專利名稱：多種生物學(xué)(微)生物及其組分的鑒定和定量的制作方法
多種生物學(xué)(微)生物及其組分的鑒定和定量
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于進(jìn)行實(shí)時PCR的過程，并涉及包含用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法的試劑以及工具和儀器的試劑盒。該過程適合于通過在實(shí)時擴(kuò)增中在相同陣列上鑒定其或鑒定其組分來鑒定、檢測和/或定量不同
群(類別、科、屬、種、其他中的個體)的大量(微)生物。
本發(fā)明特別適合于同時鑒定和/或定量相同生物學(xué)樣品中存在的(微)生物的群或亞群或相關(guān)基因。
本發(fā)明還提供了用于檢測和鑒定任何搜索(微)生物或基因連同
其定量的簡化過程。
2.相關(guān)領(lǐng)域的描述
生物或微生物的鑒定可以基于其特異性序列的遺傳材料的存在來
列來擴(kuò)增生物的給定序列容易地進(jìn)行。
然而，在許多應(yīng)用中，特別是在診斷中，生物樣品中存在的可能生物是眾多的且屬于不同科、屬、種、亞種或甚至個體。每一種可能生物的擴(kuò)增是困難和昂貴的。因此需要用于此類多參數(shù)、多水平分析的簡單方法。
給定序列的擴(kuò)增通過最常用的幾種方法來進(jìn)行，所述方法例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(美國專利號4， 683, 195和4， 683， 202 )、連接酶鏈反應(yīng)(LCR) (Wu和Wallace， 1989， Genomics 4: 560-569 )或循環(huán)探針反應(yīng)(CPR)(美國專利號5，011， 769 )。檢測給定序列的存在和因此特定生物的存在的一種特定方法是在擴(kuò)增子循環(huán)期間跟蹤擴(kuò)增子在溶液中的出現(xiàn)。該方法稱為實(shí)時PCR。當(dāng)擴(kuò)增子形成時，熒光信號出現(xiàn)在溶液中，并且當(dāng)達(dá)到閾值時，擴(kuò)增視為陽性的。
檢測擴(kuò)增子還可以在擴(kuò)增后通過基于擴(kuò)增子與固定在固體載體上的互補(bǔ)序列的特異性識別的方法來進(jìn)行。用于此類雜交的第一種載體是硝酸纖維素或尼龍膜。然而，將該方法小型化，并且提出新載體例如傳導(dǎo)表面、硅石和玻璃連同檢測過程的小型化。在擴(kuò)增步驟(PCR)后或在逆轉(zhuǎn)錄成cDNA和擴(kuò)增(RT-PCR)后，微陣列或DNA芯片用于對于生物特異的DM或RNA核苷酸序列的多重分析。待檢測的靶序列在擴(kuò)增或拷貝步驟期間進(jìn)行標(biāo)記，并隨后在陣列上進(jìn)行檢測和可能地定量。陣列上特定靶序列的存在是樣品中存在給定基因或DNA序列的指示，并且因此是存在隨后可以鑒定的給定生物的指示。當(dāng)幾種序列彼此同源，但必須在同一陣列上特異性區(qū)分時，檢測問題變得困難。希望使用用于此類診斷目的的陣列來解決這個技術(shù)問題，因?yàn)槟康纳锘蛭⑸镌诜诸悓W(xué)基礎(chǔ)上通常非常類似于其他的并存在幾乎相同的DM序列。
Company Affymetrix Inc.已開發(fā)了通過在加工的每個步驟時使用屏蔽用于在固體載體上、在特定位置處直接合成寡核苷酸的方法。所述方法包括在成長中的合成寡核苷酸上添加核苷酸，以便在所需位置處獲得所需序列。這種方法衍生自光刻法技術(shù)，并且與光保護(hù)基團(tuán)的使用偶聯(lián)，所述光保護(hù)基團(tuán)在添加新核苷酸前被釋放(美國專利號5，510，270 )。然而，在表面上僅存在小寡核苷酸，和所述方法發(fā)現(xiàn)主要用于測序或鑒定相應(yīng)于陣列上結(jié)合的每一種特定寡核苷酸的陽性點(diǎn)的模式的應(yīng)用。通過將這種多核苷酸切割成小寡核苷酸和雜交模式與參考序列的比較來獲得靶序列的表征。將所述技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis) i7 o"基因的鑒定(WO 97/29212 )，其中捕獲分子包含小于30個核苷酸，并且來自可能相差單個核苷酸的2種不同序列的分析(SNPs的鑒定或基因分型)。小捕獲寡核苷酸序列(具有10-20個核苷酸的長度)是優(yōu)選的，因?yàn)楫?dāng)它們的長度較小時，相差1個堿基的2種寡核苷酸之間的區(qū)分較高。復(fù)雜它不能直接檢測起因于基因擴(kuò)增(PCR)的擴(kuò)增子。用具有T3或T7序列的引物進(jìn)行雙重?cái)U(kuò)增，然后用RNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在陣列上檢測前，將這些RNA切割成約40個堿基的碎片(WO 97/29212的實(shí)施例1)。每種序列需要在陣列上存在IO種捕獲分子和待檢測的IO種對照核苷酸序列。關(guān)于這種復(fù)雜操作的原因是在表面上存在的小寡核苷酸捕獲分子上，長DNA或RNA片段雜交極慢。所述方法因此不適合于檢測同源序列，因?yàn)橥葱匝刂蛄卸淖儾⑶乙虼怂槠牟糠謱⒃谙嗤东@分子上雜交。因此，將用于解釋結(jié)果的軟件摻入方法中用于允許解釋獲得的結(jié)果。在陣列上不
捕獲分子上的雜交快得多地再^雜交。，" '
此類限制的后果是多核苷酸僅在被切割成寡核苷酸后在基于寡核苷酸的陣列上進(jìn)行分析。對于基于mRNA的cDNA拷貝的檢測的基因表達(dá)陣列，該問題仍存在但較不嚴(yán)重，因?yàn)閏DNA是單鏈的。片段也被切割成更小的種類和該方法需要使用幾種捕獲寡核苷酸序列，以便獲得證明給定基因的存在的信號模式。所述切割還減少標(biāo)記的核苷酸的數(shù)目，并因此減少獲得的信號。在cDNA分析的情況下，長捕獲多核苷酸序列的使用給出對于檢測好得多的靈敏度。在許多基因表達(dá)應(yīng)用中，當(dāng)待檢測的cDNAs源于具有不同序列的基周時，長捕獲分子的使用不是問題，因?yàn)樾蛄兄械牟町愖阋员苊馑鼈冎g的交叉反應(yīng)，甚至對于長于IOO個堿基的序列，從而使得多核苷酸可以用作捕獲分子。然而，長捕獲分子給出所需靈敏度，但它們?nèi)耘c其他同源序列雜交。
DNA中單核苷酸多態(tài)性的檢測僅是同源序列的檢測的一個特定方面。已提議使用陣列以區(qū)分在序列的特定位置處相差1個核苷酸的2種序列。因?yàn)镈M或RNA序列為低拷貝數(shù)，所以首先擴(kuò)增它們的序列，從而使得在陣列上分析雙鏈序列。已提出幾種方法以檢測一個位置中的此類堿基變化。文件WO 97/31256提出一種寡核苷酸探針(其具有
靶序列特異性部分和可尋址的陣列特異性部分)和第二種寡核苷酸探針(其具有靶序列特異性部分和可檢測標(biāo)記)之間的連接檢測反應(yīng)。
17當(dāng)2種寡核苷酸在靶上雜交時，它們進(jìn)行連接。在溶液中連接后，通過可尋址的陣列特異性部分將標(biāo)記產(chǎn)物固定在陣列上。SNP的檢測是用于個別生物中的多態(tài)性區(qū)分的基礎(chǔ)，也是用于其基因分型的基礎(chǔ)，因?yàn)閭€體的基因組由于所述SNPs而不同于相同物種或亞種中的彼此。特定SNP的存在影響酶如P450的活性并使得它們在藥物的代謝中更有活性或活性更少。
靶核苷酸雜交后，陣列上存在的捕獲寡核普酸還可以用作引物用于延伸。文件W0 96/31622提議通過延伸具有可檢測的經(jīng)纟l"飾的核苷酸的捕獲分子來鑒定在序列上給定位置處的核苷酸，以便檢測給定點(diǎn)，其中靶已結(jié)合在這個特定位置處與靶序列互補(bǔ)的捕獲分子的最后一個核苷酸。文件W0 98/28438提議完成雜交-延伸步驟的幾個循環(huán)以標(biāo)記點(diǎn)，以便補(bǔ)償靶序列的低雜交得率。這種方法允許通過標(biāo)記延伸捕獲分子的點(diǎn)來鑒定序列的給定位置處的核苷酸。
在延伸前，陣列上存在的捕獲分子可以通過核酸酶進(jìn)行消化，以便區(qū)分匹配和未匹配的異雙鏈體(美國專利號5, 753,439 )。還已提議使用核酸酶用于鑒定序列(EP 0721016 )。還已提議將靶互補(bǔ)的第二種標(biāo)記的核苷酸序列加入雜交的耙中并與捕獲分子連接，如果靶的最后一個核苷酸在這個位置處與靶互補(bǔ)(W0 96/31622 )。
文件EP-0785280提出基于在包含各相差1個堿基的幾種寡核苷酸序列的塊上的靶核苷酸雜交的多態(tài)性檢測，并獲得用于確定哪種序列是最佳雜交匹配的強(qiáng)度比。
提議使用膜或尼龍載體以通過在載體和捕獲分子之間摻入間隔物來增加固體栽體上的多核苷酸檢測的靈敏度。VanNess等人(NucleicAcids Research,第19巻，第3345頁，1991)描述了用于結(jié)合尼龍膜上的DNA的聚(乙烯亞胺)臂。文件EP-0511559描述了作為間隔物用于結(jié)合膜上的小寡核苷酸的六乙二醇衍生物。當(dāng)諸如尼龍的膜用作載體時，不存在固體載體和寡核苦酸之間的結(jié)合位點(diǎn)的對照，并且觀
察到polydT尾部增加固定得率和因此增加所得到的雜交(WO89/11548 )。
18Guo等人(Nucleic Acids Research,第22巻，第5456頁，1994 ) 教導(dǎo)了 15個堿基的polydT作為間隔物用于結(jié)合玻璃上的寡核苷酸的 用途，伴隨增加的雜交敏感性。
Anthony等人(Journal of clinical microbiology, 第38巻， 第7817頁，2000 )的出版物描述了在PCR擴(kuò)增后使用膜陣列用于檢測 各種細(xì)菌物種的23 S核糖體DNA。檢測的耙是通過共有區(qū)PCR由細(xì)菌 擴(kuò)增的rDNA，并在包含用于所述細(xì)菌的捕獲分子并具有20 - 30個堿 基的捕獲分子的尼龍陣列上獲得檢測，所述捕獲分子與尼龍共價連接， 并且不存在可用于雜交的序列的部分的對照。rDNA是用于補(bǔ)償該方法 的低檢測得率的多拷貝DNA。同樣，由于小捕獲分子的使用，它們僅 能通過其特異性序列而不是科或?qū)贆z測單個細(xì)菌物種。
在工藝水平中不存在下述指示或暗示，長于寡核苷酸的多核苷酸 可以用作微陣列中的捕獲序列，以便區(qū)分同源多核苷酸序列之間的結(jié) 合，并允許鑒定(微)生物序列或其組分的的其他種、屬或科中的一 種靶序列，并且在擴(kuò)增期間檢測和/或定量靶的存在。
另外不存在下述指示或暗示，在序列的一個位置處相差l個核苷 酸的同源序列(例如在多態(tài)性分析中觀察到的)可以通過在擴(kuò)增期間 擴(kuò)增的序列在相應(yīng)的捕獲分子上的雜交進(jìn)行檢測。
在本發(fā)明之前，不知道可以在單步過程中，即擴(kuò)增子在陣列上的 擴(kuò)增連同直接雜交，鑒定屬于相同群、2個群或更多的生物連同群像 這樣的特異性鑒定。另外，不知道可以在其序列之一的擴(kuò)增期間鑒定 屬于群或亞群的生物連同這些群和亞群的特異性鑒定。另外此類鑒定 可以通過使用多核普酸作為捕獲序列用于所有檢測來獲得。
另外不知道長于寡核苷酸的多核苷酸可以用于在其擴(kuò)增期間鑒定
在序列的特定位置中存在相差1個核苷酸的同源多核苷酸序列。
另外不知道同源多核苷酸序列可以在其擴(kuò)增期間以極高靈敏度直 接在陣列上進(jìn)行區(qū)分和檢測，因?yàn)橄嚓P(guān)技術(shù)需要擴(kuò)增子的斷裂用于其 在小寡核苷酸陣列上的檢測。斷裂與實(shí)時檢測不相容，因?yàn)閿嗔训臄U(kuò) 增子無法再擴(kuò)增因此導(dǎo)致擴(kuò)增的終止。
19發(fā)明概述
本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)陣列可以用于在其序列的擴(kuò)增步驟期 間獲得屬于幾個群的相同或不同(微)生物的同源(生物學(xué))組分(例 如遺傳序列或mRNA)之間的區(qū)分，連同這些群的鑒定和/或其定量。
本發(fā)明提供了用于實(shí)時PCR的過程，其包括下述步驟
a) 進(jìn)行至少一個PCR循環(huán)以形成擴(kuò)增子；
b) 使擴(kuò)增子與固定的未標(biāo)記的捕獲分子雜交；
c) 檢測雜交擴(kuò)增子；
d) 重復(fù)步驟a) b) c)至少一次。
本發(fā)明在通過實(shí)時PCR使用陣列以區(qū)分屬于幾個群的同源核苷酸 序列連同像這樣鑒定這些群中特別有用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過經(jīng)由實(shí)時RT-PCR區(qū)分基因含量用于鑒 定和/或定量生物的部分例如以mRNA形式的表達(dá)基因的方法。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于簡化技術(shù)的診斷試劑盒， 其需要在單步擴(kuò)增中使用單個或有限數(shù)目的引物對，以通過記錄所述 微陣列上的單點(diǎn)鑒定來檢測特定靼或靼序列群的存在，連同鑒定(檢 測和/或定量)所述特異性靶或靶遺傳序列群，并且在相同實(shí)驗(yàn)方案中， 所述信號對于生物或生物的群或亞群特異。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的儀器。
本發(fā)明還提供了通過在實(shí)時PCR測定法中其擴(kuò)增多核普酸序列在 陣列上雜交用于鑒定相差給定核苷酸序列的單堿基差異的生物的工 具。
附圖簡述
圖la是用于在微陣列上執(zhí)行實(shí)時PCR和檢測的優(yōu)選裝置的表示。 該裝置包含由具有腔(3)的支持物(2)制成的載體(1)、用具有入 口 ( 6 )的蓋玻片(5 )密封的運(yùn)載體(1 )。圖lb是該裝置的頂視圖， 和圖lc表示側(cè)浮見圖A-B。圖Id是與溫控儀(8 )接觸用于PCR擴(kuò)增和與檢測裝置(7 )接觸 用于微陣列分析的裝置的表示。 圖le表示

圖1的裝置的倍增。
圖2a表示用于在微陣列上執(zhí)行多重實(shí)時PCR和檢測的裝置，所述 裝置具有含蓋(9)的2個室(11)，由以具有陣列的腔的形式的通道 (10)分開。圖2b是與溫控儀(8)接觸用于PCR擴(kuò)增和與檢測裝置
(7) 接觸用于微陣列分析的裝置的表示。
圖3a是用于在微陣列上執(zhí)行實(shí)時PCR和檢測的優(yōu)選裝置的表示， 所述裝置具有存在于環(huán)上并圍繞溫控儀(8 )退火的幾個室(11 )。陣 列(4)位于室中的特定位置處。蓋(9)使得能夠通過入口 (6)將溶 液引入室中。圖3b表示當(dāng)包括檢測裝置(7)時該裝置的側(cè)視圖A-B。
圖4表示用于在微陣列上執(zhí)行實(shí)時PCR和檢測的另一種裝置，所 述裝置具有2個室(11 ),其中一個室具有陣列(4)。流體可以通過 通道(10)從一個室轉(zhuǎn)移至另一個。
圖5a表示用于在微陣列上執(zhí)行實(shí)時PCR和檢測的優(yōu)選裝置，所述 裝置具有不對稱的室(11)，其中一個部分具有陣列(4)。該裝置優(yōu) 選是圓盤載體的部分以允許該裝置的容易離心(圖5b)。其中使用該 裝置的方法的步驟在圖5a中呈現(xiàn)。在步驟1中，將包含核普酸分子以 及用于擴(kuò)增和標(biāo)記的試劑的溶液引入反應(yīng)室(11)的第一個區(qū)室內(nèi)。 將捕獲分子(4)固定在反應(yīng)室(11)的第二個區(qū)室的頂部。在步驟2 中，反應(yīng)室用蓋(9)進(jìn)行密封并且在反應(yīng)室(11)的第一個區(qū)室中執(zhí) 行PCR擴(kuò)增，使所述反應(yīng)室與溫控儀(8)接觸。在步驟3中，使反應(yīng) 室(11)離心并翻轉(zhuǎn)，以便使包含標(biāo)記的靶分子的溶液與固定在笫二 個區(qū)室中的捕獲分子(4)接觸。在步驟4中，使反應(yīng)室(11)翻回， 并且經(jīng)由檢測器(7)通過窗口測量結(jié)合的標(biāo)記的乾分子。
圖6a表示具有不同微陣列用于在PCR期間檢測擴(kuò)增子和沿著圓盤 的不同部分具有不同溫度的圓盤。具有變性(12)、退火T。 (13)、 延伸T。
(14)、用于閱讀的窗口 (15)的部分。圖6b表示與溫控儀
(8) 接觸用于PCR擴(kuò)增和與檢測裝置(7)接觸用于微陣列分析的圖6a的裝置的側(cè)視圖A-B。該圓盤借助于步進(jìn)電機(jī)(16)在其軸上旋轉(zhuǎn)。 圖7a是以3步的一個擴(kuò)增/檢測循環(huán)的表示變性(12)、退火 (13)和延伸(14)。在捕獲分子上的擴(kuò)增子的雜交(17)及其檢測 (18)優(yōu)選在循環(huán)的退火步驟期間進(jìn)行。下一個循環(huán)的開始由虛線表 示。圖7b是以5個步驟的擴(kuò)增/檢測循環(huán)的表示變性(12)、退火 (13)、延伸(14)、變性(12')和雜交(17)檢測(18)。在這個 實(shí)施方案中，擴(kuò)增子的檢測不在PCR循環(huán)期間進(jìn)行而在特異性雜交步 驟期間進(jìn)行，所述特異性雜交步驟在變性步驟(12)后，以使捕獲分 子上的信號變成零。下一個循環(huán)的開始由虛線表示。這個實(shí)施方案在 實(shí)施例2中舉例說明。
圖8是在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中以6步的一個擴(kuò)增/檢測循環(huán)的 表示，其中捕獲分子與PCR溶液斷續(xù)接觸。順次步驟是變性(12)、 退火(13)、延伸(14)、變性(12')、雜交(17)和檢測(18)。 圖8a表示其中捕獲分子被固定在反應(yīng)室中優(yōu)選在底部的實(shí)施方案。它 們在所有步驟期間與PCR溶液接觸，除了在檢測(18)期間。為了達(dá) 到這個目的，從捕獲分子處去除液體。一個實(shí)施方案是在檢測步驟(18) 前(T)和后(r )使室完全顛倒。下一個循環(huán)的開始由虛線表示。圖 8b表示其中捕獲分子被固定在反應(yīng)室的蓋(9)中的備選實(shí)施方案。 它們僅在雜交(17)步驟期間與PCR溶液接觸。為了達(dá)到這個目的， 在雜交步驟(17)前(T)和后(r )使室完全顛倒。下一個循環(huán)的開 始由虛線表示。
圖9:根據(jù)本發(fā)明用于進(jìn)行實(shí)施檢測連同PCR的不同循環(huán)以根據(jù)
所獲得的值來終止反應(yīng)的過程的不同步驟的一般示意流程圖。這個一 般流程圖對應(yīng)圖7b的5步驟循環(huán)。
圖10.使用實(shí)施例1中提供的標(biāo)記的通用引物用于在微陣列上在 線檢測PCR擴(kuò)增的結(jié)果。在包含不同結(jié)合的捕獲分子的微陣列的存在 下，對金黃色葡萄球菌(S. aureus)和肺炎球菌(S. pneumoniae) 的基因組DNA進(jìn)行PCR。 一種捕獲分子是擴(kuò)增產(chǎn)物金黃色葡萄球菌(SEQ ID NO: 1)特異的，和另一種是擴(kuò)增產(chǎn)物肺炎球菌(SEQ ID NO: 2)
22特異的。將一種陽性雜交對照加入反應(yīng)混合物中，并相應(yīng)于用與捕獲
分子BAT-973 (SEQ ID NO: 3)互補(bǔ)的cy3標(biāo)記的擴(kuò)增子。這種對照 用于檢查雜交階段。在不同熱循環(huán)的退火步驟期間對金黃色葡萄球菌 (SEQ ID NO: 1 )、肺炎球菌(SEQ ID NO: 2 )和BAT-973 ( SEQ ID NO: 3)的捕獲分子進(jìn)行測量。
圖11顯示如圖7b中提供的在5步驟中在擴(kuò)增/檢測的一個循環(huán)期 間監(jiān)控?cái)U(kuò)增子在微陣列上的雜交的動力學(xué)的結(jié)果。在包含不同結(jié)合的 捕獲分子的微陣列的存在下，對CYP2C9基因進(jìn)行PCR。 一種捕獲分子 是擴(kuò)增產(chǎn)物MT2C9*3 ( SEQ ID NO: 4)特異的。在循環(huán)41的5個步驟 期間常規(guī)進(jìn)行測量于94。C變性、于6(TC退火、于72。C延伸、于94 。C變性和于4(TC雜交。T。C ( )。提供了在變性和雜交步驟期間信 號增加的回歸曲線(▲)。
圖12顯示在5個步驟中在擴(kuò)增/檢測的3個循環(huán)期間監(jiān)控?cái)U(kuò)增子 在微陣列上的雜交的動力學(xué)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)如圖11中提供的來進(jìn)行。在 第26個(▲)、第31個(* )和第36個(■)循環(huán)時，在雜交步驟 期間以規(guī)律間隔進(jìn)行測量，并且提供了與這些測量相關(guān)的回歸曲線。T 。C ( )。
舉例說明性實(shí)施方案的描述
下文是本發(fā)明的某些實(shí)施方案的描述，所述實(shí)施方案僅為了舉例 并就附圖而言而給出。 定義
術(shù)語"核酸、寡核苷酸、陣列、核苷酸序列、靶核酸、基本上結(jié) 合、與……特異性雜交、背景、鑒定"是通過引用合并入本文的國際 專利申請W0 97/27317中描述的那些。術(shù)語多核苷酸指通常由DM或 RM序列組成的核苷酸或核普酸樣序列。寡核苷酸視為通常長度15-40個核苷酸的小序列，并且無論如何長度小于IOO個核苷酸。
術(shù)語"核苷酸三磷酸鹽、核苷酸、引物序列"是在通過引用合并 入本文的文件WO 00/72018和WO 01/31055中描述的那些。
提及核苷酸、多核苷酸等包括其中糖-磷酸鹽主鏈進(jìn)行修飾和/或
23替換的類似種類，條件是不破壞它的雜交性質(zhì)。例如主鏈可以由稱為
肽核酸(PNA)的等價合成肽替換。
術(shù)語"同源遺傳序列"意指在相應(yīng)位置處具有高于純粹隨機(jī)比對 中的相同氨基酸或核苷酸百分比的氨基酸或核苷酸序列。當(dāng)它們顯示 最低限度同源性(或序列同一性)時，它們視為同源的，所述最低限 度同源性定義為，在考慮待比較的2種序列之一中的添加或缺失(如 缺口 )序列已進(jìn)行最佳比對后，與總核苷酸或氨基酸比較，在每個位 置處發(fā)現(xiàn)的相同核苷酸或氨基酸的百分比。編碼給定蛋白質(zhì)但存在于 遺傳上不同來源如不同生物中的基因通常是同源的。另外在給定生物 中，編碼相同家族的蛋白質(zhì)或酶(白介素、細(xì)胞色素b、細(xì)胞色素P450 ) 的基因。當(dāng)同源序列僅在一部分、少數(shù)部分或沿著其序列全部同源時， 同源性(或序列同一性)的程度可以改變很多。在2種序列中相同的 序列的部分被說成保守的。具有顯著部分的相同序列的序列視為同源 的。這個部分長度為至少10個連續(xù)核苷酸和更佳15個和甚至更佳20 個。呈現(xiàn)保守的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域通常由同源基因編碼并甚至 通常由獨(dú)特的外顯子編碼。在其序列中顯示出高度不變性的序列被說 成高度保守的，并且它們呈現(xiàn)高度同源性。
術(shù)語"群、亞群和亞亞群"首先指生物學(xué)生物在分類學(xué)界、門、 綱、目、科、屬、種、亞種、變種或個體中的分類。這些構(gòu)成生物學(xué) 分類學(xué)組構(gòu)的不同水平。群還指具有某些共同方面，但具有某些遺傳 差異的生物，如例如GMO植物、轉(zhuǎn)基因或嵌合動物。為了本發(fā)明的目 的，這些共同方面必須反應(yīng)為共同或同源DNA或RNA序列以及DNA序 列中的不同性或差異?；蛐蛄羞€可以不依賴其生物起源在群或亞群 中進(jìn)行分類，并且像這樣是本發(fā)明的方面。它們隨后將指屬于給定家 族例如細(xì)胞色素P450基因、蛋白質(zhì)激酶、G受體偶聯(lián)蛋白質(zhì)及其他的 群或亞群基因。如上文定義的，這些基因?qū)τ诒舜耸鞘峭吹摹?br> 基因(核苷酸序列)的分類用作分子古生物學(xué)的基礎(chǔ)用于確定生 物分類成種、屬、科、目、綱、門、界和類(taxus)。
"微陣列"意指在其上固定多種捕獲分子以便能夠與給定特異性靶分子結(jié)合的栽體。微陣列優(yōu)選由存在于載體表面上或載體內(nèi)或在覆 蓋載體的基質(zhì)上的特異性定位區(qū)域處的捕獲分子組成。特異性定位區(qū) 域是包含對于指定靶分子特異的結(jié)合捕獲分子的表面區(qū)域。特異性定 位區(qū)域通過構(gòu)建微陣列的方法已知或在檢測期間或之后限定。點(diǎn)是在
本發(fā)明的一個具體應(yīng)用中，捕獲分子的微陣列還在不同或分開的載體 上提供，只要不同栽體包含特異性捕獲分子并且可以彼此區(qū)分開以便 能夠定量特異性靶分子。這可以通過使用具有特定特征并能夠彼此識 別以便定量結(jié)合分子的珠的混合物來達(dá)到。隨后一種珠或珠的群體被 視為具有對于一種靶分子特異的捕獲分子的點(diǎn)。另外其為多孔板平板 的部分并具有捕獲分子的孔被視為陣列。
微陣列通過將捕獲分子沉積在基質(zhì)上來優(yōu)先獲得，這通過物理方 式例如針或"針和環(huán)"觸摸表面，或通過例如壓力或納米分配器的方 法釋放溶液的微滴來完成。備選地，捕獲分子在基質(zhì)上的原位合成是 使用寡核普酸或多核苷酸在預(yù)定位置中合成的光空間分辨率的本發(fā)明
一個實(shí)施方案，例如由5， 744， 305和6， 346,413提供的。
如本文所使用的，"捕獲分子"指分子、或其復(fù)合物或組合，其 能夠與一種靶分子、或靶分子家族、或多種靶分子中的一個或多個成 員、或其部分特異性結(jié)合，捕獲分子優(yōu)選是其為寡核苷酸或多核苷酸 的核酸，其在載體的表面上原位化學(xué)合成或放在其上。核酸結(jié)合經(jīng)由 2種多核苷酸之間的堿基配對來達(dá)到， 一種是固定的捕獲分子和另一 種是待檢測的靶。
術(shù)語"實(shí)時PCR"意指其允許在PCR循環(huán)期間檢測和/或定量擴(kuò)增 子的存在的方法。在實(shí)時PCR中，擴(kuò)增子的存在在至少一個擴(kuò)增循環(huán) 中進(jìn)行檢測和/或定量。與在PCR循環(huán)期間形成的擴(kuò)增子量相關(guān)的擴(kuò)增 子或信號增加用于檢測和/或定量PCR溶液中的給定核苷酸序列。
術(shù)語穩(wěn)定(或恒定)和受控溫度意指這樣的溫度，其通過其為溫 度調(diào)節(jié)裝置的受控系統(tǒng)獲得，并且在給定測量的時間過程期間足夠穩(wěn) 定以避免超過10%的靶雜交率變化。 一般的穩(wěn)定溫度是對于至少l分鐘和更佳5分鐘的時間段或甚至更佳60分鐘的時間段或甚至24小時
變化不超過5。c并優(yōu)選不超過rc的溫度。
本發(fā)明的"擴(kuò)增子"意指其為生物材料中存在的核苷酸分子的PCR 擴(kuò)增結(jié)果的靶核苷酸分子。
術(shù)語"溶液接觸"意指流體形式或允許液體的移動。例如離心或 完全顛倒的表面不是流體接觸的，即使液體的薄膜仍覆蓋表面。
"斷續(xù)接觸"意指根據(jù)某一時幀在物理上接觸或不接觸。在本發(fā) 明的具體方面，PCR溶液與捕獲分子斷續(xù)接觸，意指對于給定時間段 從具有固定的捕獲分子的表面處去除或置換PCR溶液(不接觸)，然 后將其移回至其原始位置(接觸)。在反應(yīng)室中去除或置換優(yōu)選超過
95%和優(yōu)選超過99%的PCR溶液。PCR溶液優(yōu)選由重力引流置換，所 述重力引流起因于反應(yīng)室的方向中的變化，優(yōu)選反應(yīng)室的旋轉(zhuǎn)、平移 或側(cè)運(yùn)動。
本發(fā)明涉及用于鑒定和/或定量樣品中的生物學(xué)生物或生物的部 分的方法。該方法包括檢測對于所述生物特異的核苷酸序列，其中所 述核苷酸序列呈現(xiàn)與來自其他生物的至少2種、和優(yōu)選至少4種其他 同源核苷酸序列的同源性。該方法優(yōu)選在其為基因組DNA或mRNA的遺 傳材料的提取和/或純化后。
該方法包括下述步驟
a) 進(jìn)行至少一個PCR循環(huán)以形成擴(kuò)增子；
b) 使擴(kuò)增子與固定的未標(biāo)記的捕獲分子雜交；
c) 檢測雜交擴(kuò)增子；
d) 重復(fù)步驟a) b) c)至少一次。
優(yōu)選地，PCR循環(huán)包括變性、退火和延伸的步驟，由此PCR溶液 與捕獲分子持續(xù)接觸，從而使得擴(kuò)增子在退火步驟期間與捕獲分子雜 交。
在備選實(shí)施方案中，捕獲分子與PCR溶液斷續(xù)接觸。 因?yàn)镻CR循環(huán)其自身包含3個步驟，所以在一個實(shí)施方案中，本 發(fā)明的方法包括下述6個步驟
26a) 變性；
b) 退火； c )延伸；
d) 變性；
e) 雜交；和 f )檢測。
在一個實(shí)施方案中，捕獲分子僅在步驟e )期間和任選地在步驟d ) 期間與PCR溶液接觸。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包含下述步驟
a) 變性；
b) 退火； c )延伸
d) 變性；
e) 雜交；和 f )檢測。
在一個實(shí)施方案中，捕獲分子優(yōu)選僅在步驟a)和e)期間與PCR 溶液接觸。在備選實(shí)施方案中，捕獲分子在除了步驟f)期間外的所 有步驟中與PCR溶液接觸。
希望PCR擴(kuò)增主要在溶液中發(fā)生，并且沿著PCR循環(huán)對于形成的 擴(kuò)增子進(jìn)行檢測且不干擾擴(kuò)增過程。已發(fā)現(xiàn)由于這個原因，優(yōu)選的捕 獲分子是包含間隔物部分和捕獲部分的那些。僅捕獲分子的捕獲部分 是擴(kuò)增子特異的。希望地，將捕獲分子以這樣的方式與固體栽體固定， 使得間隔物部分位于固體載體和捕獲部分之間。優(yōu)選地，捕獲分子的 捕獲部分通過至少6.8 nm的間隔物部分與所述固體載體的表面分開。
方便地，間隔物部分是核苷酸序列，和間隔物部分的遠(yuǎn)端(即， 遠(yuǎn)離捕獲部分的末端)處的核苷酸可以用于使捕獲分子與固體載體結(jié) 合。為了這個目的，可以提供在間隔物部分的遠(yuǎn)端處具有氨基的核苷 酸，所述氨基可以與例如預(yù)處理的固體載體的表面上存在的醛基形成 共價鍵。
27間隔物部分應(yīng)包含至少20個核苷酸、優(yōu)選至少40個核苷酸、和 更優(yōu)選至少90個核苷酸，并且包含約20-約120個堿基。
特別優(yōu)選的是包含與下述序列具有至少60%同源性、優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少90%的間隔物部分的捕獲分子
5'AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTC CTATATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC 3' ( SEQ ID NO: 2) (90 個堿基)。
特別優(yōu)選的是包含與下述序列具有至少60%同源性、優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少90%的間隔物部分的捕獲分子
5'ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCAC AACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA ( SEQ ID NO: 3) (95個堿基)。
捕獲分子的捕獲部分可以包含對于在PCR期間生產(chǎn)的擴(kuò)增子特異 的1G-100個核普酸，優(yōu)選15-40個核苷酸，更優(yōu)選20 - 30個核苷 酸。優(yōu)選地，捕獲分子的捕獲部分包含10 - 600個堿基、優(yōu)選20-50 個堿基、更優(yōu)選15-4G個堿基。
捕獲分子可以通過其5'末端或通過其3'末端進(jìn)行固定。 對于倍增，捕獲分子以至少4種捕獲分子/cm2、優(yōu)選至少20種捕 獲分子/cm2、更優(yōu)選至少100種捕獲分子/cm2的微陣列形式被固定在 固體載體的特異性定位區(qū)域中。載體上的捕獲分子的密度為20 - 2000 fmoles/cm2。
在具體實(shí)施方案中，捕獲分子包含10- 100個核苷酸的捕獲部分， 其與擴(kuò)增子的特異性序列互補(bǔ)，從而使得所述捕獲部分限定擴(kuò)增子的 2個非互補(bǔ)末端，和具有至少20個核苷酸的間隔物部分，并且其中擴(kuò) 增子的2個非互補(bǔ)末端分別包含間隔物末端和非間隔物末端，從而使 得間隔物末端與捕獲分子的間隔物部分不互補(bǔ)，和所述間隔物末端超 過所述非間隔物末端至少50個堿基。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品中的生物學(xué)生物或生物的部分的鑒定和/ 或定量通過監(jiān)控陣列的不同位置上的信號來進(jìn)行，其中在擴(kuò)增過程的
28至少2個循環(huán)中的每個位置進(jìn)行至少2次測量。隨后處理數(shù)據(jù)。
在具體實(shí)施方案中，在位置上的測量在PCR擴(kuò)增的每個循環(huán)時進(jìn)行。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，陣列包含在載體的不同位置上結(jié)合的 至少4種不同的捕獲分子/cm2固體栽體表面。希望地，4種不同的單 鏈捕獲分子能夠與4種靶同源核苷酸序列特異性結(jié)合。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，將本發(fā)明的方法應(yīng)用于包含核苷酸序列的樣 品，所述核苷酸序列與樣品中也可能存在的至少4種其他同源核苷酸 序列具有高于30%、優(yōu)選超過60%、更優(yōu)選超過80%的同源性。在 極端情況下，樣品中存在的核苷酸序列與樣品中也可能存在的其他同 源核苷酸序列相差1個核苷酸。
在另一個實(shí)施方案中，至少2種擴(kuò)增子用至少2種捕獲分子進(jìn)行 檢測，和其中所述至少2種捕獲分子的捕獲部分相差至少10%、優(yōu)選 相差至少20%。
有利地，待擴(kuò)增的核苷酸序列是同源核苷酸序列，其使用如 WO0177372中描述的通用引物在PCR期間在微陣列上進(jìn)行定量。相同 引物用于擴(kuò)增樣品中可能存在的所有同源序列。用相同熒光染料標(biāo)記 的擴(kuò)增子對于不同的捕獲分子進(jìn)行區(qū)分，每一種靶向不同的同源序列。 如同僅一種引物對和一種熒光染料一樣，測定法通過使用存在于微陣 列上的多種捕獲探針進(jìn)行倍增。因此本發(fā)明優(yōu)選使用能夠擴(kuò)增具有超 過60%、優(yōu)選超過90%同源性的至少2種耙序列的通用引物對，并包 含能夠檢測2種靶序列中的每一種的捕獲分子的使用。
在一個實(shí)施方案中，通過相同引物對擴(kuò)增序列的數(shù)目高于5種并 甚至高于20種，和擴(kuò)增靶當(dāng)存在于溶液中時在陣列上進(jìn)行檢測。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括從生物學(xué)生物或生物的部 分中提取對于那種生物特異的核苷酸序列的步驟。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，PCR循環(huán)包含標(biāo)記對于所述生物特異 的核苷酸序列，以形成標(biāo)記的靶核苷酸序列。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，對于生物特異的核苷酸序列是DNA核苷酸序列。
在備選實(shí)施方案中，對于生物特異的核苷酸序列是在PCR前逆轉(zhuǎn) 錄成cDNA的mRNA。
在另一個實(shí)施方案中，在至少一個PCR循環(huán)中使用引物對，和使 用相同引物對用于拷貝對于生物特異的核苷酸序列。
在具體實(shí)施方案中，捕獲分子能夠區(qū)分其為擴(kuò)增子的一條鏈的靶 序列和與靶具有小于85°/。同源性的另一種擴(kuò)增子序列。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括能夠擴(kuò)增具有超過60%、 優(yōu)選超過90%同源性的至少2種耙序列的通用引物對的使用，并包括 能夠檢測2種靶序列中的每一種的捕獲分子的使用。在具體實(shí)施方案 中，通用引物對能夠擴(kuò)增具有超過60%、優(yōu)選超過90%同源性的至少 4種、優(yōu)選至少10種、更優(yōu)選至少20種靶序列，并包含能夠檢測4、 10或20種耙序列中的每一種的捕獲分子的使用。
在另一個實(shí)施方案中，至少一個PCR循環(huán)包含耐熱DM聚合酶的 使用，所述耐熱DNA聚合酶在25 - 300 mM的鹽濃度下是有活性的。優(yōu) 選的鹽是谷氨酸鉀、氯化鉀和氯化鈉。聚合酶優(yōu)選是嗜熱水生菌 (r/ er邁"s a^a〃c^) DNA聚合酶。耐熱意指在一個PCR循環(huán)后仍保 留至少其50%的最初活性。在鹽濃度中有活性的意指與在具有低于25 mM的鹽的溶液中的活性比較，顯示優(yōu)選至少5%和更佳以及更佳至少 20%和再更佳至少50%其活性的酶。
乾核苷酸序列優(yōu)選通過標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，和檢測雜交擴(kuò)增子的步驟 包括所述標(biāo)記的檢測。
在具體實(shí)施方案中，PCR循環(huán)包含用于擴(kuò)增超過一種核苷酸序列 的超過一種引物對的使用。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，PCR循環(huán)包含具有與捕獲分子序列不同的序 列的引物的使用。
在另一個實(shí)施方案中，生物特異的擴(kuò)增子與捕獲分子的雜交在預(yù) 定位置處形成單點(diǎn)信號，由此所述單點(diǎn)信號的檢測允許區(qū)分特異性擴(kuò) 增子與來自其他生物的同源擴(kuò)增子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測與捕獲分子雜交的擴(kuò)增子和PCR循環(huán)的 步驟都在1個室中進(jìn)行。另外該室包含含有待擴(kuò)增的特異性核苷酸序 列的溶液，以及用于核苷酸分子擴(kuò)增的試劑和固定的捕獲分子的陣列。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在檢測雜交擴(kuò)增子的步驟期間從陣列 中去除包含在室中的溶液。例如，移動室的位置以便在監(jiān)控陣列的不 同位置上的信號期間從陣列中去除包含在室中的溶液。在具體實(shí)施方 案中，這種移動包含使室完全顛倒。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法通過監(jiān)控陣列的不同位置上的信號來 進(jìn)行，其中在至少5個、優(yōu)選至少10個PCR循環(huán)、更優(yōu)選至少20個 PCR循環(huán)中的每個位置進(jìn)行至少5次測量。隨后處理數(shù)據(jù)。在具體實(shí) 施方案中，過程包括超過20個PCR循環(huán)，并且在前20個PCR循環(huán)期 間不進(jìn)行測量。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，在PCR循環(huán)開始后，在預(yù)定時間點(diǎn)上測量信 號，并且所述預(yù)定時間在不同PCR循環(huán)時對于每個位置優(yōu)選是相同的。
在另一個實(shí)施方案中，PCR循環(huán)包含退火步驟，和在退火步驟開 始后5分鐘內(nèi)、優(yōu)選2分鐘內(nèi)、更優(yōu)選l分鐘內(nèi)測量信號。
在另一個實(shí)施方案中，PCR循環(huán)包含3個溫度步驟，并在PCR循 環(huán)的3個溫度步驟中的至少一個結(jié)束時測量信號。
在備選實(shí)施方案中，通過在PCR循環(huán)的3個溫度步驟中的至少一 個期間進(jìn)行至少2次測量來隨著時間監(jiān)控信號。
在另一個實(shí)施方案中，PCR擴(kuò)增使用至少20個PCR循環(huán)來獲得， 每個循環(huán)包含變性、退火和延伸的3個步驟，由此每個循環(huán)在10秒-6分鐘、優(yōu)選1 - 3分鐘的時間段內(nèi)進(jìn)行。
在另外一個實(shí)施方案中，3個溫度步驟隨后為與捕獲分子雜交的 步驟。任選地這種雜交在變性步驟后。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲分子僅在雜交步驟期間與PCR溶液接觸， 和檢測的信號是在與不同PCR循環(huán)相關(guān)的雜交步驟期間擴(kuò)增子在捕獲 分子上積聚的結(jié)果。這個實(shí)施方案優(yōu)選通過圖8b中舉例說明的6步驟 的擴(kuò)增/檢測循環(huán)獲得。
31在另一個實(shí)施方案中，捕獲分子在雜交步驟和變性步驟期間與
PCR溶液接觸，和檢測的信號是在給定循環(huán)時擴(kuò)增子在捕獲分子上雜 交的結(jié)果。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過從在退火或延伸步驟時獲得的第二種信 號中扣除在變性溫度步驟時獲得的第一種信號處理數(shù)據(jù)。變性步驟允 許分離擴(kuò)增子的雙鏈和分離雜交鏈與捕獲分子。
在另一個實(shí)施方案中，測量關(guān)于每一個不同位置本底信號和的信 號，并通過從關(guān)于每一個不同位置的信號值中扣除本底信號處理數(shù)據(jù)。 優(yōu)選地，本底信號是其中捕獲分子結(jié)合的位置周圍的局部本底。優(yōu)選 地如de Longueville等人，2002 ( Biochem. Pharmacol. 64, 1 37-149 ) 所迷進(jìn)行點(diǎn)的定量和/或數(shù)據(jù)分析。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過使不同位置的信號值與固定值比較來獲 得樣品中生物學(xué)生物或生物的部分的定量。
在另一個實(shí)施方案中，通過使達(dá)到固定值所需的PCR循環(huán)數(shù)目 (CT)與參考核苷酸分子的CT比較來獲得定量，所述參考核苷酸分子 優(yōu)選是在與靶核苷酸分子相同的溶液中進(jìn)行擴(kuò)增，并在與靶核普酸分 子相同的陣列上進(jìn)行檢測的核苷酸分子。備選地，通過使達(dá)到固定值 所需的PCR循環(huán)數(shù)目(CT)與其中CTs值針對標(biāo)準(zhǔn)濃度標(biāo)繪的標(biāo)準(zhǔn)曲 線比較來獲得定量。
在另一個備選實(shí)施方案中，通過比較至少2個循環(huán)的信號的動力 學(xué)常數(shù)來獲得樣品中生物學(xué)生物或生物的部分的定量。
生物的定量通過關(guān)于生物中存在的遺傳元件的信號的定量來優(yōu)選 進(jìn)行。有利地，通過比較對于生物特異的靶的信號數(shù)據(jù)與加入分析溶 液中的標(biāo)準(zhǔn)拷貝的預(yù)定數(shù)目，就樣品中的拷貝數(shù)而言進(jìn)行特定生物的 定量。
在另一個實(shí)施方案中，通過比較對于生物特異的靶與對于家族特 異的靶的量相對于其家族進(jìn)行一種生物的定量。
在具體實(shí)施方案中，不同靶的PCR擴(kuò)增通過PCR來進(jìn)行，所述PCR
具有有尾引物，并使用與有尾引物的尾部相同或互補(bǔ)的第二種引物。
32在具體實(shí)施方案中，有尾引物用于擴(kuò)增耙和標(biāo)準(zhǔn)。PCR溶液還包含與 有尾引物的尾部相同或互補(bǔ)的第二種引物。如Knut等人(Nucleic Acids Research,第31巻，第e62， 2003頁)描述的，具有共有尾部 的笫 一個有尾引物對針對特異性靶和/或標(biāo)準(zhǔn)，并且第二種引物對針對 尾部。他們還提出在用第二種引物對擴(kuò)增5 - 4 0循環(huán)前破壞有尾引物。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用有尾引物和笫二種引物進(jìn)行擴(kuò)增， 兩者從擴(kuò)增開始都存在，而不破壞有尾引物。這種方法需要使用有尾 引物和笫二種引物之間的合適比，前者比后者第至少5倍，優(yōu)選低IO倍。
在具體實(shí)施方案中，待檢測和/或定量的生物的部分是表達(dá)的基因 或mRNA,或其互補(bǔ)cDNA。該方法包括下述步驟
將mRNA拷貝成cDNA，使用能夠擴(kuò)增來自相同生物的至少2種同 源核苷酸序列的引物對，通過至少2個PCR循環(huán)將所述cDNA或其部分 擴(kuò)增成雙鏈靶核苷酸序列；
使所述靶核苷酸序列與單鏈捕獲分子接觸，所述單鏈捕獲分子在 陣列的位置中與不溶性固體載體共價結(jié)合，和其中所述捕獲分子包含 能夠與所述靶核香酸序列特異性結(jié)合，而不與所述至少4種其他同源 核苷酸序列結(jié)合的10 - 600個堿基的捕獲部分，以及檢測所述靶核苷 酸序列與所述捕獲分子的特異性雜交，其中捕獲分子上的雜交與用于 鑒定和/或定量樣品中的生物學(xué)生物或生物的部分的實(shí)時PCR過程組 合在一個過程中。
在具體實(shí)施方案中，通過使用用于擴(kuò)增的引物對拷貝核苷酸序列。
在另一個實(shí)施方案中，在相同測定法中擴(kuò)增和鑒定和/或定量樣品 中存在的1-4種核苷酸序列、優(yōu)選l-20種核普酸序列。
有利地，本發(fā)明的方法可以用于鑒定和/或定量組分或(微)生物 的幾個群、亞群或亞亞群的存在。彼此相關(guān)的組分使用通用引物進(jìn)行 擴(kuò)增。預(yù)期可能存在于樣品中的可能的個體遺傳序列(核苷酸和/或氨 基酸序列)將與相應(yīng)的特異性捕獲分子結(jié)合，這在預(yù)期位置處形成信 號。這允許鑒定對于組分或包含所述組分的(微生物)的群、亞群或
33亞亞群特異的靶。
例如，通過本發(fā)明的方法鑒定的生物組分可以是相同(微)生物 特異的或不同(微)生物特異的不同核苷酸序列。所述分子的例子是
呈現(xiàn)高同源性的同源核苷酸序列，例如受體、HLA分子、細(xì)胞色素P450 等。
此外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)可以顯著簡化此類生物樣品中存在的許多 其他中的一種或幾種(微)生物或其部分的鑒定或定量。通過檢測、 定量和/或可能地記錄陣列上單個信號的存在，所述信號獨(dú)特地起因于 特異性捕獲分子及其相應(yīng)的靶核苷酸序列，通過組合使用共同引物對 的單次擴(kuò)增和可能的(微)生物或其部分的鑒定來獲得鑒定和/或定量。 隨后所述檢測的乾核苷酸序列的存在與對于所述(微)生物特異的核 苷酸序列的身份相關(guān)。
這意指本發(fā)明的方法將允許容易的鑒定和/或檢測在其他同源序 列中的特異性序列，以及其靶核苷酸序列的定量，所述靶序列具有對 于特定(微)生物特異的核苷酸序列。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過檢測和可能地記錄在其中先前 結(jié)合特異性捕獲分子的一個特定位置處的單點(diǎn)信號，在擴(kuò)增循環(huán)期間 無需洗滌而直接獲得此類鑒定和/或定量，并且甚至在可能的污染物的 存在下。鑒定不是微陣列上的特定模式的分析結(jié)果，如在現(xiàn)有技術(shù)系 統(tǒng)中提出的。因此，本發(fā)明的方法不一定需要如由現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)要求 的通過圖像處理工具和相應(yīng)的軟件詳細(xì)分析模式。
本發(fā)明通過下述發(fā)現(xiàn)變得可能，作為單鏈存在的靶序列，甚至連 同在相同溶液中存在的其互補(bǔ)鏈，可以通過使用由至少2部分組成的 結(jié)合捕獲分子在具有高靈敏度的陣列上與其他同源序列區(qū)分開，所述 2部分一個是由與栽體(優(yōu)選非孔栽體)單一和有利地預(yù)定(限定) 連接結(jié)合的間隔物部分，和其為能夠與核苷酸靶序列雜交的特異性核 苷酸序列的另 一個部分一一捕獲部分。
當(dāng)高濃度的捕獲分子與固體載體的表面結(jié)合時，這種檢測得到增加。
34此外，當(dāng)相對于雜交擴(kuò)增子鏈的游離末端捕獲分子的捕獲部分的
位置對應(yīng)下述特征時位于捕獲分子的間隔物部分側(cè)的擴(kuò)增子的游離 末端(間隔物末端)超過位于溶液中的游離末端(非間隔物末端)至 少50個堿基，檢測得到極大增加。
高濃度、長核苷酸序列和捕獲分子的捕荻部分的特異性設(shè)計(jì)的使 用產(chǎn)生允許本發(fā)明的未預(yù)料到的特有特征。DNA雜交的理論提出溶液 中的2個DNA互補(bǔ)序列之間的雜交率與DNA長度的平板根成比例，較 小的序列是限制因素(Wetmur和Davidson, J. Mol. Biol,第3巻， 第584頁，1968 )。為了獲得所需特異性，與靶比較，捕獲分子的特 異性序列將必須很小。此外，靶通過PCR擴(kuò)增來獲得并且是雙鏈的， 從而使得它們在溶液中再結(jié)合比它們在固定在固體載體上的小序列上 雜交快得多，在固體栽體中擴(kuò)散很低從而使反應(yīng)速率甚至減少更多。 在使用短特異性捕獲部分序列的雜交的得率中觀察到大增加是未預(yù)料 的。在本發(fā)明中，在PCR的不同循環(huán)期間進(jìn)行檢測。這意指擴(kuò)增子不 能被切割，因?yàn)榉駝t擴(kuò)增將在后續(xù)循環(huán)中終止。結(jié)果是甚至更加未預(yù) 料的，因?yàn)榫捅仨毰c2個完全不同過程相容的裝置、溶液和物理參數(shù) 而言，檢測與PCR循環(huán)相容在固體載體陣列上完整擴(kuò)增子的特異性 擴(kuò)增和特異性檢測。同樣未預(yù)料到的是下述事實(shí)，讀數(shù)可以在1-5
分鐘內(nèi)并甚至在退火步驟期間完成，從而使得所需擴(kuò)增時間不或僅略 微延長超過在反應(yīng)管中進(jìn)行的常規(guī)PCR。
本發(fā)明還涉及鑒定得自生物學(xué)(微)生物或其部分的靶核苷酸序 列，特別是來自至少4種其他同源(微)生物或其部分的生物樣品中 可能存在的基因。這些其他(微)生物可能存在于相同生物樣品中， 并且具有與靶同源的核苷酸序列。
所述鑒定最好通過經(jīng)由共同引物對基因擴(kuò)增所述核苷酸序列(靶 和同源序列)獲得。可以獲得可能的不同靶擴(kuò)增核苷酸序列之間的區(qū) 分。通過在陣列的表面上雜交擴(kuò)增序列有利地獲得這種區(qū)分。陣列包 含在給定位置處對于靶核苷酸序列特異的捕獲分子，所述靶核苷酸序 列對于生物樣品中可能存在的每種(微)生物特異。通過鑒定和可能地記錄信號來檢測特異性乾核苷酸序列，所述信號起因于這種耙核苷 酸序列與其相應(yīng)的捕獲分子在預(yù)期位置處的特異性結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，用于基因擴(kuò)增的優(yōu)選方法是使用2種反向平行的通 用引物的PCR，所述通用引物可以識別所有所述靶同源核苷酸序列， 但也可以使用其他基因擴(kuò)增方法。
(微)生物可以存在于任何生物材料或樣品中，包括得自病毒、 真菌、細(xì)菌、植物或動物細(xì)胞包括人體的遺傳材料。生物樣品還可以 是其中存在微生物、異生物質(zhì)或污染物質(zhì)的任何培養(yǎng)基，以及得自植
物或動物(包括人)器官、組織、細(xì)胞或生物學(xué)體液(血液、血清、 尿、唾液等)的提取物。
可以通過使用生物學(xué)生物或生物的部分的特異性鑒定(診斷和/ 或定量)試劑盒來進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法，所述試劑盒包含用于執(zhí)行 本發(fā)明的方法的工具和介質(zhì)。具體地，優(yōu)選試劑盒包含
-在其上共價結(jié)合單鏈捕獲分子的不溶性固體載體表面，根據(jù)陣 列將所述捕獲分子排列在固體載體的表面上，其中所述陣列包含在載 體的不同位置處結(jié)合的至少4種不同單鏈捕獲分子/cm2固體栽體表 面，和其中所述捕獲分子包含10 - 600個堿基的捕獲部分，其能夠與 所述生物或其部分的核苷酸序列特異性結(jié)合，
-用于執(zhí)行基因擴(kuò)增連同鑒定和/或定量來自所述生物或其部分 的擴(kuò)增核苷酸序列的反應(yīng)室，其中實(shí)時進(jìn)行關(guān)于生物的任何擴(kuò)增序列 的存在的檢測和基因擴(kuò)增。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲分子與至少4種同源靶序列特異性結(jié)合， 所述同源靶序列為待檢測和/或定量的生物或其部分的擴(kuò)增核苷酸序 列。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲分子能夠與具有高于30%、優(yōu)選高于60 o/。、更優(yōu)選超過8 0 %的同源性的靶序列特異性結(jié)合。
在另外一個優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲分子的捕獲部分具有低于90% 并仍低于80%的序列同源性。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，陣列包含在栽體的不同位置處結(jié)合的，至少
364種和優(yōu)選20種不同的單鏈捕獲分子/cm2固體載體表面的密度。
在另外一個實(shí)施方案中，陣列包含在載體的不同位置處結(jié)合的， 至少100種和優(yōu)選300種不同的單鏈捕獲分子/c^固體載體表面的密 度。
在一個實(shí)施方案中，反應(yīng)室由彼此流體接觸的2個區(qū)室組成。 在另外一個實(shí)施方案中，提供具有含結(jié)合的捕獲分子的陣列的一 個區(qū)室。
在另一個實(shí)施方案中，診斷和/或定量試劑盒進(jìn)一步包含dNTPs、 耐熱DNA聚合酶和緩沖液。更完全的試劑盒還將包含引物。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，診斷和/或定量試劑盒進(jìn)一步包含待用作內(nèi)部 標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸分子。
在另一個實(shí)施方案中，載體和反應(yīng)室是藥筒的部分。
在試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，能夠與其相應(yīng)的靶核苷酸序列雜交 的捕獲分子的特異性序列(捕獲部分)具有15-50個堿基的序列，或 備選地通過至少6.8 nm的間隔物部分與固體載體的表面分開。
在試劑盒的另一個實(shí)施方案中，間隔物部分是超過20個堿基、優(yōu) 選超過40個堿基、更優(yōu)選超過90個堿基的核苷酸序列。
在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，捕獲分子存在于具有l(wèi)微米2-75mm2 和優(yōu)選0. 005 - 0. 2 mm2的表面積的不溶性固體載體上的定位區(qū)域中。
根據(jù)本發(fā)明方法、試劑盒和裝置特別適合于鑒定靶。優(yōu)選地靶存 在于生物學(xué)(微)生物或其部分中。耙可以存在于其中還存在至少4、 12、 15種或甚至更多同源序列的生物樣品中。由于高同源性，所述核 苷酸序列可以通過通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，從而使得靶核苷酸序列的鑒定 通過在其與相應(yīng)的捕獲分子結(jié)合后區(qū)分特異性獲得，所述相應(yīng)的捕獲 分子先前結(jié)合在微陣列上的給定位置處。當(dāng)捕獲分子通過機(jī)器人、以 高密度并根據(jù)陣列點(diǎn)樣在固體載體表面上時，靈敏度可以得到更大增 加。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是使用點(diǎn)樣在陣列上的捕獲分子的量，導(dǎo) 致約0. 01 -約5 pmoles等價序列/cm2固體載體表面的結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒還可以摻入用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的各
37種介質(zhì)或裝置。所述試劑盒還可以包括在自動化儀器中，例如高流通 量篩選儀器，用于檢測和/或定量待分析的生物樣品中存在的多種核苷 酸序列。所述試劑盒或儀器可以適合于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的所有 步驟或僅幾個特定步驟。
在根據(jù)本發(fā)明的方法和試劑盒中，結(jié)合的捕獲分子的長度優(yōu)選為
約30 -約600個堿基，更優(yōu)選約40 -約400個堿基，并再更優(yōu)選約 40-約150個堿基。可以使用更長的核苷酸序列，如果它們不減少靶 核苷酸序列的結(jié)合得率，如可以起因于其采用基于發(fā)夾的二級結(jié)構(gòu)， 或通過彼此相互作用。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，能夠與其相應(yīng)的靶核苷酸序列雜交的捕獲分 子的特異性序列(即捕獲部分)通過具有至少6.8nm的長度的間隔物 部分與固體載體的表面分開，所述長度相應(yīng)于至少44個碳鍵。
間隔物部分是超過20個核苷酸，優(yōu)選長于40個核苷酸，更優(yōu)選 長于90個核苷酸的核苷酸序列。核苷酸可以包含核苷酸衍生物，例如 PM。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲分子的特異性序列的長度為約10-600 個堿基，優(yōu)選20 - 50個堿基，更優(yōu)選15-4Q個堿基。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所有捕獲分子是長度超過100個堿基 的多核苷酸。
在另一個實(shí)施方案中，捕獲分子與結(jié)合至固體載體的聚合物分子 連接。聚合物優(yōu)選是至少IO個原子的鏈，優(yōu)選選自聚乙二醇、聚氨基 酸、聚丙烯酰胺、聚氨基糖、聚糖精(polyglucides)、聚酰胺、聚 丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚環(huán)氧化物或聚酯(可能分支的聚合物)。
在具體實(shí)施方案中，反應(yīng)室包含在擴(kuò)增過程期間制成防水的入口 和出口 。
在另一個實(shí)施方案中，室是不對稱的，其中第一個部分具有比第 二個部分更低的高度。在這個實(shí)施方案中，陣列優(yōu)選存在于室的第一 個部分上。
在具體實(shí)施方案中，室被制成通過微通道彼此流體接觸的2個部分，其中 一個部分具有微陣列。在具體設(shè)計(jì)中，微通道具有不超過3 mm, 優(yōu)選小于1薩的寬度。
在具體實(shí)施方案中，栽體和/或室材料選自玻璃、電子裝置、硅載 體、塑料載體、硅石、金屬及其混合物，其中所迷栽體以選自載片、 圓盤、凝膠層和微珠的形式進(jìn)行制備。
在另外具體的實(shí)施方案中，載體和/或室材料包含環(huán)烯烴聚合物， 優(yōu)選Zeonex⑧或Zeonor ( Zeon Chemicals， Louisvi 1 le， USA ) 、 Topas、 Udel、 Radel或THV。
如果待檢測的序列之間的同源性很低(30 - 60 % )，那么對于每
而，發(fā)現(xiàn)足夠保守以提供"共有"序列的序列的部分更加困難，所述 "共有"序列將擴(kuò)增或拷貝所有所需序列。如果一對通用引物不足以 擴(kuò)增所有同源序列，那么使用2個或更多引物對的混合物，以便獲得 所需擴(kuò)增。通過相同通用引物擴(kuò)增的同源序列的最低數(shù)目是2，但不 存在關(guān)于這個數(shù)目的上限。
如果序列顯示高度同源性，高于60%并甚至高于90% ，那么容易 獲得用于通用引物的共有序列的發(fā)現(xiàn)，但用于特異性捕獲分子的選擇 變得更加困難。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲分子是短于ioo個堿基 的化學(xué)合成的寡核苷酸序列(在程序化自動合成儀上容易進(jìn)行)。此 類序列可以具有用于與載體共價附著的官能化基團(tuán)。
的質(zhì)粒內(nèi)的序列合成更長的捕獲分子。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，捕獲分子的捕獲部分包含約3-約60個 堿基，優(yōu)選約15 -約40個堿基和更優(yōu)選約20 -約30個堿基。這些堿 基優(yōu)選指定為位于捕獲分子的一個末端處或附近的連續(xù)序列。這個部 分視為用于檢測的特異性序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，位于捕 獲部分和載體之間的序列是非特異性序列，優(yōu)選地間隔物部分。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，包含約3-約60個堿基、優(yōu)選約15-約40個堿基和更優(yōu)選約20-約30個堿基的捕獲部分位于約30 -約600個堿基的捕獲分子上。
根據(jù)本發(fā)明的方法適合于檢測和/或定量由DM或RNA制成的靶， 包括在其總長上部分或全部同源的序列。
即使當(dāng)耙呈現(xiàn)與其他分子大于30%、大于60%和甚至大于80% 的同源性(或序列同一性)時，也可以執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，捕獲分子有利地與不溶性固體載體共價 結(jié)合(或固定)，如下文所述的優(yōu)選通過其末端之一。
根據(jù)本發(fā)明的方法給出允許鑒定(檢測和定量)在溶液中的擴(kuò)增 子的結(jié)果，所述擴(kuò)增子濃度為低于約10 nM、低于約1 nM、優(yōu)選低于 約0. 1 nM和更優(yōu)選低于約0. 01 nM (=1 fmole/100孩i升)。
本發(fā)明的另一個重要方面是在表面上使用極濃縮的捕獲分子。如 果這個濃度太低，那么結(jié)合的得率可能是無法檢測的。優(yōu)選在點(diǎn)樣溶 液中約600 -約3， OOOnM的捕獲分子濃度。然而，在有利的情況下(當(dāng) 共價固定的得率很高時或當(dāng)待檢測的靶是單鏈并以高濃度存在時)， 低至約100 nM的濃度仍給出陽性結(jié)果。此類低點(diǎn)樣濃度對應(yīng)低至20 fmoles/cm2的捕獲分子密度。另一方面，更高的密度在測定法僅受捕 獲溶液的濃度限制。高于3， 000 nM的濃度給出良好結(jié)果。
與存在的捕獲分子的量比較，在點(diǎn)上"結(jié)合"的把的量很小，并 且與溶液中存在的靶分子比較，也很小。
在一個實(shí)施方案中，對于在擴(kuò)增或拷貝后獲得的全長序列進(jìn)行檢 測。當(dāng)通過摻入標(biāo)記核苷酸進(jìn)行標(biāo)記時，更多的標(biāo)記存在于雜交耙上， 使得測定法靈敏。
在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括其他結(jié)合的捕獲分子 的使用，其具有與先前那種相同的特征并且用于鑒定來自另 一群同源 序列的靶。這些同源序列優(yōu)選通過通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。
在微生物領(lǐng)域中，優(yōu)選使用對于微生物的每個科或?qū)偬禺惖耐ㄓ?引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后根據(jù)本發(fā)明通過使用捕獲分子在陣列上鑒定這些 各種科的 一些或所有物種。在相同陣列上可以有利地進(jìn)行其他序列的
40檢測(例如，通過允許與用于定量的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列雜交，與用于相 同或不同微生物菌株的共有捕獲分子雜交，與允許檢測經(jīng)由微生物的 可能的抗生素抗性基因或用于雜交的陽性或陰性對照的序列雜交)。
所述其他捕獲分子可以具有長于10 - 60個堿基和高至600個堿基的總 長度的特異性序列，并且還與不溶性固體栽體結(jié)合(優(yōu)選在與本發(fā)明 相關(guān)的其他結(jié)合的捕獲分子制成的陣列中)。長捕獲分子還可以作為 共有捕獲分子存在于陣列上，用于與來自相同科或?qū)俚奈⑸锏乃?序列雜交，從而給出關(guān)于生物樣品中此類科、屬的微生物的存在與否 的信息。
在具體實(shí)施方案中，相同陣列還具有對于細(xì)菌群特異的捕獲分子， 和作為對于革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌林，或甚至所有細(xì)菌的特異性 應(yīng)用。
另 一種應(yīng)用是來自相同物種的共有蛋白質(zhì)例如各種細(xì)胞色素 P450的同源基因的檢測，通過特異性捕獲分子伴隨或不伴隨對于生物 樣品中可能存在的所有細(xì)胞色素P450的共有捕獲分子。通過逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA在基因水平上進(jìn)行此類檢測。
根據(jù)本發(fā)明的固體載體優(yōu)選由選自玻璃、電子裝置、硅栽體、塑 料載體材料、硅石、金屬及其混合物的材料以諸如載片、光盤、凝膠 層、層、微珠的形式制成。有利地，所述固體栽體是單個載玻片，其 可以包含用于改善根據(jù)本發(fā)明的方法的另外工具(條形碼、標(biāo)記等) 或介質(zhì)。優(yōu)選載體之一包含具有化學(xué)和熱穩(wěn)定性、低熒光和光穩(wěn)定性 的聚合物，優(yōu)選環(huán)烯烴聚合物，優(yōu)選Zeo認(rèn)⑧或Zeonor ( Zeon Chemicals, Louisville, USA)或但不限于Topas、 Udel、 Radel或 肌
有利地通過眾所周知的擴(kuò)增方案來獲得在根據(jù)本發(fā)明的方法中使 用的擴(kuò)增步驟，所述擴(kuò)增方案優(yōu)選選自PCR、 RT-PCR、 LCR、 CPT、 NASBA、 ICR或Avalanche DNA技術(shù)。
有利地，待鑒定的靶核苷酸序列在其與單鏈捕荻分子雜交前進(jìn)行 標(biāo)記。優(yōu)選還在變性前在擴(kuò)增序列上獲得所述標(biāo)記(使用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù))(如果該方法包括擴(kuò)增步驟)。
有利地，靶核苷酸序列的長度選擇為有限長度，優(yōu)選50 - 2000個堿基、更優(yōu)選200 - 800個堿基。這種優(yōu)選需求依賴發(fā)現(xiàn)通用引物以擴(kuò)增樣品中可能存在的所需序列的可能性。太長的靶核苷酸序列可以更快地再分配，并采用可能抑制在捕獲分子上的固定的二級結(jié)構(gòu)。
通過經(jīng)由通用引物進(jìn)行raRNA的逆轉(zhuǎn)錄獲得同源表達(dá)基因的檢測，優(yōu)選通用引物是polydT。在一個實(shí)施方案中，如本文所描述的，隨后通過通用引物擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄的cDNA。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，根椐本發(fā)明的方法有利地用于鑒定不同葡萄球菌屬(Staphylococcus )物種或變種，優(yōu)選金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(S. epidermidis )、腐生葡萄球菌(S. saprophyt icus )、溶血性葡萄球菌(S. hominis)或(S. haemolyticus )。對于可能一起或分開存在于生物樣品中的這種類型的同源器官，通過檢測所述不同物種中的尸e加J基因的遺傳變體來獲得鑒定，優(yōu)選通過使用尸ezW遺傳序列中的共同位置。在本發(fā)明的另一個方面中，在陣列上通過相同引物擴(kuò)增和鑒定后可以檢測16個葡萄球菌屬物種。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面是檢測分枝桿菌屬(Mycobacteria)物種、結(jié)核分枝桿菌和其他物種，優(yōu)選鳥分枝桿菌(M. avium)、胃分枝桿菌(M. gastrii)、戈登分枝桿菌(Mgordonae)、月包內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulars)、麻風(fēng)分枝桿菌(M. leprae)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasi )、莫爾墨埃斯分支桿菌(M. malmoense)、海洋分枝桿菌(M.marinum)、瘰疬分支桿菌(M. scrofulaceum)、猿猴分枝桿菌(M.simiae)、蘇力口分枝桿菌(M. szulgai)、蟾分枝桿菌(M. xenopi )、潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans)。
在本發(fā)明的進(jìn)一步應(yīng)用中， 一種陣列可以特異性檢測來自屬于相同屬的幾個細(xì)菌物種或來自幾個屬的擴(kuò)增序列，所述幾個屬如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、嗜血菌屬或不同細(xì)菌物種和屬于革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌的屬。
優(yōu)選地，促旋酶(亞單位A)序列的引物和特異性部分用于獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。已選擇這些引物作為通用引物用于擴(kuò)增測試的所有細(xì)菌的促旋酶基因，并且它們可能將擴(kuò)增來自許多其他可能的細(xì)菌物種和屬和科的促^走酶。
本發(fā)明特別適合于檢測術(shù)語下述屬科中的至少2個的細(xì)菌葡萄球菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、嗜血菌屬、假單月包菌屬(Pseudomonas )、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter )、奈瑟球菌屬(Neisseria )、變形桿菌屬(Proteus )、沙門菌屬(Salmonella )、西蒙斯氏菌屬(Simonsiella )、里默氏菌屬(Riemerella)、埃希氏菌屬(Escherichia)、奈瑟球菌屬(Neisseria)、腦膜炎球菌屬(Meningococcus)、 莫拉氏菌屬 (Moraxella)、 金氏桿菌屬(Kingella)、 色桿菌屬(Chromobacterium )、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)。
相同應(yīng)用被開發(fā)用于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。這些受體結(jié)合所有種類的配體，并且通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性負(fù)責(zé)至細(xì)胞質(zhì)以及經(jīng)常至核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。形成通用引物用于各種亞型的GPCR用于多巴胺以及用于血清素和組胺。對于組胺和其他配體同樣可能。各種HLA類型的檢測也是本發(fā)明的應(yīng)用之一。HLA是從一個個體到另一個不同的同源序列。HLA類型的測定在組織移植中特別有用，以便測定供體和受體之間的相容性程度。它還是用于免疫接種的有用參數(shù)?？紤]到同源序列之間的大量亞型和緊密聯(lián)系， 一般不可能完全區(qū)分一種序列與所有其他序列，并且對于它們中的一些，存在1次或2次交叉反應(yīng)。在這種情況下，在陣列上加入與擴(kuò)增序列的另一個位置互補(bǔ)的第二種捕獲分子，以便使得鑒定完全。
還可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行多態(tài)性序列(即使僅相差1個堿基，它們也可以視為同源的)的檢測。細(xì)胞色素P450形式的區(qū)分是本發(fā)明的一個重要應(yīng)用，因?yàn)槟承┩N型的存在改變某些藥物的代謝。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明對于區(qū)分細(xì)胞色素P450 2D6、 2C9和2C19的同種型特別有用。更一般地，本發(fā)明特別良好地適合于給生物基因分型，或用于區(qū)分稱為單核苷酸多態(tài)性(SNP)相差1個堿基突變或缺失的序列。本發(fā)
43明的獨(dú)特特征在于對于擴(kuò)增序列直接進(jìn)行雜交步驟，無需拷貝成RNA并將它們切割成碎片。
此外， 一種陣列可以特異性檢測來自屬于幾個科的幾個動物物種和屬的擴(kuò)增序列，所述幾個科如(Galinacea)、兔科(Leporidae )、豬科(Suidae)和?？?Bovidae)。
一種陣列可以特異性檢測來自幾個科例如鯖科(Scombridae)、鮭科(Salmonidae )、 無須鱈科(Merluccidae )、 鰈科
(Pleuronectidae)、鱈科(Gadidae)和紳科(Clupeidae)的屬于幾個屬例如舵鰹屬(Auxis)、狐鰹屬(Sarda)、鯖屬(Scomber)、金槍魚屬(Thu謹(jǐn)s) 、 (Oncorhynch)、鮭屬(Salmo)、無須鱈屬
(Merluccius)、 鰈屬(Pleuronectes ) 、 Platichtlys、 馬舌鰈屬
(Reinhardtius )、青鱈屬(Pollachius)、鱈屬(Gadus )、沙丁魚屬(Sardina)的幾個魚類物種例如太平洋鱈(G. morhua )、大頭鱈(G. raacrocephalus )、川鰈(P. flesus )、無須鱈(M. mer luccius)、虹鱒(0. mykiss)、 鰈(P. platessa)、 青鱈(P. virens )、 大西洋鮭(S. salar )、歐洲沙丁魚(S. pilchardus )、扁舵鰹
(A. thazard )、長鰭金槍魚(T. alalunga )、大眼金槍魚(T. obesus)、馬舌鰈(R. hippoglossoides )、歐鱒(S. trutta )、狐鰹(S.sarda )、藍(lán)鰭金槍魚(T. thynnus)、鯖魚(S. scombrus)的擴(kuò)增序列。其他同源序列允許測定屬于幾個科的植物物種和屬，例如馬鈴薯、番茄、稻屬、玉蜀黍?qū)?、大豆、小麥、大麥、豆、胡蘿卜。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，根據(jù)本發(fā)明的方法有利地用于鑒定肉類的起源。
優(yōu)選地，細(xì)胞色素b序列的引物和特異性部分用于獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。已選擇這些引物作為通用引物用于擴(kuò)增測試的所有動物的細(xì)胞色素B基因，并且它們可能將擴(kuò)增來自許多其他動物物種和屬和科的細(xì)胞色素B。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，根據(jù)本發(fā)明的方法有利地用于鑒定魚類的起源。
44根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一 步方面，根據(jù)本發(fā)明的方法有利地用于鑒定植物的起源。
優(yōu)選地，用于獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的蔗糖合酶序列的引物和特異性部分是下文在實(shí)施例中描述的那些。已選擇這些引物作為通用引物用于擴(kuò)增測試的所有植物的蔗糖合酶基因，并且它們可能將擴(kuò)增來自許多其他植物物種和屬和科的蔗糖合酶。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，根據(jù)本發(fā)明的方法有利地用于鑒定基
因修飾生物(GM0s)。通過將一種或多種外部基因連同其他調(diào)節(jié)或構(gòu)建序列插入生物的基因組內(nèi)來產(chǎn)生GM0s。
優(yōu)選地，用于獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的所述蔗糖合酶序列的引物和特異性部分是下文在實(shí)施例中描述的那些。已選擇這些引物作為通用引物。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，如上文引用的例子中提供的以及實(shí)施例1-2中呈現(xiàn)的，根據(jù)本發(fā)明的方法有利地用于鑒定生物或其部分。
本發(fā)明的另一個方面涉及包含所述上述序列(特別是實(shí)施例中描述的特異性捕獲分子)的生物芯片或微陣列的任何部分，以及通過任
二于科類型二所述生t特異的耙序^二t般篩選方法。'
通過一系列描述的方法但不限于下文呈現(xiàn)的那些在陣列上檢測雜
交靶，，只要它們與由PCR給出的限制相容。已提出非標(biāo)記方法，其可應(yīng)用于陣列上并且基于通過目前應(yīng)用于陣列的質(zhì)鐠法(美國專利號5,821, 060 )或通過？鑒定乾。
標(biāo)記相關(guān)的檢測方法眾多。97/27317中給出了不同標(biāo)記分子的綜述。它們使用已標(biāo)記的引物獲得，或通過在拷貝或擴(kuò)增步驟期間酶促摻入標(biāo)記核苷酸或通過嵌入劑隨后為熒光檢測(W0 97/27329 )。
優(yōu)選標(biāo)記是用熒光檢測器以高靈敏度檢測的熒光染料。焚光染料包括但不限于，適合于通過使用商購可得的陣列掃描儀(如可從例如General Scanning, Genetic Microsystem獲得)分才斤陣歹寸的花青脊染料(Cy3、 Cy5和Cy7 )。優(yōu)選地，關(guān)于花青苷3的激發(fā)波長為540- 558 nm,其峰值在550 nm處，并且發(fā)射波長為562 - 580 nm，其峰
45優(yōu)選地，關(guān)于花青苷5的激發(fā)波長為639 - 659 nm，其峰值在649 nm處，并且發(fā)射波長為665 - 685認(rèn)，其峰值在670 nm處。優(yōu)選地， 關(guān)于花青苷7的激發(fā)波長為733 - 753認(rèn)，其峰值在743 nm處，并且 發(fā)射波長為757 - 777 nm，其峰值在767 rnn處。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，與溶液中的熒光比較，與捕獲分子 上存在的擴(kuò)增子相關(guān)的熒光信號的檢測產(chǎn)生陣列上的信號增加。在具 體實(shí)施方案中，陣列上存在的熒光染料的檢測差異基于與溶液中的游 離移動分子比較，與捕獲分子如MA雙螺旋上雜交的結(jié)合分子相關(guān)的 熒光染料的各向異性中的差異。各向異性依賴待檢測的熒光染料的移 動性和壽命。關(guān)于在陣列上的各向異性的測定方法目前可從 Biotechnologies Inc. ， 238 East Caribbean Drive, Sunnyvale, CA 94089 (http: //www. blueshiftbiotech.com/dynamicfl.html ) 獲得。
在具體實(shí)施方案中，熒光團(tuán)分子的檢測優(yōu)選以時間分辨方式獲得。 熒光分子具有與發(fā)射過程相關(guān)的熒光壽命。 一般地關(guān)于小焚光團(tuán)如熒 光素和羅丹明的壽命為2 - IO納秒范圍。時間分辨熒光(TRF)測定法 使用長命(〉1000 ns)熒光團(tuán)，以區(qū)分測定法信號與短命干擾例如基 質(zhì)或熒光樣品的自體熒光，其幾乎一直具有比IO ns少得多的壽命。 壽命優(yōu)選通過在附近存在與其發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移的另一種熒光團(tuán)或猝 滅劑得到調(diào)節(jié)。用于TRF的器械只是使發(fā)射的測量延遲直至短命熒光 已消失和長命報(bào)道熒光仍持續(xù)后。焚光壽命可以以2種基本方式進(jìn)行 測定。時域技術(shù)使用極短脈沖(皮秒)的激發(fā)，然后隨著納秒壽命過 去實(shí)時監(jiān)控發(fā)射。使衰變曲線與指數(shù)擬合產(chǎn)生壽命。頻域技術(shù)以兆赫 頻率調(diào)節(jié)發(fā)射，然后觀察響應(yīng)的發(fā)射強(qiáng)度波動。時相延遲和振幅調(diào)節(jié) 隨后可以用于測定壽命。關(guān)于快速和經(jīng)濟(jì)的壽命成像的頻率技術(shù)目前 可從Blueshift Biotechnologies Inc獲得。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測雜交擴(kuò)增子的步驟在溶液中產(chǎn) 生比在雜交捕獲分子上更低的擴(kuò)增子熒光信號。
46在具體實(shí)施方案中，通過熒光染料的猝滅獲得與雜交擴(kuò)增子比較 在溶液中較低的擴(kuò)增子熒光信號。用熒光染料標(biāo)記引物，所述熒光染 料當(dāng)在溶液中游離時是熒光的，并且當(dāng)摻入擴(kuò)增子內(nèi)時被猝滅。優(yōu)選 通過使用摻入第二條非熒光擴(kuò)增子鏈內(nèi)的猝滅劑來獲得熒光猝滅，所
述幹滅劑例如但不限于Dabcyl。 一個具體實(shí)施方案使用PlexorTM技術(shù) (Promega)。這種技術(shù)利用2種經(jīng)修飾的核苷酸之間的高特異性相互 作用異鳥嘌呤(iso-dG)和5'-曱基異胞嘧啶(iso-dC)。在實(shí)時 PCR反應(yīng)中，合成在5'末端處具有iso-dC殘基和熒光染料的一種引物。 第二種引物是未標(biāo)記的。在反應(yīng)混合物中包括經(jīng)修飾以包括Dabcyl 作為猝滅劑的Iso-dGTP核苷酸。在擴(kuò)增期間僅與iso-dC殘基互補(bǔ)的 位置處摻入Dabcy卜iso-dGTP，并且作為2種殘基之間的緊密接近的 結(jié)果，熒光被胖滅。在捕獲分子上攜帶熒光染料的擴(kuò)增子鏈的雜交將 恢復(fù)熒光發(fā)射。
在備選實(shí)施方案中，通過存在于溶液中和固定在捕獲分子上的擴(kuò) 增子之間的熒光激發(fā)的最佳波長中的差異獲得在溶液中較低的擴(kuò)增子 信號。在另外一個實(shí)施方案中，通過存在于溶液中和固定在捕獲分子 上的擴(kuò)增子之間的熒光發(fā)射的最佳波長中的差異獲得在溶液中較低的 擴(kuò)增子信號。
優(yōu)選地，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)獲得熒光發(fā)射波長中的 差異。在一個具體實(shí)施方案中，用具有給定最近熒光發(fā)射波長并充當(dāng) 供體的熒光染料(Fl)標(biāo)記引物，所述熒光染料在溶液中在其激發(fā)波 長處進(jìn)行激發(fā)時是熒光的。在熒光染料受體(F2)附近將引物摻入擴(kuò) 增子內(nèi)將導(dǎo)致不同于熒光染料F1的最佳熒光發(fā)射波長。通過檢測在對 應(yīng)Fl的最佳發(fā)射的波長處的熒光發(fā)射，信號對于雜交擴(kuò)增子將是最佳 的，并對于存在于溶液中的擴(kuò)增子將是更低的。特別地，合成在5'末 端處具有iso-dC殘基和熒光染料供體(即TAMRA)的引物，并且溶液 包含經(jīng)修飾以包括熒光染料受體(即，Cy5)的Iso-dGTP核苷酸。在 PCR期間，如先前對于PlexorTM技術(shù)(Promega)解釋的，形成具有緊 密接近的2種熒光染料的擴(kuò)增子。隨后使用對于供體最佳的激發(fā)/發(fā)射波長進(jìn)行檢測。由于供體和受體之間的緊密接近，檢測出的熒光在溶 液中減少。在捕獲分子上攜帶供體的擴(kuò)增子鏈的雜交將恢復(fù)最佳熒光 發(fā)射。
上述方法允許在溶液中存在的和在捕獲分子上雜交的擴(kuò)增子之間 的更好區(qū)分。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選對于與捕獲分子結(jié)合的靶上存在 的熒光團(tuán)，而不是溶液中存在的熒光團(tuán)上的那種獲得熒光團(tuán)分子的激 發(fā)。在優(yōu)選方法中，通過集中于陣列的表面上的激光束獲得激發(fā)。具 有激光束的聚焦的掃描儀方法使用包括針孔的共焦掃描方法。許多此
類掃描儀是商購可得的，例如來自 PerkinElmer Life的 ProScanArray⑧掃描儀系列、Affymetrix 428掃描儀、Virtek Vision Chipreader系列等。某些基于熒光激光的檢測目前可用于多孔形式， :i口侈寸^口來自Tecan( Tecan Trading AG， Mannedorf ， Switzerland( http.. 〃www. tecan. com/ )的Saf ir。它們可以適合于本發(fā)明。
在另一個實(shí)施方案中，通過照射陣列基質(zhì)側(cè)獲得熒光染料的激發(fā)， 以便產(chǎn)生對于接近于表面的分子的激發(fā)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于檢 測信號的裝置包含照射不溶性固體載體側(cè)的光源。如由Aurora Photonics Inc. 26791 West Lakeview, Lake Barrington, USA (info扭auroraphotonics. com)提出的，光源優(yōu)選是非校準(zhǔn)激光源或 經(jīng)由一對光纖維束的發(fā)光二極管。
在另外一個實(shí)施方案中，通過在其上固定捕獲分子的纖維光學(xué)提 供熒光激發(fā)。US 6， 503，711提供了基于使用等于或大于光學(xué)元件相互 作用表面的折射率的固定層折射率的系統(tǒng)，從而使得在固定層中的熒 光團(tuán)的直接激發(fā)導(dǎo)致靶核酸的檢測。
某些熒光標(biāo)記可以是特別有利的，例如具有熒光性質(zhì)的納米晶體 顆粒。最常用的是量子點(diǎn)(Han等人，Nature Biotechnology,第19 巻，第631頁，2001 )。它們是熒光的并且隨著時間或用照射不漂白。 它們的穩(wěn)定性使得它們特別適合于在如本發(fā)明中提議的連續(xù)讀數(shù)中使 用。此外，它們包含對于這些顆粒賦予特定性質(zhì)的金屬，從而使得除
48熒光外的其他方法可以用于監(jiān)控其與捕獲分子的附著。這些顆粒的熱 加熱是可以隨著時間監(jiān)控的參數(shù)之一 。金屬吸收光束優(yōu)選地激光束的 能量并誘導(dǎo)顆粒加熱的事實(shí)，已用作用于檢測載體上的低密度金顆粒
的基礎(chǔ)，并且甚至檢測單一顆粒(Boyer等人，Science,第297巻， 第1160頁，2002 )。該方法稱為光熱干涉差。
線性生成頻率光謙法(GFS)的光學(xué)過程的化學(xué)繪圖法(L. Dreesen 等人，ChemPhys Chem，第5巻，第1719頁，2004 )。這種技術(shù)允許 以亞微米空間分辨率實(shí)時成像表面和界面的震動性質(zhì)。通過在基質(zhì)的 表面上混合2個激光束獲得測量， 一個具有可見光(綠色)中的固定 頻率，和另一個具有紅外線中的可變頻率。通過測量由樣品發(fā)出的光 以紅外激光束的頻率函數(shù)獲得在界面處的震動標(biāo)記。這種方法避免標(biāo) 記待檢測的靶并因此它表示具體實(shí)施方案。
用于直接測量納米顆粒的另 一種技術(shù)是雷利散射。這種方法基于 適應(yīng)的光束的使用，以便獲得金屬顆粒中的電子的振動，從而使得從 顆粒獲得可以檢測的電磁輻射(Stimpson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第100巻，第11 350頁，2003 )(通過使用光波導(dǎo)器實(shí)時檢測在 寡核苷酸陣列上的DNA雜交和解鏈)。然而，迄今為止該方法缺乏用 于應(yīng)用于生物樣品所需的靈敏度。
備選地，雷利散射和表面等離子體共振可以應(yīng)用于本發(fā)明中，所 述技術(shù)已廣泛用于檢測抗體/抗原結(jié)合，并且還充分適合于陣列的多參 數(shù)測量和適合于對于生物樣品的所需靈敏度。(Thiel等人， Analytical Chemistry,第69巻，第4948頁，1997 )。
在另一個實(shí)施方案中，可以應(yīng)用石英晶體微量天平，其目前足夠 靈敏，使得它們可以測量小于1納克的質(zhì)量變化(參見Caruso等人， Analytical Chemistry,第69巻，第2043頁，1997 )。這是用于實(shí) 時微陣列檢測的一種建議。
懸臂是用于檢測微陣列上的DNA的另一個選擇。(McKendry等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第99巻，第9783頁，2002 )。
49此外，另一種技術(shù)是考慮其金屬性質(zhì)的納米顆粒的電檢測。首先 應(yīng)用電化學(xué)檢測，但具有低靈敏度。更先進(jìn)和更靈敏的方法是通過差
示脈沖伏安法的檢測(0zsoz等人，Analytical Chemistry,第75巻， 第2181頁，2003 )。
金屬的電阻率和電容性質(zhì)在電子芯片上待檢測的最佳性質(zhì)中。2 個電極之間的金屬的存在誘導(dǎo)芯片或電極的電性質(zhì)中的變化，包括電 容和/或阻抗的電阻率或?qū)щ娦缘淖兓?。?dāng)捕獲分子存在于電極之一上 時，隨后觀察到DNA或蛋白質(zhì)的檢測(Moreno- Hagelsieb等人， Sensors and Actuators B—Chemical,第98巻，第269頁，2004 )。 金標(biāo)記的 DNA的電容測定法已由 Guiducci 等人(Biosens Bioelectron,第19巻，第781頁，2004 )描述。因?yàn)榭梢灾苽浒?幾個小塊的電子芯片，所以可以在不同小塊上檢測不同靶，并且可以 記錄電阻率或電容中的變化。 一種有希望的方法是允許陣列模式和電 極上的位置之間的相容性的交錯電極的使用。盡管這些方法仍不能產(chǎn) 生由生物樣品要求的可靠和靈敏檢測，但其中 一 些仍成功實(shí)現(xiàn)實(shí)時檢 測的需求(參見由Foultier等人，IEE Proc. Nanobiotechnol.，第 152巻，第3頁，2005的關(guān)于納米顆粒的檢測方法的綜述)。
用于檢測顆粒的另 一 種方法是通過例如由Blab等人 (Biophysical J.，第90巻，第L13頁，2006 )描述的光學(xué)方法，根 據(jù)其在陣列上的位置計(jì)數(shù)其。該方法依賴圍繞NanoAbsorder的激光誘 導(dǎo)散射(Laser Induced Scattering around a NanoAbsorder )( USNA )。 它提供在陣列的每個點(diǎn)上的單個納米顆粒的直接計(jì)數(shù)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，在陣列的不同位置上監(jiān)控的信號選自比色 法、熒光、時間分辨熒光、光熱干涉差、雷利散射、拉曼散射、表面 等離子體共振、質(zhì)量的改變、石英晶體微量天平、懸臂、差示脈沖伏 安法、通過非線性生成頻率光譜法的化學(xué)繪圖法、光學(xué)改變、電阻率、 電容、各向異性、折射率和/或計(jì)數(shù)納米顆粒。
定量不僅已考慮在陣列上的雜交得率和檢測規(guī)模(其對于靶和參 考序列是相同的)，還考慮了提取、擴(kuò)增(或拷貝)和標(biāo)記步驟。根據(jù)本發(fā)明的方法還可以包括通過使用以已知濃度加入的標(biāo)準(zhǔn)核 苷酸序列(外部或內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))用于獲得靶核苷酸序列的定量的工具。 捕獲分子也存在于陣列上，以便在與所述靶相同的條件下固定標(biāo)準(zhǔn)(可
能在復(fù)制或拷貝后)；該方法包括定量起因于由捕獲分子和標(biāo)準(zhǔn)之間 的互補(bǔ)堿基配對形成的雙鏈核苷酸序列形成的信號的步驟，以及起因 于所述雙鏈核苷酸序列形成的信號與起因于由捕獲分子和耙之間的互 補(bǔ)堿基配對形成的雙鏈核苷酸序列的信號的相關(guān)分析的步驟，以便定 量生物樣品中待檢測和/或定量的原始核苷酸序列的存在。
有利地將標(biāo)準(zhǔn)加入最初的生物樣品中或在提取步驟后加入，并且 用與靶相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增或拷貝，和/或具有與靶相同或相差不超過 20%的長度以及與靶相同或相差不超過20%的GC含量。更優(yōu)選地， 標(biāo)準(zhǔn)可以設(shè)計(jì)為具有在文件W0 98/11253中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)特征的竟 爭性內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)具有其序列與靶共同的部分和不同的特 異性部分。它在其2個末端處或附近還具有與用于擴(kuò)增或拷貝靶的2 種引物互補(bǔ)的序列和相似的GC含量(W0 98/11253 )。在本發(fā)明的優(yōu) 選實(shí)施方案中，術(shù)語"標(biāo)準(zhǔn)和靶的共同部分"意指對于通過相同引物 擴(kuò)增的所有靶同源的核苷酸序列(即，其屬于待定量的生物的相同科)。
優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)通過這種特異性序列的雜交得率等于靶序列的雜交 得率，或與靶序列的雜交得率相差不超過20% ，并且如W0 98/11253 中所述獲得定量。
在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中還有利地包括所述標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列、外 部和/或內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，可能連同用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的不同步驟所需的所 有介質(zhì)和工具(雜交和培養(yǎng)介質(zhì)、聚合酶和其他酶、標(biāo)準(zhǔn)序列、標(biāo)記 分子等)。
有利地，固體載體或生物芯片還包含具有各種濃度(即，4種) 標(biāo)記捕獲分子的點(diǎn)。這些標(biāo)記的捕獲分子還由已知溶液濃度進(jìn)行點(diǎn)樣， 并且它們的信號允許將雜交結(jié)果轉(zhuǎn)變成絕對量。它們還允許測試檢測 的重現(xiàn)性。
通過基于使用微流體技術(shù)控制液體溶液可以將生物芯片的固體栽體插入與另 一個室和自動機(jī)器連接的載體中。通過插入此類微實(shí)驗(yàn)系 統(tǒng)內(nèi)，它可以通過自動化進(jìn)行溫育、加熱、洗滌和標(biāo)記，甚至用于預(yù)
備步驟(如DNA的提取、基因擴(kuò)增步驟)或鑒定和區(qū)分步驟(標(biāo)記和 檢測)?？梢栽谙嗤腆w載體上進(jìn)行所有這些步驟。
本發(fā)明還涉及通過測量其以陣列類型形式的遺傳材料用于鑒定生 物樣品中可能存在的同源序列(及其屬于的群，以及最終生物及其群) 的方法。該方法充分適合于測定屬于幾個群的生物，其自身是超群 (super-group )的成員。該方法例如充分適合于動物、植物、真菌或 微生物的生物測定和/或分類。
該方法涉及作為陣列呈現(xiàn)的多種捕獲分子的使用，相應(yīng)的靶序列 的捕獲及其分析，和可能地其定量。該方法還允許通過表征具有所需 捕獲分子的陣列的陽性區(qū)域來鑒定這些生物及其群。本發(fā)明的 一個具 體說明是下述事實(shí)導(dǎo)致在陣列上的點(diǎn)的陽性雜交給出用于鑒定序列 或生物或其屬于的群或亞群的必需信息。
它還提供了這樣的方法，其用于在基因擴(kuò)增期間任何研究生物的 存在的序列分析，隨后為在陣列上的擴(kuò)增子檢測和其后相應(yīng)的生物或 群的鑒定。
此外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過本發(fā)明的方法可以獲得屬于彼此同源 的幾個序列群或亞群或亞亞群的此類多重序列的非?？焖俸腿菀椎蔫b 定，直至獲得可能的單個序列，通過組合使用通用引物對的單核苷酸 擴(kuò)增優(yōu)選通過PCR，連同通過在具有至少5種不同結(jié)合單鏈捕獲分子 /cm2固體載體表面的陣列上檢測和可能地記錄在不同水平上鑒定生 物，起因于捕獲序列與其相應(yīng)靶序列之間的結(jié)合的單個信號的存在， 以及其后使所述檢測的乾序列的存在與在其他中特異性遺傳序列的鑒 定關(guān)聯(lián)。該方法特別充分適合于通過分析其表達(dá)的基因組或基因的給 定部分來鑒定生物物種、屬和科，這些序列在不同生物中彼此同源。
單個信號意指這樣的信號，其自身足以鑒定它設(shè)計(jì)針對的一種或 多種靶核苷酸序列，并因此足以產(chǎn)生(必要時)關(guān)于樣品中存在的生 物或生物群，或所述樣品已從中獲得的生物或生物群存在與否的明確
52應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明的方法允許在其他可能的擴(kuò)增核苷酸序列中容易鑒定 /檢測特異性核苷酸序列，和任選地其耙序列的定量(生物樣品中拷貝 數(shù)的表征或所述生物的存在)，所述靶核苷酸序列具有對于所述生物 或生物群特異的核苷酸序列。
陣列可以包含來自幾個生物屬和來自在屬內(nèi)的幾個種的捕獲分 子。捕獲分子可以檢測屬、種以及這些屬屬于其的科。捕獲分子還可 以檢測亞種和甚至一個或多個種的個體生物。給定種的個體生物被視
為具有非常同源的序列，主要相差在其一些DNA序列或基因內(nèi)的單個 堿基。同源性對于獲得通用引物是重要的，和單堿基變化足以獲得2 個靶擴(kuò)增子之間的區(qū)分。如果不完全，那么區(qū)分可以通過使用第二種 捕獲分子加以證實(shí)，所述第二種捕獲分子存在于陣列上并能夠結(jié)合在 不同序列位置上的相同擴(kuò)增子。
所述鑒定通過下述獲得首先經(jīng)由通用引物對基因擴(kuò)增所述核苷 酸序列(靶序列)，隨后(洗滌后)根據(jù)上述方法區(qū)分?jǐn)U增的可能的 不同靶。
擴(kuò)增序列可以屬于相同基因，可以是相同DNA基因座的部分，并 且彼此同源。
該方法還像這樣應(yīng)用于核苷酸序列的鑒定和可能地表征，不依賴 于生物。基因或DNA序列可以根據(jù)其序列同源性分成群和亞群和亞亞 群。存在用于序列比對和比較的生物信息學(xué)程序(例如Clustal， Intel 1igenetics， Mountain View, Calif， 或Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、 BESTFIT、 FASTA和TFASTA， Genetics computer Group Madison, Wis., U. S. A.或Boxshade )。 可以根據(jù)同 源性百分比和序列的比對進(jìn)行分類。來自給定生物、組織或細(xì)胞中的 給定家族的序列檢測和鑒定中的優(yōu)點(diǎn)是例如檢測任何給定分子、生物 或病理學(xué)條件(通過蛋白組學(xué)、功能基因組學(xué)等)對于一個或多個家 族的總體和特異性基因的影響。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)通過使用固定在載體上的高密度捕獲分子，優(yōu)選高于約100 fmoles/ci^固體載體表面增加測定法的靈敏度。
對于生物群的測定特異的捕獲分子以這樣的方式設(shè)計(jì)，以便能夠 特異性捕獲屬于各個群的不同序列。這些捕獲分子稱為對于這個生物 群的共有區(qū)。共有捕獲分子可以包含長于群的不同成員的特異性捕獲 分子的特異性序列。這些捕獲分子是共有序列(即，序列在其每一個 位置處包含在比對時在群的成員的不同序列中出現(xiàn)最多的堿基)。在 一個實(shí)施方案中，共有捕獲分子具有擴(kuò)增序列的長度。 通過反應(yīng)的鹽濃度以及溫度和速率？。
根據(jù)本發(fā)明，像這樣通過其特異性多態(tài)性鑒定生物。在基因組的 特定位置中的單堿基置換是個體生物在相同物種的其他中的特征。用 于鑒定多態(tài)性的方法是本發(fā)明的部分，使用擴(kuò)增序列在陣列的捕獲分 子上的直接雜交和固定的靶序列的檢測。
本發(fā)明還允許通過下述鑒定多態(tài)性的存在使用具有至少5種不 同的結(jié)合單鏈捕獲多核普酸序列/cm2固體載體表面的陣列，單個信號 的測定起因于捕獲序列和靶序列之間的結(jié)合，使雜交物的至少 一個多 核苷酸引物在3'至5'方向中延伸超過其3'末端核苷酸，使用多核苷 酸序列作為模板，所述延伸在聚合劑和核苷酸前體的存在下實(shí)現(xiàn)，其 中摻入延伸的引物分子內(nèi)的至少一個核苷酸是可檢測修飾的核苷酸。
陣列可以存在于多孔的表面中，和多孔平板檢測器可以用于閱讀 結(jié)果。
在具體實(shí)施方案中，陣列在分別的區(qū)域中具有位于捕獲分子的相 同位置中僅相差1個核苷酸的幾種相同的捕獲分子，最后一個游離末 端是詢問堿基。陣列隨后能夠鑒定在序列給定位置存在的4種堿基中 的任何一種的存在。當(dāng)檢測純合或雜合生物中的多態(tài)性時，或當(dāng)多態(tài) 性未知時，此類陣列特別有用。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，與靶序列互補(bǔ)的捕獲分子的捕獲分子由 至少2個家族組成。第一個包含約5-約60個堿基，優(yōu)選約15-約 40個堿基和更優(yōu)選約20-約30個堿基。在第二個捕獲家族中，捕獲 分子序列的捕獲部分包含約10 - IOOO個堿基和優(yōu)選IOO- 600個堿基。
54這些堿基優(yōu)選指定為位于捕獲分子的末端處或附近的連續(xù)序列。這個 捕獲部分被視為用于檢測的特異性序列。在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，位 于捕獲部分和載體表面之間的序列是非特異性序列或捕獲部分。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲分子的第一個家族檢測 群的成員，而捕獲分子的第二個家族像這樣檢測群。然而，捕獲分子
的2個家族都可以是多核苷酸。
可以選擇通用引物以便擴(kuò)增不同序列和序列群。相同引物對擴(kuò)增 對于同源序列的不同群不同的幾個序列群，每一個與一個或多個生物 群相關(guān)。通用引物對可以與群鑒定和/或?qū)τ谠陉嚵猩系奈锓N鑒定相 關(guān)。
在具體實(shí)施方案中，對于擴(kuò)增步驟加入第二種或第三種或甚至更 多引物，以便可能地?cái)U(kuò)增與一個特定群相關(guān)或不相關(guān)并對于樣品中的 檢測有用的其他序列。易于存在于臨床樣品中的病毒連同細(xì)菌是其中 本發(fā)明的此類方面特別有用的例子之一，如病毒檢測的組合。
在另一個具體實(shí)施方案中，使用2對(可能通用)引物用于擴(kuò)增， 一對用于擴(kuò)增革蘭氏陽性菌序列和另一對用于擴(kuò)增革蘭氏陰性菌。擴(kuò) 增序列對于革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌特異，并且其后在陣列上作為 特定細(xì)菌物種和/或?qū)俸?或科進(jìn)行檢測)。2種引物對各自擴(kuò)增對于 一個或多個科特異的各種序列，其隨后在陣列上作為特異性種和/或 屬、科進(jìn)行檢測。相同陣列優(yōu)選具有對于細(xì)菌科或?qū)偬禺惖牟东@核苷 酸序列。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，群的任何成員的存在的檢測首 先在PCR期間使用如實(shí)時PCR的方法進(jìn)行檢測，并且擴(kuò)增子其后用于 在陣列上的鑒定。
記錄擴(kuò)增溶液的熒光信號，并且如果它與閾值相交，那么溶液進(jìn) 行處理用于陣列的捕獲分子上的雜交。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將具有陣 列的固體載體加入擴(kuò)增室和雜交過程中。在另 一個優(yōu)選實(shí)施方案中， 雜交在與PCR相同的室的表面上進(jìn)行。室優(yōu)選地閉合室具有與陣列相 容的任何大小、形式和材料。室可以是聚合物例如聚碳酸酯、聚丙烯
55或玻璃例如毛細(xì)管或混合材料?；诰郾┧狨サ谋砻媸翘貏e有用的， 因?yàn)樗鼈儗τ诠馐峭该鞯牟⒃试S對于陣列所需的捕獲分子的共價結(jié)
合。捕獲分子的游離末端優(yōu)選具有經(jīng)修飾的5'或3'-0H或磷酸基以便 避免延伸。優(yōu)選地，捕獲分子的捕獲部分具有小于用于擴(kuò)增的引物的 解鏈溫度，以便避免在PCR循環(huán)期間的雜交。此外，雜交優(yōu)選使用擴(kuò) 增循環(huán)儀的加熱和控制系統(tǒng)在給定溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，在擴(kuò)增循環(huán) 儀上提供控制過程以在擴(kuò)增步驟后繼續(xù)或不繼續(xù)陣列上的檢測。
本發(fā)明的一個實(shí)施方案將實(shí)時PCR連同在捕獲分子上的雜交組合 在一個過程中，用于在相同室中并用相同裝置鑒定靶分子或生物。
在一個實(shí)施方案中，將用于在陣列上進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測所需的 診斷和/或定量儀器的不同部分整合到相同儀器內(nèi)，以便檢測在擴(kuò)增的 PCR循環(huán)期間結(jié)合在陣列的捕獲分子上的靶核苷酸分子。為了讀出核 苷酸的存在，結(jié)合在捕獲分子上的靶意指必須在PCR其自身的步驟之 一期間或循環(huán)之間的步驟中進(jìn)行檢測。在優(yōu)選實(shí)施方案中，讀數(shù)需要 給循環(huán)添加1個優(yōu)選2個步驟， 一個是雙鏈擴(kuò)增子變性所需的和另一 個是雜交其自身所需的。
本發(fā)明還包含用于執(zhí)行該過程的各個步驟所需的機(jī)器和儀器，所 述過程主要用于診斷和/或定量樣品中可能存在的(微)生物或生物的 部分，其包含
a) 根據(jù)陣列在特定位置處與不溶性固體載體表面結(jié)合的捕獲分
子；
b) 用于熱調(diào)節(jié)的裝置；
c )用于檢測在擴(kuò)增子和捕獲分子之間的結(jié)合位置處形成的信號的 裝置；
d)用于將信號轉(zhuǎn)化成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)程序。 在另 一 個實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)程序進(jìn) 一 步識別其中形成信號的陣 列位置。
在具體實(shí)施方案中，這種儀器還包含用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)室，從 而使得在陣列上的擴(kuò)增和檢測被整合到相同儀器內(nèi)，以便在擴(kuò)增的PCR循環(huán)期間檢測雜交擴(kuò)增子。
在該儀器中，捕獲分子優(yōu)選是在陣列的位置中與不溶性固體載體 共價結(jié)合的單鏈捕獲分子，其中所述捕獲分子包含10 - 600個堿基的 捕獲部分，所述捕獲部分能夠與所述擴(kuò)增子特異性結(jié)合。
優(yōu)選地，陣列包含彼此僅相差1個核苷酸的至少2種捕獲分子。
該儀器可以進(jìn)一步包含用于執(zhí)行將得自生物或生物的部分的核苷 酸序列自動PCR擴(kuò)增成雙鏈靶核苷酸序列的熱循環(huán)儀，所述熱循環(huán)儀 能夠交替加熱和冷卻所述載體用于生產(chǎn)標(biāo)記的靶核苷酸。
優(yōu)選儀器是其中檢測在擴(kuò)增的循環(huán)期間進(jìn)行的那種。
用于檢測信號的裝置優(yōu)選在PCR期間測量在其捕獲分子上結(jié)合的 靶核苷酸序列至少2次，優(yōu)選5次，更優(yōu)選超過10次。
在備選實(shí)施方案中，用于檢測信號的裝置測量在擴(kuò)增循環(huán)完成后 在其捕獲分子上結(jié)合的靶核苷酸序列。
該儀器優(yōu)選具有選自下述方法的檢測器比色法、熒光、時間分
辨焚光、光熱干涉差、雷利散射、拉曼散射、表面等離子體共振、質(zhì)
量的改變、石英晶體微量天平、懸臂、差示脈沖伏安法、通過非線性生成頻率光i瞽法的化學(xué)繪圖法、光學(xué)改變、電阻率、電容、各向異性、 折射率和/或計(jì)數(shù)納米顆粒。
優(yōu)選地?zé)晒鈷呙鑳x使用激光束，包括共焦掃描方法并還優(yōu)選針孔。 該儀器可以進(jìn)一步包含
用于貯藏在熱循環(huán)的限定時限時來自關(guān)于載體的至少5個不同位 置的不同測量的數(shù)據(jù)的!^藏系統(tǒng)，
對于陣列的每一個位置在至少一個熱循環(huán)中重復(fù)檢測和貯藏步驟 至少一次的控制器，
用于處理至少一個熱循環(huán)中獲得的數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)程序，以便在擴(kuò) 增前檢測和/或定量樣品中存在的核苷酸分子的量。
該儀器可以進(jìn)一步包含
激光源；
關(guān)于通過所述激光源產(chǎn)生的激光束的聚焦裝置；光電倍增管； 針孔。
該儀器可以進(jìn)一步包含用于將在位置上形成的信號轉(zhuǎn)變成與特定 粑的存在相關(guān)的數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)程序。
在具體實(shí)施方案中，該儀器是用于基因、DNA和多核苷酸序列的 擴(kuò)增和檢測的多功能儀器，其執(zhí)行PCR擴(kuò)增、多核苷酸檢測；實(shí)時PCR、 定量實(shí)時PCR、微陣列檢測和/或定量、SNP檢測。
根據(jù)本發(fā)明的儀器包含2個不同系統(tǒng)第一個包含溫育部分，以 便獲得在其捕獲分子上擴(kuò)增和雜交靶所需的條件。優(yōu)選地第一個系統(tǒng) 包含用于加熱的過程，以便提供用于發(fā)生擴(kuò)增和結(jié)合反應(yīng)的溫度。加 熱系統(tǒng)可以是受控珀耳帖元件，導(dǎo)入光學(xué)級別聚酯片之間的模式的微 薄導(dǎo)線加熱元件如來自Minco的Thermal-ClearTM透明加熱器，或外部 循環(huán)溫度調(diào)節(jié)流體的流體系統(tǒng)。加熱系統(tǒng)由主動溫度控制系統(tǒng)和溫控 儀(8)組成，允許精確調(diào)節(jié)溫度并執(zhí)行溫度循環(huán)。該系統(tǒng)還優(yōu)選包含 用于去除室內(nèi)的液體并增加反應(yīng)率的混合或攪動系統(tǒng)。
第二個系統(tǒng)包含檢測系統(tǒng)以檢測來自與其捕獲分子結(jié)合的靶的光 發(fā)射。光源產(chǎn)生光束以激發(fā)載體上的標(biāo)記靶。光源可以是以約15 mW 的功率遞送的激光，其產(chǎn)生具有約532 nm的波長的束，伴隨可能低于 1. 2 mrad的發(fā)散。
由激光產(chǎn)生的激光束優(yōu)選是幾乎平行和幾乎高斯的?？筛鼡Q的激 發(fā)濾光鏡可以用于僅收集目的波長。可以放置另外的濾光鏡輪，并用 作弱化濾光鏡以精確調(diào)節(jié)激光功率。這種濾光鏡輪可以以各種已知吸 收水平進(jìn)行差異漸變?？梢允强狗瓷浒坏耐哥R可以用于使激光束集 中在載體(2)上。光源、透鏡和栽體之間的距離可以改變以允許聚焦。
其后，使光通過二色鏡。這種鏡可以通過具有低于約530認(rèn)的波 長的光，但反射具有大于560 nm的波長的光。因此，來自激光的532腿 光經(jīng)過二色鏡至載體。光隨后經(jīng)過室(11)和熒光標(biāo)記的樣品并到達(dá) 載體(2),其中結(jié)合的標(biāo)記靶被激發(fā)并發(fā)出在約560 nm處的熒光。 因?yàn)樗牟ㄩL大于約560 nm，所以發(fā)出的熒光在二色鏡上進(jìn)行反射至
58顯微鏡物鏡用于放大成像樣品。發(fā)熒光的光隨后集中于光電倍增管用 于檢測其中存在的光子數(shù)目。在具體實(shí)施方案中，可以添加透射具有
大于約550 nm的波長的光的另外發(fā)射濾光鏡。因此，光電倍增管基本 上僅檢測發(fā)熒光的光。光電倍增管對于檢測的每一個光子產(chǎn)生脈沖。 這些脈沖中的每一個進(jìn)行擴(kuò)增并通過光電效應(yīng)轉(zhuǎn)變成電子信號。數(shù)據(jù) 采集板(7)隨后收集所產(chǎn)生的信號。
收集來自底物區(qū)域的數(shù)據(jù)后，運(yùn)載體(1 )移動栽體從而使得光可 以指向在栽體(2 )上的不同區(qū)域。重復(fù)該過程直至已掃描載體上的所 有區(qū)域。
在一個實(shí)施方案中，包含捕獲分子的固體栽體相對于2個系統(tǒng)進(jìn) 行移動。隨后不依賴于第一個系統(tǒng)，在第二個系統(tǒng)中進(jìn)行結(jié)合的檢測。
在另一個實(shí)施方案中，使2個系統(tǒng)固定并一起工作，沒有固體載 體相對于2個系統(tǒng)的移動。
在另外一個實(shí)施方案中，光學(xué)系統(tǒng)的分辨率為0. 1微米-500微 米，并更優(yōu)選10-IOO微米。在另一個實(shí)施方案中，距離在溫育系統(tǒng) 和檢測系統(tǒng)中不同，優(yōu)選與溫育系統(tǒng)比較，在檢測系統(tǒng)中小2-100 倍。
圖9的流程圖描述了其中實(shí)時儀器受程序控制計(jì)算機(jī)控制的具體 實(shí)施方案。掃描儀可以是與來自Axon的可編程Genepix 6. O軟件偶聯(lián) 的來自Axon的Genepix 4200A掃描儀。
在步驟1時，提示用戶填入所需參數(shù)，例如分辨率、PMT的電 壓、激光功率、掃描區(qū)域、變性溫度、變性時間、退火溫度、退火時 間、延伸溫度、延伸時間和循環(huán)數(shù)目。
不同參數(shù)的解釋
分辨率定義像素尺寸。 一般地，選擇導(dǎo)致超過50個像素/合成區(qū) 域("特征")的像素尺寸。設(shè)置太高，分辨率產(chǎn)生數(shù)據(jù)的超負(fù)荷， 而具有太低，像素尺寸產(chǎn)生低質(zhì)量結(jié)果。
PMT電壓擴(kuò)大檢測的信號。增加激光功率將增加每個像素中的光 子計(jì)數(shù)。
59"循環(huán)數(shù)目，，參數(shù)對應(yīng)用戶希望循環(huán)溫度和掃描底物的次數(shù)。以 這種方式，用戶可以執(zhí)行一系列掃描以跟蹤反應(yīng)動力學(xué)。
掃描區(qū)域參數(shù)對應(yīng)待測試的底物的尺寸。溫度可以依待測試的聚 合物類型而變。優(yōu)選地，測試在產(chǎn)生最大結(jié)合親和力而減少錯配的溫 度下進(jìn)行。
溫度參數(shù)控制不同擴(kuò)增步驟的溫度。
溫度時間參數(shù)定義每個擴(kuò)增步驟的持續(xù)時間。這些參數(shù)還定義在
在步驟2時，系統(tǒng)進(jìn)行初始化將運(yùn)載體移至原始位置同時檢查 激光功率。
在步驟3時在預(yù)定變性時間期間發(fā)生第一次加熱至預(yù)定變性溫度。
步驟4類似于步驟3用于退火溫度。
在步驟5時，進(jìn)行笫一次掃描并收集在所選擇的底物區(qū)域上發(fā)出 的熒光。保存圖像。
如果未達(dá)到待完成的掃描數(shù)目，那么程序進(jìn)行步驟6，其在預(yù)定 持續(xù)時間期間加熱至延伸溫度，并且循環(huán)回到步驟3。
如果不是，那么發(fā)生步驟7:收集圖像用于提取關(guān)于在載體上存 在的每個靶的信號和本底值。
步驟8對應(yīng)圖像定量。
步驟9對應(yīng)數(shù)據(jù)分析。
該儀器能夠執(zhí)行2個不同過程，其具有不同任務(wù)并需要完全不同 的規(guī)格。
第一個是必須精確控制的加熱系統(tǒng)，從而使得擴(kuò)增和雜交在其中 靶多核苷酸可以正確擴(kuò)增并結(jié)合其捕獲多核苷酸而不是(或不顯著) 同源或無關(guān)序列的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，溫育必須提供液體的混合或 攪動或移動以便有利于靶分子之間的接觸，所述靶分子與其捕獲分子 一起在溶液中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過靜電波或壓電振動進(jìn)行混合。
第二個是與其存在于固體載體的表面上的捕獲分子結(jié)合的乾分子
60的檢測。檢測水平是每個點(diǎn)飛摩爾或更小的級別，并且在溶液中相同 分子的存在下檢測結(jié)合靶是挑戰(zhàn)。掃描儀必須在整個表面上以相同效 率執(zhí)行檢測，否則無法完成在相同樣品中存在的靶定量的比較。
2個過程在整合系統(tǒng)中進(jìn)行，只要技術(shù)部分(具有規(guī)格所需的) 彼此相容。光源在載體(2)表面上和與熱穩(wěn)定運(yùn)栽體(1)接觸的表 面定向相反。
其他序列的檢測可以有利地在相同載體上進(jìn)行，例如通過允許與 用于定量的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列雜交，使用用于相同或不同微生物菌林的 共有捕獲分子，使用允許檢測經(jīng)由微生物的可能的抗生素抗性基因或 用于雜交的陽性或陰性對照的序列。所述其他捕獲分子可以具有長于 10 - 60個堿基和高至600個堿基的總長度的特異性序列，并且還在不 溶性固體栽體上結(jié)合，優(yōu)選在與本發(fā)明相關(guān)的其他結(jié)合的捕獲分子制 成的陣列中。
關(guān)于核苷酸序列的具體檢測和分析詳細(xì)描述的這些特征可以由本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用于(微)生物的其他組分，例如受體、抗體、酶等。 本發(fā)明將參考附圖在下述非限制性實(shí)施例中詳細(xì)描述。 實(shí)施例
實(shí)施例1.監(jiān)控在微陣列上的同源序列的PCR擴(kuò)增 橫處》f窗定
根據(jù)專利申請WO02/18288中描述的方法，使Diaglass載片 (Eppendorf， Hamburg, Germany ) t尤趁的存在進(jìn)^f亍官能4b。遵循這個 專利申請中描述的方案用于將胺化DNA移植至醛衍生的玻璃。胺化捕 獲分子從溶液中以3 )iM的濃度進(jìn)行點(diǎn)樣，除了以300 nM點(diǎn)樣的 BAT-973外。使用250 |a m直徑針用自制(homemade)機(jī)器人裝置將 捕獲分子印跡到顯微鏡栽玻片上。點(diǎn)直徑為400 jum并且分配的體積 為約O. 5 nl。使載片在室溫下進(jìn)行干燥并貯藏于4。C直至使用。
在這個實(shí)驗(yàn)中使用的捕獲分子的捕獲部分具有下述序列
AATSauG2 ( SEQ ID NO: 1):
5,-AACTGCTGGACTTATTTTAGGTAAGAG-3,AATSpneG2 ( SEQ ID NO: 2): 5'- CTTGTCATGGGGAAATCAGGTATCCA -3' BAT-973 (雜交控制)(SEQ ID NO: 3): 5' 胺
CTCCCAGGAACTGGGCCAACTCACCTGAGTCACCCTACCTGTGCCTGACCCTACTTCTT
AAATAAAAATGGCCATTTGCTTTTTCACCAGATTTC'CTAATTTATCCTGAAATTTCAGA TTCCCAGAGCAAAATAATTTTAAACAAAGGTTGAGATGTAAAAGGTATTAAATTGATGT TGCTG GACTGTCATAGAAATTACACC -3'
2C9*3 (SEQ ID NO: 4):
5'- GGTGGGGAGAAGGTCAAGGTA -3'
AATSauGl ( SEQ ID NO: 5 )
5'-TT AATCAATGGTGTACTTAGCTTAAGTA-3'
AATSpnGl (SEQ ID NO: 6)
5'-TGACCAAAAGGTTTGGAAAACGTGCA-3'
AATSorGl ( SEQ ID NO: 7 )
5'-ACTGCCAAGGTTGAAAAGCTCATGG-3'
AATEfinGl (SEQ ID NO: 8)
5'-TCTGAGGTAGTAGCGGCTATCGATT-3'
AATEfsGl ( SEQ ID NO: 9 )
5'-GATTGATGCAACAAGTTTATTGATGGAC-3'
在例外的BAT-973的情況下，每個捕獲分子包含在捕獲部分的5' 末端處長90個堿基的間隔物部分，所述間隔物具有下述序列
5, 胺 -
AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTCCTATAT GTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC-3'。 趟/A
細(xì)菌菌林在LB培養(yǎng)基(10 g蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g NaCl/1 )中在好氧條件下于37。C由單個菌落過夜生長。通過離心(5000 g， 5 分鐘)使等分試樣(O. lral)的過夜培養(yǎng)物形成團(tuán)塊。將細(xì)菌團(tuán)塊重懸 浮于包含100 Mg溶葡萄球菌素(Sigma， Mo， USA)和100 Mg RNA 酶的300 jj 1裂解緩沖液(50 mM Tris HC1 pH 8. 0、 100 ju M EDTA、 150 raM NaCl、 1 % SDS )中，并于37。C溫育30分鐘。通過在200 ja g 蛋白酶K (Boehringer， Mannheim, Germany)的存在下于 37。C溫育 30分鐘并煮沸5分鐘來達(dá)到裂解。使裂解物在4000 g下離心5分鐘， 并且根據(jù)制造商的說明書，通過在 Nucleospin C+T柱 (Macherey-Nagel， Duren， Germany )上吸附從200 ja 1上清液中提 取DNA。 DNA在200 ju 1無菌水中進(jìn)行洗脫并貯藏于-20。C 。 戶CT々染it
PCR設(shè)計(jì)用于使用通用引物擴(kuò)增來自金黃色葡萄球菌和肺炎球菌 的細(xì)菌培養(yǎng)物的基因組DNA樣品。將一種陽性雜交對照加入反應(yīng)混合 物內(nèi)，并對應(yīng)用cy3標(biāo)記的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子與捕獲分子BAT-973 (SEQ ID NO: 3)互補(bǔ)。這種對照用于檢查雜交階段。
在這個實(shí)驗(yàn)中使用的引物具有下述序列
AAPgyrl ( SEQ ID NO: 10):
5'- GCNGCDGCRATGCGTTATAC -3'
AAPgyr3Cy3 ( SEQ ID NO: 11 ):
5'- Cy3- GAACCHYKACCTGTTTCATA -3'
N = A， G， T， C
D = G， A， T
R = A， G
H = A， T， C
Y = C， T
K = G， T
擴(kuò)增產(chǎn)物具有捕獲分子AATSauG2 (SEQ ID NO: 1)和AATSpneG2 (SEQ ID NO: 2)特異的其鏈序列之一的部分。
如下制備用于PCR反應(yīng)的475 Ml混合物lx濃縮Topo緩沖液、dNTP混合物(每一種dNTP以200 ju M的終濃度)、0.05 ju M引物 AAPgyrl (SEQ ID NO: 10)、在5'處Cy3標(biāo)記的0. 1 ja M AAPgyr3Cy3 (SEQ ID NO: 11)、在95 |a 1中以5U的Topo Taq DNA聚合酶、以 150mM的谷氨酸鉀。45 m 1這種混合物用于每次PCR反應(yīng)。加入從金 黃色葡萄球菌(從臨床樣品中分離的)的純培養(yǎng)物中提取的1 ju 1基 因組DNA;從肺炎球菌(從臨床樣品中分離的)的細(xì)菌純培養(yǎng)物中提 取的l Hl基因組DM，l pl蒸餾水，2 n 1 Cy3-BAT擴(kuò)增子(40ng)。 將50 m 1這種PCR反應(yīng)裝載到由在具有350 jnm的厚度的Zeonex中 用蓋玻片密封的9 x 9 mm,雜交室構(gòu)成的微陣列上。
在載片的背面上，固定溫度控制的專門熱電偶。完整加熱過程測 試臺由下述相關(guān)組分組成
* "熱電偶"RS-COMPONENT n° 219-4321自我粘附熱電偶K型 -鎳鉻/鎳鋁(RS組分，Northamptonshire, UK)，
*"傳送器，，RS-COMPONENTS 363-0222傳送器溫度熱電偶4-20 mA(RS組分，Northamptonshire, UK)，
* "轉(zhuǎn)換器":NATIONAL INSTRUMENTS 779026-01 USB-6009 48 K 樣品/秒DAQ多功能14比特用于USB( National Instruments, Austin, TX， USA,
* "加熱器"MINCO加熱箔彈性加熱器Kapton 0， 75" x 0, 75" HK 5578 R 18， 3 L12F(MINC0， Minneapolis, MN， U.S. A)。
盡可能靠近加熱表面放置的熱電偶通過傳送器測量溫度。經(jīng)由轉(zhuǎn) 換器將這種溫度信息給予計(jì)算機(jī)。
每一秒，軟件比較測量的溫度與由最終用戶要求的溫度設(shè)定點(diǎn)， 并且控制器調(diào)整加熱以便提供要求的溫度。
隨后將栽片倒置放入Axon掃描儀(4100個人)內(nèi)，在整個實(shí)驗(yàn) 期間它保留在其中。以20微米的分辨率在600的增益時用532波道進(jìn) 行用于Cy3檢測的掃描。
加熱蓋按程序工作以產(chǎn)生如下的50個循環(huán)于94。C30秒(變性)、 于56。Cl分鐘(退火)和于76。C30秒(延伸)。在循環(huán)5、 10、 15、
6419、 20、 25、 30、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 47、 48、 49和50 的退火步驟(于56°C )開始后，通過起始30秒掃描微陣列表面測定 熒光發(fā)射。掃描儀使用集中于載體的表面上的激光作為激發(fā)光。通過 光電倍增管檢測并擴(kuò)增發(fā)射光。圖像采集后，將掃描的16-比特圖像 輸入用于定量信號強(qiáng)度的軟件'Genepix 5" (Axon, Union city, Ca， USA )。定量關(guān)于陣列上一式三份存在的2種捕獲分子AATSauG( SEQ ID NO: 1，金黃色葡萄球菌)和AATSpneG2 (SEQ ID NO: 2，肺炎球菌) 的信號?？鄢植勘镜撞⑶沂剐盘枩p本底針對循環(huán)數(shù)目進(jìn)行標(biāo)繪。陣 列還包含在陣列上一式四份存在的用于陰性雜交對照(SEQ ID NO: 4 -9)和用Cy3標(biāo)記的陽性檢測對照的捕獲分子。用作陰性雜交對照的 捕獲分子無一給出陽性信號。
在微陣列上的實(shí)時PCR結(jié)果呈現(xiàn)于圖10中。結(jié)果顯示關(guān)于特異性 捕獲分子金黃色葡萄球菌的信號在循環(huán)37時出現(xiàn)。信號繼續(xù)有規(guī)律地 增加直至循環(huán)50。關(guān)于捕獲分子肺炎球菌的信號開始在循環(huán)46時出 現(xiàn)并有規(guī)律地增加直至循環(huán)50。雜交對照給出關(guān)于其捕獲分子 BAT-973 (SEQ ID NO: 3)的陽性信號，這伴隨循環(huán)進(jìn)展保持恒定。
實(shí)施例2.在5步驟PCR過程的1個循環(huán)期間監(jiān)控在微陣列上的 擴(kuò)增子的雜交動力學(xué)
這個實(shí)施例對應(yīng)圖7b中提供的實(shí)施方案。
捕獲分子序列及其固定與實(shí)施例1中相同，包括間隔物。
用于跟蹤雜交的捕獲分子的捕獲部分如下
2C9*3 (SEQ ID NO: 4):
5'- GGTGGGGAGAAGGTCAAGGTA -3'
尸CT 一染it
用于PCR的DNA模板是包含在載體pCR4 Topo中克隆的CYP2C9 基因的整個外顯子7的質(zhì)粒DNA。該質(zhì)粒包含突變3。它通過PCR使用 下述引物進(jìn)行擴(kuò)增。
MP2C903 (SEQ ID NO: 12):
5'- Cy3- CTAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG -3'
65MP2C904 (SEQ ID NO: 13):
5'- CAGAGTGTTGATTTGACAAGATTTTAC -3'
擴(kuò)增子的預(yù)期大小是1114 bp。起因于擴(kuò)增的擴(kuò)增子是捕獲分子 2C9*3 ( SEQ ID NO: 4 )特異的。
PCR混合物如下lx濃縮Topo緩沖液、dNTP混合物(每一種dNTP 以200 mM的終濃度)、在5'末端處Cy3標(biāo)記的0.125 mM引物 MP2C903 ( SEQ ID NO: 12)、 0.125 jj M MP2C904 ( SEQ ID NO: 13)、 在50 m 1中以2. 5U的Topo Taq dna聚合酶、以150mM的谷氨酸鉀。 將攜帶突變3的CYP2C9的外顯子7的5 |i 1質(zhì)粒DNA ( 5ng/ji 1 )加入 在200ja 1 PCR管中的45 ja 1這種PCR混合物中。
在熱循環(huán)儀(Eppendorf ， Hamburg, Germany)中進(jìn)行PCR。樣品 首先于94。C變性5分鐘。隨后進(jìn)行由下述組成的40個擴(kuò)增循環(huán)于 94°C30秒、于63°C1分鐘和于72°C1分鐘以及于72°C10分鐘的最終 延伸步驟。
在40個循環(huán)結(jié)束時，將50 m 1這種pcr反應(yīng)裝載到由雜交室構(gòu) 成的微陣列上，并且在載片的背面上，如實(shí)施例1中提供的固定專門 熱電偶。
隨后將載片倒置放入Axon掃描儀(4100個人)內(nèi)。 加熱蓋如下按程序工作用于以5個步驟的另外循環(huán) 于94X330秒(變性)然后于60'C5分鐘(退火)然后于72°C30 秒(延伸)然后于94。C30秒(變性)和最后于40。C5分鐘(雜交)。 在5種溫度的這個循環(huán)期間，在0秒、80秒、140秒、220秒、 300秒、380秒、450秒、530秒、600秒、680秒、760秒和840秒的 不同時間點(diǎn)上(對應(yīng)捕獲分子2C^3掃描時間)掃描陣列。
如實(shí)施例1中進(jìn)行掃描，除了使用500的增益代替600。定量關(guān) 于陣列上一式三份存在的捕獲分子MT2C^3 (SEQ ID NO: 4)的信號。 扣除局部本底并且使信號減本底針對第41個循環(huán)的5個步驟的時間進(jìn) 行標(biāo)繪。
結(jié)果呈現(xiàn)于圖11中。結(jié)果顯示關(guān)于特異性捕獲分子MT2C9C(SEQID NO: 4)的信號。信號在于6(TC的退火步驟期間出現(xiàn)。信號有規(guī)律 地增加直至退火步驟結(jié)束。然后信號在延伸和變性步驟期間喪失并回 到本底水平。然后信號在于40。C的雜交步驟期間再次出現(xiàn)，并且有規(guī) 律地增加直至雜交步驟結(jié)束。圖11中提供了在退火和雜交步驟期間信 號增加的回歸曲線。
實(shí)施例3.在5步驟PCR過程的3個循環(huán)期間監(jiān)控在微陣列上的 擴(kuò)增子的雜交動力學(xué)
這個實(shí)施例對應(yīng)圖7b中提供的實(shí)施方案。 捕獲分子序列及其固定與實(shí)施例1中相同，包括間隔物。 如實(shí)施例2中提供的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了下述方面。將攜帶突變3的 CYP2C9的外顯子7的10 ni 1質(zhì)粒DM ( 5ng/ m 1 )加入在200 m 1 PCR 管中的90 ju 1 PCR混合物中。
在熱循環(huán)儀(Eppendorf， Hamburg, Germany)中進(jìn)行PCR。樣品 首先于94。C變性5分鐘。隨后進(jìn)行由下述組成的40個擴(kuò)增循環(huán)于 94。C30秒、于63°C1分鐘和于72°C1分鐘，然后于72°C 10分鐘的最 終步驟。
在第25、30和35個pcr循環(huán)結(jié)束后，從pcr管中取出30 m 1 pcr
產(chǎn)物并裝載到由雜交室構(gòu)成的微陣列上，并且在載片的背面上，如實(shí)
施例1中提供的固定專門熱電偶。
隨后將載片倒置放入Axon掃描儀(4100個人)內(nèi)。 加熱蓋如下按程序工作用于以5個步驟的另外循環(huán) 于94°C30秒(變性)然后于63°C1分鐘(退火)然后于72°C30
秒(延伸)然后于94'C30秒(變性)和最后于55。C5分鐘(雜交)。 在5種溫度的這個循環(huán)期間，在0秒、100秒、300秒、400秒、
500秒和600秒的不同時間點(diǎn)上(對應(yīng)捕獲分子2C9*3掃描時間)掃
描陣列。
對于在第30和35個循環(huán)后獲得的PCR產(chǎn)物重復(fù)讀數(shù)。 如實(shí)施例1中進(jìn)行掃描，除了使用550的增益代替600。定量關(guān) 于陣列上一式三份存在的捕獲分子MT2C^3 (SEQ ID NO: 4)的信號。
67扣除局部本底并且使信號減本底針對第26、 31和36個循環(huán)的5個步 驟的時間進(jìn)行標(biāo)繪。
結(jié)果呈現(xiàn)于圖12中。在變性步驟期間(在100秒的時間點(diǎn)上)進(jìn) 行一次測量。關(guān)于3個測量循環(huán)的信號極低并且在本底水平的范圍內(nèi)。 在雜交步驟期間進(jìn)行接下來的4次測量(在300秒、400秒、500秒和 600秒的時間點(diǎn)上)。觀察到關(guān)于特異性捕獲分子MT2C9*3(SEQ ID NO: 4)的信號。信號隨著雜交的時間線性增加，并且曲線的斜率伴隨循環(huán) 數(shù)目增加(斜率對于第26個循環(huán)為0. 422，對于第31個循環(huán)為1.562， 和對于第36個循環(huán)為2. 514)。圖12中提供了在雜交步驟期間的信 號的時幀的回歸曲線。
實(shí)施例4.在5步驟PCR過程的多個循環(huán)期間監(jiān)控在微陣列上的 擴(kuò)增子的雜交動力學(xué)
捕獲分子序列及其固定與實(shí)施例1中相同，包括間隔物。
如實(shí)施例3中提供的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了下述方面。
如實(shí)施例1中提供的，將5G pi這種PCR反應(yīng)裝載到由雜交室 構(gòu)成的微陣列上。通過如實(shí)施例1中固定在載片的背面上的熱電偶控 制PCR的溫度。
隨后將載片倒置放入Axon掃描儀(4100個人)內(nèi)，在整個實(shí)驗(yàn) 期間它保留在其中。
加熱蓋按程序工作至于94°C5分鐘樣品第一次變性。在由下述組 成的5步驟PCR中進(jìn)行50個擴(kuò)增循環(huán)于94。C30秒(變性)然后于 63°C1分鐘(退火)然后于72'C30秒(延伸)然后于94。C30秒(變 性)和最后于55'C5分鐘(雜交)。
如實(shí)施例3中所述進(jìn)行掃描。在第35、 40和45個PCR循環(huán)期間， 在循環(huán)開始后的不同時間點(diǎn)上(對應(yīng)捕獲分子203掃描時間)掃描 陣列Q秒、100秒、300秒、400秒、500秒和600秒。
觀察到關(guān)于特異性捕獲分子MT2C9*3 (SEQ ID NO: 4)的信號。 信號隨著雜交的時間線性增加，并且曲線的斜率伴隨循環(huán)數(shù)目增加。
本發(fā)明已就上文討論的某些實(shí)施方案而言進(jìn)行描述。應(yīng)認(rèn)識到這
68些實(shí)施方案允許本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的各種修飾和備選形式。
無需背離本發(fā)明的精神和范圍，即可對本文描述的結(jié)構(gòu)和技術(shù)進(jìn)
行除上述那些外的許多修飾。因此，盡管已描述了具體實(shí)施方案，但 這些僅是例子并且不限制本發(fā)明的范圍。
69
權(quán)利要求
1. 用于實(shí)時PCR的方法，其包括下述步驟a)進(jìn)行至少一個PCR循環(huán)以形成擴(kuò)增子；b)使所述擴(kuò)增子與固定的未標(biāo)記的捕獲分子雜交；c)檢測所述雜交擴(kuò)增子；d)重復(fù)步驟a)b)c)至少一次。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述PCR循環(huán)包括變性、退火和延伸的步驟，由此所迷PCR溶液與所述捕獲分子持續(xù)接觸，從而使得所述擴(kuò)增子在所述退火步驟期間與所述捕獲分子雜交。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述捕獲分子與所述PCR溶液斷續(xù)接觸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其包括下述步驟a) 變性；b) 退火；c) 延伸；d) 變性；e) 雜交；和f )檢須'J由此所述捕獲分子僅在步驟e)期間和任選地在步驟d)期間與所述PCR溶液接觸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其包括下述步驟a) 變性；b) 退火；c) 延伸；d) 變性；e) 雜交；和f )檢測，由此所述捕獲分子僅在步驟a)和e)期間與所述PCR溶液接觸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其包括下述步驟a) 變性；b) 退火；c )延伸；d) 變性；e) 雜交；和f )檢測，由此所述捕獲分子在除步驟f )期間外的所有步驟期間與所述PCR溶液接觸。
7. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子包含間隔物部分和捕獲部分。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述間隔物部分是具有至少20個核苷酸、優(yōu)選40個核苷酸、更優(yōu)選至少90個核苷酸的長度的多核苷酸鏈。
9. 權(quán)利要求7或8的方法，其中所述捕獲分子包含與下述序列具有至少60%同源性、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%的間隔物部分5'AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTCCTATATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC 3' ( SEQ ID NO: 2) ( 90個堿基)。
10. 權(quán)利要求7或8的方法，其中所述捕獲分子包含與下述序列具有至少60%同源性、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%的間隔物部分ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA 3 ' ( SEQ ID NO: 3) ( 95個堿基)。
11. 權(quán)利要求7 - 10中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子的所述捕獲部分包含對于在所述PCR期間生產(chǎn)的所述擴(kuò)增子特異的10- IOO個核苷酸、優(yōu)選15 - 40個核苷酸、更優(yōu)選2D-30個核苷酸。
12. 權(quán)利要求7的方法，其中所述捕獲分子的所述捕獲部分包含10-6Q0個堿基、優(yōu)選20 - 50個堿基、更優(yōu)選15-40個堿基。
13. 權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子被固定在固體栽體上，從而使得所述間隔物部分位于所述固體載體和所述捕獲部分之間。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述捕獲分子的所述捕獲部分通過至少6.8 nm的間隔物部分與所述固體載體的表面分開。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述間隔物部分是約20-約120個堿基的核苷酸序列。
16. 權(quán)利要求13的方法，其中所述捕獲分子通過其5'末端進(jìn)行固定。
17. 權(quán)利要求13的方法，其中所述捕獲分子通過其3'末端進(jìn)行固定。
18. 權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子的所述間隔物部分的所述遠(yuǎn)端具有包含游離氨基的核苷酸。
19. 權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)的方法，其中在所述載體上的所述捕獲分子的密度為20 - 2000 fmoles/cm2。
20. 權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子包含IO- 100個核苷酸的捕獲部分，其與所述擴(kuò)增子的特異性序列互補(bǔ)，從而使得所述捕獲部分限定所述擴(kuò)增子的2個非互補(bǔ)末端，和具有至少20個核苷酸的間隔物部分，并且其中所述擴(kuò)增子的2個非互補(bǔ)末端分別包含間隔物末端和非間隔物末端，從而使得所述間隔物末端與所述捕獲分子的所述間隔物部分不互補(bǔ)，和所述間隔物末端超過所述非間隔物末端至少50個堿基。
21. 權(quán)利要求13-20中任一項(xiàng)的方法，其中捕獲分子以至少4種捕獲分子/cm2、優(yōu)選至少20種捕獲分子/cm2、更優(yōu)選至少100種捕獲分子/cin2的微陣列形式被固定在固體載體的具體指定的區(qū)域中。
22. 權(quán)利要求13-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體載體為珠的形式。
23. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中至少2種擴(kuò)增子用至少2種捕獲分子進(jìn)行檢測，和其中所述至少2種捕獲分子的所述捕獲部分相差至少lQo/。、優(yōu)選相差至少20。/。。
24. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括從生物學(xué)生物或 生物的部分中提取對于那種生物特異的核苷酸序列的步驟。
25. 權(quán)利要求24的方法，其中所述至少一個PCR循環(huán)包含標(biāo)記對 于所述生物特異的所述核苷酸序列，以形成標(biāo)記的靶核苷酸序列。
26. 權(quán)利要求24或25的方法，其中對于所述生物特異的所述核苷 酸序列是DNA核苷酸序列。
27. 權(quán)利要求24或25的方法，其中對于所述生物特異的所述核苷 酸序列是mRNA。
28. 權(quán)利要求27的方法，其進(jìn)一步包括將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDM。
29. 權(quán)利要求24的方法，其中在所述至少一個PCR循環(huán)中使用引 物對，和使用相同引物對用于拷貝對于所述生物特異的所述核苷酸序 列。
30. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子能夠區(qū)分其 為所述擴(kuò)增子的一條鏈的靶序列和與所述靶具有小于85%同源性的另 一種擴(kuò)增子序列。
31. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其包括能夠擴(kuò)增具有超過60 %、優(yōu)選超過90%同源性的至少2種革巴序列的通用引物對的使用，并包 括能夠檢測所述2種靶序列中的每一種的捕獲分子的使用。
32. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過相同引物對擴(kuò)增的所 述序列的數(shù)目高于5種并甚至高于20種，和所述擴(kuò)增耙當(dāng)存在于溶液 中時在陣列上進(jìn)行檢測。
33. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一個PCR循環(huán)包 含耐熱DM聚合酶的^f吏用，所述耐熱DNA聚合酶在25 - 300 mM的鹽濃度下是有活性的。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述聚合酶是嗜熱水生菌DNA聚合酶。
35. 權(quán)利要求l的方法，其中所述捕獲分子被固定在陣列中，和所 述擴(kuò)增子的檢測通過監(jiān)控由所述陣列的不同位置發(fā)出的信號來進(jìn)行，其 中在至少2個PCR循環(huán)中的每個位置進(jìn)行至少2次測量，和處理在這些測量中獲得的所述數(shù)據(jù)。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中在所述位置上的所述測量在所述PCR 擴(kuò)增的每個循環(huán)時進(jìn)行。
37. 權(quán)利要求35或36的方法，其中所述陣列包含在所述栽體的不 同位置上結(jié)合的至少4種不同的捕獲分子/cm2固體載體表面。
38. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中檢測所述雜交擴(kuò)增子和所 述至少一個PCR循環(huán)的步驟都在1個室中進(jìn)行。
39. 權(quán)利要求38的方法，其中所述室包含含有待擴(kuò)增的特異性核 苷酸序列的溶液，用于核苷酸分子擴(kuò)增的試劑，和固定的捕獲分子的陣 列。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中在檢測所述雜交擴(kuò)增子的步驟期間 從所述陣列中去除包含在所述室中的所述溶液。
41. 權(quán)利要求40的方法，其中在通過改變所述室的位置檢測所述 雜交擴(kuò)增子的步驟期間從所述陣列中去除包含在所述室中的所述溶液。
42. 權(quán)利要求41的方法，其中改變所述室的位置包含使所述室完 全顛倒。
43. 權(quán)利要求35的方法，其中所述監(jiān)控所述陣列的不同位置上的 所述信號用在至少5個、優(yōu)選至少10個PCR循環(huán)、更優(yōu)選至少20個PCR 循環(huán)中的每個位置至少5次測量來進(jìn)行。
44. 權(quán)利要求43的方法，其包括超過20個PCR循環(huán)，和其中在所 述前20個PCR循環(huán)期間不進(jìn)行測量。
45. 權(quán)利要求1的方法，其應(yīng)用于包含1-4種核苷酸序列、優(yōu)選 1 - 20種核苷酸序列的樣品，和所述序列當(dāng)存在于所述樣品中時在一種 測定法中進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定。
46. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在PCR循環(huán)開始后，在預(yù) 定時間點(diǎn)上測量信號。
47. 權(quán)利要求46的方法，其中所述預(yù)定時間在不同PCR循環(huán)時對 于每個位置是相同的。
48. 權(quán)利要求l的方法，其中所述PCR循環(huán)包含退火步驟，并在所述退火步驟開始后5分鐘內(nèi)、優(yōu)選2分鐘內(nèi)、更優(yōu)選1分鐘內(nèi)測量信號。
49. 權(quán)利要求l的方法，其中所述PCR循環(huán)包含3個溫度步驟，并 在所述PCR循環(huán)的所述3個溫度步驟中的至少一個結(jié)束時測量信號。
50. 權(quán)利要求49的方法，其中通過在所述PCR循環(huán)的所述3個溫 度步驟中的至少一個期間進(jìn)行至少2次測量來隨著時間監(jiān)控信號。
51. 權(quán)利要求49的方法，其中所述3個溫度步驟隨后為與所述捕 獲分子雜交的步驟，所述雜交步驟任選在變性步驟后。
52. 權(quán)利要求3和4的方法，其中所述檢測的信號是在與不同PCR果。
53. 權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測的信號是在給定循環(huán)時所述 擴(kuò)增子在所述捕獲分子上雜交的結(jié)果。
54. 權(quán)利要求1的方法，其包括至少20個PCR循環(huán)，每個循環(huán)具 有變性、退火和延伸的步驟，每個循環(huán)在10秒-6分鐘、優(yōu)選1-3分 鐘的時間段內(nèi)進(jìn)行。
55. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括數(shù)據(jù)處理步驟， 涉及從在所述退火或延伸步驟時獲得的第二種信號中扣除在所述變性 溫度步驟時獲得的第一種信號。
56. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其包括測量關(guān)于每一個所述不 同位置的本底信號和信號，其中通過從關(guān)于每一個所述不同位置的所迷 信號值中扣除所述本底信號進(jìn)一步處理所述數(shù)據(jù)。
57. 權(quán)利要求56的方法，其中所述本底信號是局部本底。
58. 權(quán)利要求56的方法，其中通過使所述不同位置的信號值與固 定值比較來獲得樣品中所述生物學(xué)生物或生物的部分的定量。
59，權(quán)利要求56的方法，其中通過使達(dá)到固定值所需的PCR循環(huán) 數(shù)目(CT)與參考核苷酸分子的CT比較來獲得樣品中所述生物學(xué)生物 或生物的部分的定量。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述參考核苷酸分子在與所述靶核 苷酸分子相同的溶液中進(jìn)行擴(kuò)增，并在與所述靶核苷酸分子相同的陣列上進(jìn)行檢測。
61. 權(quán)利要求56的方法，其中通過使達(dá)到固定值所需的PCR循環(huán) 數(shù)目(CT)與其中CT值針對標(biāo)準(zhǔn)濃度標(biāo)繪的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來獲得樣品 中所述生物學(xué)生物或生物的部分的定量。
62. 權(quán)利要求1的方法，其中通過比較至少2個循環(huán)的所述信號的 所述動力學(xué)常數(shù)來獲得樣品中所述生物學(xué)生物或生物的部分的定量。
63. 根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中通過比較對于所述生物特異的 所述靶的信號數(shù)據(jù)與加入所述分析溶液中的標(biāo)準(zhǔn)拷貝的預(yù)定數(shù)目，就所 述樣品中的拷貝數(shù)而言進(jìn)行樣品中所述生物學(xué)生物或生物的部分的定
64. 根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述不同靶的擴(kuò)增通過PCR來 進(jìn)行，所述PCR具有有尾引物，并使用與所述有尾引物的尾部相同或互 補(bǔ)的第二種引物。
65. 根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述靶和所述標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增通過 PCR來進(jìn)行，所述PCR具有有尾引物，并使用與所述有尾引物的尾部相 同或互補(bǔ)的第二種引物。
66. 根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中所述有尾引物和第二種引物從 所述擴(kuò)增開始都存在，其中所述有尾引物以低于所述第二種引物的濃度 至少5倍的濃度存在。
67. 權(quán)利要求1的方法，其中所述捕獲分子包含4種不同的單鏈捕 獲分子，每一種所述捕獲分子都能夠與4種靶同源核苷酸序列之一特異 性結(jié)合。
68. 權(quán)利要求l的方法，其應(yīng)用于包含核苷酸序列的樣品，所述核 苷酸序列與所述樣品中也可能存在的至少4種其他同源核苷酸序列具有 高于3()Q/()、優(yōu)選超過60%、更優(yōu)選超過80%的同源性。
69. 權(quán)利要求68的方法，其中所述樣品中存在的所述核苷酸序列 與所述樣品中也可能存在的其他同源核苷酸序列相差1個核苷酸。
70. 權(quán)利要求l的方法，其中靶核苷酸序列通過標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記， 和其中檢測所述雜交擴(kuò)增子的步驟包括所述標(biāo)記的檢測。
71. 權(quán)利要求1的方法，所述至少一個PCR循環(huán)包含用于擴(kuò)增超過 一種核苷酸序列的超過一種引物對的使用。
72. 權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個PCR循環(huán)包含具有與所述捕獲分子序列不同的序列的引物的使用。
73. 權(quán)利要求1的方法，其中生物特異的擴(kuò)增子與所述捕獲分子的 雜交在預(yù)定位置處形成單點(diǎn)信號，由此所述單點(diǎn)信號的檢測允許區(qū)分所 述特異性擴(kuò)增子與來自其他生物的同源擴(kuò)增子。
74. 權(quán)利要求13的方法，其中所述固體載體選自玻璃、電子裝置、 硅栽體、塑料載體、硅石、金屬及其混合物，其中所述栽體以選自栽片、 圓盤、凝膠層和微珠的形式進(jìn)行制備。
75. 權(quán)利要求13的方法，其中所述固體載體選自環(huán)烯烴聚合物， 優(yōu)選Z畫ex③或Zeonor 、 Topas、 Udel、 Radel和THV。
76. 權(quán)利要求l的方法，其用于微生物的鑒定和/或定量。
77. 權(quán)利要求l的方法，其用于鑒定和/或定量屬于細(xì)胞色素P450 形式家族的核苷酸序列。
78. 權(quán)利要求l的方法，其用于生物的多態(tài)性的鑒定。
79. 權(quán)利要求l的方法，其用于給生物基因分型。
80. 權(quán)利要求l的方法，其用于單核苷酸多態(tài)性的鑒定。
81. 權(quán)利要求1的方法，其中檢測所述雜交擴(kuò)增子的步驟包括選自 下述的方法的使用比色法、熒光、時間分辨熒光、光熱干涉差、雷利 散射、拉曼散射、表面等離子體共振、質(zhì)量的改變、石英晶體微量天平、 懸臂、差示脈沖伏安法、通過非線性生成頻率光譜法的化學(xué)繪圖法、光 學(xué)改變、電阻率電容、各向異性、折射率和/或計(jì)數(shù)納米顆粒。
82. 權(quán)利要求1的方法，其中所述擴(kuò)增子的所述熒光信號在溶液中 低于在所述雜交捕獲分子上。
83. 權(quán)利要求1和82的方法，其中通過所述熒光染料的猝滅來獲 得與所述雜交擴(kuò)增子比較在溶液中所述擴(kuò)增子更低的熒光信號。
84. 權(quán)利要求1和82的方法，其中通過存在于溶液中和固定在所 述捕荻分子上的所述擴(kuò)增子之間的熒光激發(fā)的最佳波長中的差異來獲9得溶液中所述擴(kuò)增子的更低信號。
85. 權(quán)利要求1和82的方法，其中通過存在于溶液中和固定在所 述捕獲分子上的所述擴(kuò)增子之間的熒光發(fā)射的最佳波長中的差異來獲 得溶液中所述擴(kuò)增子的更低信號。
86. 權(quán)利要求85的方法，其中通過使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET) 來獲得所述熒光發(fā)射的波長中的差異。
87. 用于鑒定和/或定量可能包含與所述基因同源的至少4種核苷 酸序列的樣品中的生物基因的方法，所述方法基于檢測所述基因的 mRNA，并包括下述步驟a. 將所述mRNA拷貝成cDNA;b. 使用能夠擴(kuò)增來自所述相同生物的至少2種同源核苷酸序列的 引物對，通過至少2個PCR循環(huán)將所述cDNA或其部分?jǐn)U增成雙鏈靶核 苷酸序列；c. 使所述靶核苷酸序列與單鏈捕獲分子接觸，所述單鏈捕獲分子 在陣列的位置中與不溶性固體載體共價結(jié)合，和其中所述捕獲分子包含 能夠與所述靶核苷酸序列特異性結(jié)合，而不與所述至少4種同源核苷酸 序列結(jié)合的10 - 600個堿基的捕獲部分；和d. 檢測所述把核苷酸序列與所述捕獲分子的特異性雜交，其中捕 獲分子上的所述雜交與權(quán)利要求1的實(shí)時PCR方法組合在一個方法中。
88. 生物學(xué)生物或生物的部分的診斷和/或定量試劑盒，其包含 -在其上共價結(jié)合單鏈捕獲分子的不溶性固體載體表面，根據(jù)陣列將所述捕獲分子排列在所述固體栽體的表面上，其中所述捕獲分子包含 10 - 600個堿基的捕獲部分，其能夠與所述生物或其部分的核苷酸序列 特異性結(jié)合；和-用于執(zhí)行基因擴(kuò)增連同鑒定和/或定量來自所述生物或其部分的 擴(kuò)增核苷酸序列的反應(yīng)室，其中實(shí)時進(jìn)行關(guān)于生物的任何擴(kuò)增序列的存 在的所述檢測和所述基因擴(kuò)增。
89. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中所述捕獲分子與至 少4種同源靶序列特異性結(jié)合，所述同源靶序列為待檢測和/或定量的所述生物或其部分的所述擴(kuò)增核苷酸序列。
90. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中所述捕獲分子能夠 與具有高于30%、優(yōu)選高于60%、更優(yōu)選超過80%的同源性的靶序列 特異性結(jié)合。
91. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中所述捕獲分子的所 述捕獲部分具有低于90%并還低于80%的序列同源性。
92. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中所述陣列包含在所 述載體的不同位置處結(jié)合的，至少4種和優(yōu)選20種不同的單鏈捕獲分 子/ci^固體栽體表面的密度。
93. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中所述反應(yīng)室由彼此 流體接觸的2個區(qū)室組成。
94. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中提供具有含結(jié)合的捕獲分子的所述陣列的一個區(qū)室。
95. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其進(jìn)一步包含dNTPs、 耐熱DNA聚合酶和緩沖液。
96. 權(quán)利要求95的診斷和/或定量試劑盒，其進(jìn)一步包含引物。
97. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其進(jìn)一步包含用作內(nèi)部 標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸分子。
98. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中所述載體和反應(yīng)室 是藥筒的部分。
99. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中能夠與其相應(yīng)的靶 核苷酸序列雜交的所述捕獲分子的所述捕獲部分具有15-50個堿基的 序列。
100. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中能夠與其相應(yīng)的 靶核苷酸序列雜交的所述捕獲分子的所述捕獲部分通過至少6.8 nm的 間隔物部分與所述固體載體的表面分開。
101. 權(quán)利要求100的診斷和/或定量試劑盒，其中所述間隔物部分 是超過20個堿基、優(yōu)選超過40個堿基、更優(yōu)選超過90個堿基的核苷 酸序列。
102. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中所述捕獲分子存 在于具有1微米2-75 mm2、優(yōu)選0. 005 - 0. 2 mm2的表面積的不溶性固 體栽體上的定位區(qū)域中。
103. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中所述室包含在所 述擴(kuò)增過程期間防水設(shè)計(jì)為制成的入口和出口。
104. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中所述反應(yīng)室是不 對稱的，具有笫一個部分和第二個部分，由此所述第一個部分具有比所 述第二個部分更低的高度。
105. 權(quán)利要求104的診斷和/或定量試劑盒，其中所述陣列存在于 所述反應(yīng)的第一個部分上。
106. 權(quán)利要求88的診斷和/或定量試劑盒，其中用于所述載體和/ 或反應(yīng)室的所述材料選自玻璃、電子裝置、硅載體、塑料載體、硅石、 金屬及其混合物，其中所述載體以選自載片、圓盤、凝膠層和微珠的形 式進(jìn)行制備。
107. 權(quán)利要求106的診斷和/或定量試劑盒，其中所述載體和/或 室材料包含環(huán)烯烴聚合物，優(yōu)選Zeonex⑧或Zeonor 、 Topas、 Udel、 Radel或THV。
108. 在權(quán)利要求1的方法中使用的儀器，其包含a) 根據(jù)陣列在特定位置處與不溶性固體載體表面結(jié)合的捕獲分子；b) 用于熱調(diào)節(jié)的裝置；c) 用于檢測在擴(kuò)增子和捕獲分子之間的結(jié)合位置處形成的信號的裝置；d) 用于將所述信號轉(zhuǎn)化成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)程序。
109. 權(quán)利要求108的儀器，其中所述計(jì)算機(jī)程序進(jìn)一步識別其中 形成信號的所述陣列的位置。
110. 權(quán)利要求108的儀器，其進(jìn)一步包含用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)室， 從而使得在所述陣列上的擴(kuò)增和檢測被整合到相同儀器內(nèi)，以便檢測在 擴(kuò)增的PCR循環(huán)期間的所述雜交擴(kuò)增子。
111. 權(quán)利要求108的儀器，其中所述捕獲分子是在陣列的位置中與不溶性固體栽體共價結(jié)合的單鏈捕獲分子，其中所述捕獲分子包含10- 600個堿基的捕獲部分，所述捕獲部分能夠與所述擴(kuò)增子特異性結(jié)合。
112. 權(quán)利要求108的儀器，其中所述陣列包含彼此相差僅1個核苷酸的至少2種捕獲分子。
113. 權(quán)利要求108的儀器，其進(jìn)一步包含用于執(zhí)行得自生物或生所述熱循環(huán)儀能夠交替加熱和冷卻所述載體用于生產(chǎn)標(biāo)記的靶核苷酸。
114. 權(quán)利要求108的儀器，其中在所述擴(kuò)增的循環(huán)期間進(jìn)行所述檢測。
115. 權(quán)利要求108的儀器，其中用于檢測信號的所述裝置在所述PCR期間測量在其捕獲分子上結(jié)合的靶核苷酸序列至少2次、優(yōu)選5次、更優(yōu)選超過10次。
116. 權(quán)利要求108的儀器，其中用于檢測信號的所述裝置在所述擴(kuò)增的循環(huán)完成后測量在其捕獲分子上結(jié)合的靶核苷酸序列。
117. 權(quán)利要求108的儀器，其包括選自下述的檢測器比色法、熒光、時間分辨熒光、光熱干涉差、雷利散射、拉曼散射、表面等離子體共振、質(zhì)量的改變、石英晶體微量天平、懸臂、差示脈沖伏安法、通過非線性生成頻率光譜法的化學(xué)繪圖法、光學(xué)改變、電阻率、電容、各向異性、折射率和/或計(jì)數(shù)納米顆粒。
118. 權(quán)利要求117的儀器，其中所述檢測器是使用激光束包括共焦掃描方法的熒光掃描儀，并且還優(yōu)選針孔。
119. 權(quán)利要求105的儀器，其進(jìn)一步包含-用于貯存來自在熱循環(huán)的限定時限時關(guān)于所述載體的至少5個不同位置的不同測量的數(shù)據(jù)的貯存系統(tǒng)，-對于陣列的每一個位置在至少一個熱循環(huán)中重復(fù)檢測和貯存步驟至少一次的控制器，-用于處理至少一個熱循環(huán)中獲得的所述數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)程序，以便在擴(kuò)增前檢測和/或定量樣品中存在的核苷酸分子的量。
120. 權(quán)利要求108的儀器，其進(jìn)一步包含a. 激光源；b. 關(guān)于通過所述激光源產(chǎn)生的激光束的聚焦裝置；c. 光電倍增管；d. 針孔。
121. 權(quán)利要求108的儀器，其中用于檢測信號的所述裝置包含照射所述不溶性固體載體面的光源。
122. 權(quán)利要求120的儀器，其中所述光源是非校準(zhǔn)激光源或經(jīng)由一對光纖維束的發(fā)光二極管。
123. 權(quán)利要求108的儀器，其進(jìn)一步包含用于將在位置上形成的信號轉(zhuǎn)變成與特定靶的存在相關(guān)的數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)程序。
124. 用于基因、DNA和多核苷酸序列的擴(kuò)增和檢測的多功能儀器，其執(zhí)行PCR擴(kuò)增、多核苷酸檢測、實(shí)時PCR、定量實(shí)時PCR、微陣列檢測和/或定量、SNP檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開的是進(jìn)行實(shí)時PCR的系統(tǒng)和方法。將特異性設(shè)計(jì)的未標(biāo)記的捕獲分子固定在固體載體上，并與在一個或多個PCR循環(huán)中產(chǎn)生的擴(kuò)增子接觸。當(dāng)固體載體與PCR溶液流體接觸時，擴(kuò)增子的檢測可以在PCR循環(huán)期間或之間發(fā)生。在備選實(shí)施方案中，擴(kuò)增子的檢測在固體載體不與PCR溶液流體接觸時發(fā)生。該方法適合于同時檢測和定量密切同源的靶分子。
文檔編號C12Q1/68GK101490277SQ200780025815
公開日2009年7月22日 申請日期2007年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月17日
發(fā)明者D·胡薩, H·科恩, I·亞歷山大, J·利馬科爾, N·扎馬托, S·瑪蓋內(nèi) 申請人:埃佩多夫陣列技術(shù)股份有限公司