專利名稱：氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)方法及培養(yǎng)反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)的方法，特別是涉及一種適于大規(guī)模生產(chǎn)用的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞、組織和器官的培養(yǎng)方法及其反應(yīng)器。
植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器已研究較多，主要分為機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器、非機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器、鼓泡塔及氣升式生物反應(yīng)器，填充床生物反應(yīng)器，流化床生物反應(yīng)器，膜生物反應(yīng)器等(陳英良等“細(xì)胞培養(yǎng)工程”，華東化工學(xué)院出版社，1992年，上海P285-294)。由于植物細(xì)胞、組織和器官有很多不同于動(dòng)物細(xì)胞及微生物的特點(diǎn)，如需氧量較少，細(xì)胞對(duì)剪切力耐受性差，細(xì)胞體積大等，所以對(duì)植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器提出了不同的要求。其中機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的高剪切特性容易對(duì)細(xì)胞造成損害，必須對(duì)攪拌器加以改進(jìn)，減小攪拌過程中的剪切力，才能用于植物細(xì)胞和組織等培養(yǎng)(邢建民等，生物工程進(jìn)展，1997，17(5)，P49-53)。流體剪切力對(duì)植物細(xì)胞有兩方面的作用。其一是增加通氣，保持良好的混合狀態(tài)及細(xì)胞分散性等，其二是在大多數(shù)情況下則對(duì)細(xì)胞有機(jī)械損傷，改變細(xì)胞形態(tài)，影響胞內(nèi)化合物釋放，改變代謝，影響產(chǎn)率，使細(xì)胞喪失活性等，因此研究開發(fā)新型的適用于各類植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器已成為各國(guó)生化工程學(xué)家努力的方向(曹孟德等，生物工程進(jìn)展，1996，16(4)，P51-53)。流體剪切力對(duì)植物細(xì)胞有兩方面的作用。其一是增加通氣，保持良好的混合狀態(tài)及細(xì)胞分散性等，其二是在大多數(shù)情況下則對(duì)細(xì)胞有機(jī)械損傷，改變細(xì)胞形態(tài)，影響胞內(nèi)化合物釋放，改變代謝，影響產(chǎn)率，使細(xì)胞喪失活性等，因此研究開發(fā)新型的適用于各類植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器已成為各國(guó)生化工程學(xué)家努力的方向(曹孟德等，生物工程進(jìn)展，1996，16(4)，P51-53)。至于植物器官、組織比植物細(xì)胞大幾十倍甚至上百倍。這些器官和組織主要包括叢生芽、毛狀根(發(fā)根)、體細(xì)胞胚、幼苗等。由于這些組織、器官的特殊形態(tài)，在培養(yǎng)過程中流動(dòng)性差，易堆積，對(duì)剪切力更敏感，長(zhǎng)期浸沒更易產(chǎn)生玻璃化和變異，因此，相對(duì)于植物細(xì)胞，在反應(yīng)器內(nèi)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)就更為復(fù)雜、困難。從七十年代后期開始植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)較多地采用了氣升式生物反應(yīng)器。如文獻(xiàn)M．A．Rodrigueg-Mendiola等(“Bioreactors for growth of plant roots”M．A．Rodrigueg-Mendiola et al．Enzyme Microb．Technol．1991，Vol．13 sep．697-702)所介紹的9立升植物發(fā)根培養(yǎng)反應(yīng)器，其結(jié)構(gòu)見

圖1。反應(yīng)器主體1由帶有擴(kuò)大段的耐熱玻璃制成。主體內(nèi)由玻璃支撐管15固定一尼龍網(wǎng)卷成的中心管28。在反應(yīng)器內(nèi)位于中心管下方，設(shè)置一燒結(jié)板氣體分布器6，所需空氣經(jīng)進(jìn)氣管30進(jìn)入中心管，由于中心管內(nèi)外的液體表觀密度差使?fàn)I養(yǎng)液實(shí)現(xiàn)循環(huán)流動(dòng)。反應(yīng)器頂部設(shè)置一接種口25，發(fā)根種子由此接入反應(yīng)器內(nèi)。反應(yīng)器內(nèi)的氣體經(jīng)冷凝器21后排出。反應(yīng)器內(nèi)溫度由加熱器19控制。在培養(yǎng)過程中，發(fā)根種子掛在中心網(wǎng)上生長(zhǎng)，此反應(yīng)器特點(diǎn)解決了接種及掛在中心管上固定分布和生長(zhǎng)，部分解決了發(fā)根堆積問題，營(yíng)養(yǎng)液可以循環(huán)及有一定程度的混合。但由于無隔層空間大，所以并未根本解決接種的均勻性，發(fā)根生長(zhǎng)過程的均勻分布，甚至在底部特別是在中心管網(wǎng)下口周圍仍會(huì)形成局部發(fā)根的堆積，以至在發(fā)根生長(zhǎng)期間影響營(yíng)養(yǎng)液的循環(huán)流動(dòng)，從而影響混合特性和傳質(zhì)、傳熱過程，而且此類反應(yīng)器屬于全浸沒式反應(yīng)器，植物組織器官長(zhǎng)期浸沒其中會(huì)產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象和變異，由于反應(yīng)器內(nèi)未設(shè)置內(nèi)部光源，對(duì)喜光照的發(fā)根培養(yǎng)，反應(yīng)器直徑的放大必然受到限制。因此，此類反應(yīng)器難以放大以適應(yīng)植物發(fā)根的大規(guī)模培養(yǎng)。
又如Chun-zhao Liu，Yuchun Wang等(“Production of arthmisininby shoot cultures of Arthmisia annua L in a modified inner-loop mistbioreactor”，Plant science，已接收并正在出版，1988)研究開發(fā)出2．5立升改造的內(nèi)環(huán)流超聲波霧化反應(yīng)器。其主要結(jié)構(gòu)如圖2所示。此反應(yīng)器主體1由耐液熱玻璃制成，內(nèi)置一帶有孔20的中心管18，圍繞中心管有三層不銹鋼隔網(wǎng)26，在反應(yīng)器底部安裝一霧化頭17，并與霧化器16連接，除菌空氣由進(jìn)氣管30進(jìn)入反應(yīng)器底部營(yíng)養(yǎng)液中。反應(yīng)器內(nèi)氣體由排氣口27排放，此反應(yīng)器無接種裝置，需將反應(yīng)器放在超凈臺(tái)上開蓋接種，使發(fā)根均勻接至各層隔網(wǎng)上，啟動(dòng)霧化器，霧化頭產(chǎn)生超聲波使液面位于中心管下方的營(yíng)養(yǎng)液霧化，營(yíng)養(yǎng)霧由中心管上升，經(jīng)中心管孔及頂部出口進(jìn)入各隔層，并沿反應(yīng)器壁與中心管之間的環(huán)間下降而充滿整個(gè)反應(yīng)器，提供給發(fā)根、芽生長(zhǎng)所需養(yǎng)分。霧化間歇進(jìn)行，兩次霧化之間通入無菌空氣，以滿足發(fā)根及芽對(duì)氧的需要。此反應(yīng)器解決了發(fā)根以及叢生芽在反應(yīng)器內(nèi)均勻分布和生長(zhǎng)，利用超聲霧化原理產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)霧可迅速擴(kuò)散并分布均勻，間歇霧化和供氣使反應(yīng)器內(nèi)供養(yǎng)充足，并避免了浸沒反應(yīng)器中由于植物器官組織長(zhǎng)期被液體浸泡所帶來的玻璃化和畸形化現(xiàn)象。但霧化反應(yīng)器仍未解決接種裝置，使得接種不易操作，易染菌。由于無內(nèi)部光源，光分布及光強(qiáng)受到影響。由于霧滴細(xì)小并間歇產(chǎn)霧，器官表面營(yíng)養(yǎng)液膜更新差，使得新的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足。同時(shí)氣體夾帶營(yíng)養(yǎng)液霧滴易從排氣口排出，造成營(yíng)養(yǎng)液的流失。又由于產(chǎn)霧高度受到限制，使得霧化反應(yīng)器不易放大以進(jìn)行植物組織器官的大規(guī)模培養(yǎng)。
上述目前現(xiàn)有的氣升式反應(yīng)器和霧化反應(yīng)器與其它類型的反應(yīng)器相比，雖然更適合于植物細(xì)胞、組織器官的培養(yǎng)，但仍存在許多影響大規(guī)模培養(yǎng)和提高有用次生代謝產(chǎn)物的問題和缺欠。而且現(xiàn)有生物反應(yīng)器在用于植物細(xì)胞、組織器官培養(yǎng)時(shí)專一性較強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到限制。因此，在具體應(yīng)用時(shí)，必須針對(duì)植物細(xì)胞、組織器官生長(zhǎng)代謝特性對(duì)其加以改進(jìn)，才能更好地適應(yīng)大規(guī)模培養(yǎng)的要求。
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，為實(shí)現(xiàn)植物組織、器官的均勻接種，塵長(zhǎng)分布均勻，具有良好的混合、傳質(zhì)、傳熱特性，同時(shí)克服植物組織、器官長(zhǎng)期浸沒培養(yǎng)產(chǎn)生的玻璃化和變異的現(xiàn)象，以及實(shí)現(xiàn)氣液交替半浸沒周期的調(diào)節(jié)和控制，光照周期和強(qiáng)度可調(diào)，從而提供一種適合大規(guī)模生產(chǎn)用的氣升式半浸沒光照植物細(xì)胞、組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞、組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器是由反應(yīng)器主體，光源，帶有不銹鋼篩網(wǎng)的不銹鋼隔層、接種管、氣體分布器組成，其特征在于還包括儲(chǔ)液槽、電磁閥、氣液循環(huán)管、氣液分配管。其中在反應(yīng)器主體內(nèi)安裝多層不銹鋼篩網(wǎng)隔層，隔層上有一中心孔，內(nèi)置光照管從孔中插入，隔板固定在其上，隔層間距根據(jù)培養(yǎng)物決定。中心管的側(cè)邊開有接種管插入孔，孔上活動(dòng)連接一蓋孔的帶有不銹鋼篩網(wǎng)的翻板，一分段接種管穿過此孔，每段接種管螺合固定；儲(chǔ)液槽安裝在反應(yīng)器主體的下面，通過一根管子把儲(chǔ)液槽內(nèi)的氣體分布器與電磁閥和反應(yīng)器主體內(nèi)底部的氣體分布器連接上，另一不銹鋼管通過一電磁閥將反應(yīng)器主體底部與儲(chǔ)液槽頂部連通。儲(chǔ)液槽另一側(cè)壁接出一根氣液循環(huán)管連通到反應(yīng)器主體內(nèi)的氣液分配管上。反應(yīng)器主體上蓋上插入一根排氣管；光源放置在內(nèi)置光照管中。氣液分配管在反應(yīng)器主體內(nèi)各隔層之間。根據(jù)不同深度開有不同直徑和數(shù)目的通孔，以利于不同氣體和營(yíng)養(yǎng)液的均勻分配。
本發(fā)明提供的采用氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織的培養(yǎng)方法1．經(jīng)氣、水冷試后通入蒸氣滅菌，滅菌溫度為100-121℃，滅菌時(shí)間為40-200分鐘，再通入無菌空氣保護(hù)。
2．在室溫下打開接種管上部封帽，在無菌環(huán)境中將培養(yǎng)物種子(植物細(xì)胞、組織、器官等)逐層加入，完成一層接種后提高一段接種管并取下，新一層上翻板自動(dòng)落下再接種，依次從低到高完成接種。
3．蓋好封帽，輸入培養(yǎng)液
4．按所需溫度調(diào)好溫控儀5．按所需培養(yǎng)物要求的浸沒時(shí)間和通氣周期調(diào)好時(shí)序儀，啟動(dòng)本系統(tǒng)，按照下列條件要求自動(dòng)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)。按培養(yǎng)物的要求所需浸沒時(shí)間3-60分鐘、非浸沒時(shí)間30-100分鐘、儲(chǔ)液罐通氣攪拌時(shí)間1-20分鐘、上下料時(shí)間10-20分鐘、光照時(shí)間8-24小時(shí)，光照強(qiáng)度500lux-5000lux。
培養(yǎng)過程中培養(yǎng)條件可調(diào)，不同培養(yǎng)物需不同培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官反應(yīng)器是大規(guī)模培養(yǎng)的一種新型生物反應(yīng)器，可以實(shí)現(xiàn)周期性浸沒、通氣、周期性光照及停止光照和無光的培養(yǎng)操作，可實(shí)現(xiàn)植物組織器官的均勻接種，生長(zhǎng)分布均勻，具有優(yōu)良的混合傳質(zhì)、傳熱特性，無機(jī)械運(yùn)動(dòng)部件，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易密封，不易染菌以及易于放大到工業(yè)化規(guī)模。
本發(fā)明培養(yǎng)方法解決了目前植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)中出現(xiàn)的接種不均，長(zhǎng)期浸沒培養(yǎng)產(chǎn)生玻璃化和變異現(xiàn)象，霧化培養(yǎng)不易放大，氣液固三相混合及傳質(zhì)差，光照不易調(diào)節(jié)，生長(zhǎng)后期出現(xiàn)氣液短路，溫度分布不均以及以往此類反應(yīng)器專一性較強(qiáng)，功能單一等問題。發(fā)明通過分段接種管及隔層翻板設(shè)計(jì)使接種操作簡(jiǎn)單，接種均勻。氣液交替半浸沒周期調(diào)節(jié)培養(yǎng)，符合生物生長(zhǎng)代謝節(jié)律，強(qiáng)化了傳質(zhì)的均勻性，光照強(qiáng)度及周期可調(diào)可實(shí)現(xiàn)光照-無光照周期交替培養(yǎng)及暗培養(yǎng)。儲(chǔ)液罐的設(shè)計(jì)進(jìn)一步強(qiáng)化了營(yíng)養(yǎng)物及氣液均勻混合，增加了培養(yǎng)物溶氧，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)器內(nèi)氣液交替切換的周期性操作。同時(shí)，氣體溫度按培養(yǎng)最佳溫度可調(diào)節(jié)。因此本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)具有多功能性，植物細(xì)胞、組織器官生長(zhǎng)及代謝可調(diào)控性，環(huán)境因子可調(diào)控及最佳選擇性，易于放大等特點(diǎn)，是目前植物組織器官培養(yǎng)系統(tǒng)的創(chuàng)新和突破。下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明圖1是一種現(xiàn)有的9立升植物發(fā)根培養(yǎng)反應(yīng)器示意2是一種現(xiàn)有的2．5立升內(nèi)環(huán)流超聲霧化反應(yīng)器示意3是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意4是本發(fā)明氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞、組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器的一種實(shí)施例 的結(jié)構(gòu)示意面說明如下1-反應(yīng)器主體2-分段接種管 3-隔層 4-翻板5-內(nèi)置光照管6-氣體分布器 7，8，10，11-電磁閥9-外置光源12-儲(chǔ)液槽 13-氣、液分配管14-氣、液循環(huán)管15-玻璃支撐管16-霧化器 17-霧化頭 18-帶孔中心管 19-加熱器20-中心管孔 21-冷凝器 25-接種26-不銹鋼隔網(wǎng)27-排氣口 28-尼龍網(wǎng)中心管29-壓力表 30-進(jìn)氣管31-溫控儀 32-pH探頭及控制儀 33-溶氧探頭及控制儀34-尾氣氣相色譜檢測(cè)35-時(shí)序控制儀 36-氣體控溫裝置37-補(bǔ)液罐 38-氣體流量計(jì) 39-除菌過濾器 40-安全閥41-蠕動(dòng)泵 42-酸液儲(chǔ)罐43-堿液儲(chǔ)罐實(shí)施例1本發(fā)明提供的氣升式半浸沒光照植物細(xì)胞、組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器，由φ230×1400耐熱玻璃制造的反應(yīng)器主體1，將帶有翻板4的10層φ204的不銹鋼隔層及篩網(wǎng)3通過不銹鋼氣液分配管13，固定后置入反應(yīng)器主體1內(nèi)，通過間距為10cm的各層不銹鋼隔層上為φ42的孔插入不銹鋼分段接種管2，各層不銹鋼隔板上的篩網(wǎng)中心開孔，經(jīng)此孔插入φ40耐熱玻璃內(nèi)置光照管5，日光燈插入內(nèi)置光照管5中作為內(nèi)置光源。反應(yīng)器主體1底部設(shè)置氣體分布器6，并用不銹鋼管穿過反應(yīng)器主體1底部后將氣體分布器與市售電磁閥7連接。位于反應(yīng)器下部，設(shè)置-φ408×408的不銹鋼儲(chǔ)液槽12，儲(chǔ)液槽12內(nèi)安裝一氣體分布器6，一不銹鋼管通過儲(chǔ)液槽12頂部焊接一不銹鋼管同電磁閥11連接，然后再同反應(yīng)器底部連通。另一不銹鋼管同電磁閥10連接，并連通到氣液循環(huán)管14上。氣、液循環(huán)管14在反應(yīng)器主體1上方同伸入反應(yīng)器主體1內(nèi)的兩支氣液分配管13連通。氣液分配管13穿過反應(yīng)器主體1內(nèi)不銹鋼隔層而固定，各層之間的空間部分根據(jù)不同深度開有不同直徑和數(shù)目的通孔，以利于不同隔層和營(yíng)養(yǎng)液及氣體的均勻分配。實(shí)施例2按圖4制作一臺(tái)40立升的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織反應(yīng)器，由耐熱玻璃中心光照管5，耐熱玻璃反應(yīng)器主體1，帶篩網(wǎng)的不銹鋼隔層3及翻板4，不銹鋼氣、液分配管13，在反應(yīng)器主體外有日光燈管作外部光源9，加熱器、溫度探頭及溫控儀31，不銹鋼氣體分布器6，不銹鋼電磁閥7，8，10，11，不銹鋼儲(chǔ)液槽12，pH探頭及控制儀32，溶氧探頭及控制儀33，尾氣氣相色譜檢測(cè)34，時(shí)序控制儀35，不銹鋼分段接種管2，氣體控溫裝置36，尾氣冷凝器21，補(bǔ)液罐37，氣體流量計(jì)38，除菌過濾器39，壓力表29，安全閥40，蠕動(dòng)泵41，酸液儲(chǔ)槽42，堿液儲(chǔ)槽43組成；其中在反應(yīng)器主體內(nèi)安裝多層不銹鋼篩網(wǎng)隔層3，隔層3上有孔，內(nèi)置光照管從孔中插入，隔板固定在其上，隔層間距根據(jù)培養(yǎng)物決定。中心管孔20的側(cè)邊開有接種管2插入孔，孔上活動(dòng)連接一蓋孔的帶有不銹鋼篩網(wǎng)的翻板4，一分段接種管穿過此孔，每段接種管螺合固定；儲(chǔ)液槽12安裝在反應(yīng)器主體的下面，通過一根管子把儲(chǔ)液槽12內(nèi)的氣體分布器6與電磁閥和反應(yīng)器主體內(nèi)底部的氣體分布器6連接上，另一不銹鋼管通過一電磁閥將反應(yīng)器主體底部與儲(chǔ)液槽12頂部連通。儲(chǔ)液槽12另一側(cè)壁接出一根氣液循環(huán)管14連通到反應(yīng)器主體1內(nèi)的氣液分配管13上。反應(yīng)器主體1上蓋上插入一根排氣管；光源放置在內(nèi)置光照管5中。氣液分配管13在反應(yīng)器主體1內(nèi)各隔層3，其中內(nèi)置光照管5從孔中插入，隔板固定在其上，隔層3間距根據(jù)培養(yǎng)物決定。中心管孔20的側(cè)邊開有接種管2插入孔，孔上活動(dòng)連接一蓋孔的帶有不銹鋼篩網(wǎng)的翻板4，一分段接種管2穿過此孔，每段接種管2螺合固定；儲(chǔ)液槽安裝在反應(yīng)器主體的下面，通過一根管子把儲(chǔ)液槽12內(nèi)的氣體分布器6與電磁閥和反應(yīng)器主體內(nèi)底部的氣體分布器6連接上，另一不銹鋼管通過一電磁閥將反應(yīng)器主體底部與儲(chǔ)液槽頂部連通。儲(chǔ)液槽12另一側(cè)壁接出一根氣，在反應(yīng)器主體1內(nèi)其中內(nèi)部光源5與外部光源9可調(diào)節(jié)光強(qiáng)及光照周期。分段接種管2，隔層3、篩網(wǎng)3及翻板4，易于接種及種子在反應(yīng)器內(nèi)均勻分布，避免培養(yǎng)物局部堆積。電磁閥7，8，10，11與時(shí)序控制儀35結(jié)合可實(shí)現(xiàn)氣液周期交替浸沒培養(yǎng)。加熱器、溫度探頭及溫度控制儀31可實(shí)現(xiàn)液體浸沒培養(yǎng)時(shí)的加熱和控制。氣體調(diào)溫控溫裝置36可將氣體控制在所需溫度，氣體流到38調(diào)節(jié)氣體流量后經(jīng)除菌過濾器39除菌。氣體分布器6可實(shí)現(xiàn)氣體在溶液中均勻分布。氣、液分配管13將氣體及培養(yǎng)液輸送到反應(yīng)器各層。尾氣冷凝器21可冷凝尾氣中夾帶水分。補(bǔ)液罐37可補(bǔ)加損失水分。反應(yīng)器主體及儲(chǔ)液罐安裝壓力表29及安全閥40，保證操作安全。實(shí)施例3在40立升本發(fā)明的反應(yīng)器系統(tǒng)中應(yīng)用本發(fā)明的方法，對(duì)中科院植物所提供的發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)青蒿葉片形成植物器官毛狀根進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，接種量為0．1-1克干重／升，半浸沒周期為3-10分鐘浸沒，30-60分鐘非浸沒并通氣。光照強(qiáng)度500lux-5000lux，光照周期每天光照8-20小時(shí)，溫度20-35℃，培養(yǎng)20-30天，整個(gè)反應(yīng)器長(zhǎng)滿發(fā)根，獲得發(fā)根干重為5-30克干重／升，生物量增加30-60倍。操作步驟實(shí)施例4在40立升規(guī)模本發(fā)明的反應(yīng)器系統(tǒng)中，對(duì)中科院植物所提供的青蒿叢生芽進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，接種量為0．1-0．6克干重／升，浸沒周期、光照強(qiáng)度、光照周期及溫度同實(shí)例1。培養(yǎng)20-30天后，整個(gè)反應(yīng)器長(zhǎng)滿叢生芽，獲得青蒿叢生芽干重為5-30克干重／升，生物量增加15-20倍，所得生物量分別為固體培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)的1．7倍和2．5倍。
本發(fā)明方法和培養(yǎng)反應(yīng)器已實(shí)現(xiàn)了青蒿器官毛狀根、青蒿叢生芽周期性浸沒培養(yǎng)。試驗(yàn)中生長(zhǎng)良好，反應(yīng)器有效體積充分利用，培養(yǎng)物無玻璃化現(xiàn)象及變異發(fā)生，整個(gè)反應(yīng)器密封良好，無染菌現(xiàn)象，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)物、溫度分布均勻，氣液間傳質(zhì)良好，周期性輸送液體和氣體。pH、溫度、溶氧可監(jiān)測(cè)并調(diào)控到最佳范圍，整個(gè)系統(tǒng)操作可靠。國(guó)內(nèi)首次設(shè)計(jì)的40升植物組織、器官大規(guī)模培養(yǎng)首次獲得成功。
權(quán)利要求
1．氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器，包括反應(yīng)器主體，光源，隔層、接種管、氣體分布器，其特征在于還包括儲(chǔ)液槽、電磁閥、氣液循環(huán)管、氣液分配管。其中在反應(yīng)器主體內(nèi)安裝多帶篩網(wǎng)的隔層，隔層上設(shè)有一孔，內(nèi)置光照管從孔中插入固定在其上。隔層側(cè)邊開有接種管插入孔，孔邊上活動(dòng)連接一蓋孔的帶有不銹鋼篩網(wǎng)的翻板，一分段接種管穿過一隔層的孔，每段接種管穿出隔層與下段接種管螺合固定；儲(chǔ)液槽安裝在反應(yīng)器主體的下面，通過一根管子把儲(chǔ)液槽內(nèi)的氣體分布器與電磁閥和反應(yīng)器主體內(nèi)底部的氣體分布器連接上，另一不銹鋼管通過一電磁閥將反應(yīng)器主體底部與儲(chǔ)液槽頂部連通。儲(chǔ)液槽另一側(cè)壁接出一根氣液循環(huán)管連通到反應(yīng)器主體內(nèi)的氣液分配管上。反應(yīng)器主體上蓋上插入一根排氣管；光源放置在內(nèi)置光照管中。氣液分配管在反應(yīng)器主體內(nèi)各隔層之間，根據(jù)不同深度開有不同直徑和數(shù)目的通孔，以利于不同隔層中營(yíng)養(yǎng)液及氣體的均勻分配。
2．按權(quán)利要求1所述的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器，其特征在于還包括在反應(yīng)器主體的外側(cè)設(shè)有外置光照管。
3．按權(quán)利要求1所述的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器，其特征在于還包括電磁閥與時(shí)序控制儀連接，時(shí)序控制儀與內(nèi)置光源電連接。
4．按權(quán)利要求1所述的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器，其特征在于氣／液分配管改善了培養(yǎng)后期通氣及營(yíng)養(yǎng)物輸送排放的問題，防止了如毛狀根等生長(zhǎng)后期出現(xiàn)的氣液短路，傳質(zhì)不均，溫度分布不均等問題。
5．按權(quán)利要求1所述的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器，其特征在于在半浸沒循環(huán)培養(yǎng)過程中用儲(chǔ)液槽保證了營(yíng)養(yǎng)液的充分混合及足夠的溶解氧等，為反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)物的均勻生長(zhǎng)提供了條件。
6．按權(quán)利要求1所述的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器，其特征在于還包括在反應(yīng)器主體外設(shè)一氣體定溫裝置。
7．按權(quán)利要求1所述的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器，其特征在于隔層上有一活連接的，翻板中間為篩網(wǎng)，翻板，篩網(wǎng)是不銹鋼材料制成的。
8．按權(quán)利要求1所述的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器，其特征在于無機(jī)械運(yùn)動(dòng)部件，自動(dòng)操作，減少了培養(yǎng)中染菌機(jī)會(huì)。
9．按權(quán)利要求1所述的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器，其特征在于還包括在反應(yīng)器主體底部設(shè)置加熱器，并與溫度探頭及溫控儀電連接，溫控儀又與時(shí)序控制儀電連接。
10．一種權(quán)利要求1所述的氣升式周期浸沒光照植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)反應(yīng)器的使用方法，其特征在于(1)經(jīng)氣、水冷試后通入蒸氣滅菌，滅菌溫度為100-121℃，滅菌時(shí)間為40-2．00分鐘，再通入無菌空氣保護(hù)；(2)．在室溫下打開接種管上部封帽，在無菌環(huán)境中將培養(yǎng)物種子(植物細(xì)胞、組織、器官等)逐層加入，完成一層接種后提高一段接種管并取下，新一層上翻板自動(dòng)落下再接種，依次從低到高完成接種；(3)．蓋好封帽，輸入培養(yǎng)液；(4)按所需溫度調(diào)好溫控儀；(5)按所需培養(yǎng)物要求的浸沒時(shí)間和通氣周期調(diào)好時(shí)序儀，啟動(dòng)本系統(tǒng)，按照下列條件要求自動(dòng)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)。按培養(yǎng)物的要求所需浸沒時(shí)間3-60分鐘、非浸沒時(shí)間30-100分鐘、儲(chǔ)液罐通氣攪拌時(shí)間1-20分鐘、上下料時(shí)間10-20分鐘、光照時(shí)間8-24小時(shí)，光照強(qiáng)度500lux-5000lux。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)的方法和培養(yǎng)反應(yīng)器。反應(yīng)器由主體,光源,隔層、接種管、氣體分布器,其特征在于還包括儲(chǔ)液槽、電磁閥、氣液循環(huán)管、氣液分配管組成。方法經(jīng)蒸氣滅菌,滅菌溫度為100—121℃,滅菌時(shí)間為40—200分鐘,再通入無菌空氣保護(hù);在室溫下,在無菌環(huán)境中將培養(yǎng)物逐層加入;蓋好封帽,輸入培養(yǎng)液;按所需培養(yǎng)物要求的浸沒時(shí)間和通氣周期調(diào)好時(shí)序儀自動(dòng)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12M3/00GK1203943SQ9810239
公開日1999年1月6日 申請(qǐng)日期1998年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月16日
發(fā)明者王玉春, 趙兵, 歐陽藩, 閉靜秀, 劉春朝, 葉和春, 李國(guó)鳳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化工冶金研究所