專(zhuān)利名稱(chēng)：人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒系列及其在腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和基因治療領(lǐng)域，是關(guān)于一種人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子(NF-IL6)表達(dá)質(zhì)粒系列及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。
現(xiàn)有的腫瘤治療藥物因毒性和副作用大(如化療藥物)和效果低(如中草藥及其制劑)，不能滿意地控制腫瘤和挽救病人的生命。
本發(fā)明人在研究工作中發(fā)現(xiàn)了外源的人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子在某些惡性細(xì)胞中的人工表達(dá)引起這些惡性細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，該工作已發(fā)表在[Zhu Min-sheng and Liu Ding-gan et al.,DNA and Cell Biology,1997,16(2):127-135]。國(guó)際上也公布了NF-IL6是巨噬細(xì)胞發(fā)揮其殺滅細(xì)菌和惡性細(xì)胞的功能所必需的研究結(jié)果[Tanaka,T.et al.,Cell,1995,80(2):353-361]。這些研究結(jié)果顯示，NF-IL6基因可能被用來(lái)治療惡性腫瘤。
為了使NF-IL6基因能在惡性細(xì)胞和有關(guān)效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)，需要將它與質(zhì)粒載體相連接。質(zhì)粒載體是目前普遍用于分子生物學(xué)和基因工程研究的一種工具DNA；它們具有使人工插入的基因能夠表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄成信息核糖核酸[mRNA]，再按照mRNA提供的遺傳信息合成起生理作用的蛋白質(zhì))的全部元件(如參見(jiàn)[Sambrook et al.,Molecular cloning:A Laboratory Manual.2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,1989])。因此，設(shè)計(jì)構(gòu)建含有NF-IL6基因的表達(dá)質(zhì)粒系列，并對(duì)其在腫瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)行研究，是很有意義和實(shí)用價(jià)值的。
本發(fā)明的目的是提供NF-IL6表達(dá)質(zhì)粒系列，該質(zhì)粒能抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，可應(yīng)用于腫瘤的治療。
本發(fā)明提供的NF-IL6表達(dá)質(zhì)粒系列(也稱(chēng)為“14-6RS”)是根據(jù)本發(fā)明人和國(guó)際上關(guān)于腫瘤表型和基因表達(dá)的研究結(jié)果設(shè)計(jì)和構(gòu)建的，它具有下列基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)1見(jiàn)圖1，它是由啟動(dòng)子，NF-IL6編碼區(qū)，DNA序列1,polyA信號(hào)和DNA序列2順序連接而成的環(huán)狀雙鏈DNA分子，其中NF-IL6編碼區(qū)=人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子基因的編碼區(qū)；啟動(dòng)子=任何真核基因的啟動(dòng)子，它是啟動(dòng)它下游緊鄰之基因的表達(dá)的元件，例如SV40病毒早期啟動(dòng)子；SV40病毒晚期啟動(dòng)子；巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；金屬硫蛋白基因的啟動(dòng)子；肌球蛋白基因的啟動(dòng)子；腺病毒啟動(dòng)子；痘苗病毒啟動(dòng)子；皰疹病毒啟動(dòng)子；流感病毒啟動(dòng)子；肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子；膠原蛋白基因的啟動(dòng)子；乳頭狀瘤病毒啟動(dòng)子；多瘤病毒啟動(dòng)子；甲胎蛋白基因的啟動(dòng)子；癌胚抗原基因的啟動(dòng)子；小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子等。
DNA序列1=任何真核質(zhì)粒載體的介于多克隆位點(diǎn)和polyA信號(hào)之間的DNA序列，一般含有mRNA(信息核糖核酸)的剪接信號(hào)；polyA信號(hào)=任何真核質(zhì)粒載體的polyA信號(hào)，它是mRNA的polyA(多腺嘌呤核苷酸)尾的起始位點(diǎn)；DNA序列2=任何真核質(zhì)粒載體的介于polyA信號(hào)和啟動(dòng)子之間的DNA序列，一般含有質(zhì)粒載體DNA的復(fù)制起始位點(diǎn)，也可含有抗生素抗性基因，包括使細(xì)菌獲得對(duì)某種抗生素的抗性的基因(如氨基芐青霉素抗性基因amp，四環(huán)素抗性基因tet，卡那霉素抗性基因kan等)，或使真核細(xì)胞獲得對(duì)某種抗生素的抗性的基因(如抗生素G418抗性的基因neo等)。
以上所述的任何真核質(zhì)粒載體，可用下列質(zhì)粒為例pSV.SPORT1,pSPORT1,pMSEx-1,pMSEx-2,pMSEx-3,pcDNA3,pSFV1,pCDV-1,pSVK3,pBPV,pMSG等。
基本結(jié)構(gòu)2見(jiàn)圖2，是由DNA序列2(一部分)，啟動(dòng)子，NF-IL6編碼區(qū)，DNA序列1,polyA信號(hào)和DNA序列2(另一部分)順序連接而成的的線型雙鏈DNA分子，其中NF-IL6編碼區(qū)=人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子基因的編碼區(qū)；啟動(dòng)子=任何真核基因的啟動(dòng)子，它是啟動(dòng)它下游緊鄰之基因的表達(dá)的元件，例如SV40病毒早期啟動(dòng)子；SV40病毒晚期啟動(dòng)子；巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；金屬硫蛋白基因的啟動(dòng)子；肌球蛋白基因的啟動(dòng)子；腺病毒啟動(dòng)子；痘苗病毒啟動(dòng)子；皰疹病毒啟動(dòng)子；流感病毒啟動(dòng)子；肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子；膠原蛋白基因的啟動(dòng)子；乳頭狀瘤病毒啟動(dòng)子；多瘤病毒啟動(dòng)子；甲胎蛋白基因的啟動(dòng)子；癌胚抗原基因的啟動(dòng)子；小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子等。
DNA序列1=任何真核質(zhì)粒載體的介于多克隆位點(diǎn)和polyA信號(hào)之間的DNA序列，一般含有mRNA(信息核糖核酸)的剪接信號(hào)；polyA信號(hào)=任何真核質(zhì)粒載體的polyA信號(hào)，它是mRNA的polyA(多腺嘌呤核苷酸)尾的起始位點(diǎn)；DNA序列2=任何真核質(zhì)粒載體的在polyA信號(hào)下游和/或啟動(dòng)子上游的DNA序列，一般含有質(zhì)粒載體DNA的復(fù)制起始位點(diǎn)，也可含有抗生素抗性基因，包括使細(xì)菌獲得對(duì)某種抗生素的抗性的基因(如氨基芐青霉素抗性基因amp，四環(huán)素抗性基因tet，卡那霉素抗性基因kan等)，或使真核細(xì)胞獲得對(duì)某種抗生素的抗性的基因(如抗生素G418抗性的基因neo等)。
以上所述的任何真核質(zhì)粒載體，可用下列質(zhì)粒為例pSV.SPORT1,pSPORT1,pMSEx-1,pMSEx-2,pMSEx-3,pcDNA3,pSFV1,pCDV-1,pSVK3,pBPV,pMSG等。
本發(fā)明的NF-IL6表達(dá)質(zhì)粒系列是用基因工程的方法構(gòu)建的。將含有啟動(dòng)子，polyA位點(diǎn)，質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，抗生素抗性基因和其它調(diào)控序列的質(zhì)粒載體用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶切成線型；NF-IL6編碼區(qū)也用限制性?xún)?nèi)切酶從克隆有NF-IL6基因的質(zhì)粒切下，純化并經(jīng)適當(dāng)處理；然后用DNA連接酶將二者連成環(huán)狀，轉(zhuǎn)化細(xì)菌并擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒并加以純化，即得。最終的產(chǎn)物為純的質(zhì)粒DNA，不含任何蛋白，多糖(包括熱原)。
如將純化的質(zhì)粒在上述DNA序列2的區(qū)域內(nèi)用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶酶解切斷，即得線型的質(zhì)粒。
以下的實(shí)施例中將以pSN,pCN,pVN,pTN和pGN為例，詳細(xì)描述制備方法。其它結(jié)構(gòu)的“14-6RS”均可參照該例，用一般的基因工程方法制備。
本發(fā)明的“14-6RS”以pSN為例經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所荷的人類(lèi)腫瘤的治療實(shí)驗(yàn)，證明其能有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，甚至使腫瘤消失而痊愈，而無(wú)明顯副作用。例如對(duì)裸小鼠皮下接種人肝癌細(xì)胞所形成之腫瘤，每瘤單次注射1-10微克“14-6RS”,3天后均能觀察到腫瘤逐漸縮小并趨于消失，而對(duì)照的腫瘤則在增長(zhǎng)；對(duì)裸小鼠腹腔接種人胃癌細(xì)胞后，每鼠腹腔單次注射10微克“14-6RS”，半月后，對(duì)照者腹腔內(nèi)大量出血，解剖發(fā)現(xiàn)腫瘤大而壞死，而注射“14-6RS”者解剖示1/3無(wú)病變，2/3腫瘤顯著小于對(duì)照；對(duì)裸小鼠皮下接種人肺癌細(xì)胞所形成之腫瘤，每瘤注射1-10微克“14-6RS”，觀察到瘤的增殖比對(duì)照顯著減慢。
因而，本發(fā)明的NF-IL6表達(dá)質(zhì)粒系列是一種具有在體內(nèi)使腫瘤縮小和/或消失的功能的質(zhì)粒DNA。使用含不同啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體構(gòu)建本發(fā)明表達(dá)質(zhì)粒系列，將使其可能治療不同組織中的各種惡性腫瘤，例如含甲胎蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒，特別適用于治療肝癌。將它注射到荷有各種人惡性腫瘤的裸小鼠的腫瘤部位或其附近，與對(duì)照相比，腫瘤明顯地縮小甚至消失。它使用的有效劑量很低，在荷瘤裸鼠中，一般每個(gè)瘤注射數(shù)微克即能抑制腫瘤增殖。在至今的觀察中，注射“14-6RS”的動(dòng)物未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)和藥物副作用。因此，“14-6RS”可被開(kāi)發(fā)為一種高效而安全的基因藥物，以應(yīng)用于各種腫瘤的治療和預(yù)防。


圖1是NF-IL6表達(dá)質(zhì)粒系列的基本結(jié)構(gòu)1(環(huán)狀)。
圖2是NF-IL6表達(dá)質(zhì)粒系列的基本結(jié)構(gòu)2(線型)。
圖3是質(zhì)粒pSN構(gòu)建方法的流程圖。
圖4是質(zhì)粒pCN構(gòu)建方法的流程圖。
圖5是質(zhì)粒pVN構(gòu)建方法的流程圖。
圖6是質(zhì)粒pTN構(gòu)建方法的流程圖。
圖7是質(zhì)粒pGN構(gòu)建方法的流程圖。
圖8是質(zhì)粒pSN對(duì)人肝癌裸鼠種植瘤的治療曲線與對(duì)照組的結(jié)果曲線圖。
圖9是質(zhì)粒pSN對(duì)人胃癌裸鼠種植瘤的治療實(shí)驗(yàn)(1)，鼠框中右面為治療有效的裸鼠，左面為瀕死的裸鼠。
圖10是質(zhì)粒pSN對(duì)人胃癌裸鼠種植瘤的治療實(shí)驗(yàn)(2)，裸鼠的解剖右面為治療有效的裸鼠，左面為病死的裸鼠。
圖11是質(zhì)粒pSN對(duì)人肺癌裸鼠種植瘤的治療結(jié)果曲線與對(duì)照組的曲線圖。
本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步描述，但并不限止本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1質(zhì)粒pSN的構(gòu)建方法a．質(zhì)粒載體和NF-IL6基因片段的準(zhǔn)備1．取質(zhì)粒pMSEx-l(德國(guó)Schuemann博士贈(zèng)，含有SV40病毒早期啟動(dòng)子)0.5μg(0.5μl)，加10X限制性?xún)?nèi)切酶StuI緩沖液2μl，滅菌水17μl和限制性?xún)?nèi)切酶StuI 1μl，混合，37℃保溫1小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)液用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀質(zhì)粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HClpH8.0-1m mol/L EDTA。
2．取上述溶解的pMSEx-19μl,10X小牛腸堿性磷酸酯酶緩沖液1μl和小牛腸堿性磷酸酯酶0.5μl，混合，37℃保溫30分鐘進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)液加1μl 50m mol/L EDTA,75℃加熱10分鐘，然后用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀質(zhì)粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA，是為A液。
3．取質(zhì)粒pBlue610(日本審良靜男博士贈(zèng))0.5μg(0.5μl)，加10X限制性?xún)?nèi)切酶SalI緩沖液2μl，滅菌水17μl和限制性?xún)?nèi)切酶SalI 1μl，混合，37℃保溫1小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)液中加2μl含dATP,dCTP,dTTP和dGTP各10m mol/L的溶液，以及1μl T4 DNA聚合酶，繼續(xù)保溫20分鐘。反應(yīng)液用0.7％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離，切下1.0kb區(qū)帶，從凝膠中提取出質(zhì)粒DNA，用苯酚/氯仿抽提1次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀質(zhì)粒，溶于10μl的10mmol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA備用，是為B液，即平頭的NF-IL6編碼區(qū)。b．平頭NF-IL6編碼區(qū)和質(zhì)粒載體pMSEx-1的連接，細(xì)菌轉(zhuǎn)化和鑒定取A液5μl,B液10μl,10XT4 DNA連接酶緩沖液2μl,10m mol/L ATP2μl和T4 DNA連接酶2μl，混合，4℃保溫過(guò)夜。次日，取2μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取集落，用1ml LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增細(xì)菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI酶解，反應(yīng)液用0.7％普通瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇出現(xiàn)1.3kb插入片段的質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pSN。可保存和擴(kuò)增備用。
以上過(guò)程如圖3所示。
實(shí)施例2質(zhì)粒pCN的構(gòu)建方法a．質(zhì)粒載體和NF-IL6基因片段的準(zhǔn)備1．取質(zhì)粒pcDNA3(源自Invitrogen公司，含有SV40病毒早期啟動(dòng)子)0.5μg(0.5μl),10X限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI緩沖液2μl，滅菌水16μl，限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI 1μl和限制性?xún)?nèi)切酶XhoI 1μl，混合，37℃保溫1小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)液用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀質(zhì)粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA,是為A液。
2．取質(zhì)粒pBlue610 0.5μg(0.5μl),10X限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI緩沖液2μl，滅菌水.17μl，限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI 1μl和限制性?xún)?nèi)切酶XhoI 1μl，混合，37℃保溫1小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)液用0.7％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離，切下1.0kb區(qū)帶，從凝膠中提取出質(zhì)粒DNA，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1mmol/LEDTA備用，是為B液，即NF-IL6編碼區(qū)。b．NF-IL6編碼區(qū)和質(zhì)粒載體pcDNA3的連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化取A液5μl,B液10μl,10XT4 DNA連接酶緩沖液2μl,10m mol/L ATP2μl和T4 DNA連接酶1μl，混合，16℃保溫過(guò)夜進(jìn)行酶反應(yīng)。次日，取1μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取集落，用1ml LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增細(xì)菌，抽提質(zhì)粒，各質(zhì)粒均用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶解，反應(yīng)液用0.7％普通瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇出現(xiàn)約1.0kb插入片段的質(zhì)粒(不必另行鑒定)，即為質(zhì)粒pCN?？杀４婧蛿U(kuò)增備用。
以上過(guò)程如圖4所示。
實(shí)施例3質(zhì)粒pVN的構(gòu)建方法a．質(zhì)粒載體和NF-IL6基因片段的準(zhǔn)備1．取質(zhì)粒pSV.SPORT1(購(gòu)自GibcoBRL公司，含有SV40病毒早期啟動(dòng)子)0.5μg(0.5μl),10X限制性?xún)?nèi)切酶SalI緩沖液2μl，滅菌水17μl和限制性?xún)?nèi)切酶SalI 1μl，混合，37℃保溫1小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)液用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀質(zhì)粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1mmol/L EDTA。
2．取上述溶解的pSV.SPORT1 9μl,10X小牛腸堿性磷酸酶緩沖液1μl和小牛腸堿性磷酸酶0.5μl，混合，37℃保溫30分鐘進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)液加1μl 50m mol/L EDTA,75℃加熱10分鐘，然后用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀質(zhì)粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA，是為A液。
3．取質(zhì)粒pBlue610 0.5μg(0.5μl),10X限制性?xún)?nèi)切酶SalI緩沖液2μl，滅菌水17μl和限制性?xún)?nèi)切酶SalI 1μl，混合，37℃保溫1小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)液用0.7％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離，切下1.0kb區(qū)帶，從凝膠中提取出質(zhì)粒DNA，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA備用，是為B液，即NF-IL6編碼區(qū)。b．NF-IL6編碼區(qū)和質(zhì)粒載體pSV.SPORT1的連接，細(xì)菌轉(zhuǎn)化和鑒定取上述A液5μl,B液10μl,10XT4 DNA連接酶緩沖液2μl,10mmol/LATP 2μl和T4 DNA連接酶1μl，混合，16℃保溫過(guò)夜進(jìn)行酶反應(yīng)。次日，取1μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取集落，用1ml LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增細(xì)菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性?xún)?nèi)切酶SalI酶解，反應(yīng)液用0.7％普通瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇出現(xiàn)約1.0kb插入片段的質(zhì)粒，進(jìn)一步提純，以便鑒定。c．正向插入的重組質(zhì)粒的鑒定取在b步得到的重組質(zhì)粒9μl，加10XEcoRI酶緩沖液1μl和EcoRI酶4單位，混合，37℃保溫2小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)液用0.7％普通瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇不出現(xiàn)約1.0kb片段的重組質(zhì)粒，此即為質(zhì)粒pVN?？杀４婧蛿U(kuò)增備用。
以上過(guò)程如圖5所示。
實(shí)施例4．質(zhì)粒pTN的構(gòu)建a．質(zhì)粒載體和NF-IL6基因片段的準(zhǔn)備1．取質(zhì)粒pSMT(中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所沈孝宙教授贈(zèng)，該質(zhì)粒含有金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子)0.5μg(0.5μl),10X限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液A(Boehringer-Mannheim公司)2μl，滅菌水17μl和限制性?xún)?nèi)切酶SmaI 1μl，混合，25℃保溫2小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)，然后加限制性?xún)?nèi)切酶KpnI 1μl,37℃繼續(xù)保溫2小時(shí)。反應(yīng)液用苯酚/氯仿抽提1次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀質(zhì)粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA,是為A液。
2．取質(zhì)粒pBlue610 0.5μg(0.5μl),10X限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液A2μl，滅菌水17μl和限制性?xún)?nèi)切酶SmaI 1μl，混合，25℃保溫2小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)，然后加限制性?xún)?nèi)切酶KpnI 1μl,37℃繼續(xù)保溫2小時(shí)。反應(yīng)液用0.7％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離，切下1.0kb區(qū)帶，從凝膠中提取出質(zhì)粒DNA，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA備用，是為B液，即NF-IL6編碼區(qū)。b．NF-IL6編碼區(qū)和質(zhì)粒載體pSMT的連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化取A液5μl,B液10μl,10XT4 DNA連接酶緩沖液2μl,10m mol/L ATP2μl和T4 DNA連接酶1μl，混合，4℃保溫過(guò)夜進(jìn)行酶反應(yīng)。次日，取1μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取集落，用1ml LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增細(xì)菌，提取質(zhì)粒，各質(zhì)粒均用限制性?xún)?nèi)切酶SmaI和KprI雙酶解，反應(yīng)液用0.7％普通瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇出現(xiàn)約1.0kb插入片段的質(zhì)粒(不必另行鑒定)，即為質(zhì)粒pTN。可保存和擴(kuò)增備用。
以上過(guò)程如圖6所示。
實(shí)施例5．質(zhì)粒pGN的構(gòu)建a．質(zhì)粒載體和NF-IL6基因片段的準(zhǔn)備
1．取質(zhì)粒pMSG(Pharmacia Biotech公司，該質(zhì)粒含有小鼠乳腺腫瘤病毒[MMTV]啟動(dòng)子)0.5μg(0.5μl),10X限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液A(Boehringer-Mannheim公司)2μl，滅菌水17μl和限制性?xún)?nèi)切酶SmaI 1μl，混合，25℃保溫2小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)，然后加限制性?xún)?nèi)切酶XhoI 3μl,37℃繼續(xù)保溫2小時(shí)。反應(yīng)液用苯酚/氯仿抽提1次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀質(zhì)粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA，是為A液。
2．取質(zhì)粒pBlue610 0.5μg(0.5μl),10X限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液A2μl，滅菌水17μl和限制性?xún)?nèi)切酶SmaI 1μl，混合，25℃保溫2小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)，然后加限制性?xún)?nèi)切酶XhoI 3μl,37℃繼續(xù)保溫2小時(shí)。反應(yīng)液用0.7％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離，切下1.0kb區(qū)帶，從凝膠中提取出質(zhì)粒DNA，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA備用，是為B液，即NF-IL6編碼區(qū)。b．NF-IL6編碼區(qū)和質(zhì)粒載體pMSG的連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化取A液5μl,B液10μl,10XT4 DNA連接酶緩沖液2μl,10m mol/L ATP2μl和T4 DNA連接酶1μl，混合，16℃保溫過(guò)夜進(jìn)行酶反應(yīng)。次日，取1μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取集落，用1ml LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增細(xì)菌，提取質(zhì)粒，各質(zhì)粒均用限制性?xún)?nèi)切酶SmaI和XhoI雙酶解，反應(yīng)液用0.7％普通瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇出現(xiàn)約1.0kb插入片段的質(zhì)粒(不必另行鑒定)，即為質(zhì)粒pGN。可保存和擴(kuò)增備用。
以上過(guò)程如圖7所示。
實(shí)施例6線型質(zhì)粒pVN的構(gòu)建取實(shí)施例3構(gòu)建的質(zhì)粒pVN 100μg(100μl)，加10×限制性?xún)?nèi)切酶PvuI緩沖液20μl，滅菌水70μl和限制性?xún)?nèi)切酶PvulI 10μl(100單位)，混合，37℃保溫2小時(shí)進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)液用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀質(zhì)粒，溶于100μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA，即得線型質(zhì)粒pVN?？杀４?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例7質(zhì)粒pSN對(duì)人肝癌裸鼠種植瘤的治療實(shí)驗(yàn)裸小鼠15只，皮下每注射點(diǎn)接種107人肝癌SMMC7721細(xì)胞。1周后，均形成腫瘤。每4只為一組(不注射任何藥物的對(duì)照組為3只)，各組分別在腫瘤部位注射如下物質(zhì)0.1組……………pSN0.1μg加脂質(zhì)體50μg1組……………pSN 1μg加脂質(zhì)體50μl10組……………pSN10μg加脂質(zhì)體50μl對(duì)照組……………0注射后，每隔3天測(cè)量一次各腫瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，并按下列公式計(jì)算腫瘤體積VV=0.4ab2。結(jié)果表明，注射了pSN的腫瘤均停止增殖而趨于縮小，部分腫瘤最后消失。如表1和圖8所示。
表1質(zhì)粒pSN對(duì)人肝癌裸鼠種植瘤的治療實(shí)驗(yàn)注射后天數(shù)0.1組 1組 10組對(duì)照組01 1 1 13 0.49+-0.41 0.53+-0.11 0.66+-0.10 0.94+-0.216 0.21+-0.20 0.21+-0.08 0.24+-0.14 1.7+-0.569 0.06+-0.04 0.11+-0.08 0.04+-0.05 1.9+-0.67表中數(shù)據(jù)為觀察日腫瘤體積和注射時(shí)該腫瘤體積之比(平均值+-標(biāo)準(zhǔn)差)，以該實(shí)施數(shù)據(jù)作曲線圖8。
實(shí)施例8質(zhì)粒pSN對(duì)人胃癌裸鼠種植瘤的治療實(shí)驗(yàn)(1)裸小鼠12只，各腹腔注射6×106個(gè)人胃癌MKN-45細(xì)胞，一周后對(duì)其中8只各腹腔注射10μg pSN加脂質(zhì)體50μl和生理鹽水250μl，其余4只為對(duì)照。8天后觀察，結(jié)果如下
a)4只對(duì)照鼠全部處于瀕死狀態(tài)，腹部膨隆，解剖發(fā)現(xiàn)大量腹腔內(nèi)出血(見(jiàn)圖9)；b)12只治療鼠中，5只也處于瀕死狀態(tài)，腹部膨隆，解剖發(fā)現(xiàn)大的腫瘤和大量腹腔內(nèi)出血；4只表現(xiàn)活潑，解剖也發(fā)現(xiàn)有腫瘤和內(nèi)出血，但程度比對(duì)照顯著輕；3只與正常鼠無(wú)異，解剖亦未發(fā)現(xiàn)腫瘤，說(shuō)明被治愈(見(jiàn)圖10)。因此pSN的注射能顯著減慢腫瘤增殖速度，甚至治愈腫瘤。
實(shí)施例9質(zhì)粒pSN對(duì)人肺癌裸鼠種植瘤的治療實(shí)驗(yàn)(2)裸小鼠6只，各皮下注射107個(gè)人肺癌SPC-A-1細(xì)胞，一周后，均形成腫瘤。將荷瘤鼠平均分為3組，1組為對(duì)照，其余2組分別在腫瘤部位注射pSN0.1μg和1μg。每隔2-3天測(cè)量一次各腫瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，并按下列公式計(jì)算腫瘤體積VV=0.4ab2。結(jié)果表明，注射了pSN的腫瘤的增殖速度較對(duì)照顯著減慢，如表2和圖11所示。
表2質(zhì)粒pSN對(duì)人肺癌種植瘤的治療實(shí)驗(yàn)注射后天數(shù) 0.1組1組對(duì)照組0 1 114 2.19+-1.11 0.80+-0,483.53+-1.116 2.15+-0.16 1.40+-0.586.18+-1.638 6.45+-3.45 2.63+-0.769.78+-4.4712 9.38+-3.76 5.48+-1.7416.2+-6.44表中數(shù)據(jù)為觀察日腫瘤體積和注射時(shí)該腫瘤體積之比(平均值+-標(biāo)準(zhǔn)差)，以該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作曲線圖11。
權(quán)利要求
1．一種人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒系列，其特征在于它具有以下的基本結(jié)構(gòu)由啟動(dòng)子、NF-IL6編碼區(qū)、DNA序列1、polyA信號(hào)和DNA序列2順序連接而成的環(huán)狀雙鏈DNA分子，其中，NF-IL6編碼區(qū)=人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子基因的編碼區(qū)；啟動(dòng)子=任何真核基因的啟動(dòng)子，它是啟動(dòng)它下游緊鄰之基因的表達(dá)的元件；DNA序列1=任何真核質(zhì)粒載體的介于多克隆位點(diǎn)和polyA信號(hào)之間的DNA序列，含有mRNA(信息核糖核酸)的剪接信號(hào)；polyA信號(hào)=任何真核質(zhì)粒載體的polyA信號(hào)，它是mRNA的polyA(多腺嘌呤核苷酸)尾的起始位點(diǎn)；DNA序列2=任何真核質(zhì)粒載體的介于polyA信號(hào)和啟動(dòng)子之間的DNA序列，含有質(zhì)粒載體DNA的復(fù)制起始位點(diǎn)，也可含有抗生素抗性基因，包括使細(xì)菌獲得對(duì)某種抗生素的抗性的基因或使真核細(xì)胞獲得對(duì)某種抗生素的抗性的基因。
2．一種人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒系列，其特征在于它具有以下的基本結(jié)構(gòu)由DNA序列2(一部分)、啟動(dòng)子、NF-IL6編碼區(qū)、DNA序列1、polyA信號(hào)和DNA序列2(另一部分)順序連接而成的線型雙鏈DNA分子；其中，NF-IL6編碼區(qū)=人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子基因的編碼區(qū)；啟動(dòng)子=任何真核基因的啟動(dòng)子，它是啟動(dòng)它下游緊鄰之基因的表達(dá)的元件；DNA序列1=任何真核質(zhì)粒載體的介于多克隆位點(diǎn)和polyA信號(hào)之間的DNA序列，含有mRNA(信息核糖核酸)的剪接信號(hào)；polyA信號(hào)=任何真核質(zhì)粒載體的polyA信號(hào)，它是mRNA的polyA(多腺嘌呤核苷酸)尾的起始位點(diǎn)；DNA序列2=任何真核質(zhì)粒載體的在polyA信號(hào)下游和/或啟動(dòng)子上游的DNA序列，含有質(zhì)粒載體DNA的復(fù)制起始位點(diǎn)，也可含有抗生素抗性基因，包括使細(xì)菌獲得對(duì)某種抗生素的抗性的基因或使真核細(xì)胞獲得對(duì)某種抗生素的抗性的基因。
3．如權(quán)利要求1、2所述的人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒系列，其特征在于該表達(dá)質(zhì)粒系列中的各質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中含有下列的任意一種啟動(dòng)子[Ⅰ]SV40病毒早期啟動(dòng)子；[Ⅱ]SV40病毒晚期啟動(dòng)子；[Ⅲ]巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；[Ⅳ]金屬硫蛋白基因的啟動(dòng)子；[Ⅴ]肌球蛋白基因的啟動(dòng)子；[Ⅵ]腺病毒啟動(dòng)子；[Ⅶ]痘苗病毒啟動(dòng)子；[Ⅷ]皰疹病毒啟動(dòng)子；[Ⅸ]流感病毒啟動(dòng)子；[Ⅹ]肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子；[Ⅺ]膠原蛋白基因的啟動(dòng)子；[Ⅻ]乳頭狀瘤病毒啟動(dòng)子；[ⅩⅢ]多瘤病毒啟動(dòng)子；[ⅩⅣ]甲胎蛋白基因的啟動(dòng)子；[ⅩⅤ]癌胚抗原基因的啟動(dòng)子；[ⅩⅥ]小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子。
4．如權(quán)利要求1、2所述的人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒系列的應(yīng)用，其特征在于該質(zhì)粒系列可應(yīng)用于作為治療和預(yù)防各種腫瘤的基因藥物。
全文摘要
本發(fā)明為一種具有在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能的質(zhì)粒DNA－人白介素6核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒系列。此種表達(dá)質(zhì)粒系列可應(yīng)用于各種腫瘤的治療和預(yù)防。
文檔編號(hào)C12N15/85GK1221795SQ9812202
公開(kāi)日1999年7月7日 申請(qǐng)日期1998年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月20日
發(fā)明者劉定干 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所