專利名稱：用于鑒定多種微生物的通用檢測系統(tǒng)和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于鑒別微生物的通用檢測系統(tǒng)和方法，此微生物可能屬于多個不同群，例如如下來自不同族群微生物中的任何一種厭氧菌，酵母菌，在合成培養(yǎng)基上不易生長的細菌，腸道菌，葡萄球菌，鏈球菌，和腸道球菌。本發(fā)明的檢測系統(tǒng)包括一套預定的試驗，用于檢測某科或群，屬和/或種微生物特異性酶的存在。
背景技術：
自從微生物學科開始確立以來，發(fā)展細菌分類或鑒別的方法始終是微生物學界一貫的追求目標。早期分類法是基于對微生物的顯微鏡觀察，并繼而描述它們細胞形態(tài)，即球形細胞，桿(棒)狀細胞，球一桿形細胞，出芽酵母，和螺旋形生物(Sphirochytes)，微生物學家還對微生物細胞的排列方式進行描述，作為微生物分類的補充手段，即鏈球菌是顯得象一串珍珠似的成串的球形細胞，葡萄球菌是一串象葡萄似的球形細胞等。爾后，染色技術的發(fā)展增強了顯微鏡的鑒別能力。其中最重要的是革蘭氏染色，它把微生物分為二類革蘭氏陰性微生物被染成粉紅至紅色，革蘭氏陽性微生物被染成淡蘭至蘭色，繼而觀察到，在引起人疾病的微生物中，絕大多數(shù)革蘭氏陰性微生物是桿形的，而絕大多數(shù)革蘭氏陽性微生物是球形的。另一種早期區(qū)分微生物的方法是，確定微生物在存在或不存在氧時的生長能力。存在氧時生長的微生物被稱為需氧微生物，不存在氧時生長的被稱為厭氧微生物。
診斷微生物學中較重要的早期發(fā)現(xiàn)之一是，可以用不同類型的液體或固體細菌生長培養(yǎng)基，使細菌生長在試管或平皿中。此后微生物學家開始將各種不同的化學物質(zhì)加入到生長培養(yǎng)基中，建立了鑒別微生物的另一種方法，例如，生長或生長抑制試驗，如6.5％NaCl抑制鏈球菌生長，但是不抑制腸道球菌生長，或者生化試驗，例如腸道菌可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生酸性最終產(chǎn)物，而非發(fā)酵菌不能。
將所有上述的形態(tài)學，生長/抑制，以及生化試驗結合起來，形成一套微生物學家可用于鑒定細菌的測定法，導致構成了可將細菌分類為用于對所有生物進行分類的傳統(tǒng)的科、屬、種分類學單位。歷史上微生物學家的探索建立了多種僅適用于一群或一科微生物的分類測定法，例如鑒別綠毛鏈球菌的Facklam氏法(參考文獻3)，鑒別凝固酶陰性鏈球菌的Kloos and Schleifer氏法(參考文獻2)，鑒別革蘭氏陰性腸道菌的Edwards和Ewing法(參考文獻1)，等等。這些方法的每一種，使用特定設計針對該方法選定微生物種類代謝和生長特點的試驗組合。因此，對鏈球菌的葡萄糖發(fā)酵試驗，不同于對葡萄球菌和對腸道菌的葡萄糖發(fā)酵試驗。實際上，配制細菌培養(yǎng)基的廠商是以商業(yè)為基礎提供上述種類特異性的配方。Remel(12076 Santa Fe Drive Lenexa,Kansas 66215-3594)目錄號103(1994年1月)為微生物學家提供了廣泛多種常規(guī)的生化測試管配方，用于完成上述參照性鑒定方案。Remel商品目錄專門提供了8種不同配方的培養(yǎng)基，用于檢測7個不同族微生物的糖類發(fā)酵，它們包括如下紫色液體培養(yǎng)基(PurpleBroth)，用于檢測腸道菌(見P40-41)，酚紅液體培養(yǎng)基，用于檢測鏈球菌(見P38-39)P.R.A.S.培養(yǎng)基和CHO培養(yǎng)基，用于檢測厭氧菌(見P29-30，和40),CTA培養(yǎng)基和心肌浸汁液體培養(yǎng)基，用于檢測在合成培養(yǎng)基上不生長的微生物(見P30-31，和33)。OF培養(yǎng)基，用于檢測非發(fā)酵性革蘭氏陰性桿菌和腸道菌(見P37-38)，以及酵母菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基，用于檢測酵母菌(見P47-48)。
參考文獻1.Ewing,W.H.1986，“腸道菌的Edwards和Ewing氏鑒定法，第4版，Elsevier Science Publishing Co.New york。
2.Kloose,W.E.and.K.H.schleifer,1975，“人葡萄球菌種屬常規(guī)鑒定的簡化方案”J.Clin.Microbiol.1:82-88。
3.Facklam,R.R.and J.A.Washington Ⅱ,1991，“鏈球菌及相關的過氧化氫酶陰性的革蘭氏陽性球菌”，P238-257，見A.Barlows,W.J.Hausler,Jr.K.L.Herrmann,H.D.Isenberg,and H.J.
Shadome(ed)，臨床微生物學手冊，第5版，American Society fbrMicrobiology,Washington DC。
從二十世紀60年代后期開始，隨著Roche Diagnostic(1447 YorkCourt,Burlington,NC 27215)引入腸道菌鑒定系統(tǒng)(EnterotubeIdentification system)用于腸道菌，緊接著API(595 Anglum Drive,HazelWood,MO 63042-2395)推出了20E腸道菌鑒定系統(tǒng)(20EEnteric Identification System)，檢定公司開始采用與此相同的原理，開發(fā)和制造商品細菌鑒定試劑盒。Vitek,MicroScan,IDS(InnovativeDiagnostic Systems,2797 Peterson Place,Norcross,GA 30071)，和API等，都提供了鑒別細菌各族群的族特異性產(chǎn)品(見下面表1)表Ⅰ
探索歷史使微生物學家認識到，對屬于不同細菌族的臨床微生物分離物或菌株的鑒定，需要使用不同設計的常規(guī)生化測試管或不同的商品。所有傳統(tǒng)的生化測定法都依賴于生長培養(yǎng)作為擴增細胞數(shù)量和誘導某些酶的手段。必須針對各個細菌族的生長特征使檢測方案最優(yōu)化，這種要求正是使族特異性測定法(傳統(tǒng)的生化測試管或商品試劑盒)成為歷史熱點的基礎。例如，在上面論述的常規(guī)生化測定法中，存在8種不同的葡萄糖發(fā)酵配方，它們被配制與7個不同族的微生物具有特異性反應活性，因為常規(guī)的生化測定法在很大程度上是生長依賴性的，所以每個葡萄糖發(fā)酵反應，對特定微生物族的生長，以及對該族微生物葡萄糖發(fā)酵的檢測都是最優(yōu)化的。商品生化鑒定系統(tǒng)推進了這種實踐過程，對每個不同族群的微生物存在不同的生化鑒定產(chǎn)品(見上面的表格)。開發(fā)群特異性產(chǎn)品種類，既是需要發(fā)展各種配方，以便支持族群特異性生長特征的反映，也是優(yōu)化底物對各族群微生物代謝的反應性需要的反映。在各檢定公司開始利用生色反應，發(fā)熒光反應，或者利用比色或熒光測定的快速常規(guī)測定法，發(fā)展快速鑒定檢測時，仍繼續(xù)采用了族特異性的格式，雖然對生長的依賴性大大減少了。這些新型的快速鑒定系統(tǒng)確切說是與生長無關的，而不是生長依賴性的。與用于基于生長的系統(tǒng)相比較，它們是測定存在于更濃的細菌懸液中預先形成的酶。
因此，理想的是有一個通用的檢測系統(tǒng)，可用于分類和/或鑒定屬于完全不同的多群微生物中任何一種微生物，例如通過使用一套生化試驗，避免使用多套試驗或商品檢測試劑盒，其中每套試驗或每種組合是針對特定的微生物族群所特制的。
發(fā)明概述本發(fā)明首創(chuàng)用一套各具有單獨通用配方的生化試驗，能夠鑒定屬于完全不同微生物群的任何一種微生物。這種“通用的”形式包括幾個通用的生化鑒定系統(tǒng)，它在短至15分鐘的孵育時間內(nèi)，或者在8小時內(nèi)(一個單獨的工作班次)產(chǎn)生鑒定結果。這些測定法性質(zhì)上可能是生色反應/比色測定法，或者是熒光發(fā)生/熒光測定法，并且可能是肉眼可視的，或者是自動化測定的。用于分類和鑒定微生物的數(shù)據(jù)庫(機率模型)包括，或者是含有所有待檢定族各成員的單一數(shù)據(jù)庫，或者是一系列對每一族微生物特異性的次級數(shù)據(jù)庫。這種機率模型在下文有時指的是一個預定的標準。對使用者本系統(tǒng)的一個優(yōu)點是，對于大多數(shù)他們需要鑒定的微生物，他們只需要學會如何使用單獨一種測定方法。其次，對于大多數(shù)他們需要鑒定的微生物，使用者只需要編制調(diào)整一個檢定試驗，而不需要管理多成分的程序。
本發(fā)明涉及一套(通用的)生化測定法，即檢測系統(tǒng)，可用于鑒定屬于多個完全不同微生物群的任何一種微生物。要在這些明顯差異的群中對其中一種特定微生物進行分類，主要是根據(jù)那些特定的微生物對生長的要求。例如，葡萄球菌，鏈球菌和腸道球菌具有同腸道菌和非發(fā)酵菌類似的生長要求。在過去，是通過在特別適合于各族群微生物的已知生化配方中(例如，對酵母菌，厭氧菌，或在合成培養(yǎng)基中不易生長細菌的特異性生長的培養(yǎng)基)觀察其生長情況，來檢測不同群的微生物。完全不同族群微生物的例子包括(ⅰ)酵母菌和厭氧菌，(ⅱ)酵母菌和葡萄球菌，鏈球菌和/或腸道球菌，(ⅲ)酵母菌和腸道菌，(ⅳ)酵母菌，厭氧菌，和在合成培養(yǎng)基中不易生長的細菌，(ⅴ)在合成培養(yǎng)基中不易生長的細菌和酵母菌，以及(ⅵ)厭氧菌和在合成培養(yǎng)基中不易生長的細菌。非特異性族群微生物的例子包括例如，(ⅰ)腸道菌和非發(fā)酵菌，(ⅱ)葡萄球菌，鏈球菌，和腸道球菌，以及(ⅲ)奈瑟氏菌屬和嗜血桿菌屬。
屬于這些完全不同群的各類微生物例子可在下面表Ⅱ至表Ⅴ中看到。微生物的這些群在經(jīng)常補充和刪除，并且以一種替換另一種，或者被給予新的名稱。本發(fā)明的檢測系統(tǒng)適用于所有這些群。
表ⅡHNID菌群
表Ⅲ酵母菌群
表Ⅳ革蘭氏陽性群
表Ⅴ厭氧菌群
本發(fā)明的方法包括使樣品經(jīng)受一套預定的生化試驗，檢測微生物代謝途徑中是否存在某微生物科、屬和/或種特有的至少一種酶和/或幾組酶，以便對此微生物進行鑒定。一套試驗在下文有時被稱為試驗組合或檢測系統(tǒng)。在此使用的樣品包括來自生長在選擇性或非選擇性培養(yǎng)基上菌落的微生物懸液，最優(yōu)選的是基本純培養(yǎng)物的懸液。
本發(fā)明的檢測系統(tǒng)包括許多實行生化測定的反應小室，其中每個反應小室內(nèi)含有針對至少一種酶的底物，其中的底物如果受酶的作用，將在反應小室內(nèi)形成可檢測的產(chǎn)物，并且，試驗組合中的這些可檢測的產(chǎn)物與樣品中微生物的鑒別相關聯(lián)。
在優(yōu)選的實施方案中，反應小室是分布在一片盒卡內(nèi)，例如微量滴定板，在此被稱為“卡板”?？ò逯蟹磻∈业臄?shù)目可根據(jù)特定的用途改變。反應小室根據(jù)需要可以是開放的或被復蓋的。
這樣，一方面本發(fā)明提供了一個通用的檢測系統(tǒng)，以及使用該系統(tǒng)的方法，形成了一套預定的生化試驗，用于鑒定屬于完全不同的多群微生物的任何一種微生物。優(yōu)選地該微生物可被分類至獨立的屬，更優(yōu)選地可被分類至種。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該通用的檢測系統(tǒng)包括至少一片卡板，其中配置有許多反應小室，例如反應小池，小池中含有至少一種酶的底物和其它測定成分。在一個優(yōu)選的實施方案中，是通過使用單獨一片通用檢測卡板來完成一組預定的生化試驗，此卡板含有最多達到大約60個反應小室，更優(yōu)選地是大約36-48個反應小室。在特別優(yōu)選的實施方案中，反應小池在測定卡板上是排列成直線，以便于采用優(yōu)選的半自動或全自動的采樣、檢測和數(shù)據(jù)處理技術。
一般來說，可通過應用已知的統(tǒng)計學技術，來選擇一套適合用于本發(fā)明通用檢測系統(tǒng)的生化試驗，以便選定一套能夠鑒別所需多種微生物的試驗。然后構建不同的數(shù)據(jù)庫。再用已知的統(tǒng)計學技術評價各套不同的數(shù)據(jù)庫。在下文實施例3中描述了一種這樣的統(tǒng)計學技術。用于鑒別微生物的數(shù)據(jù)庫(機率模型)或預定的標準包括，或者是包含所有待鑒定群各成員的單一數(shù)據(jù)庫，或者是一系列對每一群微生物特異的次級數(shù)據(jù)庫。如前面所術，此系統(tǒng)對使用者的主要優(yōu)點是，對于大多數(shù)他們需要鑒定的微生物，他們只需要學會使用單獨一種測定方法，并且，對于大多數(shù)他們需要鑒定的微生物只需要編制調(diào)整一個檢定試驗，而不需要管理多成分的程序。
在上述實施方案中，單一數(shù)據(jù)庫或一系列次級數(shù)據(jù)庫，即機率模型，是被用作預定的標準，通過將樣品測定系統(tǒng)(卡板)的結果與此標準作比較而對微生物進行鑒定。見實施例3。優(yōu)選地是，該預定的標準是從用分光光度技術或熒光測定技術得到的數(shù)據(jù)而形成的。但是，該預定的標準也可以使用通過目測比色測定得到的數(shù)據(jù)來確定。
用于鑒定微生物各種酶的多種生化試驗都是本領域熟知的。這些測定法的大多數(shù)都適合用于本發(fā)明的通用檢測系統(tǒng)。
本發(fā)明的通用測定系統(tǒng)包括基于熒光的測定法或基于比色的測定法，或者是它們的某種結合形式。例如，在本發(fā)明的通用檢測系統(tǒng)中，對于某些試驗優(yōu)選地是采用基于熒光的測定法，因為它比基于比色的(生色反應的)測定法有較高的靈敏度和速度。但是，對于該通用檢測系統(tǒng)中的其它一些試驗，優(yōu)選地是采用基于比色的測定法，因為它比較方便，例如，對測定結果的可視性判斷。
因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，該通用檢測系統(tǒng)通過使用一套其中大多數(shù)試驗是基于熒光的預定的生化試驗，能夠鑒定多種微生物。在此實施方案中，是通過檢測某種熒光可測定產(chǎn)物的存在，來檢測某一途徑中幾種酶和/或幾組酶的存在。在某些情況下，熒光產(chǎn)物的生成是通過酶與底物反應引起pH改變的結果(熒光測定)。在另一些情況下，熒光產(chǎn)物的生成伴隨著生熒光底物的斷開(例如水解)，形成可檢的衍生物熒光團，通常表現(xiàn)出熒光增強(熒光生成測定)。還有另一些情況是，生成猝滅熒光指示劑的生色產(chǎn)物。
為了鑒定樣品中的微生物，從一套預定的試驗中得到的結果，將經(jīng)受多種統(tǒng)計學方法檢驗，即同至少一種預定的標準相比較。見實施例3。
在一個優(yōu)選的實施方案中，可檢測的熒光產(chǎn)物是在預定的一套試驗中的一個或幾個試驗中形成，通過斷開至少一個熒光底物(例如通過水解)生成衍生的熒光團，隨之增強熒光。在本通用檢測系統(tǒng)的一個特別優(yōu)選的實施方案中，酯酶、肽酶和糖苷酶試驗都優(yōu)選地以熒光生成方式進行。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，一個或幾個生化試驗中的可檢測性熒光產(chǎn)物，是在酶反應存在下，由熒光指示劑形成。一般是，該熒光指示劑是能夠顯示熒光改變的pH反應性化合物。特別是，在發(fā)生pH增加(堿性化)或pH降低(酸性化)時，該熒光指示劑顯示出熒光增強。在本通用檢測系統(tǒng)的一個特別優(yōu)選的實施方案中，糖發(fā)酵酶、脲酶、脫羧酶和碳素利用酶試驗都是以熒光測定方式進行。
本發(fā)明還首先以熒光測定方式提供了碳素利用酶試驗。在此實施方案中，這種酶試驗包括針對碳素利用酶的至少一個底物，以及至少一個熒光指示劑。碳素利用酶，如果存在的話，作用于底物，引起pH改變，導致從熒光指示劑形成熒光產(chǎn)物。
在某些實施方案中，本發(fā)明的通用檢測系統(tǒng)包括至少一種基于比色測定的生化試驗。比色測定可以是熒光檢測試驗的補充或替代方式。在某些情況下，生色產(chǎn)物的形成是酶與底物反應而引起pH改變的結果(比色測定法)。比色測定指示劑一般是能顯示顏色改變的pH反應性化合物。特殊情況下，生色指示劑是在pH增加(堿性化)或降低(酸性化)時發(fā)生顏色改變。在另一些情況下，生色產(chǎn)物的形成是伴隨著生色底物的斷開(例如通過水解)，生成可檢測的衍生物生色團。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，該通用的測定系統(tǒng)包括用于檢測肽酶和糖苷酶每一種的至少一種試驗。在其它一些優(yōu)選實施方案中，該檢測系統(tǒng)還進一步包括糖發(fā)酵酶試驗。在另一些優(yōu)選的實施方案中，此測定系統(tǒng)還進一步包括用于檢測脲酶、脫羧酶、酯酶、色氨酸酶(吲哚測定)或碳素利用酶的至少一種試驗。在卡板式檢測實施方案中，通用測定卡板上預定數(shù)量的小池中，配備有測定每種酶的至少一種底物，以及測定所必須的其它成分。使用時，將樣品加到每個小孔中，如果樣品中存在某種酶或某組酶，就作用于此底物，生成可檢測性產(chǎn)物。如果每種試驗中存在某種酶或某組酶，可通過鑒別每個孔中可檢測性產(chǎn)物來測定，其中來自幾種試驗組合的可檢測性產(chǎn)物，通過同預定的標準相比較，與樣品中某種微生物的存在相關聯(lián)。
在其它的優(yōu)選實施方案中，補充試驗包括磷酸酶試驗。對于補充的酶試驗，可以按需要以生色測定或熒光發(fā)生方式進行。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，這種通用的測定卡板中包含一套預定的生化試驗，其中包括對肽酶、糖苷酶、糖發(fā)酵酶、酯酶和碳素利用酶每一種的熒光測定法，以及對脲酶，磷酸酶、色氨酸酶和脫羧酶的至少一種比色測定法。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，該通用檢測系統(tǒng)包括一套在大約10分鐘至8小時內(nèi)，優(yōu)選地在大約10分鐘至2.5小時內(nèi)完成的預定的生化試驗。雖然按照現(xiàn)有的方法，絕大多數(shù)生化試驗可以在大約2小時內(nèi)完成，但是，在某些情況下，理想的是延長測定時間至大于3小時，達到約8小時。例如，在某些情況下，測定時間大于2小時是用于增強對表現(xiàn)緩慢催化速率的低水平酶的檢測。在另一些情況下，測定時間小于2小時是用于檢測含量豐富的酶或高催化速率的酶。
還有另一方面是，本發(fā)明提供了用于快速檢測或鑒定樣品中各種酵母菌的基于熒光的測定法，例如引起疾病的酵母菌(如念珠菌)。
還有另一方面是，本發(fā)明提供了基于熒光的碳素利用酶試驗。發(fā)明詳述本發(fā)明的通用測定系統(tǒng)被設置成為具有預定數(shù)目反應小室或池的簡便的卡板。將用這樣一種結構形式來說明本發(fā)明的檢測系統(tǒng)。這不意味著對本通用檢測系統(tǒng)的限制，因為，還可以將它設置成為符合預定用途的很多種適合的形式。
本發(fā)明的檢測系統(tǒng)能夠鑒定樣品中屬于多個完全不同群微生物的任何一種微生物。在一個優(yōu)選的實施方案中，該檢測系統(tǒng)包括一套預定的非重復性生化試驗，它們被配置在預定數(shù)目的反應小室內(nèi)，其中每一個生化試驗包括一個針對一種酶或一組酶的底物，進而如果其中的底物受這種酶或這組酶的作用，將導致在反應小室內(nèi)形成可檢測的產(chǎn)物；并且其中來自各試驗組合的可檢測性產(chǎn)物被用于鑒定樣品中的微生物。
關于本發(fā)明的通用檢測系統(tǒng)在此所用的名詞“非重復性”，意指該預定的一套生化試驗，如本領域所知，對于各族和/或群并不是基于族特異性或群特異性的配方。相反地，本發(fā)明的各生化試驗是族和群無關的。優(yōu)選的是，在一塊卡板中對一種底物的使用不多于1次。但是，在某些情況下，可能需要對同一底物使用幾次，不過是在例如不同的緩沖系統(tǒng)中。
如下發(fā)現(xiàn)是一次巨大進步，形成了本發(fā)明的檢測系統(tǒng)和方法鑒定例如臨床樣品中的微生物不需要群特異性配方，此樣品中可能含有來自多個完全不同群的任何一種微生物。
在此所指的形成可檢測性產(chǎn)物，優(yōu)選地包括在反應小室內(nèi)形成熒光產(chǎn)物或生色產(chǎn)物，或者發(fā)生顏色或熒光改變。其它一些可檢測性產(chǎn)物，例如通過放射性或發(fā)光改變進行檢測的產(chǎn)物，也可用于本發(fā)明的實際測定中。
配置在本發(fā)明通用檢測卡板上試驗的數(shù)目，足以鑒定樣品中屬于多個完全不同群的任何一種微生物。例如，如果需要構成一種能夠鑒定如下群中任何一種微生物的通用檢測卡板腸道菌，非發(fā)酵菌，厭氧菌、和在合成培養(yǎng)基上不能生長的菌，適當?shù)脑囼灲M合可容易地通過例如在實施例3中簡述的如下程序來確定。這種試驗選擇程序是累接性的，即對一組試驗進行選擇，試運行，然后進行實測。如果這給試驗不能通過實測。那么可對它進行修改，例如，可選擇不同的底物濃度，也可增加或刪除某個試驗，等等，再次試運行和再次實測，依此類推。為了鑒定至種的水平而不是屬的水平，一般需要較多的試驗數(shù)目。對于某一特定用途的最少和/或最佳試驗數(shù)目，可容易地根據(jù)本文的教導運用已知的統(tǒng)計學技術來確定。這種技術的一個實例可在下面實施例3中見到。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的檢測系統(tǒng)包括用于檢測肽酶，糖苷酶，糖發(fā)酵酶，脲酶，脫羧酶，酯酶，碳素利用酶，磷酸酶，或色氨酸酶的至少一種試驗。在其它優(yōu)選實施方案中，此測定系統(tǒng)包括用于檢測至少一種肽酶和至少一種糖苷酶的試驗。
此測定系統(tǒng)還可以進一步包括用于檢測至少一種糖發(fā)酵酶，至少一種脲酶，至少一種脫羧酶的試驗，用于檢測至少一種酯酶和至少一種碳素同化酶的試驗，以及它們的各種組合形式。在本發(fā)明的其它優(yōu)選測定系統(tǒng)中，該預定組合的非重復性生化試驗，能夠鑒定在如下菌的至少二種中的微生物腸道菌，非發(fā)酵菌，厭氧菌，酵母菌，葡萄球菌，鏈球菌，腸球菌，和合成培養(yǎng)基中不生長的菌。另一個優(yōu)選的測定系統(tǒng)能夠鑒定在如下菌的至少一種中的微生物葡萄球菌，鏈球菌，腸球菌，棒狀桿菌，乳酸桿菌，片球菌；明串珠菌，差異球菌，漫游球菌，克呂沃爾氏菌，勒米諾氏菌，嗜血桿菌，奈瑟氏菌，摩拉氏菌，沙門氏菌，梭狀芽孢桿菌和利斯特氏菌。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的測定系統(tǒng)中，該預定組合的非重復性生化試驗，能夠鑒定在厭氧菌，酵母菌或合成培養(yǎng)基內(nèi)不生長菌中至少一種的微生物，屬于厭氧菌和酵母菌或合成培養(yǎng)基內(nèi)不生長菌的微生物，或者屬于酵母菌和合成培養(yǎng)基內(nèi)不生長菌的微生物。
在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的測定系統(tǒng)能夠鑒定屬于葡萄球菌，鏈球菌，或腸球菌中至少一種和厭氧菌，酵母菌，腸道菌，非發(fā)酵菌或合成培養(yǎng)基內(nèi)不能生長菌中至少一種，或者它們的組合中的微生物；屬于葡萄球菌，鏈球菌，和腸球菌的微生物，屬于酵母菌，厭氧菌，和合成培養(yǎng)基內(nèi)不能生長菌的微生物；或者屬于腸球菌，葡萄球菌，鏈球菌，厭氧菌，酵母菌和合成培養(yǎng)基內(nèi)不能生長菌的微生物。
本發(fā)明通過應用一個檢測系統(tǒng)，鑒定樣品中可能存在的至少二個完全不同群微生物的方法包括如下步驟a)將樣品加到含有底物的各反應小室中；b)如果存在酶，使其與該底物發(fā)生反應；c)通過檢測某一試驗中可檢測的產(chǎn)物來確定樣品中此種酶的存在，和d)將預定試驗組合的結果同至少一個預定的標準比較，以便鑒定樣品中的微生物。
本發(fā)明還提供了檢測微生物碳源利用的試驗，其中該試驗包括至少一種碳源和至少一種熒光指示劑，微生物作用于碳源，引起pH改變，pH改變則導致指示劑的熒光改變，這種熒光改變指示該微生物對碳源的利用。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，該通用的檢測卡板能夠?qū)?ⅰ)腸桿菌科，葡萄球菌科，腸球菌科和鏈球菌科，以及(ⅱ)厭氧菌群，酵母菌群和合成培養(yǎng)基內(nèi)不生長的菌群中的任何一種，鑒定到所需要的水平，例如屬和/或種。
反應小室的容積一般是根據(jù)方便和經(jīng)濟-有效的原則進行選擇。
用于制造這種卡板的適合材料應該是基本上與酶測定成分無反應性的，包括各種塑料如聚苯乙烯，PVC及其它。
在一個實施方案中，本發(fā)明的通用檢測卡板可用于鑒定多群微生物中的任何一種微生物。微生物可被鑒定至獨立的屬和/或種，優(yōu)選地是鑒定至種的水平。
本發(fā)明的通用檢測卡板可被配置用于鑒定細菌和酵母菌，例如，完全不同群的細菌如腸道菌和非發(fā)酵菌；厭氧菌；葡萄球菌，鏈球菌和腸球菌；以及合成培養(yǎng)基內(nèi)不生長的菌。
在一個實施方案中，該通用檢測卡板包含帶有不同生化試驗的多個反應小池。但是，在另一個實施例中，該通用檢測卡板包括至少一個特定的生化試驗，其中該試驗是在含有相同的底物，但含有不同緩沖液的不同反應池內(nèi)進行，不同的緩沖液包括如TRIS、HEPES,MOPS,PIPES，組氨酸緩沖液，磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，乙酸鹽緩沖液，或碳酸鹽緩沖液。例如，本發(fā)明通用檢測卡板的一個實施方案，包括在一個反應池內(nèi)使同在Tris中的底物(即甘氨酰-甘氨酸7-AMC)，以及在另一個反應池內(nèi)使用在Hepes中的底物的肽酶試驗。
該通用檢測卡板各反應池內(nèi)的pH，一般是大約5-9。例如，肽酶和糖苷酶試驗典型地是分別在大約pH7-9和pH7-8下進行，糖發(fā)酵酶試驗在大約pH7-8下進行，而碳素利用酶試驗典型地在大約pH5.0-6.0下進行。
在另一些情況下，該通用檢測卡板包括至少一個在含有酶底物異構體的不同反應池內(nèi)進行的生化試驗。在此實施方案中，這種異構體可以是例如對映體，非對映體，或順-反非對映體。另一方面，該底物還可以是異構體的混合物。例如，半乳糖的α-和β-異構體是用于糖發(fā)酵酶試驗的適合異構體。參見上面表Ⅵ。
用于該通用檢測卡板上的待測樣品是從基本上是微生物純分離物得到的微生物懸液。
這種基本純的分離物可通過幾種熟知的方法得到。例如，在一種方法中，是用能夠支持所需微生物群生長的液體、固體或半固體培養(yǎng)基預培養(yǎng)樣品。更具體地說，可將樣品在選擇性固體或半固體培養(yǎng)基上預培養(yǎng)，以便得到從其中可獲得基本是微生物純分離物的菌落。如果需要，此基本純的分離物可被進一步選擇，以便增加所需微生物的數(shù)量。在此二種情況下，該分離物都是懸浮于表面活性劑溶液中，以便形成適合用于該通用檢測卡板的懸液。典型的情況是，這種懸液具有大約0.1-5McFarland單位的密度，優(yōu)選地是大約0.5McFarland單位。在某些情況下，為了更快地以通用檢測卡板得到結果，在此范圍內(nèi)較高的懸液密度是優(yōu)選的。對微生物樣品進行預培養(yǎng)的方法是熟知的。
在為本發(fā)明的通用檢測系統(tǒng)選擇測定法時，可選擇一組測定，配置在適當?shù)目ò迳?，并如下面所述進行測定，以便獲得一個預定的標準(機率模型)，用于鑒定屬于完全不同群微生物的任何一種微生物。
如上面所述，很多種熒光測定法(例如熒光發(fā)生測定，熒光檢測)比色測定法和熒光猝滅測定法，可用于本發(fā)明的通用檢測系統(tǒng)。
此外，多種底物都適合用于其中各種測定法。例如，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，熒光發(fā)生和/或熒光檢測測定法被選擇用于此通用檢測系統(tǒng)。在這些實施方案中，熒光發(fā)生測定法包括至少一種生熒光底物，優(yōu)選地是如下一種生熒光底物，它被酶催化斷開，形成可檢測的熒光產(chǎn)物。在特別優(yōu)選的實施方案中，生熒光底物典型地是由共軛結合于熒光團的底物組成。熒光檢測測定包括至少一種底物，優(yōu)選地是如下一種底物，它與樣品中至少一種酶發(fā)生反應，導致可由熒光指示劑檢測的pH改變。已經(jīng)公開了很多種適合的熒光團和熒光指示劑。參見例如下面的表Ⅶ、以及Hangland.R.P.熒光探針和探測性化學制劑手冊，第6版(1996),Molecular Probes,Inc；Bascomb.S.(1987)Methods in Microbiol,19,106,Mahafi,M.et al.(1991)Microbiological Rev.335。
用于本發(fā)明通用檢測系統(tǒng)的示范性底物被列入下面的表Ⅵ中。底物1-25是用于肽酶試驗的生熒光底物。底物26-34是用于糖苷酶試驗的生熒光底物。底物35，和37-54是使用4-甲基傘形酮熒光測定指示劑進行糖發(fā)酵試驗的底物。底物55-60是碳模擬底物。底物61-62,64-65,73-78,88-89，和92是用于糖發(fā)酵試驗的底物。底物63是用于脲酶試驗的底物。底物66-70,79-80和90-91是用于糖苷酶試驗的底物。底物71,81-83，和93-95是用于肽酶試驗的底物。底物72和84是用于磷酸酶試驗的底物。底物85-87是用于脫羧酶試驗的底物。底物96是用于吲哚試驗的底物。
表Ⅵ
表Ⅵ(續(xù))
用于本發(fā)明實際應用中肽酶試驗的示范性生熒光底物包括，氨基酸，肽，或共軛結合于熒光團的多肽。適合熒光團的例子顯示在下面表Ⅵ中，并特別包括β-萘胺和7-氨甲基香豆素(7-AMC)。用于脂酶試驗特別優(yōu)選的熒光團是7-AMC。制備和使用生熒光底物的方法對本領域是已知的(參見例如英國專利1,547,747和歐洲專利0,000,063)。
表Ⅶ
適合用于肽酶試驗的肽和多肽是長度大約2-20個氨基酸的肽，以單鏈，分支鏈或環(huán)狀排列。適合的氨基酸包括20種常見的氨基酸丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，賴氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，色氨酸，和酪氨酸。其它適合的氨基酸包括稀有的或非蛋白質(zhì)氨基酸，如那些在纖維狀蛋白和某些真菌及植物毒素中發(fā)現(xiàn)的氨基酸，如4-羥基脯氨酸，5-羥基賴氨酸，ε-N-甲基賴氨酸，3-甲基組氨酸，鎖鏈賴氨素，異鎖鏈賴氨素，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，高半胱氨酸，高絲氨酸，刀豆氨酸，黎豆氨酸，和β-氰丙氨酸。這些氨基酸胺需要時可以是D或L構型。用于肽酶試驗的示例性底物被列舉在上面的表Ⅵ中。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的通用檢測卡板包括至少一個優(yōu)選地以熒光發(fā)生方式進行的糖苷酶試驗。在此實施方案中，該糖苷酶試驗包括至少一種生熒光底物，優(yōu)選地是如下一種生熒光底物，它在樣品中存在糖苷酶時被斷開。適合用于此糖苷酶試驗的生熒光底物包括碳水化合物，一般是糖，與適當熒光團的共軛結合物。適當熒光團的例子在上面的表Ⅶ中已有描述。特別優(yōu)選的熒光團是4-MeU。適合用于此糖苷酶試驗的糖包含大約3-8個碳原子(例如四糖，戊糖，己糖或庚糖)，以及含有大約2-10個共價連接的糖單位，分子量約350-4000道爾頓的糖和二糖。用于此糖苷酶試驗的例證性生熒光底物列舉在上面的表Ⅵ中。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的通用檢測卡板包括至少一個以熒光檢測方式進行的糖發(fā)酵酶試驗。在此實施方案中，該糖發(fā)酵試驗包括至少一種如那些在上述糖苷酶試驗中所述的糖或糖類；以及至少一種熒光測定指示劑。適合的熒光測定底物的例子顯示在上面表Ⅶ中，還包括4-MeU。優(yōu)選地是，該熒光測定指示劑能夠在大約6-8的pH范圍內(nèi)發(fā)熒光。特別優(yōu)選的熒光測定指示劑是4-MeU。用于此試驗的輔助底物包括多糖如具有分子量約104-106的淀粉和糖原。用于此糖發(fā)酵酶試驗的例證性底物列舉在上面的表Ⅵ中。
在另一個實施方案中，該通用檢測卡板包括至少一個以熒光檢測方式進行的碳素利用試驗。在此實施方案中，該碳素利用試驗包括至少一種碳源，優(yōu)選地是一種碳源以及至少一種適合的熒光測定指示劑，優(yōu)選地是一種熒光測定指示劑。適用的熒光測定指示劑列舉在上面的表Ⅶ中，并包括4-MeU及其它一些化合物。特別優(yōu)選的熒光測定指示劑是β-甲基七葉亭，能夠在大約5-7的pH范圍內(nèi)發(fā)熒光。
適合用于該碳素利用試驗的碳源包括，烯烴，炔烴，醇，醚，酯，腈，硫化物，砜，硫醇，酮，亞砜，醛，酰胺，胺，羧酸，或苯甲酸。這種碳源一般含有大約2-10個碳原子，以直鏈，分支鏈或環(huán)狀的方式排列，分子量大約為40-500。優(yōu)選的碳源是能在水溶液(例如生理鹽水和包括Tris或Hepes的緩沖液)中混溶的，并且是不揮發(fā)性的。上面表Ⅵ提供了適合碳源的例子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該檢測系統(tǒng)的底物包括，賴氨酸(AMC)，亮氨酸(AMC)，甲硫氨酸(AMC)，甘氨酰-脯氨酸(AMC)，異亮氨酸(AMC)，海藻糖，麥芽糖，L-色氨酸(7-AMC),4-MeU-磷酸鹽，β-D-木糖苷-4MeU，羥基-脯氨基-AMC,β-D-葡糖苷酸-4MeU，酪氨酸(AMC),4-MeU-β-D-半乳糖苷，甘露糖，蔗糖，和脯氨酸(AMC)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，其底物還進一步包括果糖，甘油，L-組氨酸7-AMC，焦谷氨酸(AMC)和4-MeU-β-D-糖苷。在再一個優(yōu)選的實施方案中，其底物還包括L-絲氨酸7-AMC，纖維二糖，精氨酸(AMC)，和4-MeU-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷。
上述熒光檢測試驗形成可借助于常規(guī)的非破壞性熒光儀測定法或熒光鏡法檢測的產(chǎn)物，因而可以對試驗中的熒光產(chǎn)物進行定量。例如，特別優(yōu)選的自動化熒光儀是MicroScan Walkaway系統(tǒng)，可從DadeMicroScan Inc.購得。但是，本發(fā)明的通用檢測系統(tǒng)還可以采用其它可購得的儀器。
在本發(fā)明的一個實施方案中，該通用檢測卡板包括至少一種以比色(生色)方式進行的試驗。例如，在此公開的肽酶試驗，糖苷酶試驗，糖發(fā)酵酶試驗或碳素利用酶試驗，可以按比色(生色)方式進行。已知多種比色測定法可用于檢測肽酶如焦谷氨?；被拿福籐-丙氨酸氨基肽酶，芳基肽酶，芳基酰胺酶，和糖苷酶如β-D-葡糖苷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，6-磷酸-β-D-半乳糖苷6-磷酸半乳糖水解酶，α-D-半乳糖苷酶，β-D-葡糖苷酶，神經(jīng)氨酸苷酶，α-淀粉酶，α-葡糖苷酶和N-乙酰基-(3-D-氨基葡糖苷酶，N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶，α-D-阿拉伯糖苷酶，β-D-巖藻糖苷酶和β-D-木糖苷酶。進而，用于檢測糖發(fā)酵酶的比色測定法也是周知的，并且可被用于本發(fā)明的檢測系統(tǒng)，適合用于本通用檢測卡板的輔助比色測定法包括已知用于檢測如下酶的試驗，例如脲酶，氧化酶，還原酶，水解酶，氫化酶，酯酶，磷酸酶，色氨酸酶，蛋白酶如胰凝乳蛋白酶，脫羧酶如鳥氨酸和賴氨酸脫羧酶，以及能夠同化檸檬酸循環(huán)中間產(chǎn)物的酶。如上所述，這些測定法可被用于本發(fā)明的通用檢測系統(tǒng)，并且可用機率分析法進行測定。
適合用于本方法的比色試驗可以按各種檢測方式來進行。例如，在某些情況下，含有生色團的底物以直接檢測的方式被使用。在這種情況下，生色底物可以包括例如，鄰-硝基酚，間-硝基酚或?qū)?硝基酚的酯，吲哚酚或5-溴-4-氯-3-吲哚酚的酯或?qū)ο趸桨返姆蓟难苌?。在比色測定中直接檢測生色團的釋放。但是，在另一些情況下，要求借助于適當?shù)脑噭?，以間接檢測的方式進行比色測定。這種測定法的例子包括無機的酶反應產(chǎn)物(例如硝酸鹽)與無機酸如對氨基苯磺酸和α-萘胺的化學反應。在另一種情況下，要求用pH反應性指示劑分子檢測此試驗中pH改變的間接方式進行比色測定。這類分子的例子包括溴百里酚蘭和酚紅。其它一些適合的比色測定例如肽酶生色試驗，用對-二甲基氨基肉桂醛檢測從包括β-萘酰胺的生色底物中β-萘胺的釋放。在再一種情況下，適合的比色測定可以包括對-硝基苯胺衍生物與重氮化合物的反應，用于提高檢測靈敏度。
特別是，公開了幾種比色測定法，用于檢測和鑒定酵母菌和類酵母菌微生物如Protheca以及奈瑟氏菌屬，嗜血桿菌，粘膜炎布蘭漢氏菌，和陰道加德納爾氏菌。
下面的表Ⅷ提供了適用于比色測定的生色團的例子。
表Ⅷ
>
因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，其通用檢測卡板包括這樣一些生化試驗；其中這些試驗又進一步包括至少一種用于檢測肽酶，糖苷酶，糖發(fā)酵和碳素利用試驗的測定，優(yōu)選地是以熒光方式測定；并且還包括至少一種用于檢測脲酶，脫羧酶(優(yōu)選地是鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶)，酯酶和色氨酸酶的比色測定法。這些測定法還可以以各種方式組合，這取決于對該檢測系統(tǒng)所計劃的用途。
本發(fā)明的一個優(yōu)選的檢測系統(tǒng)包括用于檢測至少一種肽酶和至少一種糖苷酶的試驗。另一個優(yōu)選的檢測系統(tǒng)進一步包括用于檢測至少一種糖發(fā)酵酶的試驗。再一個優(yōu)選的檢測系統(tǒng)另外還包括用于檢測脲酶，脫羧酶，酯酶或碳素利用酶，或者其組合的至少一種測定法。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其通用檢測卡板包括這樣一些生化試驗，其中這些試驗包括至少一種用于檢測如下酶的測定過氧化氫酶，脫羧酶如谷氨酸或精氨酸脫羧酶，氨基酸脫酰胺酶如精氨酸脫酰胺酶，脂肪酶，焦磷酸-二酯酶，DNA酶，氧化酶，芳基硫酸酯酶，或3-羥基丁酮/聯(lián)乙酰生成酶。在此實施方案中，按需要以比色方式或熒光檢測方式進行測定。
在此所用的名詞“預定的”用以表示根據(jù)已知的統(tǒng)計學技術如DFA或線性回歸技術，某生化測定法已被選擇。在實施例3中提供了一個優(yōu)選的統(tǒng)計學技術實例。因此，在此使用的“一套預定的生化測定或預定的生化測定組合”，是已通過用適當?shù)慕y(tǒng)計學技術選擇的一組生化測定。
下面的非限制性實施例是對本發(fā)明的說明。
實施例1-通用檢測系統(tǒng)用于本發(fā)明的底物可用各種方式配制。一般是設計將底物配方用于方便的緩中液中，例如pH范圍在5-9的TRIS或HEPES緩沖液。選擇底物和緩沖系統(tǒng)的特定量或濃度，使特定生化測定的Vmax最佳化。
更具體地說，肽酶試驗底物被選擇使其具有大約0.01-1.0mM的最終濃度。在適當?shù)木彌_劑如Tris中(例如Tris磷酸鹽)，濃度為大約0.1-1.0M。對于肽酶試驗，優(yōu)選的pH范圍是約7.5-8.5。將底物按需要溶解于允許的溶液中，如水，緩沖液，或二甲基亞砜(DMSO)?？梢灶愃频姆绞皆O計糖苷酶試驗的底物配方，不同的是該底物的濃度一般是0.1-3.0mM,pH約為7-8。對于碳素利用試驗和脫羧酶試驗，在脫羧酶緩沖液內(nèi)進行此試驗是優(yōu)選的，雖然如果需要也可以使用其它緩沖液如Tris或Hepes緩沖液。脫羧酶緩沖液是通過組合如下成分來配制酵母浸出物(約0.1-1.0％(w/v))，蛋白胨(約0.1-1.0％(w/v)),吡哆醛-5-PO4(約0.01-0.1mM),10％(w/v)甘油儲存液(約0.5-2％(w/v)),0.02M 4-β-甲基七葉亭(約0.1-1mM),Phallic酸(約1.0-10.0mM),pH5-6，氨基酸或碳源約占0.5-5％(w/v)。
糖(產(chǎn)酸)試驗典型地是在Hepes緩沖液或其它適合的緩沖液(約0.5-2.5mM)中進行，pH在約7-8。該試驗的其它成分包括4-MeU(約0.01-0.25mM)，蛋白胨(約0.01-0.5％(w/v))，糖(約0.05-2％(w/v))，在大約1升去離子蒸餾水中。
表Ⅵ列出了用于本通用檢測系統(tǒng)的示范性底物。下面的部分(A-D)將描述本發(fā)明特別優(yōu)選的底物的配制。
在一個實施方案中，底物是配置在檢測卡板中，如帶有小池(反應小室)的微量滴定板，小池以例如線狀排列。每個反應小室約0.3ml。
每種底物用于一個以熒光或比色方式進行的生化測定。按照標準的統(tǒng)計學技術將每個試驗的結果編碼，并與數(shù)據(jù)庫進行比較，以便以標準的微生物學培養(yǎng)技術鑒別多群微生物。所使用的數(shù)據(jù)庫通常是機率模型，它被構形成為例如含有將在樣品中被鑒定的所有微生物族或群成員的單一數(shù)據(jù)庫。另一種方式(或者此外還有)是，該數(shù)據(jù)庫是，被構形成為對樣品中特定微生物族群特異的一系列亞數(shù)據(jù)庫的機率模型。用熟知的統(tǒng)計學方法構建于用于本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫(參見例如下面的實施例3)。
一般情況下，用于分配到通用檢測卡板小池中的底物制劑，是按適當?shù)淖詈篌w積配置在檢測卡板的每個小池中，此后，在室溫下使小池中的溶液干燥。通過將試驗配方的各成分稀釋或濃縮，可使分配液的體積按比例減少或增加。在絕大多數(shù)情況下，底物制劑是以過濾除菌，分配之前貯于冰箱內(nèi)。
A-生熒光肽酶試驗制備肽酶Tris緩沖液(pH8.0)。此緩沖液被調(diào)至pH7-9。
對于上述表Ⅱ中的底物1-13，在二甲基亞砜(DMSO)中將下面的底物溶液配制成大約0.1-0.3mM的溶液底物是從Sigma或Biosynth購得。將約5ml每種溶液置于分配管內(nèi)。用肽酶Tris緩沖液將此溶液稀釋至500ml。對于底物95，是通過在5ml DMSO中混合約0.01-0.02g酪氨酸(AMC)來配制TYR濃縮物。對于底物83，是將大約8-10mg脯氨酸(AMC)加到大約5ml DMSO中。將每個分配管加塞，并倒轉幾次，然后進行震蕩。
上面表Ⅵ中底物14-25的配制基本上同底物1-13，不同的是這些底物是以肽酶Hepes緩沖液(pH8.0)稀釋。在緩沖劑成分溶解之后，溶液被校準至pH約7-9。
B-生熒光糖苷酶試驗上面表Ⅵ中的底物26-34是在DMSO中配制成約0.9mM-1.gmM的溶液；這些底物中的每一個都是從Sigma購得。
將5ml每種底物溶液加入到分配管內(nèi)，并隨之加入10ml糖苷酶緩沖液(見下面)。通過將Trizma堿和一代磷酸鉀加到去離子水中配制糖苷酶磷酸鉀緩沖液。將此溶液混勻后，校準至pH約7-7.8。用此緩沖液將約5ml濃縮物稀釋至約500ml。
對于底物70，是通過在大約5ml DMSO內(nèi)加入約0.3-0.5g MeU-β-D-半乳糖苷來配制BGAL濃縮物。再取2-3ml這種溶液，以糖苷酶緩沖液稀釋至最終體積約500ml。對于底物76和77，是通過在約1升水中加入約3-5g甘露糖或蔗糖來配制糖儲備液。
C-熒光測定的糖發(fā)酵酶試驗對于上面表Ⅵ中的底物35，是通過在約40ml去離子水中混合約1-2g對苯二酚葡糖苷(Sigma)來配制2x對苯二酚葡糖苷儲備液(ARB儲備液)。再取約20ml ARB儲備液置于分配管內(nèi)，加入約12.5ml糖緩沖液和2ml 4-MeU儲備液。用高壓滅菌的去離子水將此溶液稀釋至最終體積約500ml。糖緩沖液是通過在1升去離子水中混合一代磷酸鉀，二代磷酸鉀和蛋白胨水來配制。將這些成分混勻后，再調(diào)pH至約7-8。蛋白胨水溶液是通過在約10ml去離子水中混入lg蛋白胨來制備。MeU儲備液是通過在20ml去離子水中混入約0.1g Na+甲基-傘形酮-4來配制。底物36是AMC對照。
對于上面表Ⅵ中的底物37-54，其2x糖儲備液是通過在約40ml去離子蒸餾水中分別混入約1-2g下面的糖類來配制半乳糖醇，赤蘚糖醇，果糖，半乳糖，甘油，菊糖，乳糖，麥芽糖，松三糖，鼠李糖，核糖，海藻糖，松二糖，木糖或腭糖(palatinose)。其中每種糖都是從Sigma購得。
上面表Ⅵ中的底物37，是通過在約400ml去離子水和約2ml 5NNaOH中混入約1-2g半乳糖二酸來配制。對于底物50,2x淀粉(STA)儲備液是通過在約445ml水中，將約0.5-1g淀粉(Baker)與Pluronic P-104(10％溶液)混合而配制的。
上面表Ⅵ中除47和50以外的其余底物，是將每種2x糖儲備液約20ml加入到分配管中，隨后加入約12.5ml糖基礎儲備液，再加入2ml MeU儲備液，并以去離子蒸餾水稀釋至約500ml。對于底物47，是將約400mlMUC儲備液加到分配管中，隨后加入約12.5ml糖緩沖液儲備液和2mlMeU儲備液。再將此溶液用高壓滅菌的去離子蒸餾水稀釋至約500ml。對于底物50，是將約452.5ml STA儲備液加到分配管中，隨后加入約12.5ml糖緩沖液和約2ml MeU儲備液，再用高壓滅菌的去離子蒸餾水將此溶液稀釋至約500ml。
D-熒光測定的碳素利用試驗上面表Ⅵ中的底物55-60是通過形成一個適當?shù)奶荚磧湟簛砼渲?。每種儲備液是通過在約600ml脫羧酶基礎緩沖液中加入約12g如下的碳源來配制乙酰胺，苯甲酸，甲酸，馬來酸，丙酮酸，和丙二酸。各種碳源均購自Sigma。脫羧酶試驗基礎液是通過制備一個儲備液來配制。此儲備液是在約2700ml去離子水中，混合了約9-10g酵母浸出物，約70ml β-甲基七葉亭的2x儲備液，約10-20g蛋白酶蛋白胨-3，約300ml 10％甘油，和約2-4g苯二甲酸(鉀鹽)。2x β-甲基七葉亭儲備液是通過在約400ml 2-甲氧基乙醇和約600ml去離子水中混合約3-4g 4-甲基七葉亭來配制。使這些成分溶解后，校準至pH5-6。對于底物55-60，是將500ml這種適當?shù)娜芤杭拥椒峙涔苤羞M行分配。
E-補充試驗已報導了很多種生化試驗(參見例如，Bascomb,S.同上，和Manafi,et,al，同上)?？山柚谠诖怂龅姆椒ㄟx擇適合用于本發(fā)明的試驗。參見實施例3。在優(yōu)選的實施方案中，補充試驗包括如下幾種ⅰ)脲酶試驗-已報導了多種用于檢測脲酶的方法，包括測定pH改變和NH3的產(chǎn)生。參見例如Godsey et al(1981)J.Clin.Microbiol.13,483，和Bascomb.S.同上。
ⅱ)色氨酸酶試驗(吲哚試驗)-已報導了幾種檢測色氨酸酶的方法，包括比色測定法和基于熒光猝滅的測定法。例如，先前已描述了一個優(yōu)選的色氨酸酶試驗。參見Morris et al，美國專利5,173,434，在此全部引入作為參考。也見Bascomb.S.同上。
ⅲ)酯酶和脫羧酶試驗-酯酶試驗可按幾種方式進行，包括熒光測定法(參見例如，Manafi et al同上)。對用于脫羧酶檢測的多種試驗已有描述(參見例如，Bascomb,S.同上)。在一個優(yōu)選的實施方案中，鳥氨酸和賴氨酸脫羧酶試驗是通過檢測堿性胺的形成，它引起pH增加，可通過熒光pH指示劑4-甲基七葉亭來檢測。在另一個實施方案中，是以熟知的比色測定方式進行脫羧酶試驗(參見例如，MacFaddin,J.F.(1980)用于鑒定醫(yī)學細菌的生化試驗，第二版，Williams and Wilkins,Baltimore and London)。
使用中，用大約104-108CFU/ml的待測樣品對通用檢測卡板接種，然后置于Walkaway(W/A)儀中，35℃溫育。用WADEV探測軟件收集樣品的數(shù)據(jù)，在40分鐘(基線時間),120分鐘和140分鐘進行讀數(shù)。用RENOK水化器/接種器對卡板上各小池接種之后，將接種物密度調(diào)整至0.08±0.01 Artel讀數(shù)。用統(tǒng)計學技術，使各種酶試驗結果通過ID模型處理，以便對樣品中的微生物進行檢測和鑒定。優(yōu)選的統(tǒng)計學技術是Bayesian機率分析法。在下面的實施例中，對樣品的檢測和鑒定是基于用選定種類的酵母菌和細菌的純培養(yǎng)物預先構成的數(shù)據(jù)庫。
F-質(zhì)量控制對通用檢測卡板每周進行一次質(zhì)量控制試驗，在某些情況下是每天進行一次。用于數(shù)據(jù)庫分離物的所有傳代平板，對其純度都要嚴格檢查，任何受污染的平板必需重新培養(yǎng)。在試驗過程中，應采取各種措施確保數(shù)據(jù)庫的質(zhì)量，以致于對原始數(shù)據(jù)須作嚴格檢查，對任何可疑的結果，例如缺乏清楚的熒光，未加入試劑，特定菌株的反應速度明顯不同于所有其它相同的種類，都必須重復試驗，或者得到確證之后才能用于數(shù)據(jù)庫。
可用各種適當?shù)馁|(zhì)控分離物對通用檢測卡板進行測定，包括那些用于MicroScan RNID2,RPID,HNID，以及快速厭氧菌和酵母菌檢測卡板的微生物。下面表Ⅸ列舉了適用于本通用檢測卡板的質(zhì)控微生物的例子。適合質(zhì)控微生物的補充例子包括產(chǎn)酸克雷伯氏菌，鮑氏不動桿菌，腐敗希瓦氏菌，大腸桿菌，嗜水氣單孢菌，普通變形桿菌，熒光假單胞菌，銅綠假單胞菌。通常在此通用檢測卡板上還包括生理鹽水對照，用于確立評定檢測結果的基線。
表Ⅸ
實施例2-數(shù)據(jù)庫的構建各種微生物如酵母菌和細菌都可被用于構建適合用于本通用檢測卡板的數(shù)據(jù)庫。例如，下面各群微生物被用于構建適合的數(shù)據(jù)庫HIND菌群陰道加德納爾氏菌，溶血嗜血桿菌，流感嗜血桿菌Ⅰ群，流感嗜血桿菌Ⅱ群，流感嗜血桿菌Ⅲ群，流感嗜血桿菌Ⅳ群，流感嗜血桿菌Ⅴ群，流感嗜血桿菌Ⅵ群，流感嗜血桿菌Ⅶ群，副流感嗜血桿菌Ⅰ群，副流感嗜血桿菌Ⅱ群，副流感嗜血桿菌Ⅲ群，副流感嗜血桿菌Ⅳ群，副/嗜沫嗜血桿菌，惰性嗜血桿菌，粘膜炎布蘭漢氏菌，灰質(zhì)奈瑟氏菌，金黃奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，解乳糖奈瑟氏菌，腦膜炎奈瑟氏菌，粘膜奈瑟氏菌，奈瑟氏菌，干燥奈瑟氏菌。
酵母菌群頭狀芽裂殖菌，白色念珠菌，鏈狀念珠菌，季也蒙念珠菌，土生念珠菌，克柔氏念珠菌，郎比可念珠菌，解脂念珠菌，葡萄牙念珠菌，近平滑念珠菌，偽熱帶念珠菌，皺褶念珠菌，類星形念珠菌，熱帶念珠菌，熱帶念珠菌(sn)，桶形念珠菌，淺白隱球菌，羅倫特隱球菌，新型隱球菌，指甲隱球菌，異常漢遜酵母，多形漢遜酵母Protothecawickerhamii，膠粘紅酵母，深紅酵母，釀酒酵母，念珠球擬酵母、光滑球擬酵母，平常球擬酵母，白色絲孢子菌。
革蘭氏陽性菌群產(chǎn)單核細胞李斯特氏菌，克氏微球菌、滕黃微球菌，里拉微球菌，玫瑰色微球菌，棲息微球菌，變異微球菌，片球菌，阿爾萊特葡萄球菌，耳葡萄球菌，頭狀葡萄球菌，山羊葡萄球菌，肉葡萄球菌，溶酪葡萄球菌，產(chǎn)色葡萄球菌，孔氏葡萄球菌，表皮葡萄球菌，馬胃葡萄球菌，母雞葡萄球菌，溶血葡萄球菌，玉米粥葡萄球菌，家畜葡萄球菌/產(chǎn)色亞種，家畜葡萄球菌豬亞種，中間型葡萄球菌，克氏葡萄球菌，緩慢葡萄球菌，路鄧葡萄球菌，腐生葡萄球菌，施氏葡萄球菌，賽氏葡萄球菌，模仿葡萄球菌，華納氏葡萄球菌，木糖葡萄球菌，G.morbillorum，無乳鏈球菌B群，咽炎鏈球菌群，牛鏈球菌，馬腸鏈球菌，似馬鏈球菌，緩癥鏈球菌群，變異鏈球菌，肺炎鏈球菌，化膿鏈球菌，唾液鏈球菌，血液鏈球菌Ⅰ，獸疫鏈球菌，鉛黃腸球菌，鳥腸球菌，糞腸球菌，類糞腸球菌，鶉雞腸球菌，海氏腸球菌，蒙氏腸球菌，棉子糖腸球菌，孤立腸球菌，和厭氧菌群吉氏擬桿菌，厭氧性消化鏈球菌，胞弱擬桿菌，卵園擬桿菌，單形擬桿菌，解脲擬桿菌，普通擬桿菌，內(nèi)臟擬桿菌，齒雙歧桿菌，死亡梭桿菌，壞死梭桿菌，具核梭桿菌，變形梭桿菌，不解糖卟啉單胞菌，二路普雷沃氏菌，頰普雷沃氏菌，人體普雷沃氏菌，產(chǎn)黑素普雷沃氏菌，無害梭菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌，索氏梭菌，產(chǎn)芽胞梭菌，遲緩真桿菌，淤泥真桿菌，痤瘡丙酸桿菌，巨大消化球菌，小韋榮氏球菌，不解糖消化球菌。
此特定數(shù)據(jù)庫的分類細目包括如下厭氧菌(54種)，在合成培養(yǎng)基下易生長菌(21種)，腸球菌(10種)，葡萄球菌(28種)，鏈球菌(14種)，酵母菌(42種)。
為了用上述各種酵母菌和細菌構建數(shù)據(jù)庫，對每種約30個分離物(共約338個分離物)，用一套生化試驗進行測定，這些生化試驗已用熟知的統(tǒng)計學技術如在實施例3中公開的技術進行了鑒定。然后將這些測定結果編排成數(shù)據(jù)庫(機率模型)，這種數(shù)據(jù)庫由含有待鑒定的所有微生物族成員的單一數(shù)據(jù)庫，或者對每一族微生物特異的亞數(shù)據(jù)庫系列組成。
實施例3-為通用檢測卡板選擇試驗組合的示范性方法表Ⅵ中96個非重復性底物如下面所述被用于構成機率模型。
下面將對用于單一微生物群如革蘭氏陰性菌群酶試驗的選擇進行描述，以便對此過程給予說明。對發(fā)酵菌，非發(fā)酵菌，和以普通臨床種類為代表的其它菌群，可采用同樣的程序。
A)細菌分離物及其制備用常規(guī)的IDS對來自MicroScan儲備培養(yǎng)物的細菌進行測定。
試驗之前，對儲備菌株傳代2次，以便確保其純度和活力。絕大多數(shù)試驗分離物是在生長選擇性瓊脂板(例如對革蘭氏陰性菌特異的MacConkey瓊脂)上培養(yǎng)，35℃培育約18-24小時。在一種生長選擇性瓊脂上不能生長的分離物可在另一種瓊脂上生長(例如，在添加了5％羊血的胰胨豆胨瓊脂板上，在非CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，35℃對革蘭氏陰性菌培養(yǎng)18-24小時)。
分別在加有6.5ml 0.4％生理鹽水的試管內(nèi)制備細菌懸液，用MicroScen濁度計，使之具有相當于0.5 McFarland標準單位的Pluronic。將含有相同分離物的4支試管匯集裝入一個Renok盤內(nèi)，用MicroScan Renok水化接種器進行接種。在將接種物分配進入卡板之后，對選定的試驗加入3滴礦物油。然后將卡板放入Walkway系統(tǒng)中35℃溫育，從開始接種起溫育30分鐘。
b)數(shù)據(jù)收集和分析用二個MicroScan-WalkAway分類系統(tǒng)，四個WalkAway96系統(tǒng)，和一個WalkAway40，對所有4個試驗的這些卡板進行溫育和讀數(shù)。用MicroSean研究數(shù)據(jù)搜索軟件收集數(shù)據(jù)，此軟件比在WalkAway見到的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(DMS)軟件能收集更多的數(shù)據(jù)點，即0分鐘，40分鐘，120分鐘和140分鐘。用MicroScan校準卡板對每臺儀器每周校準2-3次。然后，將在探索軟件中作為模擬熒光單位(AFU′S)收集的原始數(shù)據(jù)以ASCI文件格式轉化成使用常規(guī)軟盤的統(tǒng)計學分析軟件(SAS)。
按照標準的Bayesian機率分析法，用前述的生化試驗構成了精確、完整和可靠的數(shù)據(jù)庫。
c)機率模型的構建，如果酶試驗組合以正?；瘷C率≥85％(優(yōu)選地是90％或95％)正確地鑒定到種(或組合種)的水平并且這種鑒定與參照鑒定一致，則鑒定是符合的。這被認為是“種符合，高機率”。如果在種(或組合種)水平的鑒定沒有得到≥85％的機率，但是其正確的種顯示是低機率的一種可能的鑒定(2-5分類單位)，則認為是“種符合，低機率”，并需要用補充試驗確證種的鑒定。在這種情況下，將進行補充的酶試驗，用于更充分地區(qū)分待測的菌種。
“不正確的鑒定”表示不符合這些標準，如果試驗組合61到96顯示與最可能的分類單位預期的結果有過度的偏離，則得到“非常罕見的生物型”。如果酶試驗不能以≥85％的機率給出種水平的鑒定，但是對于相同屬/群成員的機率總和＞85％，則得到“屬群鑒定，高機率”。
對所有的數(shù)據(jù)用SAS軟件進行處理和分析。對于除吲哚試驗和脫羧酶試驗之外的所有試驗，用如下等式將在數(shù)據(jù)庫測定過程中收集的原始數(shù)據(jù)轉化成比值比值=(最后熒光值-起始熒光值)/時間×100對于脫羧酶試驗，可以用此相同的等式計算起始比值。但是，為了計算對鳥氨酸或賴氨酸的最后比值，對于脫羧酶的基礎比率將被扣除。對于吲哚試驗，在2小時對吲哚試驗小池和熒光對照小池加入二甲基肉桂醛(DMCA)，并在2小時20分讀數(shù)。用如下等式對此試驗計算比值吲哚比值=熒光對照小池熒光值-吲哚試驗小池熒光值。
檢查所有原始數(shù)據(jù)和反應比值數(shù)據(jù)的錯誤，即重復輸入，打印錯誤，或暗示微生物學污染的反常結果，發(fā)現(xiàn)錯誤時，輸入數(shù)據(jù)庫之前須進行重復測定或確證試驗。
然后對數(shù)據(jù)庫內(nèi)的每個分離物求其單個反應比值。將這些定量比值數(shù)據(jù)轉化成為定性數(shù)據(jù)，以便減少分離物之間和分離物內(nèi)變異性的影響。一般情況下，對于特定試驗的反應比值分布是雙模態(tài)的，或者三模態(tài)的，即某些分類單位沒有或僅有低反應比值，而其它一些分類單位有中等的或高反應比值。使用幾種統(tǒng)計學技術和SAS編程語言，對各個試驗計算其反應比值，并賦予數(shù)字比值(斷點數(shù)值)，以便區(qū)分陽性和陰性結果。對于每個試驗，在不同斷點值的“分離數(shù)字”(Gyllenberg,1963,Rypka et al,1967,Lapage & Bascomb,1968,La Page et al,1970)，當被認為是全部或部分數(shù)據(jù)庫分類單位的比值時，以及當以生理鹽水接種的卡板觀察到此比值時，它們被考慮選作斷點值。對于二模態(tài)試驗結果，如果分離物的反應比值大于此值，則此試驗被記為陽性(+)，或者如果反應值小于此值，則此試驗被記為陰性(-)。
對每個試驗計算斷點值之后，將來自革蘭氏陰性菌各試驗組合的結果從定量值轉化成定性的陽性或陰性值。然后用不同的試驗組合，構建不同的機率模型組(Bascomb et al.,1973)。用Bayesian機率鑒定模型(Wilicox et al,1973)對不同組機率模型進行評價，評定它們正確鑒定所有被測定分離物的能力，以及每個機率模型中的單個試驗對其分辨能力，即區(qū)分種的能力有何貢獻。進而，還評價這些試驗是否容易操作，儲存期限，容忍卡板配置變化的能力和對表層油的清除。應用所有這些標準，選出了滿足上述符合記分的36個試驗(見例如表Ⅵ中的61-96)接下來是評定這些組合試驗的準確度?？偟恼f來，應用85％正?；刂箼C率作為對鑒定的認可(“高機率鑒定”)，該系統(tǒng)在2小時20分鐘內(nèi)具有98.8％的綜合準確度(93.9％準確到種，1.2％準確到屬，3.6％準確到種，但需要補充試驗)。采用90％正?；刂箼C率，而不是85％檢驗這些相同的數(shù)據(jù)，導致較小數(shù)目的分離物被鑒定到種的水平(30個分離物-0.9％)，并伴有需要補充試驗，被正確地鑒定到種水平的分離物數(shù)目增加(33個分離物-1.1％)，但是，沒有顯著地減少不正確鑒定的數(shù)目(4個分離物-0.1％)。由于這個原因，選擇了85％正?；迫恍宰鳛閷﹁b定認可的截止值。
對于具有臨床重要性的分離物(包括24個常見的種)，組合酶試驗61-96具有99.4％的綜合準確度(97.5％準確到種，不需要補充試驗，1.0％準確到屬和0.9％準確到種需要補充試驗)。
并且，以這些試驗組合對所有革蘭氏陰性發(fā)酵菌種測定的數(shù)據(jù)庫結果，顯示了98.8％的綜合準確度(96.5％準確到種，不需要補充試驗，1.1％準確到屬，和1.2％準確到種需要補充試驗)。總的來說，該系統(tǒng)具有98.1％的綜合準確度(86.5％準確到種，1.4％準確到屬的水平，和10.2％準確到種需要補充試驗)這些試驗組合在2小時20分鐘內(nèi)可鑒定119個分類單位(85個發(fā)酵菌種，和34個非發(fā)酵菌種)，包括24個有臨床重要性的菌種。此外，全部有臨床重要性分類單位的僅0.9％(通常在臨床實驗室遇到的100個分離物中少于1個)和數(shù)據(jù)庫中所有分離物的3.7％，需要補充試驗才能得到最后正確的鑒定。
在上面的詳細說明中，已對本發(fā)明的原理，優(yōu)選的實施方案和操作方法作了描述。但是，不能把打算在此尋求保護的本發(fā)明看作僅限于所公開的特定形式，因為這些公開內(nèi)容被看作是說明性的而不是限制性的。本領域的技術人員依賴于本發(fā)明的精髓可能作出一些變化和改變形式。
權利要求
1．一種用于鑒定樣品中微生物的檢測系統(tǒng)，其中該測定系統(tǒng)能夠鑒定可能存在于此樣品中的至少二群完全不同微生物中的微生物，該檢測系統(tǒng)包括預定組合的一組非重復性生化試驗，它們被配置在預定數(shù)目的反應小室內(nèi)，其中每個生化試驗包括針對一個酶或一組酶的底物，進而如果這種酶或這組酶作用于該底物，將導致在反應小室內(nèi)形成可檢測的產(chǎn)物，并且，其中來自該生化試驗組合的可檢測性產(chǎn)物可用于鑒定樣品中的微生物。
2．權利要求1的檢測系統(tǒng)，其中對微生物的鑒定包括將微生物分類到屬或種，或者此二者。
3．權利要求1的檢測系統(tǒng)，其中該預定組合的非重復性試驗，包括熒光測定法，比色測定法，或者二者的組合。
4．權利要求3的檢測系統(tǒng)，其中的熒光測定法是以熒光發(fā)生方式或熒光測定方式進行。
5．權利要求3的檢測系統(tǒng)，其中預定組合的非重復性試驗在約15分到8小時內(nèi)完成。
6．權利要求1的檢測系統(tǒng)，其中預定組合的非重復性試驗在約25℃-37℃的溫度下進行。
7．權利要求6的檢測系統(tǒng)，其中的比色測定法是可視性讀數(shù)或用比色計讀數(shù)。
8．權利要求4的檢測系統(tǒng)，其中的熒光測定法是用熒光計讀數(shù)。
9．權利要求1的檢測系統(tǒng)，包括至少一種用于檢測如下酶的試驗肽酶、糖苷酶、糖發(fā)酵酶、脲酶、脫羧酶、酯酶，碳素利用酶，磷酸酶，或色氨酸酶。
10．權利要求9的檢測系統(tǒng)，包括用于至少一種肽酶和至少一種糖苷酶的試驗。
11．權利要求10的檢測系統(tǒng)，另外還包括用于至少一種糖發(fā)酵酶的試驗。
12．權利要求11的檢測系統(tǒng)，另外還包括用于至少一種脲酶的試驗。
13．權利要求12的檢測系統(tǒng)，另外還包括用于至少一種脫羧酶的試驗。
14．權利要求13的檢測系統(tǒng)，另外還包括用于至少一種酯酶的試驗。
15．權利要求14的檢測系統(tǒng)，另外還包括用于至少一種碳素同化酶的試驗。
16．權利要求1的檢測系統(tǒng)，其中該預定組合的非重復性生化試驗，能夠鑒定在如下菌的至少二種中的微生物腸道菌和非發(fā)酵菌；厭氧菌；酵母菌；葡萄球菌，鏈球菌，或腸球菌；以及合成培養(yǎng)基中不生長的菌。
17．權利要求1的檢測系統(tǒng)，其中該預定組合的非重復性生化試驗，能夠鑒定在如下菌的至少一種中的微生物葡萄球菌，鏈球菌，和腸球菌；棒狀桿菌；乳酸桿菌；片球菌；明串珠菌；差異球菌；漫游球菌；克呂沃爾氏菌；勒米諾氏菌；嗜血桿菌和奈瑟氏菌；摩拉氏菌；沙門氏菌；梭狀芽孢桿菌；和利斯特氏菌。
18．權利要求1的檢測系統(tǒng)，其中該預定組合的非重復性生化試驗，能夠鑒定屬于厭氧菌，酵母菌或合成培養(yǎng)基中不生長菌中至少一種的微生物。
19．權利要求18的檢測系統(tǒng)，其中該預定組合的非重復性生化試驗，能夠鑒定屬于厭氧菌和酵母菌或合成培養(yǎng)基中不生長菌的微生物。
20．權利要求19的檢測系統(tǒng)，其中該預定組合的非重復性生化試驗，能夠鑒定屬于酵母菌和合成培養(yǎng)基不生長菌的微生物。
21．權利要求1的檢測系統(tǒng)，其中該預定組合的非重復性生化試驗，能夠鑒定屬于葡萄球菌、鏈球菌、或腸球菌中至少一種和厭氧菌，酵母菌，腸道菌和非發(fā)酵菌或合成培養(yǎng)基內(nèi)不生長菌中至少一種，或者它們的組合的微生物。
22．權利要求1的檢測系統(tǒng)，其中該檢測系統(tǒng)能夠鑒定屬于酵母菌，厭氧菌和合成培養(yǎng)基內(nèi)不生長菌的微生物。
23．權利要求1的檢測系統(tǒng)，其中該檢測系統(tǒng)能夠鑒定腸球菌，葡萄球菌，或鏈球菌；厭氧菌；酵母菌；和合成培養(yǎng)基內(nèi)不生長的菌。
24．權利要求1的檢測系統(tǒng)，其中的底物包括賴氨酸(AMC)，亮氨酸(AMC)，甲硫氨酸(AMC)、甘氨酰-脯氨酸(AMC)、異亮氨酸(AMC)，海藻糖，麥芽糖，L-色氨酸(7-AMC),4-MeU-磷酸鹽，β-D-木糖苷-4MeU，羥基脯氨酸-AMC,β-D-葡糖苷酸-4MeU，酪氨酸(AMC),4-MeU-β-D-半乳糖苷，甘露糖，蔗糖，和脯氨酸(AMC)。
25．權利要求25的檢測系統(tǒng)，其中的底物另外還包括果糖，甘油，L-組氨酸7-AMC，焦谷氨酸(AMC)和4-MeU-β-D-葡糖苷。
26．權利要求26的檢測系統(tǒng)，其中的底物另外還包括L-絲氨酸7-AMC，纖維二糖，精氨酸(AMC)，和4-MeU-N-乙?；?β-D-氨基半乳糖苷。
27．一種通過應用權利要求1的檢測系統(tǒng)，鑒定樣品中可能存在的至少二群完全不同微生物的方法，該方法包括a)將樣品加到含有底物的各反應小室內(nèi)，b)如果存在酶，使其與該底物發(fā)生反應，c)通過檢測某一試驗中的可檢測產(chǎn)物來確定樣品中這種酶的存在，d)將預定試驗組合的結果同至少一種預定的標準比較，以便鑒定樣品中的微生物。
28．一種用于檢測微生物碳源利用的試驗，其中該試驗包括至少一種碳源和至少一種熒光指示劑，微生物作用于碳源，引起pH改變，pH改變則導致指示劑的熒光改變，這種熒光改變指示該微生物對碳源的利用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定屬于至少二個完全不同微生物群的通用檢測系統(tǒng)和方法。此通用檢測系統(tǒng)包括一組預定組合的非重復性生化試驗，這些試驗都包括針對至少一種酶的底物，其中該底物如果受到酶的作用，將導致產(chǎn)生一種可檢測性產(chǎn)物。然后，將來自生化試驗組合的可檢測性產(chǎn)物用于鑒定微生物。
文檔編號C12Q1/04GK1228125SQ98800771
公開日1999年9月8日 申請日期1998年3月16日 優(yōu)先權日1997年4月10日
發(fā)明者J·H·戈德塞, D·M·諾塔夫特 申請人:達德微掃描公司