專利名稱：：表達c4植物光合酶的c3植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種C3植物，這種植物包含C4光合作用途徑中所涉及的酶的基因(此后稱為C4光合作用基因)，并以高水平表達C4光合作用基因。基于在二氧化碳的光合固定中的初始固定產(chǎn)物的種類，植物分成C3植物、C4植物和景天酸代謝(CAM)植物。地球上百分之九十或更多的植物屬于C3植物，這包括，例如，農(nóng)業(yè)上重要的植物(如水稻和大麥)。C3植物的光合途徑也稱為加爾文途徑，在這一途徑中二氧化碳的光合固定所涉及的酶是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶。這種酶對二氧化碳具有低的親和性，對氧氣具有高的親和性。因此，光合反應(yīng)以及二氧化碳的光合固定的效率在C3光合途徑中是低的。C4植物是那些進化得克服了二氧化碳低效光合固定的植物。C4植物具有濃縮二氧化碳的機制和高的光合能力，C4植物光合途徑中二氧化碳的光合固定所涉及的酶是烯醇丙酮酸磷酸羧化酶。這種酶具有高的光合固定二氧化碳的能力，其活性不受氧氣抑制。CAM植物具有適合于干燥環(huán)境的光合系統(tǒng)，該光合系統(tǒng)被認為是C3光合系統(tǒng)的一種進化的形式?？梢灶A(yù)期，通過向C3植物提供C4植物的光合功能，農(nóng)業(yè)上重要的C3植物(例如水稻)的光合能力和生產(chǎn)力可以得到極大地提高。已有把C4光合作用基因引入C3植物的一些嘗試。為了表達C4植物的光合作用基因，已使用了連接到其上的葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)啟動子或花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子。例如，Kogami等，轉(zhuǎn)基因研究3237-96(1994)報道將可以在C3植物的葉片組織中高水平表達的(CaMV)35S啟動子連接到C4植物的光合作用基因(烯醇丙酮酸磷酸羧化酶(PEPC)基因)上，以產(chǎn)生重組DNA，然后將重組DNA引入C3植物煙草；然而，在C3植物中的PEPC活性至多僅增加2至3倍。另外，Matsuoka等，植物生理學(xué)，111949-957(1996)報道為了研究C4光合作用基因啟動子的功能，將大腸桿菌的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因和PEPC基因的5’-側(cè)翼區(qū)(啟動子區(qū))的融合基因引入煙草，由此GUS基因以高水平表達。Hudspeth等，植物生理學(xué)，98458-464(1992)也報道將包含表達控制區(qū)(啟動子區(qū))的玉米PEPC基因組基因作為C4光合作用基因引入煙草；然而，PEPC活性僅增加2至3倍。這樣，本發(fā)明的發(fā)明人清楚地了解到，在日本專利申請9-56742(本申請要求了該申請的優(yōu)先權(quán))之前，尚沒有報道指出在光合作用中所涉及的酶以高水平表達。因此，需要在C3植物中以高水平表達C4植物的光合作用基因，從而增強C3植物光合能力的技術(shù)。本發(fā)明旨在克服上述的問題，其目的是在C3植物中以高水平表達C4植物的光合作用基因。如以上所述，已有嘗試將C4植物玉米(早熟禾科(poaceae))光合途徑中所涉及的PEPC基因組基因引入C3植物煙草(茄科)中導(dǎo)致低表達效率的例子。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過將含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上與C3植物相關(guān)的C4植物的光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)系統(tǒng)發(fā)育上與C3植物相關(guān)的C4植物的光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的這樣一種基因引入到C3植物中，C4植物的光合途徑中所涉及的酶的表達效率得到極大的提高，進而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的基因的C3植物包含這樣的DNA，該DNA含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因，其中所說的C3植物以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。一種產(chǎn)生表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物之基因的C3植物的方法包括以下步驟用含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA轉(zhuǎn)化C3植物細胞；使轉(zhuǎn)化的C3植物細胞再生為C3植物；其中所說的再生的C3植物以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。在本發(fā)明的一個實施方案中，所說的C4植物是單子葉植物，并且所說的C3植物是單子葉植物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的C4植物是雙子葉植物，并且所說的C3植物是雙子葉植物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的DNA是C4植物的基因組基因。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的C4植物的基因組基因是C4早熟禾科植物的基因組基因，并且所說的C3植物是C3早熟禾科植物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的C4早熟禾科植物的基因組基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因組基因，其中所說的C3早熟禾科植物是水稻。本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的方法可獲得的C3植物和C3植物部分。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的C3植物部分是蔬菜(vegetable)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的C3植物的部分是果實。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的C3植物的部分是花。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的C3植物的部分是種子。本發(fā)明的表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的基因的C3植物組織包含這樣的DNA，該DNA含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因，其中所說的C3植物組織以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。本發(fā)明的產(chǎn)生表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物之基因的C3植物組織的方法包括以下步驟用含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA轉(zhuǎn)化C3植物的細胞；使轉(zhuǎn)化的C3植物細胞再生為C3植物組織；其中所說的再生的C3植物組織以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。在本發(fā)明的一個實施方案中，所說的C4植物是單子葉植物，并且所說的C3植物組織是單子葉植物組織。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的C4植物是雙子葉植物，并且所說的C3植物組織是雙子葉植物組織。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的DNA是C4植物的基因組基因。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的C4植物的基因組基因是C4早熟禾科植物的基因組基因，并且所說的C3植物組織是C3早熟禾科植物組織。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的C4早熟禾科植物的基因組基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因組基因，其中所說的C3早熟禾科植物是水稻。本發(fā)明的表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的基因的C3植物種子包含這樣的DNA，該DNA含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因，其中所說的C3植物種子至少在發(fā)芽和生長后以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。本發(fā)明的產(chǎn)生表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物之基因的C3植物種子的方法包括以下步驟用含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA轉(zhuǎn)化C3植物的細胞；使轉(zhuǎn)化的C3植物細胞再生為C3植物；并且從所說的C3植物獲得種子；其中所說的再生的C3植物種子至少在發(fā)芽和生長后以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。在本發(fā)明的一個實施方案中，所說的C4植物是單子葉植物，并且所說的C3植物種子是單子葉植物種子。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的C4植物是雙子葉植物，并且所說的C3植物種子是雙子葉植物種子。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的DNA是C4植物的基因組基因。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所說的C4植物的基因組基因是C4早熟禾科植物的基因組基因，并且其中所說的C3植物是C3早熟禾科植物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中所說的C4早熟禾科植物的基因組基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因組基因，其中所說的C3早熟禾科植物是水稻。這樣，本文所描述的本發(fā)明可以給出以下的優(yōu)點(1)提供有效地表達C4光合基因的C3植物及其組織和種子，(2)通過賦予C3植物以C4光合能力進一步提供提高C3植物光合能力的技術(shù)基礎(chǔ)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在參照附圖閱讀和理解以下詳細描述后，本發(fā)明的這些和其它優(yōu)點會很清楚。圖1是顯示包含PEPC基因的DNA片段的限制酶圖，其中線的較寬的部分代表外顯子。圖2是顯示包含PEPC基因的DNA片段的大約8Kb的堿基序列的圖。圖3是圖2的繼續(xù)。圖4是圖3的繼續(xù)。圖5是顯示雙向載體pIG121-Hm的圖。圖6是顯示表達載體PEPCgenome/pBIH2的結(jié)構(gòu)的圖。圖7是顯示轉(zhuǎn)基因水稻植物的PEPC活性的圖。以下參照附圖通過說明性的例子描述本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語″系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的″指具有某些系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性，例如，屬于相同的科、相同的目或相同的綱。本文所使用的術(shù)語″植物″包括(除非以其它方式指明)植物體、植物器官、植物組織、植物細胞和種子。植物細胞的例子包括愈傷組織。植物器官的例子包括根、葉片、花等。術(shù)語″C3植物″指在光合作用的C3途徑中固定二氧化碳的植物，包括單子葉植物(如水稻、小麥和大麥)以及雙子葉植物(如大豆、馬鈴薯和甘薯)。術(shù)語″C4植物″指在光合作用的C4途徑中固定二氧化碳的植物，包括單子葉植物(如玉米，甘蔗和高粱)以及雙子葉植物(如Flaveria和Amaranthus)。術(shù)語″光合作用的C4途徑所涉及的酶″指在C4植物的光合作用中所涉及的酶。非限制性地，該酶包括，例如，碳酸酐酶(CA)、烯醇丙酮酸磷酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、蘋果酸酶、丙氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)。這些酶的基因的表達控制區(qū)和這些酶的結(jié)構(gòu)基因可以用于本發(fā)明中。與酶的表達關(guān)聯(lián)的術(shù)語“以高水平”本文用于指在C3植物綠葉粗提物中的酶的比活性(每單位蛋白量的活性)在將光合作用的C4途徑中所涉及的酶的基因引入到C3植物中后至少是在引入所說的基因前的C3植物中的酶的比活性的7倍，該比活性優(yōu)選地是至少10倍，較優(yōu)選地是至少40倍，更優(yōu)選地是至少75倍，最優(yōu)選地是至少100倍。本文所使用的術(shù)語″表達控制區(qū)″指包含控制結(jié)構(gòu)基因表達的序列的區(qū)域。非限制性地，表達控制區(qū)包括，例如，轉(zhuǎn)錄控制序列、轉(zhuǎn)錄后控制序列和/或轉(zhuǎn)錄終止序列。內(nèi)含子也符合表達控制區(qū)?！遛D(zhuǎn)錄控制序列″的例子包括一些序列，例如啟動子、阻遏物、激活物和增強子?！遛D(zhuǎn)錄后控制序列″包括待轉(zhuǎn)錄后加工(例如添加polyA，產(chǎn)生帽結(jié)構(gòu)，剪接等)的初級轉(zhuǎn)錄物中所涉及的元件?！遛D(zhuǎn)錄終止序列″包括在轉(zhuǎn)錄終止中所涉及的元件，如終止子。這些表達控制區(qū)可以單獨地位于結(jié)構(gòu)基因的上游或下游，取決于其性質(zhì)。術(shù)語″含有在光合作用的C4途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)和在光合作用的C4途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA″指一種包含一種酶的表達控制區(qū)和結(jié)構(gòu)基因的重組DNA序列、一種包含一種酶的表達控制區(qū)和結(jié)構(gòu)基因的基因組基因序列或者包含重組DNA序列或基因組基因序列的表達載體。這種DNA也包括化學(xué)合成的DNA。結(jié)構(gòu)基因包括編碼酶的蛋白質(zhì)部分的DNA(可以包含內(nèi)含子)和來自mRNA的cDNA。表達載體指一種核酸序列，在其中″含有在光合作用的C4途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)和在光合作用的C4途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA″被引入和可操作地連接到宿主細胞中。表達載體可以包含不同于光合作用的C4途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)的表達控制序列(例如，各種調(diào)節(jié)元件，如啟動子、增強子和終止子)。表達控制序列可以用于控制結(jié)構(gòu)基因的表達。在光合作用的C4途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)和在光合作用的C4途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的分離按照本發(fā)明，使用在系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)聯(lián)的C3植物和C4植物。優(yōu)選地，在利用C4單子葉植物的基因的情況下，基因被引入C3單子葉植物中，在利用C4雙子葉植物的基因的情況下，基因被引入C3雙子葉植物中。更優(yōu)選地是，其中所說的C4植物和C3植物屬于相同的科?？梢杂霉姆椒ǚ蛛x參與光合作用的C4途徑的酶的結(jié)構(gòu)基因。分離mRNA(其是酶的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄物)，并且利用分離的mRNA產(chǎn)生cDNA。通過利用cDNA篩選基因組DNA，可以獲得酶的表達控制區(qū)。大約8Kb的包含玉米PEPC基因的基因組基因片段已被分離到(歐洲生物化學(xué)雜志，181593-598，1989)?；蚪M基因片段包括PEPC的結(jié)構(gòu)基因的上游和下游區(qū)和內(nèi)含子(即表達控制區(qū))，以便它可以以其本來的形式使用。在光合作用的C4途徑中所涉及的另一個基因，PPDK基因組基因(玉米)也已被分離(Matsuoka等，生物化學(xué)雜志，26516772-16777(1990))，其可以用于本發(fā)明。PPDK基因組基因的表達控制區(qū)具有與PEPC基因組基因的表達控制區(qū)的相似性，這一表達控制區(qū)可以用于本發(fā)明中。此外，NADP-蘋果酸酶的基因組基因也已被分離(Rothermel等，生物化學(xué)雜志，26419587-9592，1989)，其表達控制區(qū)和這一基因組基因的結(jié)構(gòu)基因可以用于本發(fā)明中。通過利用光合作用的C4途徑中所涉及的任何酶的基因的表達控制區(qū)，可以表達光合作用的C4途徑所涉及的任何酶的結(jié)構(gòu)基因。所說的酶包括碳酸酐酶(CA)、烯醇丙酮酸磷酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、蘋果酸酶、丙氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)等。蘋果酸脫氫酶或丙氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)基因可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法分離，包括以下步驟分離和純化任何這些酶；測定酶的部分氨基酸序列；基于從測定的氨基酸序列推導(dǎo)的核苷酸序列制備探針；利用探針篩選cDNA文庫或基因組文庫。這些酶的表達控制區(qū)也可以用于本發(fā)明。如果所形成的編碼酶的基因組基因包括表達控制區(qū)和結(jié)構(gòu)基因，該基因組基因可以以其本來的形式使用。光合作用的C4途徑所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)可以在與另一個植物基因的表達區(qū)的序列比較中測定?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法產(chǎn)生包含光合作用的C4途徑所涉及的酶的表達控制區(qū)和結(jié)構(gòu)基因的重組基因。重組基因可以具有多個表達控制區(qū)和/或結(jié)構(gòu)基因。所形成的光合作用的C4途徑所涉及的酶的基因組基因或者如上所述所獲得的重組DNA序列，可以以其本來的形式和以在表達載體中的形式用于轉(zhuǎn)化C3植物。兩個或更多個重組DNA序列或基因組基因可被摻人到C3植物中。通過向C3植物引入光合作用的C4途徑中所涉及的兩個或更多個基因，可以預(yù)期光合能力進一步得到改進。表達載體的構(gòu)建本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚可以選擇用于構(gòu)建表達載體的載體，取決于表達的目的和宿主細胞。起始載體優(yōu)選地可以包括啟動子、增強子、T-DNA區(qū)和藥物抗性基因。用于構(gòu)建本發(fā)明的載體的載體不是不必需需要表達C4植物的結(jié)構(gòu)基因的附加啟動子。這是因為系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的表達控制區(qū)(例如啟動子)被認為在C3植物的表達控制系統(tǒng)中起作用。然而，本發(fā)明的表達載體具有表達控制區(qū)是合乎需要的。在這種情況下，啟動子的非限制性例子包括被一定的應(yīng)力誘導(dǎo)表達的啟動子，如煙草的感染特異性蛋白質(zhì)PR1a、CaMV35S啟動子和胭脂氨酸合酶(NOS)的啟動子。增強子可以高水平表達。就增強子而言，包含上述CaMV35S啟動子的上游序列的增強子區(qū)是優(yōu)選的。許多增強子都可以使用。終止子也可以使用。非限制性地，終止子包括例如CaMV35S終止子、胭脂氨酸合酶(TNOS)的終止子、煙草PRla基因的終止子。希望的是使用使得轉(zhuǎn)化植物容易選擇的藥物抗性基因。可以優(yōu)選地使用新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPTII)基因，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因等。非限制性地，表達藥物抗性基因的啟動子的例子包括上述的植物基因啟動子。優(yōu)選地是，可以使用以高水平組成型表達的CaMV35S啟動子。NPTII基因?qū)z測轉(zhuǎn)化子或轉(zhuǎn)化細胞有用。當(dāng)將HPT基因引入植物核基因組時，該基因被表達，植物變成對潮霉素有抗性，因此基因向核基因組的引入得到確認。就用于構(gòu)建本發(fā)明的表達載體的起始載體而言，可以優(yōu)選地使用pBI-型載體、pUC-型載體或pTRA-型載體?？梢愿鼉?yōu)選地使用pBI-型雙向載體，這一載體包含在一個區(qū)域(T-區(qū))中的待引入到植物中的基因和作為標(biāo)記基因的植物啟動子控制下表達的NPTII基因(提供卡那霉素抗性)。pBI-型載體可以經(jīng)農(nóng)桿菌把感興趣基因引入植物。pBI-型載體的例子包括pBI121、pBI101、pBI101.2和pB1101.3。優(yōu)選地，可以使用pBI101和來源于它的載體。pUC-型載體的例子包括pUC18、pUC19和pUC9。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將含有在光合作用的C4途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)和在光合作用的C4途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA連接到載體上。例如，在使用pBI載體的情況下，載體在多克隆位點以任一適當(dāng)?shù)南拗泼赶信d趣DNA在斷裂位點插入到載體中，將形成的載體轉(zhuǎn)化進大腸桿菌菌株中，選擇轉(zhuǎn)化子，然后回收感興趣的表達載體。將重組DNA序列或表達載體引入C3植物細胞非限制性地，被轉(zhuǎn)化的C3植物的例子包括水稻、小麥、大麥、大豆和馬鈴薯。可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備這些植物的植物細胞。重組DNA序列或表達載體經(jīng)由農(nóng)桿菌引入或直接引入到制備的植物細胞中。作為一種方法，首先經(jīng)電穿孔用表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后采用在植物分子生物學(xué)手冊(S.B.Gelvin等，學(xué)術(shù)出版社)中所描述的方法將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌引入植物細胞。作為直接農(nóng)桿菌的方法，例如，可以使用Nagel等的方法(微生物學(xué)通訊，67，325(1990))。就這種方法而言，為了將表達載體引入細胞，可以合適地使用電穿孔方法和基因槍方法。轉(zhuǎn)基因植物細胞再生成植株或植物組織基于藥物抗性(如卡那霉素抗性)選擇其中已引入重組基因或表達載體的C3植物細胞。此后，通過常規(guī)方法將細胞再生為植物組織或者植株，并且可以從植株獲得種子。種子自身可以表達酶。另外，僅在種子發(fā)芽和開始生長之后，它們可以表達光合作用的C4途徑所涉及的酶。為了確認在轉(zhuǎn)基因C3植物中表達光合作用的C4途徑中所涉及的酶，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。例如，可以用引入的C4光合作用基因的部分序列為探針與從植物組織或者植物葉片抽提的DNA的Southern雜交的普通方法證實轉(zhuǎn)化和表達，或者通過抽提蛋白質(zhì)和測定從植物組織或者植物葉片抽提的蛋白質(zhì)的活性，或者對所抽提的蛋白質(zhì)進行電泳和進行凝膠測定由此獲得活性印跡證實轉(zhuǎn)化和表達。二氧化碳補償點測定可以例如按照Hudspeth等，植物生理學(xué)，98458-464(1992)的描述采用紅外氣體分析儀測定轉(zhuǎn)基因植物的光合活性(二氧化碳補償點)。更具體地說，將一片新展平的葉片密封進有機玻璃室，室中的溫度保持在30℃，在照明下光合活性光子通量密度為1000μmol/m2/S時經(jīng)通過室的循環(huán)空氣連續(xù)測定二氧化碳的濃度，當(dāng)室內(nèi)濃度達到平衡時確定補償點。在下文中，本發(fā)明將通過以玉米PEPC基因組基因作為C4植物的光合途徑中所涉及的酶的表達控制區(qū)和結(jié)構(gòu)基因，以水稻作為C3植物為例具體描述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)明確本發(fā)明不限于實施例。用于以下實施例的限制酶、質(zhì)粒等可從TakaraShuzoCo.和ToyoboCo.獲得。實施例1玉米PEPC基因組基因的分離用文獻中所描述的方法(歐洲生物化學(xué)雜志，181593-598，1989)分離玉米PEPC基因組基因。將玉米(ZeamaysL.cv.GoldenCrossBantam)植入到蛭石中。種植的玉米于30℃在黑暗下于培養(yǎng)室中培養(yǎng)4天。依據(jù)Matsuoka等的方法(植物生理學(xué)，85942-946(1985))從黃化葉子分離基因組DNA。將這種基因組DNA用XbaI消化，并經(jīng)10％至40％蔗糖密度梯度離心分級分離。將所獲得的XbaI片段連接到噬菌體λongC(Stratagene，CA)的Xbal臂上，將連接的DNA體外包裝。使用包裝的DNA構(gòu)建基因組文庫。然后，采用Matsuoka等，植物細胞生理學(xué)，30479-486(1989)中描述的序列5’-GTCCACGAGAAGATCCAGGG-3’為探針，經(jīng)噬菌斑雜交篩選噬菌斑。使用這一探針分離的cDNA克隆(pPEP3055)也可以用作探針。分離陽性克隆，用雙脫氧法測定該基因組克隆的核苷酸序列。獲得了大約8Kb的包含全長PEPC結(jié)構(gòu)基因的XbaI-XbaI片段。圖1顯示了包含所獲得的PEPC的DNA片段的限制圖，圖2到圖4顯示了其核苷酸序列。如表1所示，經(jīng)分析，大約8Kb的Xbal-XbaI片段的序列具有表達控制區(qū)。表1元件位置序列TATA盒-24到-28TATITCCAAT盒-367到-371CCAATSp-1結(jié)合位點-80到-85CCGCCC-48到-53CCGCCC275到280(內(nèi)含子1)CCGCCG281到286(內(nèi)含子1)CCGCCC光效應(yīng)元件-653到-661CCTTATCCT直接重復(fù)序列-536到-550CCCTCAACCACATCCTGC-510到-527GACACCCTCG-CCACATCC-453到-470GACGCCCTCT-CCACATCCTGC-378到-395GACGCCCTCT-CCACATCCTGC-201到-214CCCTCT-CCACATCC-30到-39CT-CCCCATCC實施例2；表達載體的構(gòu)建使用pBI101(Jefferson等，EMBOJ.63901-3907(1987))、pIG221(Ohta等，植物細胞生理學(xué)，31805-813(1990))和pLAN101MHYG(由Dr.K.Shimamoto提供)構(gòu)建雙向載體pIG121-Hm(圖5)。這一載體包含由啟動子和終止子控制的NPTII基因、多克隆位點、來源于大腸桿菌的β-GUS基因、35SCaMV啟動子控制下的具有TNOS的HPT基因。首先以HindIII和SstI消化這一載體pIG121-Hm，回收大的片段。將以上獲得的玉米PEPC基因的大約8KbXbaI-XbaI片段連接到消化的載體上，其后引入大腸桿菌JM109?；厥湛敲顾乜剐跃辏拗泼阜治霭l(fā)現(xiàn)獲得了表達載體PEPCgenome/pBIH2，其中以正確的方向引入了玉米PEPC基因(圖6)。實施例3將表達載體PEPCgenome/pBIH2引入水稻中根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化于20℃下在含有50μg/毫升卡那霉素和100μg/毫升潮霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌EHA101(從華盛頓的大學(xué)的Dr.Nester獲得)。制備細胞懸液培養(yǎng)物，經(jīng)電穿孔將表達載體PEPCgenome/pBIH2引入上述細菌中，依據(jù)Nagel等的方法(微生物學(xué)通訊，67，325(1990))選擇潮霉素抗性菌株。水稻的轉(zhuǎn)化和水稻細胞的再生獲得用表達載體PEPCgenome/pBIH2轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，在AB瓊脂培養(yǎng)基(Chilton等，美國科學(xué)院學(xué)報，713672-3676(1974))上形成菌落。用AAM培養(yǎng)基(Hiei等，植物雜志，6271-282(1994))稀釋所形成的菌落。與水稻(Oryzasativa)的愈傷組織一起培養(yǎng)3天。此后，將細菌移到包含50μg/毫升潮霉素的培養(yǎng)基上。每兩周在潮霉素選擇培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)菌落一次。用常規(guī)方法選擇轉(zhuǎn)基因水稻細胞并再生，結(jié)果獲得了38個獨立的轉(zhuǎn)基因水稻個體。實施例4轉(zhuǎn)基因水稻中PEPC基因表達的檢測按照以下所述研究PEPC基因在由此獲得的38個轉(zhuǎn)基因水稻個體、非轉(zhuǎn)基因水稻和玉米中的表達水平。用Edwards等，Aust.植物生理學(xué)雜志，15385-395(1988)中描述的方法測量PEPC活性。依據(jù)Hudspeth等，植物生理學(xué)，98458-464(1992)的描述制備PEPC酶。更具體地說，收獲大約0.5g綠色葉片，用液氮迅速冷凍，磨成細粉。將10倍體積的抽提緩沖液添加到粉中，進一步研磨所說的粉。抽提緩沖液包含50mMHepes-KOH(pH8.0)、10mMMgCl2、1mMEDTA、10mMDTT、10％(W/V)不溶性PVP、12.5％(V/V)甘油、10mM亮抑酶肽、1mMPMSF。粗提物以Miracloth(CalbiochemLaJolla，CA)過濾，濾液在4℃和15,000rpm下離心5分鐘，用已由無PVP抽提緩沖液預(yù)平衡的SephadexG-25使上清液脫鹽。收集洗脫液，測量酶活性和蛋白質(zhì)量。圖7顯示了結(jié)果。在圖7中，WT代表野生型(即非轉(zhuǎn)基因水稻)，Com代表玉米。PEPC活性用比活性表示(非轉(zhuǎn)基因水稻綠色葉片抽提物中的PEPC比活性為1)。玉米顯示出為非轉(zhuǎn)基因水稻約40倍高的PEPC活性。38個轉(zhuǎn)基因水稻植物中的4個顯示出比玉米更高的PEPC活性。經(jīng)轉(zhuǎn)化可以獲得具有為非轉(zhuǎn)基因水稻115倍高的PEPC活性的轉(zhuǎn)基因水稻植物(轉(zhuǎn)基因水稻具有為玉米3倍高的PEPC活性)。令人驚奇的是，具有引入其中的C4植物基因組基因的C3早熟禾科植物顯示出高于C4植物的PEPC活性。實施例5二氧化碳補償點測定采用非轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因水稻(在實施例4中獲得的具有為非轉(zhuǎn)基因水稻約75倍和約7倍高PEPC活性的轉(zhuǎn)基因水稻)測定光合二氧化碳補償點。表2顯示了結(jié)果。表2水稻種類二氧化碳補償點(ppm)具有為非轉(zhuǎn)基因水稻約75倍高的PEPC活性的轉(zhuǎn)基因水稻48.8具有為非轉(zhuǎn)基因水稻約7倍高的PEPC活性的轉(zhuǎn)基因水稻53.5非轉(zhuǎn)基因水稻53.7具有為非轉(zhuǎn)基因水稻約75倍高的PEPC活性的轉(zhuǎn)基因水稻其二氧化碳補償點降低約10％，預(yù)期會進一步改善光合能力。在不背離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚各種其它變化，并且易于進行這些變化。因此，意欲用所附的權(quán)利要求來限定本文所描述的范圍，但是權(quán)利要求應(yīng)予以寬范圍的解釋。權(quán)利要求1.一種表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的基因的C3植物，該植物包含這樣的DNA，該DNA含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物的光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因，其中所說的C3植物以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。2.按照權(quán)利要求1的C3植物，其中所說的C4植物是單子葉植物，并且所說的C3植物是單子葉植物。3.按照權(quán)利要求1的C3植物，其中所說的C4植物是雙子葉植物，并且所說的C3植物是雙子葉植物。4.按照權(quán)利要求1的C3植物，其中所說的DNA是C4植物的基因組基因。5.按照權(quán)利要求4的C3植物，其中所說的C4植物的基因組基因是C4早熟禾科植物的基因組基因，并且其中所說的C3植物是C3早熟禾科植物。6.按照權(quán)利要求5的C3植物，其中所說的C4早熟禾科植物的基因組基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因組基因，其中所說的C3早熟禾科植物是水稻。7.一種產(chǎn)生表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的基因的C3植物的方法，該方法包括以下步驟用含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物的光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA轉(zhuǎn)化C3植物的細胞；和使轉(zhuǎn)化的C3植物細胞再生為C3植物；其中所說的再生的C3植物以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。8.按照權(quán)利要求7的產(chǎn)生C3植物的方法，其中所說的C4植物是單子葉植物，并且其中所說的C3植物是單子葉植物。9.按照權(quán)利要求7的產(chǎn)生C3植物的方法，其中所說的C4植物是雙子葉植物，其中所說的C3植物是雙子葉植物。10.按照權(quán)利要求7的產(chǎn)生C3植物的方法，其中所說的DNA是C4植物的基因組基因。11.按照權(quán)利要求10的產(chǎn)生C3植物的方法，其中所說的C4植物的基因組基因是C4早熟禾科植物的基因組基因，并且其中所說的C3植物是C3早熟禾科植物。12.按照權(quán)利要求11的產(chǎn)生C3植物的方法，其中所說的C4早熟禾科植物的基因組基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因組基因，其中所說的C3早熟禾科植物是水稻。13.用權(quán)利要求7的方法獲得的C3植物。14.權(quán)利要求13的植物的一部分，其中所說的植物部分是蔬菜。15.權(quán)利要求13的植物的一部分，其中所說的植物部分是果實。16.權(quán)利要求13的植物的一部分，其中所說的植物部分是花。17.權(quán)利要求13的植物的一部分，其中所說的植物部分是種子。18.一種表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的基因的C3植物組織，該組織包含這樣的DNA，該DNA含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物的光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因，其中所說的C3植物組織以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。19.按照權(quán)利要求18的C3植物組織，其中所說的C4植物是單子葉植物，并且所說的C3植物組織是單子葉植物組織。20.按照權(quán)利要求18的C3植物組織，其中所說的C4植物是雙子葉植物，并且所說的C3植物組織是雙子葉植物組織。21.按照權(quán)利要求18的C3植物組織，其中所說的DNA是C4植物的基因組基因。22.按照權(quán)利要求21的C3植物組織，其中所說的C4植物的基因組基因是C4早熟禾科植物的基因組基因，并且所說的C3植物組織是C3早熟禾科植物組織。23.按照權(quán)利要求22的C3植物組織，其中所說的C4早熟禾科植物的基因組基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因組基因，并且所說的C3早熟禾科植物是水稻。24.一種產(chǎn)生表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物之基因的C3植物組織的方法，該方法包括以下步驟用含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物的光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA轉(zhuǎn)化C3植物的細胞；和使轉(zhuǎn)化的C3植物細胞再生為C3植物組織；其中所說的再生的C3植物組織以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。25.按照權(quán)利要求24的產(chǎn)生C3植物組織的方法，其中所說的C4植物是單子葉植物，并且所說的C3植物組織是單子葉植物組織。26.按照權(quán)利要求24的產(chǎn)生C3植物組織的方法，其中所說的C4植物是雙子葉植物，并且所說的C3植物組織是雙子葉植物組織。27.按照權(quán)利要求24的產(chǎn)生C3植物組織的方法，其中所說的DNA是C4植物的基因組基因。28.按照權(quán)利要求27的產(chǎn)生C3植物組織的方法，其中所說的C4植物的基因組基因是C4早熟禾科植物的基因組基因，并且所說的C3植物組織是C3早熟禾科植物組織。29.按照權(quán)利要求28的產(chǎn)生C3植物組織的方法，其中所說的C4早熟禾科植物的基因組基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因組基因，并且所說的C3早熟禾科植物是水稻。30.一種表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的基因的C3植物種子，該種子包含這樣的DNA，該DNA含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物的光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因，其中所說的C3植物種子至少在發(fā)芽和生長后以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。31.按照權(quán)利要求30的C3植物種子，其中所說的C4植物是單子葉植物，并且所說的C3植物種子是單子葉植物種子。32.按照權(quán)利要求30的C3植物種子，其中所說的C4植物是雙子葉植物，并且所說的C3植物種子是雙子葉植物種子。33.按照權(quán)利要求30的C3植物種子，其中所說的含有系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)和C4植物的光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA是C4植物的基因組基因。34.按照權(quán)利要求33的C3植物種子，其中所說的C4植物的基因組基因是C4早熟禾科植物的基因組基因，并且所說的C3植物種子是C3早熟禾科植物種子。35.按照權(quán)利要求34的C3植物種子，其中所說的C4早熟禾科植物的基因組基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因組基因，并且所說的C3早熟禾科植物是水稻。36.一種產(chǎn)生表達系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物之基因的C3植物種子的方法，該方法包括以下步驟用含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū)，和(b)C4植物的光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA轉(zhuǎn)化C3植物的細胞；使轉(zhuǎn)化的C3植物細胞再生為C3植物；和從所說的C3植物獲得種子；其中所說的再生的C3植物種子至少在發(fā)芽和生長后以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。37.按照權(quán)利要求36的產(chǎn)生C3植物種子的方法，其中所說的C4植物是單子葉植物，并且所說的C3植物種子是單子葉植物種子。38.按照權(quán)利要求36的產(chǎn)生C3植物種子的方法，其中所說的C4植物是雙子葉植物，并且所說的C3植物種子是雙子葉植物種子。39.按照權(quán)利要求36的產(chǎn)生C3植物種子的方法，其中所說的DNA是C4植物的基因組基因。40.按照權(quán)利要求39的產(chǎn)生C3植物種子的方法，其中所說的C4植物的基因組基因是C4早熟禾科植物的基因組基因，并且所說的C3植物種子是C3早熟禾科植物種子。41.按照權(quán)利要求40的產(chǎn)生C3植物種子的方法，其中所說的C4植物的基因組基因是玉米烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基因組基因，其中所說的C3早熟禾科植物是水稻。全文摘要本發(fā)明提供了一種具有C4光合作用途徑中所涉及的酶的基因并且以高水平表達C4光合作用基因的C3植物。更具體地說,所說的C3植物包含這樣的DNA,該DNA含有(a)系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的C4植物的光合途徑中所涉及的酶的基因的表達控制區(qū),和(b)C4植物的光合途徑中所涉及的酶的結(jié)構(gòu)基因。所說的C3植物以高水平表達由所說結(jié)構(gòu)基因編碼的酶。文檔編號C12N15/09GK1193047SQ9810088公開日1998年9月16日申請日期1998年3月4日優(yōu)先權(quán)日1997年3月11日發(fā)明者松岡信,德富光惠,土岐精一,莫里斯·新-本·顧申請人:農(nóng)林水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)生物資源研究所長