHS與阿拉伯木聚糖的比是0.2的底物儲存液在包被滴定板之前稀釋10,000倍。應用偶氮-大麥葡聚糖法檢測β-葡聚糖酶是根據(jù)麥克科利爾和珊米爾(McClearyandShameer,1987)的方法。用三種不同的酶濃度來研究試驗的精確度，酶濃度分別是0.076、2.1和160mU/孔，每個濃度加100μl到孔里，其中含有已稀釋50000倍的0.2生物素β-葡聚糖?；靹?，22℃下，溫育15分鐘。其它操作流程上文已述。試驗在同一個滴定板上重復8次，全部試驗要重復6次。在研究β-葡聚糖對酶活性的影響，在磷酸鈉緩沖液(20mM,pH6.5)中的β-葡聚糖濃度是(5.12mg/ml)，取出等體積0.2U/mL的β-葡聚糖酶與之混勻，在40℃，水解60分鐘。將酶溶液進行沸水浴15分鐘。對照樣品包括β-葡聚糖，但未與酶進行溫育反應，也就不用煮。每孔加50μl水解與未水解的的β-葡聚糖溶液，孔中已含有稀釋了50000倍的0.2生物素-葡聚糖。溶液與50ul(0.5mU)的β-葡聚糖酶溫育，在22℃下，保持15分鐘，其他條件如上所述。結(jié)果與討論β-葡聚糖的水解圖3顯示用不同濃度的β-葡聚糖酶水解不同的生物素-葡聚糖，用堿性磷酸酶-鏈霉抗生物素蛋白復合物檢測未水解底物，獲得的光密度值不同，吸收值提供了一個未水解的底物的量。被水解的底物的凈含量可通過減去每個試驗的無酶對照的吸收值來估算。標記葡聚糖，生物素/葡聚糖=0.2(w/w)，它比0.002比例的復合物吸收值變化大，得到一個較陡的標準曲線。在比較0.2和0.002生物素?；a(chǎn)生的程度，表明底物稀釋越高，靈敏度越高。這些結(jié)果說明，提高靈敏度和降低背景值，可通過提高底物的生物素/葡聚糖的比率，加大包被平板的底物溶液的稀釋度。但這也是有限度的，底物過分的生物素?；?，有可能降低它與酶接觸的能力。相似的，在本試驗中，雖然加大底物的稀釋度可提高靈敏度，但也相應的要增加顏色反應所需的時間。顯然要找一個折衷的方法，就是適當?shù)纳锼嘏c底物的結(jié)合水平、底物濃度以保證試驗中靈敏度、背景值以及顏色反應所需時間都能滿足要求。0.2生物素-葡聚糖底物稀釋100,000能夠在1到100mU/孔范圍內(nèi)檢測β-葡聚糖的活性。這些數(shù)據(jù)表明檢測方法能夠檢出很低的酶活性值。當?shù)孜锸巧锼?阿拉伯木聚糖復合物，用β-葡聚糖酶和木聚糖酶與其溫育，得一相似曲線，在這個試驗中，當把β-葡聚糖酶加入溫育混合物中，它沒有任何活性(圖4)。不同酶濃度的時間-反應在這個研究中，生物素-葡聚糖復合物用不同濃度的β-葡聚糖酶水解(從0.032到100mU/孔)反應時間從1到27分鐘(圖5)。在此試驗和接下去的試驗中，凈吸收值由酶的活性而定。(OD0-OD1450nm)。結(jié)果證實，濃度相對高的酶100mU/孔)其反應在1分鐘之內(nèi)完成，而濃度相對低的酶(0.032mU/孔)反應速度慢，一直持續(xù)超過27分鐘。所得結(jié)果在圖6顯示，證明在較短時間內(nèi)(1-3分鐘)，酶反應速度隨酶量的增加接近直線上升。但隨著溫育時間的延長，曲線就不在隨濃度的增加而呈直線了。這些結(jié)果指出樣品中β-葡聚糖酶的含量，如果選擇適當?shù)脑囼灄l件是可以估測出來的。試驗的優(yōu)點除了靈敏度高外是它的高效率，即一個人一天內(nèi)可做200個這樣的試驗。它的缺點是，僅給出相對的酶活性單位，而不是精確值。此操作可在試驗中加一個已知活性的酶進行校訂，就象偶氮-大麥葡聚糖法(McCleanyandShameer,1987)相似的方法，以校訂或標準曲線就可得到精確值。外源β-葡聚糖對檢測結(jié)果的影響已很清楚，β-葡聚糖酶和其它碳水化合物水解酶一樣，與它們的底物鍵合(Headon,1993；Yuetal.,1995)當樣品中外源底物濃度高時就會干擾試驗。最近的研究證實，水解底物的存在并不影響結(jié)果，而是降低了酶的活性，從吸收值上就能看出。當板孔里的β-葡聚糖的量超過1μg/孔(圖7)，相當于含有酶的抽提物中有10μg/mL的β-葡聚糖。大麥中含有高濃度的β-葡聚糖(5％)，如果抽提用最小量的緩沖液(假設1∶10w/v)，那么每毫升就有5μgβ-葡聚糖5μg/mL，在此條件下，抽提物中的β-葡聚糖對β-葡聚糖酶活性的影響相當小。即使外源β-葡聚糖對β-葡聚糖酶有抑制作用，它的影響可通過事先酶促水解而減輕。類似情況請看圖7。下面討論在β-葡聚糖酶檢測中內(nèi)源底物對檢測結(jié)果的影響。如果在這些試驗中，若稀釋酶抽提物會產(chǎn)生較低檢測值的可能性很大。因為它降低了靈敏度，近來的研究很少采用。從此項研究的數(shù)據(jù)顯示，對試驗進行修訂可用于對抽提物中β-葡聚糖酶的含量進行定量。在此條件下，競爭性的ELSA法適用于兩種形式的底物抽提物中的未知含量和參照量(生物素?；摩?葡聚糖)與滴定板孔表面結(jié)合。這樣的檢測類似于ELISA廣泛應用于檢測分析低分子量的物質(zhì)(KemenyandChallacombe,1988)。試驗的精確度在ELSA檢測中的平均值±SD是根據(jù)三個酶濃度(160、2.1和0.076mU/mL)的8個重復試驗得出的分析結(jié)果。所得的吸收值分別是0.33±0.016(CV=6.4％)和1.25±0.06(CV=4.9％)和1.92±+0.078(CV=4.0％)。當平均CV=12.9％時吸收值的變化比(平均CV=5.1％)時大很多。不同的溫育和顏色反應時間或其它變化的條件導致兩個變化的不同?？赏ㄟ^對照適當?shù)膮⒖记€和更嚴格的反應條件來減輕它們的不同。偶氮-大麥-葡聚糖法與ELSA法在檢測β-葡聚糖酶活性時，二者之間的關(guān)系研究的目的是比較兩個檢測方法的靈敏度，展示本文的方法與另一個間接的而又十分流行的方法，即偶氮-大麥-葡聚糖法。(McClearyandShameer,1987)。在這個比較中，酶濃度采用對數(shù)標度作圖，以此可在很大范圍內(nèi)對兩個方法進行比較。據(jù)圖8所示，當酶濃度相對高時，偶氮-染色過程得到一個陡直的曲線，而ELSA法得到一個平穩(wěn)漸進的曲線。ELSA的檢測范圍從0.001到1mU/檢測，而偶氮-大麥-葡聚糖法的檢測范圍從10到100mU/檢測，靈敏度相差10至100,000倍。偶氮-藍染色法被認為比其它標準更簡便，但也有局限。它需要離心分離水解底物和未水解的底物進行沉淀，這些步驟在ELSA法的試驗預備中是采用的。由于一些常數(shù)改變，如染色的多糖片段溶解性，沉淀劑的離子強度，沉淀和離心的溫度等條件的變化，所以偶氮-染色法必需進行標準校定。這些數(shù)據(jù)說明，用ELSA法檢測β-葡聚糖酶活性，做起來更簡單比相應的偶氮-大麥-葡聚糖法更靈敏。用其它酶水解生物素?；?β-葡聚糖試驗結(jié)果示于表1，對照不同酶制劑對生物素?；?β-葡聚糖的水解程度。在這些檢測中，根據(jù)酶的生產(chǎn)者提供的檢測值，將酶活性稀釋到一般狀態(tài)。雖然對照結(jié)果只是近似而并不精確，但證實了那些酶可以水解β-葡聚糖，如地衣淀粉酶(做對照的酶)，纖維素酶(McClearandGlennie-Holmme,1985)也能夠水解生物素?；?β-葡聚糖。RM-1是一個未純化的粗酶制劑具有較高的β-葡聚糖酶活性，亦能水解生物素?；?β-葡聚糖。其它酶，如內(nèi)-1,3-β-葡聚糖酶(WoodandBhat,1988)水解β-葡聚糖的活性較低或沒有水解底物的能力，支鏈淀粉酶、β-木聚糖酶和α-淀粉酶雖沒有水解底物的能力，但相對于地衣淀粉酶也產(chǎn)生了一個較低的值。影響α-淀粉酶活性的因素，可能與淀粉污染了β-葡聚糖制劑或在酶制劑中殘存了β-葡聚糖酶活性等因素有關(guān)。纖維素酶水解底物的能力說明改變底物(用纖維素而不是β-葡聚糖)為檢測提供基礎。實施例2對酶及其抑制劑進行定量此實施例提供了定量樣品中的酶，同時也可對其抑制劑的濃度進行定量的方法。此試驗推薦“生物素?；拿敢种莆談┓ā?BEISA)，它的原理是生物素標記的酶能特異性的與之相對應的抑制劑結(jié)合。方法NHS-生物素溶液(200μl二甲基亞砜中加5.5mgNHS-生物素)和胰蛋白酶溶液(1000μlPBS加15mg)混合，室溫反應3小時并輕柔的震蕩。用minicon-15濃縮器(Amicon公司產(chǎn)品)，4℃條件下，去除未偶聯(lián)的生物素。最終體積為1000μl。所有化學試劑從希格瑪化學試劑公司(密蘇里州圣路易斯市)或Fisher科學公司(加拿大Winnipeg市)購得。胰蛋白酶(EC3.4.21.4)及其抑制劑、從蛋清中提取的卵類粘蛋白以及抑蛋白酶醛肽用作該試驗證實BEISA的模型。96孔微量滴定板(Falcon3911)用胰蛋白酶抑制劑(卵類粘蛋白4μg/100μl/孔)包被，37℃條件下過夜。板用PBS-T{[PBS,NaCl9.00,Na2HPO4,1.15NaH2PO40.23(g/l)；]加0.05％(V/V)吐溫-20]}清洗一次。再在每個孔內(nèi)加200μl5％的脫脂乳，接著37℃溫育2小時。滴定板用PBST沖洗兩次。除第一排孔內(nèi)加100μl的PBS外，其余每孔加50μl。在第二排孔內(nèi)加50μl濃度為400μg/ml的未標記的胰蛋白酶，其濃度依次稀釋兩倍連續(xù)往后加，直到第11排孔(包括第11)。除第一排孔外，其余各孔加50μl生物素?；囊鹊鞍酌福?用PBS稀釋3000倍，接近2μg/100μl/孔)，然后37℃下溫育1小時。最后每孔體積是100μl。空白對照的那排孔(第一排)中無胰蛋白酶，它作為陰性對照。而第12排孔雖然有生物素?；囊鹊鞍酌?，但沒有未標記的胰蛋白酶，它作為陽性對照。滴定板用PBST清洗3次。然后在每個板孔中加100μl鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(用50mM(pH9.5)的碳酸氫鹽緩沖液稀釋1000倍)，滴定板在室溫溫育30分鐘。隨后滴定板用PBST清洗5次。然后每孔加對硝基苯磷酸底物(100μl/孔)，[對硝基苯磷酸底物在10％的乙二醇胺緩沖液(pH9.8)中的濃度是1mg/ml]。之后滴定板在空氣溫度下，溫育30分鐘。最后滴定板在450nm下用微量滴定板讀出器讀取吸收值(加拿大Bio-Rad實驗室，450型)。得到的是三次分析的平均值。陽性對照的吸收值±SD是1.9±0.02光密度(OD)單位。胰蛋白酶可檢測的濃度范圍從0.1到1.0μg/ml示于圖9，而抑制劑(卵類粘蛋白)可檢測的濃度范圍從1到10μg/ml示于圖10-A，抑制劑(抑蛋白酶醛肽)可檢測的濃度范圍從0.03到1μg/ml示于圖10-B。此試驗可通過降低卵類粘蛋白包被到微量滴定板孔上的量來提高靈敏度。在此條件下需要較長時間的溫育，以獲得酶的顏色反應。使用親和素偶聯(lián)多個單位的堿性磷酸酶來修改顏色反應試驗，可適當縮短顏色反應時間。BEISA的特異性是，特殊的酶需要選擇特異性的抑制劑來包被微量滴定板。在本試驗中，胰蛋白酶抑制劑(卵類粘蛋白)沒有和其它蛋白酶交叉反應(見圖11)。這些結(jié)果顯示BEISA可特異的檢測并定量存在于其它蛋白酶內(nèi)的胰蛋白酶。另外其它抑制劑如結(jié)合彈性蛋白酶的彈性蛋白酶抑制劑，不能干擾標記的胰蛋白酶與胰蛋白酶抑制劑的結(jié)合。其它蛋白象牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA),α-酪氨酸都不干擾檢測。BEISA是可用于定量胰蛋白酶及其抑制劑的新方法。本方法具有靈敏、特效、簡便的優(yōu)點，適合流水作業(yè)和自動化。樣品的混合物不需清除，因為所有影響顏色反應的混合物都在清洗步驟中棄除了。此操作過程可用于任何有合適抑制劑的酶。已知有8000種抑制劑與2000種酶反應。(Zollner,1993)。盡管本試驗采取把抑制劑包被到微量滴定板的表面和標記偶聯(lián)生物素的酶的操作過程，相反，也可采用將酶包被在滴定板表面，標記偶聯(lián)生物素的抑制劑的方法。實施例3相法用生物素?；业鞍讬z測蛋白酶和蛋白酶抑制劑材料α-酪蛋白，生物素酰胺己酰酸酯，(正)羥基琥珀酰亞胺酯，(NHS-生物素)，吐溫-20，對硝基苯磷二鈉(pNPP)，用于本試驗的蛋白酶有胰蛋白酶(EC3.4.21.4)、木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)、嗜熱菌蛋白酶(EC3.4.24.3)、膠原酶(EC3.4.24.3)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)、組織蛋白酶D(EC3.4.23.5)、彈性酶(EC3.4.21.11)蛋白酶Ⅳ(Streptomycescaespitosus)蛋白酶ⅩⅩⅪ(Bacilluslicheniformis)、蛋白酶ⅩⅢ(Aspergillussaitoi)(EC3.4.23.18)和卵類粘蛋白(Sigma化學試劑公司產(chǎn)品)，二甲基亞砜(DMSO)(J.T.Baker化學試劑公司產(chǎn)品)和微量滴定板(Falcon3911)購自BeetonDickionandCO.，檸檬酸(0.1M)-磷酸(0.2M)緩沖液(Stolletal.,1990)用于木瓜蛋白酶(pH6.2)，蛋白酶ⅩⅢ(pH2.8)，織蛋白酶D(pH3.0)彈性酶(pH6.5)，磷酸(0.2M)緩沖液(Stolletal.,1990)用于胰蛋白酶(pH7.5)，蛋白酶Ⅳ(pH7.5)，蛋白酶ⅩⅩⅪ(pH7.5)，嗜熱菌蛋白酶(pH7.5)，膠原酶(pH7.1)，10mM鹽酸用于胃蛋白酶(pH2.0)。制備生物素酰化酪蛋白12mg的α-酪蛋白溶丁1ml，(0.1M,pH7.2)的磷酸鹽緩沖液中[PBS,NaCl9.00；Na2HPO4；1.15NaH2PO40.23(g/l)；]可以和3.6mgNHS-生物素(溶于150μlDMSO中)反應2小時，室溫上輕柔搖振。用生物素?；业鞍讬z測蛋白酶活性的過程微量滴定板，除了第1排的8個，均用生物素酰化酪蛋白(在PBS里0.13μg/孔/100μl)包被，37℃下溫育2小時。滴定板用0.1M的PBST[PBS加0.05％(V/V)吐溫-20]清洗3次。不同濃度的酶溶液100μl(見圖12-14)用適當?shù)木彌_液稀釋(見表2)把它們加到同一個板的3個孔里，在濕潤的空氣中，37℃下溫育30分鐘。滴定板用PBST清洗3次以結(jié)束反應。然后加鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶溶液(碳酸氫鹽緩沖液pH9.5稀釋1000倍)100μl/孔，除第1排8個孔不加外(空白對照)，其余都加。滴定板室溫溫育30分鐘?？瞻讓φ罩挥蠵BS，不加酶，也未包被生物素?；业鞍?。傾空滴定板，用PBST清洗6次，以結(jié)束反應。加pNPP底物孔，[在10％的二乙醇胺緩沖液(pH9.8)中pNPP的濃度是1mg/ml。然后室溫溫育20分鐘，最后滴定板在450nm下用微量滴定板讀出器(Bio-Rad實驗室，450型，加拿大)讀取吸收值。當最大吸收值在2.0光密度(OD)單位左右時，靈敏度最好。用生物素?；业鞍讬z測抑制劑的含量在本檢測中除了每個孔的蛋白酶(胰蛋白酶)濃度一樣(3.36μg/100μl/孔)外，其它步驟與蛋白酶活性檢驗的基本相似，而抑制劑(卵類粘蛋白)的濃度是變化的(見圖15)。在所有過程中，滴定板要蓋上以防止蒸發(fā)。結(jié)果生物素?；业鞍捉Y(jié)合到微量滴定板表面，被不同濃度的胰蛋白酶(見圖12)、木瓜蛋白酶(見圖13)、蛋白酶Ⅳ(見圖14)水解。不同酶濃度為胰蛋白酶從10至106ng/100μl/樣品；木瓜蛋白酶從0.5至4ng/100μl/樣品；蛋白酶Ⅳ從1至1000ng/100μl/樣品。檢測的靈敏度由酶的含量決定，分別是胰蛋白酶30ng/100μl、木瓜蛋白酶700ng/100μl、蛋白酶Ⅳ200ng/100μl最大吸收值的10％的量決定。如果把溫育蛋白酶的時間采用24小時，而不是0.5小時的話，靈敏度可增加10倍。如果把結(jié)合到孔表面的標記的酪蛋白減少，也可大大改進靈敏度。不過這些條件的改變將使生物素-堿性磷酸酶復合物產(chǎn)生顏色反應的比率減低。表2證實了生物素酰化酪蛋白可作為所有蛋白酶的底物。這些酶和包括有活性的絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸及金屬離子在內(nèi)，可歸為4組(IUBMB,1992)，表1示出每個酶進行反應所需的最適pH值。通過研究卵類粘蛋白-胰蛋白酶的抑制劑也證實可用生物素?；业鞍追?，定量樣品中的胰蛋白酶抑制劑其抑制性曲線的斜度是陡直的(見圖15)。貫穿本專利申請，引用包括美國專利在內(nèi)的各種出版物，在下文有全部引用資料的列表。在此特意披露這些參考過的出版物和專利，是此申請完整性不可分割的一部分，也是為了詳細描述與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)背景。本發(fā)明采用例證說明的描述方法，為了更易理解，描述中盡量采用通俗的文字來解釋專業(yè)術(shù)語。顯然，本發(fā)明的許多修正與變化都是根據(jù)上述前人的經(jīng)驗。在所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)進行實際應用本發(fā)明要比詳細的說明更易理解。表1不同酶之間的相對活性11、其檢測過程描述見圖3。所有酶的濃度根據(jù)生產(chǎn)者提供的活性值都稀釋到5U酶活性/mL。所有酶根據(jù)圖5以及材料和方法中的操作規(guī)程進行檢測。所有滴定板孔中的底物是0.2生物素-葡聚糖(稀釋50,000)倍。水解時間15分鐘，顯色反應時間30分鐘，22℃，對每個酶進行檢驗。平均CV小于5％。2、RM-1含有900U/g的β-葡聚糖酶(pH5.0)和其它酶的混合物。表2不同種蛋白酶水解生物素?；?酪蛋白所得光譜1．參閱(IUBMB,1992)有酶分類的進一步描述。2．每一個蛋白酶的檢測都是在最適pH(Sigma,1997)。3．靈敏度由需要水解10％的生物素?；?酪蛋白所需酶的量決定。4．只有當膠原酶超過50000ng/100μl/樣品才能水解生物素?；?酪蛋白(在檢測甲硫氨酸蛋白酶時，介質(zhì)中不能有鋅)。參考文獻1-貝爾利、納瓦來內(nèi)，1981，應用改進溶解性纖維素酶的產(chǎn)量，誘導、分離和檢測Trichodermareesei穩(wěn)定突變，《酶微生物學技術(shù)》，3:153-157。2．博格、凱克維茲，1994，應用熒光極化法檢測蛋白酶的新方法，《生化技術(shù)》，17:585-589。3．貝尼、皮爾森，1970，釀造中的β-葡聚糖和β-葡聚糖酶，《釀造設備雜志》，76:328-335。4．布赫勒，1991，雙抗體三明治酶聯(lián)免疫吸收劑法定量Trichodermareese的內(nèi)原葡聚糖酶Ⅰ《環(huán)境微生物及其應用》，57:3317-3321。5．卡爾曼，1990,β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與各種β-內(nèi)酰胺酶之間的相互作用，《化學療法》，36:200。6．德納爾特等，簡便蔗糖還原法，用各種微生物酶制劑測量麥芽中的β-葡聚糖酶，《美國釀造化學學會雜志》，36:18-23。7．伊德尼，1986，應用單向膠擴散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生物活性量的固相檢測法，包括以下步驟a．一組份1結(jié)合到表面，其中該組份1與一指示劑1偶聯(lián)；b．一樣品中包含組份2，其生物活性未知，與已偶聯(lián)的組份1接觸，混合物反應條件是保持組份1與組份2之間生物活性反應，使組份1解離；c．在確定的反應時間后，去掉樣品；以及d．測定仍然舊結(jié)合的組份1的量，其中生物活性與殘留的組份1的量之間是反比關(guān)系。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該組份2是酶，該組份1是該酶的底物。3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中該酶是一種能夠降解底物的酶，該底物是選自由聚合物底物和非聚合物組成的類組。4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中聚合物底物是選自由蛋白、多肽、碳水化合物、DNA、RNA組成的類組。5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中蛋白是選自酪蛋白、白蛋白、膠原蛋白和明膠使之成為一種用于選出蛋白酶的底物。6．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中酶是β-葡聚糖酶，底物是葡聚糖。7．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中酶是蛋白酶，底物是酪蛋白。8．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中酶是木聚糖酶，底物是阿拉伯木聚糖酶。9．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中酶是纖維素酶，底物是纖維素。10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的測定步驟包括，加入一個與該指示劑1結(jié)合的有標記的指示劑2，測量結(jié)合上去的有標記的指示劑2的量。11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中指示劑1是生物素。12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中指示劑2是親和素或鏈霉抗生物素蛋白。13．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中該標記物選自堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、顏色染料、熒光分子、發(fā)光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘。14．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該樣品是一個抽提物。15．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的測定步驟包括測量尚存留指示劑1的量的步驟。16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的指示劑1是選自由堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、顏色染料、熒光分子、發(fā)光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘所組成的類組。17．一種利用生物抑制活性通過固相檢測法檢測具有生物活性物質(zhì)的生物活性抑制劑含量的方法，包括下列步驟a．一組份1結(jié)合到表面，其中該組份1與一指示劑1偶聯(lián)；b．一樣品中含有已知含量的組份2，其生物活性也已知，樣品中還有未知含量的組份3，它是組份2的抑制劑，該樣品與組份1接觸，此混合物是在這樣條件下進行反應該組份1和組份2之間的生物活性解離該組份1，同時，該組份3干擾該組份1和組份2之間的反應；c．去除樣品；以及d．測定尚存留結(jié)合的組份1的量，其與樣品中組份3的量是正比關(guān)系。18．一種利用生物抑制活性通過固相檢測法鑒定具有生物活性物質(zhì)的方法，包括下列步驟a．一組份1結(jié)合到表面，其中該組份1與指示劑1偶聯(lián)；b．一樣品中含有組份2，已知其具有一般生物活性但不知其特性，樣品中還有已知含量的組份3，它可能是組份2的抑制劑，樣品與組份1接觸，此混合物是在這樣條件下進行反應該組份1和組份2之間的生物活性反應解離該組份1，同時該組份3干擾組份1和2之間的反應；c．在預先確定時間后，去除樣品；以及d．測定尚存留結(jié)合的組份1的量，如果其量減少，則該組份3干擾了組份1和2之間的反應，從而鑒定出該組份2。19．一種利用物質(zhì)的生物活性通過固相競爭性試驗檢測生物活性物質(zhì)定量的方法，包括下列步驟a．已定量的組份1結(jié)合著有生物活性的組份2，再結(jié)合到表面；b．一樣品含有兩部分具有生物活性的組份2，一部分的量未知，另一部分與指示劑1偶聯(lián)，其量已知，該樣品與組份1接觸，此混合物反應條件是，因為有生物活性，組份1與組份2結(jié)合；c．去除樣品；以及d．測定偶聯(lián)到指示劑1并結(jié)合到組份1上的組份2的量，這個量與樣品中有生物活性的組份2的未知含量之間存在著反比關(guān)系。20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該組份2是酶，該組份1是該酶的抑制劑。21．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中組份2是凝集素，組份1是可結(jié)合到凝集素上。22．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中組份2是受體，組份1可與受體結(jié)合的物質(zhì)。23．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中酶是胰蛋白酶，抑制劑是卵類粘蛋白或抑蛋白酶醛肽。24．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的測定步驟包括加入與指示劑結(jié)合的帶有標記的指示劑2，并測量結(jié)合上去的帶有標記指示劑2的量的步驟。25．根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中指示劑1是生物素。26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中指示劑2是親和素或鏈霉抗生物素蛋白。27．根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該標記物是選自由堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、顏色染料、熒光分子、發(fā)光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘組成的類組。28．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中測定步驟包括測量尚存留的指示劑1的量。29．根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述指示劑1是選自由堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、顏色染料、熒光分子、發(fā)光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘組成的類組。30．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中樣品是一個加入已知含量且偶聯(lián)到指示劑1上的組份2的抽提物。31．一種利用物質(zhì)的生物活性通過固相競爭性試驗檢測結(jié)合在生物活性物質(zhì)的定量的方法，包括下列步驟a．已知量的組份1，它能和有生物活性的組份2結(jié)合，結(jié)合到表面；b．樣品中含有組份1，其量未知，還含有組份2，其量已知，且與指示劑1偶聯(lián)，樣品與有組份1接觸，此組份2與組份1結(jié)合混合物反應條件因有生物活性組份1與2結(jié)合；c．去除樣品，以及d．測定與指示劑偶聯(lián)且結(jié)合到組份1上去的組份2的量，此量與樣品中組份1的未知量之間存在反比關(guān)系。32．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中組份2是酶，組份1是酶的抑制劑。33．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中組份2是凝集素，組份1是可與凝集素結(jié)合的物質(zhì)。34．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中組份2是受體，組份1是可與受體結(jié)合的物質(zhì)。35．一種利用物質(zhì)的生物活性通過固相競爭性試驗檢測生物活性的物質(zhì)的定量的方法，包括下列步驟a．把有生物活性的組份2，其量已知，結(jié)合到表面；b．樣品中含有組份2，其量未知，還含有組份1，其量已知且與指示劑1偶聯(lián)，與表面的組份2結(jié)合，混合物反應條件因有生物活性，組份1與2結(jié)合；c．去除樣品；以及d．測定與指示劑1偶聯(lián)并與結(jié)合在表面的組份2結(jié)合的組份1的量，此量與樣品中組份2的未知量呈反比關(guān)系。36．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中組份2是酶，組份1是酶的抑制劑。37．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中組份2是凝集素，組份1是可與凝集素結(jié)合的物質(zhì)。38．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中組份2是受體，組份1是可與受體結(jié)合的物質(zhì)。39．根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中酶是胰蛋白酶，抑制劑卵類粘蛋白或抑蛋白酶醛肽。40．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中測定步驟包括加入帶有標記的指示劑2與指示劑1結(jié)合，測量結(jié)合上去的帶標記的指示劑2的量。41．根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中指示劑1是生物素。42．根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中指示劑2是親和素或鏈霉抗生物素蛋白。43．根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中標記物是選自由堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、顏色染料、熒光分子、發(fā)光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘組成的類組。44．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中測定步驟包括尚存留的指示劑1的量。45．根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中指示劑1是選自由堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、顏色染料、熒光分子、發(fā)光分子、β-半乳糖苷酶、尿酶、氚、14C和碘組成的類組。46．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中樣品是抽提物，加入有已知量且與指示劑1偶聯(lián)的組份2。47．一種利用物質(zhì)的生物活性通過固相競爭性試驗檢測結(jié)合到有生物活性物質(zhì)上的其它物質(zhì)的定量的方法，包括下列步驟a．把已知量的有生物活性的組份2，與組份1結(jié)合，再將此混合物結(jié)合到表面；b．樣品含有兩部分組份1，與指示劑1偶聯(lián)的那部分，其量已知；另一部分其量未知，樣品接觸表面，并與組份2結(jié)合，混合物反應條件因為有生物活性，組份1與2結(jié)合；c．去除樣品；以及d．測定結(jié)合到已結(jié)合的組份2的指示劑1相偶聯(lián)的組份1的量，其中偶聯(lián)到一指示劑的已結(jié)合組份1的量與樣品中未知量的組份1呈反比關(guān)系。48．根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中組份2是酶，組份1是酶的抑制劑。49．根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中組份2是凝集素，組份1是可與凝集素結(jié)合的物質(zhì)。50．根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中組份2是受體，組份1是可與受體結(jié)合的物質(zhì)。51．一套用于實施權(quán)利要求1方法的試劑盒，它包括已偶聯(lián)指示劑1的組份1，已知量的有生物活性的組份2，合適的緩沖液以及試劑，以組成反應混合物，在這樣條件下使組份1與組份2之間的生物活性解離出組份1，反應容器事先以指示劑1標記的組份1包被，以及測定組份1的量所用的檢測材料，而該組份1的量留存在反應容器中以指示劑1為標記。52．一套用于實施權(quán)利要求17方法的試劑盒，它包括已偶聯(lián)指示劑1的組份1，已知量的有生物活性的組份2，組份3是組份2的抑制劑用于對照，合適的緩沖液以及試劑，以組成反應混合物，在這樣條件下使組份1與組份2之間的生物活性解離出組份1，反應容器事先以組份1包被的反應容器，該組份1標記有指示劑1，以及測定組份1的量所用的檢測材料，而該組份1的量留存在反應容器中是以指示劑1為標記的。53．一套用于實施權(quán)利要求18方法的試劑盒，它包括已偶聯(lián)指示劑1的組份1，一組合適的抑制劑的組份3，合適的緩沖液以及試劑，以生成反應混合物，反應容器事先被指示劑1標記的組份1包被，以及測定組份1的量所用的檢測材料，而該組份1的量留存在反應容器中是以指示劑1為標記的。54．一套用于實施權(quán)利要求19或31方法的試劑盒，它包括組份1，已知量的與指示劑1偶聯(lián)的組份2，合適的緩沖液以及試劑，以組成反應混合物，在這樣條件下使組份1結(jié)合到有生物活性的組份2上不能被解離，反應容器事先以組份1包被，以及測定組份2的量所用的檢測材料其留存在反應容器中是以指示劑1為標記的。55．一套用于實施權(quán)利要求35或47方法的試劑盒，它包括已偶聯(lián)指示劑1的組份1，已知量的組份2，合適的緩沖液以及試劑，以組成反應混合物，在這樣條件下使組份1結(jié)合到有生物活性的組份2上不能被解離，反應容器事先以組份2包被，以及測定組份1的量所用的檢測材料，而該組份1的量留存在反應容器中是以指示劑1為標記的。全文摘要本發(fā)明披露一種方法,通過固相檢測法測定生物活性的量,鑒定和/或定量分析生物活性物質(zhì)。該方法是利用生物物質(zhì)自身的活性而形成的檢測方法。該方法提供了競爭性的和非競爭性的檢測。文檔編號C12Q1/34GK1225134SQ97196375公開日1999年8月4日申請日期1997年5月13日優(yōu)先權(quán)日1996年5月14日發(fā)明者羅納德·阿·馬夸特,肖浩,王國杰,張志群,甘志波申請人:曼尼托巴大學