專利名稱：用轉基因技術提高植物耐鹽性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用轉基因技術提高植物耐鹽性的方法。
鹽堿及干旱是影響植物生長和農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素。它們都能引起生物體內(nèi)滲透壓的變化。為了生存，許多生物體通常會積累一些滲透調節(jié)劑以適應外部環(huán)境的滲透脅迫。植物細胞中的果聚糖就是其中一種天然的滲透調節(jié)物，它在液泡中的大量積累對代謝無不利影響，而且有證據(jù)表明被子植物演化過程中果聚糖積累與植物耐旱(寒)能力相關。在滲透脅迫(包括溫度與鹽漬)下植物體內(nèi)果聚糖含量會有增加，因而將果聚糖合成酶基因轉入植物并積累其表達產(chǎn)物可能會提高植物耐旱耐鹽的能力。
在植物中果聚糖的生物合成可能至少需2種酶，蔗糖-蔗糖果糖基轉移酶和果聚糖-果聚糖果糖基轉移酶，而迄今仍未能從植物中克隆出相關酶的基因。在微生物，特別是在枯草桿菌中果聚糖的生物合成由一種酶所催化。因此將枯草桿菌果聚糖合成酶基因轉移至植物中，使其在該植物中表達，從而提高植物的耐旱耐鹽的能力將是一個很好的途徑。在這方面雖然已有人作過嘗試(Van der Meer IM,Ebskamp MJM,Visser RGF,et al.,The Plant Cell,1994,6:561-570.)，但其未能構建出沒有突變的嵌合基因，并且至今仍未有試驗成功的報道。
本發(fā)明的目的是提供一種利用轉基因技術提高植物耐旱耐鹽能力的方法。
本發(fā)明人根據(jù)枯草桿菌的果聚糖合成酶基因的序列資料(SteinmetzM,Le Coq D,Aymerich S,et al.,Mol Gen Genet,1985,200:220-228)，設計出特異引物，采用PCR方法克隆了該酶即蔗糖-6-果糖基轉移酶基因SacB。由于植物細胞內(nèi)果聚糖的合成及積累部位均為液泡，本發(fā)明人在SacB基因5’端連接來自酵母的羧肽酶A的液泡引導肽(cpy)序列，它可以將蔗糖-6-果糖基轉移酶基因SacB定向引導到液泡中并合成果聚糖。
因而本發(fā)明提供了一種提高植物耐旱耐鹽能力的方法，包括1、分別從枯草桿菌和酵母的DNA中克隆蔗糖-6-果糖基轉移酶基因SacB和羧肽酶A的液泡引導肽(cpy)序列；2、用上述1中得到的兩種基因構建嵌合基因；3、用2中的嵌合基因構建植物表達載體；4、用得到的植物表達載體轉化植株，篩選出抗性苗。
其中，所述的枯草桿菌可以是Bacillus subtilis 168，所述的酵母可以是啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae X8。
從枯草桿菌和酵母的DNA中對蔗糖-6-果糖基轉移酶基因Sac8和羧肽酶A的液泡引導肽(cpy)序列的克隆是首先用已知方法提取其DNA，然后用PCR方法擴增而進行的，擴增枯草桿菌蔗糖-6-果糖基轉移酶基因(SacB)的引物為5’端引物gatctagAAAGAAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG3’端引物cagtcgaccTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC擴增酵母菌羧肽酶A液泡引導肽序列(cpy)引物為5’端引物taggatccgaccATGAAAGCATTCACCAGTTTAC3’端引物ctgaatattGACACGAAGCTGATAGTTTTCPCR反應的其它步驟，以及嵌合基因的構建，植物表達載體的構建，植株的轉化，抗性苗的篩選均是按已知方法進行的。
用上述方法獲得了耐旱耐鹽性植株，并且對轉基因植株的PCR及Northern分析表明，外源基因已整合進耐鹽轉基因植株中。
附圖簡要說明

圖1表示SacB和cpy基因片段PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析(A為cpy，B為λDNA EcoRⅠ和HindⅢ酶切分子量標準，C為SacB)；圖2表示嵌合基因的構建；圖3表示亞克隆的構建策略；圖4表示嵌合基因的核甘酸序列(箭頭示SacB和cpy基因連接點)；圖5表示嵌合基因的植物表達載體結構；圖6表示煙草Kn抗性芽與對照在含鹽培養(yǎng)基上的生長比較；圖7表示轉基因煙草植株的PCR檢測；圖8表示轉基因煙草植株的Northern檢測。
實施例實施例一蔗糖-6-果糖基轉移酶基因和羧肽酶A液泡引導肽基因的克隆及序列分析1、枯草桿菌和酵母的DNA的制備枯草桿菌(Bacillus subtilis168)的DNA和啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae X8)的DNA均按Ausubel等方法提取(Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,et al.,Current Protocols in Molecular Biology.New York,1987,John Wiley and Sons.)。2、引物設計及基因擴增根據(jù)枯草桿菌蔗糖-6-果糖基轉移酶基因(SacB)的序列資料(Steinmetz M,Le Coq D,Aymerich S,et al.,Mol Gen Genet,1985,200:220-228)，設計了一對引物5’端引物gatctagAAAGAAACGAACCAAAAGGCCATATAAGXbaⅠ3’端引物cagtcgaccTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC
Sall根據(jù)酵母菌羧肽酶A液泡引導肽序列(cpy)(Valls LA,Hunter CP,RothmanJH,et al.,Cell,1987,48:887-897.)，設計了另一對引物5’端引物taggatccgaccATGAAAGCATTCACCAGTTTACBamHⅠ3’端引物ctgaatattGACACGAAGCTGATAGTTTTCSspⅠ擴增反應在50μl體系中進行，含約50ng模板，5μl 10×PCR緩沖液，4μldNTP(2.5mM),5’端和3’端引物各2 μl(10μm),0.4μl Taq酶(5U/μ1)及超純H2O。擴增條件為94℃,1min；56℃,1min；72℃,2min；共30個循環(huán)，最后在72℃延伸10mir。
產(chǎn)物經(jīng)1.2％的瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1),SacB和cpy片段大小分別與預期的1.3kb和0.3kb相似。
3、嵌合基因的構建及全序列分析嵌合基因的克隆過程見圖2。SacB基因擴增產(chǎn)物用XbaⅠ和SalⅠ雙酶切后，定向克隆于PUC19的XbaⅠ和SalⅠ位點，獲得重組質粒pUB。然后用XbaⅠ酶切pUB質粒，再在溫和的條件下用S1酶處理，除去XbaⅠ酶切殘存的多余單鏈堿基(4個堿基)，回收片段后再用Smal酶切，除去原載體中的BamHl位點，最后與經(jīng)補平及Sspl酶切的cpy基因片段連接(參見圖2)，轉化大腸桿菌后，采用PCR篩選含嵌合基因(cpy+SacB)的重組質粒pUYB。所用引物對為cpy基因片段的5’端引物及SacB基因的3’端引物，得到了3個含嵌合基因的重組克隆，其中1個克隆經(jīng)正向測序證實重組質粒(pBYU)內(nèi)cpy基因片段與SacB基因連接無誤。
分別采用BamHⅠ-EcoRⅠ、EcoRⅠ-KpnⅠ、KpnⅠ-SalⅠ共3組酶酶切pUYB，獲得了3個亞克隆PSBE,PSEK及PSKS(見圖3)，提取質粒后分別測序，結果表明嵌合基因開放閱讀區(qū)全長1664bp，編碼558個氨基酸(圖4)，而且由于引物設計及嵌合基因構建過程精密，SacB基因和cpy的連接準確符合原序列。實施例二SacB基因在模式植物煙草中的轉化及耐鹽性檢測1、植物表達載體構建和農(nóng)桿菌的轉化用BamHⅠ和SalⅠ酶解重組質粒(pUYB)，嵌合基因經(jīng)Geneclean回收后克隆至相同酶切的雙元載體pBin438中得到植物表達載體pBYB，其結構見圖5，并按(Horsch方法Horsch RB,Fry JE,Hoffman NL.,Science 1985,227:1229-1232.)轉化農(nóng)桿菌。2、煙草轉化及耐鹽性鑒定煙草(Nicotiana tabaccum)品系為K326，按常規(guī)程序培養(yǎng)無菌苗。農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)介導的葉園盤法轉化按Horsch等(Horsch方法Horsch RB,Fry JE,Hoffman NL.,Science 1985,227:1229-1232.)，在含卡那霉素200μg/ml的分化培養(yǎng)基(MS)上篩選抗性芽，經(jīng)3輪篩選后，自300個轉化子中共獲得61個綠色抗性芽(芽長2-3cm)，將其轉移至含1％NaCl的MS生根培養(yǎng)基，經(jīng)過20天后有17株不僅正常生根且長勢良好，而對照(未經(jīng)卡那霉素篩選，直接轉至含鹽培養(yǎng)基中)僅有個別能生根，且根長及根數(shù)均大大低于轉基因植株(見圖6)。
轉基因煙草小苗移入盛蛭石的花盆看護培養(yǎng)(Hoagland營養(yǎng)液)5天后，用含1％NaCl的Hoagland營養(yǎng)液處理17天，其生長狀況明顯好于未轉化的煙草再生苗，且無明顯受害跡象，而未轉化對照的下部葉出現(xiàn)嚴重萎蔫。3、轉基因植株的PCR及Northern分析轉基因植株葉片DNA的微量提取及PCR操作，根據(jù)Edwards等(Edwards K,Johnstone C,Thomson C Acids Res 1991,19:1349.),PCR檢測用cpy的5’端引物和SacB的3’端引物進行。提取轉基因煙草(5株)及對照(2株)葉片的DNA進行擴增，轉基因植株均給出了與含嵌合基因的質粒擴增片段相同分子量(1.7kb)的條帶，而對照植株未擴增出相應條帶，說明外源基因已整合至耐鹽轉基因植株中(圖7)。
RNA的提取及Northern操作同張勁松等(張勁松、周駿馬、張弛等，中國科學B輯，1995,25:1172-1177)。Northern結果表明所有能經(jīng)受鹽脅迫選擇的轉基因植物的外源基因均有不同程度的轉錄(圖8)。
權利要求
1.一種提高植物耐旱耐鹽能力的方法，包括a、分別從枯草桿菌和酵母的DNA中克隆蔗糖-6-果糖基轉移酶基因SacB和羧肽酶A的液泡引導肽(cpy)序列；b、用上述a中得到的兩種基因構建嵌合基因；c、用b中的嵌合基因構建植物表達載體；d、用得到的植物表達載體轉化植株，篩選出抗性苗。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的枯草桿菌是Bacillussubtilis 168，所述的酵母是啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae X8。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，從枯草桿菌和酵母的DNA中對蔗糖-6-果糖基轉移酶基因SacB和羧肽酶A的液泡引導肽(cpy)序列的克隆是首先提取其DNA，然后用PCR方法擴增而進行的，擴增枯草桿菌蔗糖-6-果糖基轉移酶基因(SacB)的引物為5’端引物gatctagAAAGAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG3’端引物cagtcgaccTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC擴增酵母菌羧肽酶A液泡引導肽序列(cpy)引物為5’端引物taggatccgaccATGAAAGCATTCACCAGTTTAC3’端引物ctgaatattGACACGAAGCTGATAGTTTTC
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，用本發(fā)明的嵌合基因構建的植物表達載體為pBYB。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植株是煙草植株。
6.一種權利要求1中所述的具有如下序列的嵌合基因或其密碼簡并體ATGAA AGCAT TCACC AGTTT ACTAT GTGGA CTAGG CCTGT CCACT ACACT CGCTA AGGCC 60ATCTC ATTGC AAAGA CCGTT GGGTC TAGAT AAGGA CGTTT TGCTG CAAGC TGCGG AAAAA120TTTGG TTTGG ACCTC GACCT GGATC ATCTC TTGAA GGAGT TGGAC TCCAA TGTAT TGGAC180GGCCC AAATA GAGCA TTTGT ACCCA AACCA GGTTA TGAGC CTTGA TGAGC AACTT CCACT240↓AAGCC AAAAT TCCCT GAAGC AATCA AAACG AAGAA AGACT GGGAC TTTGT GGTCA AGAAT300GACGC AAGTG AAAAC TATCA GCTTC GTGTC AATAA AGAAA CGAAC CAAAA GCCAT ATAAG360GAAAC ATACG GCATT TCCCA TATTA CACGC CATGA TATGC TGCAA ATCCC TGAAC AGCAA420AAAAA TGAAA AATAT CAAGT TCCTG AATTC GATTC GTCCA CAATT AAAAA TATCT CTTCT480GCAAA AGGCC TGGAC GTTTG GGACA GCTGG CCATT ACAAA ACGCT GACGG CACTG TCGCA540AACTA TCACG GCTAC CACAT CGTCT TTGCA TTAGC CGGAG ATCCT AAAAA TGCGG ATGAC600ACATC GATTT ACATG TTCTA TCAAA AAGTC GGCGA AACTT CTATT GACAG CTGGA AAAAC660GCTGG CCGCG TCTTT AAAGA CAGCG ACAAA TTCGA TGCAA ATGAT TCTAT CCTAA AAGAC720CAAAC ACAAG AATGG TCAGG TTCAG CCACA TTTAC ATCTG ACGGA AAAAT CCGTT TATTC780TACAC TGATT TCTCC GGTAA ACATT ACGGC AAACA AACAC TGACA ACTGC ACAAG TTAAC840GTATC AGCAT CAGAC AGCTC TTTGA ACATC AACGG TGTAG AGGAT TATAA ATCAA TCTTT900GACGG TGACG GAAAA ACGTT ACAAA ATGTA CAGCA GTTCA TCGAT GAAGG CAACT ACAGC960TCAGG CGACA ACCAT ACGCT GAGAG ATCCT CACTA CGTAG AAGAT AAAGG CCACA AATAC1020TTAGT ATTTG AAGCA AACAC TGGAA CTGAA GATGG CTACC AAGGC GAAGA ATCTT TATTT1080AACAA AGCAT ACTAT GGCAA AAGCA CATCA TTCTT CCGTC AAGAA AGTCA AAAAC TTCTG1140CAAAG CGATA AAAAA CGCAC GGCTG AGTTA GCAAA CGGCG CTCTC GGTAT GATTG AGCTA1200AACGA TGATT ACACA CTGAA AAAAG TGATG AAACC GCTGA TTGCA TCTAA CACAG TAACA1260GATGA AATTG AACGC GCGAA CGTCT TTAAA ATGAA CGGCA AATGG TACCT GTTCA CTGAC1320TCCCG CGGAT CAAAA ATGAC GATTG ACGGC ATTAC GTCTA ACGAT ATTTA CATGC TTGGT1380TATGT TTCTA ATTCT TTAAC TGGCC CATAC AAGCC GCTGA ACAAA ACTGG CCTTG TGTTA1440AAAAT GGATC TTGAT CCTAA CGATG TAACC TTTAC TTACT CACAC TTCGC TGTAC CTCAA1500GCGAA AGGAA ACAAT GTCGT GATTA CAAGC TATAT GACAA ACAGA GGATT CTACG CAGAC1560AAACA ATCAA CGTTT GCGCC AAGCT TCCTG CTGAA CATCA AAGGC AAGAA AACAT CTGTT1620GTCAA AGACA GCATC CTTGA ACAAG GACAA TTAAC AGTTA ACAAA TAG 1668
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用轉基因技術提高植物耐鹽性的方法,包括從枯草桿菌和酵母的DNA中克隆蔗糖－6－果糖基轉移酶基因SacB和羧肽酶A的液泡引導肽(cpy)序列,用得到的兩種基因構建嵌合基因,用該嵌合基因構建植物表達載體,然后用得到的植物表達載體轉化植株,篩選出抗性苗。用該方法獲得了耐旱耐鹽性植株,并且對轉基因植株的PCR及Northern分析表明,外源基因已整合進耐鹽轉基因植株中。
文檔編號C12N15/57GK1231337SQ9810133
公開日1999年10月13日 申請日期1998年4月8日 優(yōu)先權日1998年4月8日
發(fā)明者陳受宜, 張慧, 董偉, 杜保興, 谷冬梅 申請人:中國科學院遺傳研究所