一種堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstD1及其基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstDl，及其編碼基因，以及在7-ACA脫 乙?；械膽?yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] SGNH家族酯酶（esterase, EC 3. I. I. 1)是一類具有廣泛底物特異性的水解酶，包 含脂肪酶、蛋白酶、硫酯酶、芳香酯酶、溶血磷脂酶、碳水化合物酯酶、?；D(zhuǎn)移酶活性。該 家族大約在1995年被鑒定，但是其成員仍然很少被定性，它們不同于大部分含有典型的 GxSxG的保守序列的α/β水解酶超家族酯酶，而是含有獨特的GDSL的保守序列，是一類 新家族的醋酶。⑶SL家族的醋酶含有5段保守序列區(qū)（five consensus sequence blocks I-V)，在5段保守序列區(qū)中含有4個較保守的催化位點Ser，Gly，ASn和His，因此又可以分 為SGNH亞家族酯酶。SGNH家族酯酶參與細菌毒力，植物發(fā)育和形態(tài)發(fā)生以及植物防御機制 (Asler IL, et al.，Chembiochem. 2010, 11:2158 - 2167)，本發(fā)明的醋酶 EstDl 屬于微生物 來源的⑶SL酯酶家族中SGNH亞家族酯酶。
[0003] 脫乙?；念^孢菌素是工業(yè)上合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的重要原料，而脫乙酰化 的頭孢菌素通常由頭孢菌素 C和7-ACA經(jīng)化學途徑或酶途徑脫乙?；饔玫玫剑阜ㄒ蚱?反應(yīng)較溫和，產(chǎn)量較高而且伴有較少的副反應(yīng)而得到重視（Irene Martinez-Martinez, et al.，Analytical Biochemistry. 2007, 369:210 - 217)。因此尋找能夠?qū)㈩^抱菌素高效脫乙 酰化的酯酶具有重要的工業(yè)價值。
[0004] 然而，天然菌株發(fā)酵周期長，產(chǎn)酶量低，純化困難，生產(chǎn)成本高，難以大量生產(chǎn)，限 制了其推廣應(yīng)用。利用分子生物學手段構(gòu)建高效生物反應(yīng)器，可以提高SGNH家族酯酶的表 達量，實現(xiàn)其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstDl，及其編 碼基因，以及含有該基因的重組表達載體、重組菌株，以及EstDl在7-ACA脫乙?；械膽?yīng) 用。本發(fā)明從嗜熱脂環(huán)酸芽孢桿菌D-I基因組中克隆SGNH家族酯酶基因 EstDl，與表達載 體pEASY?-E2連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達并對EstDl酶學性質(zhì)及其對 7-ACA脫乙?；M行了初步研宄，本發(fā)明對了解微生物來源的SGNH酯酶家族的特性具有重 要意義。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] -種堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstDl，其氨基酸序列為以下序列之一：
[0008] (1)如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
[0009] (2) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一個或若干個氨基酸 的序列。
[0010] 一種編碼上述堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl，其核苷酸序列為以 下序列之一：
[0011] ⑴如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；
[0012] (2) SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一個或若干個核苷酸 的序列；
[0013] (3)在嚴格條件下，與（1)或（2)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
[0014] (4)由于遺傳密碼子的簡并性區(qū)別于（1)、（2)、（3)的核苷酸序列的核苷酸序列。
[0015] 一種重組載體，其含上述的編碼堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl的 完整編碼閱讀框序列。
[0016] 上述重組載體，載體優(yōu)選pEASY?-E2。
[0017] 一種重組菌株，其含上述的編碼堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl或 上述重組載體。
[0018] 上述重組菌株的受體菌為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌 Escherichia coli BL21(DE3)。受體菌內(nèi)含有上述的重組載體，編碼堿性熱穩(wěn)定SGNH家 族酯酶EstDl的核苷酸序列被可操作地連接于受體細胞中引起堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶 EstDl充分表達的啟動子，從而賦予了受體菌產(chǎn)生堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstDl的能力。
[0019] 一種利用上述重組菌株生產(chǎn)堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstDl的方法：培養(yǎng)發(fā)酵重 組菌株，誘導(dǎo)SGNH家族酯酶EstDl表達，收集菌體，分離純化得到SGNH家族酯酶EstDl。
[0020] 上述堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstDl在7-ACA脫乙?；械膽?yīng)用。具體應(yīng)用時， 按以下方法進行：取100 μ L純化的SGNH家族酯酶EstDl加入到含有濃度為4. 5g/L7-ACA 的l/15mol/L、pH7. 3的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，總反應(yīng)體系為400 yL，25°C反 應(yīng)，對7-ACA進行降解。
[0021] 本發(fā)明的堿性熱穩(wěn)定SGNH家族酯酶EstDl可得自嗜熱脂環(huán)芽孢桿菌 (thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504) 〇 本發(fā)明的 SGNH 家族酯酶EstDl總共含有215個氨基酸，理論分子量為25. 31kDa，理論等電點為6. 68。以 乙酸-4-硝基苯酯（PNPC2)為底物：最適溫度65°C ;最適pH 8. 5 ;終濃度ImM的金屬離子 Hg2+、Mg2+和Cu 2+及化學試劑SDS、TWeen-80、β -巰基乙醇對酶有較強的激活作用，K +、A13+、 Ni2+、EDTA等對酶有抑制作用；在37°C下保溫60min，酶活基本保持穩(wěn)定，在50°C和65°C下 保溫60min后，酶活均保持在50%以上；經(jīng)pH4. 0至pHll. 0的緩沖液在37°C下處理60min 后，均保持50%以上的活性；同時還可以水解α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、丁酸-4-硝基苯 酯。
[0022] 本發(fā)明通過PCR方法克隆了 SGNH家族酯酶EstDl的編碼基因 EstDl，其全長 648bp，起始密碼為 ATG，終止密碼為 TAG。經(jīng)BLAST 在 GeneBank (http: //www. Ncbi. Nlm. Nih. gov)數(shù)據(jù)庫進行比對分析，該SGNH家族酯酶的基因 EstDl編碼的氨基酸序列與GeneBank 中 Alicyclobacillus hesperidum 來源的 GDSL 家族脂酶（WP_006447773)具有 98 % 序 列一致性（2013-5-29);與 Alicyclobacillus acidocaldarius 來源的 GDSL 家族脂酶 (WP_012811841)具有68%的序列一致性（2013-5-26)，但二者至今均未被鑒定。
[0023] 本發(fā)明的SGNH家族醋酶基因來源于嗜熱脂環(huán)芽孢桿菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)，通過在大腸桿菌中進行異源表 達，用IPTG誘導(dǎo)就可以獲得大量可溶性蛋白，經(jīng)Nickel-NTA Agarose純化即可獲得較純蛋 白。雖然與已申請專利的枯草芽孢桿菌SHS0133來源的頭孢菌素乙酰水解酶（光島健二， 龍本明生，八木茲雄，園山高康，1998,由頭孢菌素乙酰水解酶基因編碼的酶的制備方法， CN98103932)相比該酶對7-ACA脫乙酰化的活力較低，應(yīng)用到工業(yè)上還需要進一步的發(fā)酵 工藝上的優(yōu)化，如使用大規(guī)模培養(yǎng)裝置，在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)本發(fā)明中的重組菌株增 加該酶的產(chǎn)量。但培養(yǎng)周期短、易于獲得純蛋白，并具有優(yōu)良的酶學性質(zhì)，而且除頭孢菌素 乙酰水解酶外，用于水解7-ACA的其他酶類鮮被報道，因此本發(fā)明為工業(yè)上生產(chǎn)β -內(nèi)酰胺 類藥物提供了新思路。此外，由于SGNH家族酯酶的成員被定性的很少，所以該家族還沒有 被完全了解，本發(fā)明對了解微生物來源的SGNH酯酶家族的特性具有重要意義。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :在大腸桿菌中表達的重組SGNH家族酯酶EstDl的SDS-PAGE分析，其中，M : 低分子量蛋白質(zhì)Marker ;1 :BL21(DE3)/pEASY?-E2誘導(dǎo)后表達的總蛋白；2 :BL21(DE3)/ EstDl誘導(dǎo)后表達的總蛋白；3 :純化的重組SGNH家族酯酶EstDl。
[0025] 圖2 :重組SGNH家族酯酶EstDl的最適溫度示意圖。
[0026] 圖3 :重組SGNH家族酯酶EstDl的熱穩(wěn)定性示意圖。
[0027] 圖4 :重組SGNH家族酯酶EstDl的最適pH示意圖。
[0028] 圖5