專利名稱：Dna聚合酶相關(guān)因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA聚合酶相關(guān)因子。具體而言，涉及用作基因工程學(xué)試劑的DNA聚合酶相關(guān)因子及其制備方法，以及編碼該因子的基因。
背景技術(shù)：
作為基因工程學(xué)所用的試劑，DNA聚合酶是一種有用的酶，它能廣泛用于DNA堿基序列測(cè)定、DNA的標(biāo)記、位點(diǎn)特異性突變導(dǎo)入等。另外，最近，隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法的開發(fā)，耐熱性DNA聚合酶引起廣泛關(guān)注，適于PCR方法的各種DNA聚合酶得到開發(fā)并已被商品化。
根據(jù)其氨基酸序列的同源性，現(xiàn)在已知的DNA聚合酶可分為4個(gè)家族，其中家族A(pol I型酶)和家族B(α型酶)占大多數(shù)。雖然各家族的DNA聚合酶具有大致相似的生化學(xué)特征，但詳細(xì)比較時(shí)，針對(duì)不同的酶，底物特異性、底物類似物的攝取效率、引物延伸性延伸速度、DNA合成的方式、是否兼有核酸外切酶活性、溫度、pH等最適反應(yīng)條件及對(duì)抑制劑的敏感性等具有不同的性質(zhì)。因此，從目前可以著手的DNA聚合酶中選擇具有最佳適用性的酶使用。
超嗜熱性古細(xì)菌激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)產(chǎn)生α型的DNA聚合酶，已經(jīng)分離出其基因[核酸研究(Nucleic Acids Research)第21卷，239～265頁(yè)(1993)]。
如同上述的pol I型酶、α型酶等一樣，已知DNA聚合酶除僅由一種酶蛋白質(zhì)表達(dá)其功能之外，還有由多個(gè)亞單位蛋白質(zhì)構(gòu)成的寡聚酶。另外還知道除具有DNA聚合酶作用的蛋白質(zhì)外，有時(shí)還共存有調(diào)節(jié)其功能的蛋白質(zhì)分子。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的是提供促進(jìn)DNA聚合酶DNA合成活性的耐熱性DNA聚合酶相關(guān)因子，以及具有與DNA聚合酶結(jié)合活性的耐熱性DNA聚合酶相關(guān)因子。
本發(fā)明另一目的是提供本發(fā)明DNA聚合酶相關(guān)因子的基因。
本發(fā)明的其它目的是提供本發(fā)明DNA聚合酶相關(guān)因子的制備方法。
本發(fā)明的其它目的是提供在本發(fā)明DNA聚合酶相關(guān)因子存在的條件下，使用DNA聚合酶合成DNA的方法。
本發(fā)明的其它目的是提供含有本發(fā)明DNA聚合酶相關(guān)因子的試劑盒。
根據(jù)本發(fā)明，通過利用本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子，可以提供比以往更優(yōu)秀的試管內(nèi)DNA合成及DNA擴(kuò)增系統(tǒng)。
最近，本發(fā)明人激烈熱球菌中發(fā)現(xiàn)了與目前已知的DNA聚合酶結(jié)構(gòu)完全不同的新型DNA聚合酶(國(guó)際公開第97/24444號(hào))。該DNA聚合酶由2種新型蛋白質(zhì)形成復(fù)合體來表達(dá)DNA聚合酶活性。另外，該酶具有強(qiáng)3′→5′核酸外切酶活性和良好的引物延伸活性，例如，應(yīng)用該酶進(jìn)行PCR的時(shí)候，可擴(kuò)增出20kb長(zhǎng)的DNA片段。該來源于激烈熱球菌的新型DNA聚合酶，至少有2種蛋白質(zhì)是酶活性所必須的構(gòu)成要素，但除此之外是否還存在該酶的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或者是否還存在影響該酶活性的因子尚不清楚。
本發(fā)明人進(jìn)行了大量研究，結(jié)果成功地分離出與上述來源于激烈熱球菌的新型DNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)。并且克隆了其基因，使通過基因工程學(xué)方法來生產(chǎn)該蛋白質(zhì)成為可能，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)可以促進(jìn)DNA聚合酶所具有的DNA合成活性。
本發(fā)明的要點(diǎn)涉及[1]促進(jìn)DNA聚合酶之DNA合成活性的耐熱性DNA聚合酶相關(guān)因子；[2]另外還具有與DNA聚合酶結(jié)合活性的上述[1]的DNA聚合酶相關(guān)因子；[3]上述[2]的DNA聚合酶相關(guān)因子，它含有序列表的序列號(hào)5或6中所示氨基酸序列的DNA聚合酶結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，具有與DNA聚合酶結(jié)合的活性； 上述[1]-[3]任一項(xiàng)中的DNA聚合酶相關(guān)因子，它含有選自序列表的序列號(hào)1、3、19、27、34、64、70及80中的至少一種氨基酸序列，或者含有該氨基酸序列中有1個(gè)以上的氨基酸發(fā)生置換、缺失、添加或插入的氨基酸序列；[5]編碼DNA聚合酶相關(guān)因子的基因，該DNA聚合酶相關(guān)因子含有選自序列表的序列號(hào)1、3、19、27、34、64、70及80中的至少一種氨基酸序列，或者含有在該氨基酸序列中有1個(gè)以上的氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加或插入的序列，對(duì)DNA聚合酶的DNA合成活性有促進(jìn)作用；[6]上述[5]的基因，它含有選自序列表序列號(hào)2、4、18、26、33、63、69及79的堿基序列，或者含有該堿基序列中1個(gè)以上的堿基發(fā)生了置換、缺失、添加或插入的序列；[7]編碼DNA聚合酶相關(guān)因子的基因，該DNA聚合酶相關(guān)因子能與上述[5]或[6]記載的基因進(jìn)行雜交，且對(duì)DNA聚合酶的DNA合成活性有促進(jìn)作用；[8]DNA聚合酶相關(guān)因子的制備方法，其特征在于它包含如下工序培養(yǎng)含有上述[5]～[7]中任一種基因的轉(zhuǎn)化體，從該培養(yǎng)物中獲取可促進(jìn)DNA聚合酶DNA合成活性的耐熱性DNA聚合酶相關(guān)因子；[9]用DNA聚合酶合成DNA的方法，其特征在于在上述[1]～[4]中任一種DNA聚合酶相關(guān)因子存在的條件下合成DNA；[10]上述[9]的DNA合成方法，它是在2種以上的DNA聚合酶相關(guān)因子存在的條件下合成DNA；[11]上述[10]的DNA合成方法，在F7、PFU-RFC及PFU-RFCLS作為DNA聚合酶相關(guān)因子存在的條件下進(jìn)行DNA合成的方法；[12]上述[9]～[11]任一項(xiàng)中記載的DNA合成方法，其中DNA聚合酶為耐熱性DNA聚合酶；[13]通過PCR來實(shí)施的上述[12]中的DNA合成方法；[14]試管內(nèi)合成DNA所使用的試劑盒，它含有上述[1]～[4]任一項(xiàng)中記載的DNA聚合酶相關(guān)因子及DNA聚合酶； 上述[14]的試劑盒，它還含有DNA合成反應(yīng)所必需的試劑；[16]上述[14]或[15]中的試劑盒，含有2種以上的DNA聚合酶相關(guān)因子；[17]上述[16]的試劑盒，作為DNA聚合酶相關(guān)因子，它含有F7、PFU-RFC及PFU-RFCLS；[18]上述[14]～[17]任一項(xiàng)的試劑盒，它含有的DNA聚合酶為耐熱性DNA聚合酶。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示從抗Pfu聚合酶抗體柱分離出的7種蛋白質(zhì)(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5，F(xiàn)6，F(xiàn)7)的SDS-PAGE圖。按F1～F7的順序，SDS-PAGE上的分子量大約為55kDa，24kDa，37kDa，19.5kDa，27kDa，64kDa，33kDa。
圖2表示含有編碼F1蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒pF1-4-10的插入DNA片段的限制性酶譜。
圖3表示F1蛋白質(zhì)的5′→3′核酸外切酶活性。
圖4表示F1蛋白質(zhì)的3′→5′核酸外切酶活性。
圖5表示含有編碼F2蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒pF2172Nh的插入DNA片段的限制性酶譜。
圖6表示含有編碼F7蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒pF7-1-8的插入DNA片段的限制性酶譜。
圖7表示添加F7蛋白質(zhì)時(shí)DNA聚合酶引物延伸活性的放射自顯影圖。
圖8表示添加F7蛋白質(zhì)時(shí)DNA聚合酶對(duì)較高分子的引物延伸反應(yīng)物的引物延伸活性的放射自顯影圖。
圖9表示含有編碼PFU-RFC蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒pRFS254NdB的插入DNA片段的限制性酶譜。
圖10表示從抗Pfu DNA聚合酶抗體柱分離出的蛋白質(zhì)(F7)的SDS-PAGE結(jié)果。推定SDS-PAGE上F7的分子量大約為33kDa。
圖11表示Pfu DNA聚合酶以及PFu DNA聚合酶與F7的混合物，進(jìn)行凝膠過濾后，對(duì)所得洗脫液進(jìn)行DNA聚合酶活性測(cè)定的結(jié)果。
圖12是含有編碼PFU-RFCLS蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒pRFLSNh的插入DNA片段的限制性酶譜。
圖13表示激烈熱球菌基因組DNA上編碼F5蛋白質(zhì)的基因周圍的限制性酶譜。
圖14表示從抗PFU-RFC抗體柱分離出的3種蛋白質(zhì)(PFU-RFCLS、PFU-RFC、F7)的SDS-PAGE結(jié)果。
圖15表示添加F7或RFC-N復(fù)合體時(shí)的DNA聚合酶活性。
圖16表示含有編碼PFU-RFCLS及PFU-RFC的基因的質(zhì)粒pRFC10的插入DNA片段的限制性酶譜。
圖17表示添加F7或F7和rRFC-M復(fù)合體時(shí)的DNA聚合酶活性。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式1.本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子本說明書中的“DNA聚合酶相關(guān)因子”是指與DNA聚合酶共存，由此影響DNA聚合酶功能的因子，具體而言，包括具有促進(jìn)DNA聚合酶DNA合成活性作用的因子，具有與DNA聚合酶結(jié)合活性的因子，以及具有這兩種活性的因子等。另外，本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子為耐熱性蛋白質(zhì)，例如，可耐受80℃15分鐘的熱處理。因此，也可用于使用耐熱性DNA聚合酶，在高溫條件下進(jìn)行的DNA合成反應(yīng)中。
(a)促進(jìn)DNA聚合酶DNA合成活性的DNA聚合酶相關(guān)因子。
作為促進(jìn)DNA聚合酶DNA合成活性的DNA聚合酶相關(guān)因子只要能促進(jìn)DNA聚合酶的DNA合成活性，沒有特殊限定，例如含有全部或部分選自序列號(hào)1，3，19，27，34，64，70及80中的至少一種氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者含有在這些序列中1個(gè)以上的氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加或插入的氨基酸序列，且具有促進(jìn)DNA聚合酶的DNA合成活性這一作用的功能性同等物。本說明書中的“1個(gè)以上”指1個(gè)或數(shù)個(gè)或更多的個(gè)數(shù)。另外，“功能性同等物”指雖具有結(jié)構(gòu)上的差異，但其功能和活性基本上同等，包含在本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的范圍內(nèi)。
作為本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子促進(jìn)其活性的DNA聚合酶，沒有特殊限定，例如耐熱性的DNA聚合酶，尤其是來源于超嗜熱菌的DNA聚合酶。具體地講，可例舉來源于激烈熱球菌的DNA聚合酶(后述的Pfu聚合酶C等)。如后面所述，Pfu聚合酶是含有具有序列表的序列號(hào)5和序列號(hào)6中所示氨基酸序列的DNA聚合酶結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的酶。
另外，本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子，雖然只促進(jìn)特定DNA聚合酶活性的也可以，但優(yōu)選能對(duì)不同來源的多種DNA聚合酶起促進(jìn)活性的。
促進(jìn)DNA聚合酶的DNA合成活性的活性促進(jìn)測(cè)定方法，只要是DNA聚合酶的DNA合成活性測(cè)定中所常用的方法即可，無特殊限定。促進(jìn)DNA合成活性的活性可這樣測(cè)定，如在新合成的DNA鏈攝取標(biāo)記核苷酸的活性測(cè)定時(shí)，通過比較添加該因子和不添加該因子時(shí)的活性不同，可對(duì)該因子的活性進(jìn)行測(cè)定。另外還可通過單位時(shí)間內(nèi)新合成的DNA鏈的鏈長(zhǎng)和PCR中擴(kuò)增產(chǎn)物的量進(jìn)行確認(rèn)。前面所講DNA合成活性的測(cè)定方法可以采用(哈珀&出版社發(fā)行(ハ一パ一アンドロ一發(fā)行))，D.R.Davis編輯的《來自大腸桿菌的DNA聚合酶》(DNA polymerasefrom Escherichia coli)中第263-276頁(yè)(C.C.Richardson著)記載的方法。
另外，本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子，與單獨(dú)使用相比，多個(gè)DNA聚合酶相關(guān)因子并用時(shí)，可能會(huì)使共存的DNA聚合酶發(fā)揮出更高的DNA聚合酶活性。
(b)具有與DNA聚合酶相結(jié)合活性的DNA聚合酶相關(guān)因子作為具有與DNA聚合酶相結(jié)合活性的DNA聚合酶相關(guān)因子，只要具有與DNA聚合酶相結(jié)合的活性即可，無特殊限定。另外，本說明書中的“具有與DNA聚合酶相結(jié)合活性的DNA聚合酶相關(guān)因子”，除指具有與DNA聚合酶直接結(jié)合活性的物質(zhì)外，還包含其它物質(zhì)，如具有通過其它的DNA聚合酶相關(guān)因子介導(dǎo)與DNA聚合酶間接結(jié)合活性的物質(zhì)。例如，含有全部或部分選自序列表的序列號(hào)1，3，19，27，34，64，70和80中的至少一種氨基酸序列的蛋白質(zhì)，含有這些序列中1個(gè)以上的氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加或插入的氨基酸序列，且具有與DNA聚合酶相結(jié)合活性的功能性同等物。本說明書中“1個(gè)以上”指1個(gè)或數(shù)個(gè)或更多的個(gè)數(shù)。
作為本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子結(jié)合的DNA聚合酶沒有特殊限定，例如耐熱性DNA聚合酶，尤其是超嗜熱菌來源的DNA聚合酶。具體而言可推薦來源于激烈熱球菌的DNA聚合酶(Pfu聚合酶C等)。對(duì)于Pfu聚合酶C，可與具有序列表的序列號(hào)5，序列號(hào)6所示氨基酸序列的DNA聚合酶結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)中的任一方或雙方結(jié)合。
另外，本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子，雖然與特定的DNA聚合酶相結(jié)合的也可以，但優(yōu)選可與不同起源的多種DNA聚合酶相結(jié)合的。
作為與DNA聚合酶相結(jié)合的測(cè)定方法，可推薦將該因子與DNA聚合酶相混合，通過未變性凝膠電泳、凝膠過濾等檢測(cè)分子量變化的方法，該因子將DNA聚合酶向固相載體吸附的檢測(cè)方法。
另外，由序列表的序列號(hào)19所示氨基酸序列構(gòu)成的DNA聚合酶相關(guān)因子，具有核酸外切酶活性。由此認(rèn)為序列表中序列號(hào)19所示的氨基酸序列所構(gòu)成的DNA聚合酶相關(guān)因子，是具有與DNA復(fù)制、DNA修復(fù)等DNA聚合酶作用相關(guān)功能的蛋白質(zhì)。并且，作為上述DNA聚合酶相關(guān)因子的功能性同等物，含有序列表中序列號(hào)19所示的氨基酸序列的一部分，或者含有該序列中有1個(gè)以上的氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加或插入的序列，具有與DNA聚合酶相結(jié)合的活性，且同樣還具有核酸外切酶活性的蛋白質(zhì)，也作為DNA聚合酶相關(guān)因子，屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。本說明書中“1個(gè)以上”指1個(gè)或數(shù)個(gè)或更多的個(gè)數(shù)。
在本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的說明中，表示為“分別含有序列表中特定序列號(hào)所示氨基酸序列全部或一部分的蛋白質(zhì)”，但這里的“含有的蛋白質(zhì)”是指如下的蛋白質(zhì)，也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。即，用基因工程學(xué)方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)的時(shí)候，可屢次作為融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)。例如，為了增加目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量，可在N末端添加來源于其它蛋白質(zhì)的N末端肽鏈，或者在目的蛋白質(zhì)的N末端或C末端添加合適的肽鏈進(jìn)行表達(dá)，通過使用與該肽鏈具有親和性的載體，很容易地進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的純化。上述融合蛋白質(zhì)也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。2.編碼本發(fā)明DNA聚合酶相關(guān)因子的基因(a)編碼本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的基因性質(zhì)編碼本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的基因，是編碼前面所講的DNA聚合酶相關(guān)因子的DNA或RNA。具體而言，可推薦這樣的基因，它所編碼的DNA聚合酶相關(guān)因子含有選自序列表序列號(hào)1，3，19，27，34，64，70及80中的至少一種氨基酸序列的全部或一部分，或者含有這些序列中有1個(gè)以上的氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加或插入的氨基酸序列，還具有促進(jìn)DNA聚合酶的DNA合成活性的活性，或與DNA聚合酶相結(jié)合的活性。具體而言，這樣的基因所編碼的DNA聚合酶相關(guān)因子含有選自序列表序列號(hào)2，4，18，26，33，63，69和79中的至少一種氨基酸序列的全部或其中一部分，或者含有這些序列中有1個(gè)以上的氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加或插入的氨基酸序列，具有促進(jìn)DNA聚合酶的DNA合成活性的活性或具有與DNA聚合酶相結(jié)合的活性。本說明書中“1個(gè)以上”指1個(gè)或數(shù)個(gè)或更多的個(gè)數(shù)。再者本發(fā)明中還包括這樣的基因，它所編碼的DNA聚合酶相關(guān)因子也能與本發(fā)明的這些基因的DNA雜交，且具有促進(jìn)DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的活性，或具有與DNA聚合酶相結(jié)合的活性。
本說明書中的“(與某種基因)雜交的基因”指由能與某基因的DNA進(jìn)行雜交的DNA組成的基因，是具有與該基因類似的堿基序列的基因。具有與某基因類似的堿基序列的基因，與該基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該蛋白質(zhì)所具有的功能相類似的可能性高?；驂A基序列的相似性可通過檢測(cè)兩基因的DNA或其一部分序列能否在嚴(yán)格條件下形成雜交體(進(jìn)行雜交)來加以判斷，利用這種方法可獲得編碼與某基因編碼的蛋白質(zhì)具有同樣功能的蛋白質(zhì)的基因。也就是說，用本發(fā)明中得到的基因的DNA或其一部分作探針，通過應(yīng)用眾所周知的方法進(jìn)行雜交，可得到具有與本發(fā)明的某基因相類似的堿基序列的本發(fā)明的其它基因。例如雜交可根據(jù)1989年冷泉港實(shí)驗(yàn)室發(fā)行，T.Maniatis等編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第2版(Molecular CloningA Laboratory Manual2nd ed.)所記載的方法進(jìn)行。
這里所講的“嚴(yán)格條件”是指不引起非特異性雜交的條件，具體而言，可推薦以下的條件。即，在含有0.5％SDS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll 400、0.01％變性鮭精DNA的6×SSC(1×SSC表示0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)中將固定了DNA的膜。50℃，與標(biāo)記DNA探針共溫育12-20小時(shí)。溫育之后，從0.5％SDS的2×SSC、37℃的條件開始洗滌，到SSC濃度為0.1×SSC，溫度到達(dá)50℃的范圍內(nèi)進(jìn)行變化來洗膜，直到固定的標(biāo)記DNA探針的信號(hào)能與背景相區(qū)別為止。
另外，雜交中可用本發(fā)明的基因的堿基序列的一部分作引物的基因擴(kuò)增法，例如可利用PCR法。PCR的條件可根據(jù)引物DNA或模板DNA的序列進(jìn)行適宜的設(shè)定。這樣所得的基因是否能編碼具有目的功能的蛋白質(zhì)，可利用適當(dāng)?shù)乃拗骱捅磉_(dá)體系來表達(dá)該基因所編碼的蛋白質(zhì)，通過確認(rèn)所得蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行檢測(cè)。
另外，作為人為制備本發(fā)明中的氨基酸序列或堿基序列中有1個(gè)以上的序列發(fā)生了置換、缺失、添加或插入了的氨基酸序列或堿基序列的方法，可推薦1989年，冷泉港實(shí)驗(yàn)室發(fā)行，T.Maniatis等編著的“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第2版(Molecular CloningA Laboratory Manual2nd ed.)中記載的多種基因工程學(xué)方法，具體而言，可推薦位點(diǎn)特異的突變導(dǎo)入法、盒突變法等基因工程學(xué)方法。應(yīng)用前述的部位特異性突變導(dǎo)入法可制備具有1個(gè)或數(shù)個(gè)置換、缺失、添加或插入的氨基酸序列或堿基序列。另外，應(yīng)用前述的盒突變法可制備出比用前述的部位特異性突變導(dǎo)入法得到的序列具有更大區(qū)域的缺失、添加或插入的氨基酸序列或堿基序列，若如此所得的變異體也具有功能上的同等性，則也包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在基因工程學(xué)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)中，編碼目的蛋白質(zhì)的原來基因上使用的密碼子在宿主中使用頻度低的時(shí)候，蛋白質(zhì)的表達(dá)量低。這種情況下，不改變編碼的氨基酸序列而人為地將密碼子變成在宿主中頻繁使用的密碼子，這樣來達(dá)到高表達(dá)目的蛋白質(zhì)的目的(例如，特公平7-102146號(hào)公報(bào))。
(b)編碼本發(fā)明的DNA聚合物相關(guān)因子的基因的克隆以下詳細(xì)說明對(duì)所得克隆的分析，其表達(dá)產(chǎn)物DNA聚合酶相關(guān)因子理化性質(zhì)、功能的闡明。
如前所述，本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子具有促進(jìn)DNA聚合酶具有的DNA合成活性的作用，或具有與DNA聚合酶相結(jié)合的性質(zhì)。因此，可以這些作用為指標(biāo)來獲取該因子。
作為獲取本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子時(shí)所應(yīng)用的DNA聚合酶沒有特殊限制，例如，可應(yīng)用激烈熱球菌生產(chǎn)的DNA聚合酶。作為激烈熱球菌生產(chǎn)的DNA聚合酶，可應(yīng)用來源于激烈熱球菌DSM 3638株的含有具有序列表中序列號(hào)5和/或序列號(hào)6所示的氨基酸序列的DNA聚合酶構(gòu)造蛋白質(zhì)的酶。
另外，本說明書中為了與從同一激烈熱球菌發(fā)現(xiàn)的α型DNA聚合酶[Pfu DNA聚合酶，核酸研究(Nucleic Acids Research)，第21卷，259～265頁(yè)(1993)]相區(qū)別，將該酶記作Pfu聚合酶C。編碼該酶的基因包含在質(zhì)粒pFU 1001中，而將用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM 109的轉(zhuǎn)化體命名為大腸桿菌JM 109/pFU 1001，按照布達(dá)佩斯的條約，于平成7年8月11日(原保藏日)保藏于日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)(郵編305-8566)的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM BP-5579。由此，Pfu聚合酶C可通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，對(duì)所得培養(yǎng)物進(jìn)行純化而獲得。該P(yáng)fu聚合酶C是含有具有序列表中序列號(hào)5和序列號(hào)6所示氨基酸序列的DNA聚合酶構(gòu)成蛋白質(zhì)的酶。
Pfu聚合酶C是具有以下性質(zhì)的酶。
(A)以單鏈模板DNA的引物退火的復(fù)合體作底物測(cè)定聚合酶活性時(shí)，比以活性DNA作底物時(shí)的活性高。
(B)具有3′→5′核酸外切酶活性。
(C)以λ-DNA作模板在以下條件下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的時(shí)候，在不添加其它酶時(shí)可擴(kuò)增出大約20kb的DNA片段。PCR的條件a)反應(yīng)液組成含有10mM Tris-HCl(pH9.2)，3.5mMMgCl2，75mM KCl，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各400μm，0.01％牛血清白蛋白，0.1％Triton X-100，5.0％ng/50μl λ-DNA，10pmole/50μl引物λ1(序列表中序列號(hào)58)及引物λ11(序列表中序列號(hào)59)，3.7單位/50μl DNA聚合酶。
b)反應(yīng)條件98℃10秒～68℃10分為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR。
(D)由SDS-PAGE上大約相當(dāng)于90,000道爾頓，140,000道爾頓的2種DNA聚合酶結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成。
獲得本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的方法沒有特殊限定，例如可這樣獲得將上述的Pfu聚合酶C等DNA聚合酶固定到適宜的載體上，將之與含有DNA聚合酶相關(guān)因子的樣品相混合，除去未與載體結(jié)合的物質(zhì)后，溶出結(jié)合了的物質(zhì)?？捎帽娭姆椒▽NA聚合酶固定到載體。另外也可制備DNA聚合酶的抗體，利用將之固定化的載體進(jìn)行DNA聚合酶的固定化。例如，制備抗Pfu聚合酶C的抗體，應(yīng)用該抗體，從激烈熱球菌來源的樣品，如激烈熱球菌的細(xì)胞裂解液中獲取本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的時(shí)候，若使用該抗體的固定化載體，由于樣品中的Pfu聚合酶C與該抗體相結(jié)合，不必要額外再添加該P(yáng)fu聚合酶C，就可容易地純化出DNA聚合酶相關(guān)因子。
作為獲取本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子所使用的樣品，沒有特殊限定，例如可應(yīng)用來源于微生物的樣品，具體而言，可應(yīng)用來源于激烈熱球菌SDM 3638的樣品。該菌株可從德意志微生物保藏中心GmbH得到。在適當(dāng)?shù)脑鲋撑囵B(yǎng)基上培養(yǎng)該菌株，將由培養(yǎng)物制備的細(xì)胞裂解液加樣到填充了Pfu聚合酶C抗體固定化載體的柱子上，除Pfu聚合酶C之外，數(shù)種蛋白質(zhì)吸附到柱上?？捎萌缦滤镜墓ば蚩寺〕鼍幋a這些蛋白質(zhì)的基團(tuán)。
首先，應(yīng)用眾所周知的方法分離上述的蛋白質(zhì)，測(cè)定其N末端的氨基酸序列，以此作參考制備合成寡核苷酸用作引物或探針。然后，以合成的寡核苷酸作引物，以激烈熱球菌的基因組DNA作模板進(jìn)行PCR，由此獲得含有目的基因的DNA片段。PCR條件可進(jìn)行適當(dāng)設(shè)定。或者以上述的寡核苷酸作探針進(jìn)行雜交，從激烈熱球菌的基因組DNA獲得含有目的基因的DNA片段。這種情況下可應(yīng)用很適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶说募ち覠崆蚓蚪MDNA進(jìn)行Southern雜交，應(yīng)用該激烈熱球菌基因組DNA的基因文庫(kù)進(jìn)行菌落雜交、噬斑雜交、點(diǎn)雜交等。
如此所得的DNA片段沒有包括目的基因全長(zhǎng)的時(shí)候，可參考所得DNA片段的堿基序列制作新的引物，再進(jìn)行PCR，或者用所得DNA片段或其一部分作探針進(jìn)行雜交，由此得到目的基因的全長(zhǎng)。
上述的PCR和雜交操作沒有特殊的限定，例如可參照1989年，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，T.Maniatis等編著的“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第2版(Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd ed.)進(jìn)行。
當(dāng)激烈熱球菌DSM 3638的細(xì)胞裂解液與上述的抗Pfu聚合酶C抗體固定化載體混合的時(shí)候，除Pfu聚合酶C之外，還有7種蛋白質(zhì)吸附到該載體上。本發(fā)明通過上述操作分離出了其中6種蛋白質(zhì)的基因。這些蛋白質(zhì)分別命名為F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5和F7，是本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的具體例子。編碼它們的基因的開讀框的堿基序列分別示于序列表的序列號(hào)18，26，79，33，69及2中。另外，由這些堿基序列所推算的各蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別示于序列表的序列號(hào)19，27，80，34，70及1中。
將克隆的基因?qū)脒m當(dāng)?shù)乃拗髦校鐚?dǎo)入大腸桿菌中，可表達(dá)出到所編碼的蛋白質(zhì)。例如，將導(dǎo)入了編碼上述F7基因的大腸桿菌JM 109的轉(zhuǎn)化體命名為大腸桿菌JM 109/pF7-HH-18，依照布達(dá)佩斯條約，于平成9年6月3日(原保藏日)保藏于日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)(郵編305-8566)的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM BP-6338。培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，可從培養(yǎng)物中獲得F7。本發(fā)明中證明如此所得的F7除分離該蛋白質(zhì)時(shí)所應(yīng)用的Pfu聚合酶C之外，還可促進(jìn)來源于激烈熱球菌的α型聚合酶(Pfu DNA聚合酶)及來源于隱蔽熱網(wǎng)菌(Pyrodictium occultum)的2種DNA聚合酶[細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol)第177卷，第2164～2177頁(yè)(1993)的活性。
另外證明上述的F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4和F5也分別促進(jìn)Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶的活性。
將上述來源于激烈熱球菌DSM 3638的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比較的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)F1與來源于流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的單鏈DNA特異的核酸外切酶[科學(xué)(Science)，第269卷，第496～512頁(yè)(1993)]間具有同源性。F3為來源于多枝支動(dòng)菌(Mycoplana ramosa)的乙?；喟钒被饷竅細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)，第178卷，第5781～5786頁(yè)(1996)]及人的組蛋白脫?；竅科學(xué)(Science)，第272卷，第408～411頁(yè)(1996)]之間具有同源性。另外，F(xiàn)7和與真核生物DNA復(fù)制相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigenPCNA)[EMBO J.，第11卷，第5111～5120頁(yè)(1995)；核酸研究(Nucleic Acids Research)第18卷，第1363～1381頁(yè)(1990)；美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第84卷，第1575～1579頁(yè)(1987)]之間具有同源性。未發(fā)現(xiàn)F2，F(xiàn)4及F5與已知的蛋白質(zhì)間具有同源性。
具報(bào)道，PCNA與復(fù)制因子(RFC，RF-C)形成復(fù)合體，與DNA合成相關(guān)[生物化學(xué)，第68卷，第1542～1548頁(yè)(1996)]。因此期望激烈熱球菌中也有與RFC相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)表達(dá)，與上述的F7一起關(guān)系到DNA合成反應(yīng)。獲得該蛋白質(zhì)，例如通過與上述F7一起加入到DNA聚合酶反應(yīng)體系中，得到DNA聚合酶活性更佳促進(jìn)效果?？赏ㄟ^如下所示的工程來獲得編碼激烈熱球菌的RFC同源體的基因。
古細(xì)菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)染色體DNA的全部堿基序列已經(jīng)闡明[科學(xué)(Science)，第273卷，第1058～1073頁(yè)(1996)]，該堿基序列中包含編碼PCNA及RFC的同源蛋白質(zhì)的基因。比較該菌株的RFC小亞基和大亞基的同源基因及已知的RFC小亞基基因編碼的氨基酸序列[核酸研究(Nucleic Acids Research)，第21卷，第123頁(yè)(1993)；核酸研究(Nucleic Acids Research)，第22卷，第1527～1535頁(yè)(1994)]，檢測(cè)其同源性高的氨基酸序列，以此作參考，可以制備合成寡核苷酸作為引物或探針，以獲得編碼RFC小亞基及大亞基的基因片段。接著使用該寡核苷酸，根據(jù)上述獲得編碼F1～F7的基因時(shí)的操作，可獲得編碼來源于激烈熱球菌的RFC小亞基相同物PFC-RFC的基因及編碼RFC大亞基相同物的PFU-RFCLS的基因。
測(cè)定如此所得的編碼PFC-RFC的基因的堿基序列，將由至所編碼的推算的氨基酸序列，與已知的RFC小亞基的氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果證明該氨基酸序列中存在介內(nèi)序列(intein)。
將介內(nèi)序列對(duì)應(yīng)的區(qū)域從該基因中除去，可獲得在可能表達(dá)PFU-RFC的狀態(tài)下所包含的基因。編碼該基因中PFC-RFC區(qū)域的開放閱讀框的堿基序列以及由該堿基序列所推算的PFU-RFC的氨基酸序列分別示于序列表的序列號(hào)4和3中。另外，PFU-RFCLS基因中的編碼PFU-RFCLS的開放閱讀框的堿基序列以及至所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別顯示于序列表的序列號(hào)63和64中。這兩種蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的具體實(shí)例之一。
應(yīng)用該基因可構(gòu)建PFU-RFC表達(dá)時(shí)使用的質(zhì)粒。這樣的表達(dá)質(zhì)粒有質(zhì)粒pRFS254SNc，另外，將導(dǎo)入了該質(zhì)粒的大腸桿菌JM 109的轉(zhuǎn)化體命名為大腸桿菌JM 109/pRFS254SNc，于平成9年6月3日(原保藏日)，依照布達(dá)佩斯條約，保藏于日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)(郵編305-8566)的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM BP-6339。培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，可從培養(yǎng)物中獲得PFU-RFC。該P(yáng)FU-RFC單獨(dú)應(yīng)用時(shí)可促進(jìn)DNA聚合酶的活性，與上述F7聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，與單獨(dú)添加各蛋白質(zhì)的情況相比，可以看到協(xié)同的促進(jìn)效果。
另外，可制備同時(shí)導(dǎo)入了PFU-RFC基因和PFU-RFCLS基因的轉(zhuǎn)化體，由此可表達(dá)PFU-RFC與PFU-RFCLS所形成的復(fù)合體(以下叫做holo-RFC。另外，特別將用基因工程學(xué)方法生產(chǎn)的holo-RFC記作rRFC-M復(fù)合體)。前面復(fù)合體能促進(jìn)DNA聚合酶的活性，尤其與前面的F7并用的時(shí)候表現(xiàn)出高效。
前面所述的PFU-RFC及PFU-RFCLS與F7混合使用的時(shí)候，能更強(qiáng)的促進(jìn)DNA聚合酶活性。這種情況下可將前面所述的holo-RFC(或rRFC-M復(fù)合體)與F7混合使用，也可應(yīng)用前述的PFU-RFC、PFU-RFCLS及F7構(gòu)成的復(fù)合體(RFC-N復(fù)合體)。
按照以上說明，本發(fā)明提供促進(jìn)DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的DNA聚合酶相關(guān)因子及編碼該因子的基因。利用該基因，可通過基因工程學(xué)方法生產(chǎn)該基因。再者，利用該基因可獲得編碼與本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子具有同等功能的蛋白質(zhì)的基因。
本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子包括前述已知與DNA合成反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如與來自真核生物的PCNA、RFC等蛋白質(zhì)間具有同源性的蛋白質(zhì)。據(jù)報(bào)道，PCNA、RFC等蛋白質(zhì)以形成復(fù)合體的方式，通過DNA聚合酶δ參與DNA合成反應(yīng)[生物化學(xué)，第68卷，第1542～1548頁(yè)(1996)]。但是，本發(fā)明所公開的DNA聚合酶相關(guān)因子不僅其復(fù)合體，即便在分別單獨(dú)應(yīng)用的時(shí)候也可促進(jìn)DNA聚合酶的活性，另外，對(duì)與DNA聚合酶δ結(jié)構(gòu)不同的DNA聚合酶也有效果。
可用于具有促進(jìn)作用的、利用DNA聚合酶的各種各樣的工程中，例如用于DNA堿基序列測(cè)定，DNA的標(biāo)記，通過PCR進(jìn)行的DNA擴(kuò)增等。向DNA聚合酶的反應(yīng)體系中加入本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子后，尤其可見從引物開始的延伸DNA鏈的活性得以改善。另外，由于該因子具有高熱穩(wěn)定性，所以可用于PCR，尤其是期望擴(kuò)增長(zhǎng)鏈DNA的PCR。
再者，本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子中具有與DNA聚合酶結(jié)合活性的因子，可在DNA聚合酶的檢測(cè)、純化等過程中使用。例如，在使用結(jié)合了本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的載體進(jìn)行親和層析的時(shí)候，可有效地純化該因子結(jié)合的DNA聚合酶。3.本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的制備方法本發(fā)明DNA聚合酶相關(guān)因子的制備方法的特征之一是含有這樣的工序培養(yǎng)含有本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中采集具有促進(jìn)DNA聚合酶所具有的DNA合成活性或具有與DNA聚合酶相結(jié)合活性的耐熱性DNA聚合酶相關(guān)因子。
本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的制備方法中，可應(yīng)用蛋白質(zhì)純化中所適用的普通方法。例如，可將編碼本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的DNA連接到表達(dá)載體上，在表達(dá)載體啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行過量表達(dá)?；蛘邔⒕幋a本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的DNA與慣用的編碼谷胱甘肽還原酶、β-半乳糖苷酶等蛋白質(zhì)的DNA或者與編碼組氨酸標(biāo)記(ヒスチジンタグ)的DNA連接，以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，這樣可從保持本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)化體中容易地采集到該DNA聚合酶相關(guān)因子。可通過應(yīng)用常用的鎳柱等親和層析色譜，容易地分離前面的融合蛋白質(zhì)。通過常用的方法可從前面的融合蛋白質(zhì)的谷胱甘肽還原酶、β-半乳糖苷酶等蛋白質(zhì)分離到本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子。
另外，與從激烈熱球菌獲得本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的方法相同，表達(dá)的本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子可這樣獲得將Pfu聚合酶C等DNA聚合酶固化到適當(dāng)?shù)妮d體上，將之與含有DNA聚合酶相關(guān)因子的樣品相混合，除去未與載體相結(jié)合的物質(zhì)之后，溶出結(jié)合的物質(zhì)，即可獲得。4.DNA的合成方法本發(fā)明的合成方法的一大特征是在前述本發(fā)明DNA聚合酶相關(guān)因子的存在下，應(yīng)用DNA聚合酶合成DNA。本發(fā)明的DNA合成方法中，在本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的存在下，通過應(yīng)用DNA聚合酶合成DNA，可擴(kuò)增得到大約20kb的長(zhǎng)鏈DNA。
本發(fā)明的DNA合成方法中所應(yīng)用的DNA聚合酶相關(guān)因子可推薦F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5，F(xiàn)7，PFU-RFC和PFU-RFCLS等。本發(fā)明的DNA合成方法中，上述的DNA聚合酶相關(guān)因子可單獨(dú)應(yīng)用或2種以上混合使用。例如，本發(fā)明的DNA合成方法中，通過應(yīng)用F7，PFU-RFC和PFU-RFCLS 3種DNA聚合酶相關(guān)因子，可合成比以往DNA合成方法中所得到的DNA片段更長(zhǎng)的DNA片段。本發(fā)明的DNA的合成方法中，前述的3種DNA聚合酶相關(guān)因子可各自單獨(dú)混合使用，亦可將F7與PFU-RFC及PFU-RFCLS構(gòu)成的holo-RFC(rRFC-M復(fù)合體)2種一起混合使用。再者，前面的3種DNA聚合酶相關(guān)因子也可以F7、PFU-RFC及PFU-RFCLS構(gòu)成的復(fù)合體(RFC-N復(fù)合體)的形式應(yīng)用。
本發(fā)明的DNA合成方法中所應(yīng)用的DNA聚合酶，可應(yīng)用以來源于大腸桿菌的Pol I等DNA聚合酶，來源于嗜熱型棲熱菌(Thermusthermophilus)的Tth DNA聚合酶，來源于水生型棲熱菌(Thermusaquaticus)的Taq DNA聚合酶，來源于激烈熱球菌的Pfu DNA聚合酶等為代表的耐熱性DNA聚合酶。
另外，本發(fā)明的DNA合成方法中，可應(yīng)用前述的DNA聚合酶通過PCR來合成DNA。
本發(fā)明的DNA合成方法中對(duì)本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子存在的使用量沒有特殊限定，為了發(fā)揮促進(jìn)DNA聚合酶的合成活性的活性，可足量使用。5.含有本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子的試劑盒本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子可用于使用DNA聚合酶的各種反應(yīng)中。因此可將本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子添加到用于試管內(nèi)進(jìn)行DNA合成反應(yīng)的試劑盒中，如用雙脫氧法測(cè)定DNA堿基序列的試劑盒，DNA標(biāo)記用試劑盒，PCR試劑盒等，由此可改善這些試劑盒的性能。這樣的試劑盒除含有DNA聚合酶和本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子外，也可包含DNA聚合酶反應(yīng)中所必要的其他試劑，如dNTP，MgCl2等。作為本發(fā)明的試劑盒中所包含的DNA聚合酶相關(guān)因子，可推薦F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5，F(xiàn)7，PFU-RFC及PFU-RFCLS等。本發(fā)明的試劑盒中，前述的DNA聚合酶相關(guān)因子可單獨(dú)或2種以上混合使用。優(yōu)選應(yīng)用F7，PFU-RFC及PFU-RFCLS 3種DNA聚合酶相關(guān)因子。前述的3種DNA聚合酶相關(guān)因子可各自單獨(dú)混合使用，也可將F7與PFU-RFC及PFU-RFCLS構(gòu)成的holo-RFC(rRFC-M復(fù)合體)2種一起混合使用，再者，前述的3種DNA聚合酶相關(guān)因子可以F7，PFU-RFC及PFU-RFCLS構(gòu)成的復(fù)合體(RFC-N復(fù)合體)形式使用。另外，作為本發(fā)明的試劑盒中所包含的DNA聚合酶可應(yīng)用以來源于大腸桿菌的Pol I等DNA聚合酶，來源于嗜熱型棲熱菌(Thermusthermophilus)的Tth DNA聚合酶，來源于水生型棲熱菌(Thermusaquaticus)的Taq DNA聚合酶，來源于激烈熱球菌的Pfu DNA聚合酶為代表的耐熱性DNA聚合酶。本發(fā)明的試劑盒中優(yōu)選含有耐熱型DNA聚合酶。將本發(fā)明的試劑盒用于前述的DNA合成方法中，可更簡(jiǎn)便地合成高分子DNA。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。實(shí)施例1(1)激烈熱球菌基因組DNA的制備激烈熱球菌DSM 3638的培養(yǎng)如下進(jìn)行。
將由1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％可溶性淀粉，3.5％Jamlin S·固態(tài)(Jamlin(ヅャマリン)研究室)，0.5％Jamlin S·液態(tài)(Jamlin研究室)，0.5％MgSO4，0.003％NaCl，0.001％FeSO4·7H2O，0.0001％CoSO4，0.0001％CaCl2·7H2O，0.0001％ZnSO4，0.0001％CuSO4·5H2O，0.1ppm KAl(SO4)2，0.1ppmH3BO3，0.1ppm Na2MoO4·2H2O，0.25ppm NiCl2·6H2O組成的培養(yǎng)基裝入到2升的培養(yǎng)瓶中，120℃、滅菌20分鐘后，吹入氮?dú)?，除去溶解的氧氣后，將前述的菌種接種到所得培養(yǎng)基上，95℃，靜置培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌體。
接著，將菌體懸浮到含有25％蔗糖的0.05M Tris-HCl(pH8.0)4ml中，向該懸液中加入8ml的溶菌酶[5mg/ml，0.25MTris-HCl(pH8.0)]，2ml的0.2M EDTA，20℃保溫1小時(shí)后，加入24ml的SET溶液[150mM NaCl，1mM EDTA，20mMTris-HCl(pH8.0)]，再加入5％SDS 4ml，蛋白酶K(10mg/ml)400μl，37℃反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀，制備出大約3.2mg的基因組DNA。(2)粘粒DNA文庫(kù)的制備用Sau 3AI部分消化400μg激烈熱球菌DSM 3638基因組DNA，通過密度梯度超速離心得到35～50kb大小的級(jí)分。接著用XbaI消化三鏈螺旋粘粒載體(Stratagene公司)1μg后，用堿性磷酸酶(寶酒造公司)脫磷酸化，再用BamHI消化后，與上面分離到的35～50kb的DNA 140μg混合，然后進(jìn)行連接反應(yīng)。應(yīng)用所得反應(yīng)液和ガイガ一パツク·gold(Stratagene公司)，通過體外包裝法，將含有激烈熱球菌基因組DNA片段的粘粒包裝到λ噬菌體粒子中，制備粘粒文庫(kù)。然后用該文庫(kù)的一部分轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH 5αMCR(BRL公司)。從所得轉(zhuǎn)化體中篩選出500個(gè)克隆，分別為粘?？寺o.1～No.50，再?gòu)拿總€(gè)克隆制備粘粒DNA。從中篩選出數(shù)個(gè)，用限制性酶進(jìn)行外消化，確認(rèn)到其中插入了適當(dāng)大小的片段。(3)Pfu聚合酶C基因的克隆預(yù)制反應(yīng)液中含有20mM Tris-HCl(pH7.7)，2mM MgCl2，2mM 2-巰基乙醇，0.2mg/ml活化DNA，各40μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，60nM[3H]-dTTP(Amersham公司)。將來源于上述粘粒DNA文庫(kù)各克隆中的提取液1μl，每份5個(gè)克隆(5μl)加入到上述反應(yīng)液45μl中，75℃反應(yīng)15分鐘后，從所得各反應(yīng)物中每份吸取40μl到DE紙上，用5％Na2HPO4洗滌5次，用液閃儀測(cè)定DE紙上殘留物的放射活性。5個(gè)克隆作為一組測(cè)定一次。發(fā)現(xiàn)有活性的組，再將5個(gè)克隆分成各單獨(dú)1個(gè)克隆，進(jìn)行再次測(cè)定。粘粒DNA文庫(kù)中包含已知DNA聚合酶基因的，預(yù)先用該基因作探針進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，由此判斷為克隆No.57，154，162和363，除這些克隆以外，可得到含有DNA合成活性的克隆No.41，153，264，462和491 5個(gè)克隆。
對(duì)上述的5個(gè)克隆分離其粘粒，分別用BamHI消化，通過觀測(cè)其電泳圖發(fā)現(xiàn)彼此有幾條帶相同，盡管這5個(gè)克隆有所重疊，但可以預(yù)測(cè)其組成中含有稍微不同的部分。于是對(duì)克隆No.264及491的插入DNA片段作了限制性酶譜。以所得限制性酶譜為依據(jù)，從來源于克隆264或491的粘粒切出約10kb左右的各種DNA片段，亞克隆到pTV118N或pTV119N載體(寶酒造)中。對(duì)所得的保持重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行耐熱性DNA聚合酶活性的測(cè)定，結(jié)果表明在約10kb的XbaI-XbaI片段中存在著產(chǎn)生強(qiáng)耐熱性DNA聚合酶的基因。因此將該XbaI-XbaI片段重組到pTV118N載體上的部分命名為質(zhì)粒pFU 1001，將用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM 109命名為大腸桿菌JM 109/pFU 1001(FERM BP-5579)。(4)Pfu聚合物C的DNA聚合酶結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分析再次用XbaI從上述的質(zhì)粒pFU 1001中切出含有DNA聚合酶基因的上述XbaI-XbaI片段，用DNA平端化試劑盒(寶酒造公司)，使其末端平端化后，與用SmaI消化新的pTV118N載體形成的開環(huán)部分連接，制備成用于制作缺損突變體的質(zhì)粒，根據(jù)插入片段的方向性不同，分別命名為pFU 1002和pFU 1003。應(yīng)用這些質(zhì)粒，從所插入的DNA片段的兩端開始依次造成缺失，由此制作缺損突變體。制作時(shí)可按Henikoff的方法(基因(gene)，第28卷，第351～359頁(yè))，應(yīng)用Kilo-Sequence用的缺失試劑盒(寶酒造)。分別用PstI和XbaI作為3′突出型和5′突出型限制性酶。以所得的各種缺失突變體為模板，應(yīng)用BcaBEST雙脫氧測(cè)序試劑盒(寶酒造)，通過雙脫氧法測(cè)定插入片段的堿基序列。分析所得的堿基序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼蛋白質(zhì)的6個(gè)開放閱讀框(ORF)。應(yīng)用各種缺失突變體測(cè)定耐熱性DNA聚合酶活性時(shí)，顯示ORF3和ORF4的翻譯產(chǎn)物在DNA聚合酶活性的表達(dá)中起到重要作用。序列表的序列號(hào)5、6分別表示ORF3和ORF4的氨基酸序列。也就是說，Pfu聚合酶C是一種這樣的酶，它含有分別具有序列表的序列號(hào)5和6中氨基酸序列的2種DNA聚合酶組成蛋白質(zhì)。實(shí)施例2(1)Pfu聚合酶C的制備如下制備作為抗原的Pfu聚合酶C。在2升含有100μg 1ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1.0％胰蛋白胨，0.3％酵母提取物，0.5％氯化鈉，pH7.2)中培養(yǎng)大腸桿菌JM 109/pFU 1001。當(dāng)培養(yǎng)液的濃度達(dá)0.6 A600時(shí)，加入終濃度為1mM的誘導(dǎo)物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再培養(yǎng)16小時(shí)。收集細(xì)菌后，將菌體懸浮到37ml的超聲緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.0，0.2mM 2-巰基乙醇，10％甘油，2mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中，置于超聲破碎機(jī)上。將破碎液經(jīng)1200rpm離心10分鐘，所得上清80℃熱處理15分鐘。之后再經(jīng)1200rpm離心10分鐘，收集上清，得到33ml的熱處理上清液。接著，以2升緩沖液A(50mM磷酸鈣、pH6.5，2mM 2-巰基乙醇，10％甘油)作透析外液，將該溶液進(jìn)行2小時(shí)的透析，共透析4次。將透析后的酶液32ml提供給用緩沖液A平衡過的RESOURCE Q柱(Pharmacia公司)，應(yīng)用FPLC系統(tǒng)(Pharmacia公司)進(jìn)行色譜分析。用0～500mM的NaCl直線濃度梯度進(jìn)行洗脫。DNA聚合酶活性在340mM NaCl的濃度下被洗脫出。
收集活性部分，得到10ml酶溶液，用旋轉(zhuǎn)濃縮儀Centripro CF 50(セントリフロ一CF-50)(グレ一スジャパン公司)濃縮該溶液后，用PD-10柱(Pharmacia公司)置換成含有150mM NaCl的緩沖液A，將所得3.5ml酶溶液提供給用同一緩沖液平衡過的HiTrapHeparin柱(Pharmacia公司)。用FPLC系統(tǒng)，用150～650mM NaCl直線濃度梯度進(jìn)行洗脫，在400mM NaCl的濃度下洗脫出活性部分。用離心超濾儀Centricon-10(セントリコン-10)(Amicon公司)經(jīng)超濾濃縮該活性部分5ml，將120μl的濃縮液提供給用含有75mM氯化鈉、2mM 2-巰基乙醇的50mM磷酸鈣緩沖液(pH6.5)平衡過的Superose 6凝膠過濾柱(Pharmacia公司)，用同一緩沖液進(jìn)行洗脫，結(jié)果在保留時(shí)間為34.7分和38.3分鐘的位置洗脫出DNA聚合酶活性。濃縮在38.3分鐘的位置洗脫出的級(jí)分，將所得濃縮液作為抗原用于制備抗Pfu聚合酶C的多克隆抗體。
在上述Pfu聚合酶C的純化中，按以下的方法測(cè)定酶活性。應(yīng)用小牛胸腺DNA(ワ一ジントン公司)活化產(chǎn)物(活化DNA)作底物。DNA的活性及DNA聚合酶的活性測(cè)定按哈珀&朗出版社(ハ一パ一アンドロ一)發(fā)行，D.R.Davis編著的《來自大腸桿菌的DNA聚合酶》(DNApolymerase from Escehrichia coli)，第263-276頁(yè)(C.C.Richardson著)記載的方法進(jìn)行。向用于測(cè)定活性的樣品5μl中加入45μl反應(yīng)液[20mM Tris-HCl(pH7.7)，15mM MgCl2，2mM2-巰基乙醇，0.2mg/ml活化DNA，dATP、dCTP、dGTP及dTTP各40μM，60nM[3H]-dTTP(Amersham公司)]，75℃反應(yīng)5分鐘。將其中的40μl吸到DE紙(Whattaman公司)上，用5％Na2HPO4洗滌5次后，用液閃儀測(cè)定DE紙上殘存的放射活性。根據(jù)上述的酶活性測(cè)定方法，把每30分鐘將10nmol的[3H]-dTMP攝取到底物DNA中的酶量作為1個(gè)酶單位。(2)抗Pfu聚合酶C抗體的制備用50mM磷酸鈣、pH6.5，2mM 2-巰基乙醇，75mM NaCl稀釋上述的Pfu聚合酶C標(biāo)準(zhǔn)品，使之達(dá)1mg/100μl，加入等量的氟氏完全佐劑，使之乳化。將之注射到兔子皮下，每次注射50μl，每隔3周，共注射4次。最后一次免疫10天后采全血，室溫放置60分鐘后，離心，得到含有抗Pfu聚合酶C多克隆抗體的抗血清60ml。向20ml抗血清中加入20ml飽和硫酸銨溶液，4℃45分鐘緩慢攪拌后，離心。將所得沉淀懸浮到5ml的20mM磷酸鈉緩沖液pH7.0中，用同一緩沖液2L作透析外液透析2小時(shí)，共透析3次。將透析后的溶液14ml提供給用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡過的蛋白A柱(Pharmacia公司)，經(jīng)同一緩沖液洗滌后，用0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0)進(jìn)行洗脫。用1M Tris-HCl、pH9.0中和洗脫出的抗Pfu聚合酶C多克隆抗體，然后用旋轉(zhuǎn)濃縮儀Centripro CF-50濃縮，用PD-10柱(Pharmacia公司)置換成偶聯(lián)緩沖液(0.5M氯化鈉，0.2M碳酸氫鈉、pH8.3)，制備出含有抗Pfu聚合酶C抗體的溶液。(3)抗Pfu聚合酶C抗體柱的制作用1mM鹽酸6ml洗滌HiTrap NHS-活化柱(Pharmacia公司)后，將上述的抗Pfu聚合酶C多克隆抗體溶液0.9ml(相當(dāng)于含3.6mg的抗Pfu聚合酶C抗體)上柱。室溫放置1小時(shí)后，用3ml的偶聯(lián)緩沖液洗滌。接著，依次用6ml的封閉緩沖液(0.5M Tris-HCl pH8.3，0.5M氯化鈉)；6ml的緩沖液B(0.1M醋酸鈉pH4.0，0.5M氯化鈉)，6ml的封閉緩沖液洗滌柱子，室溫放置30分鐘。再用6ml的緩沖液B，6ml的封閉緩沖液，6ml的緩沖液B洗滌柱子后，制備出用50mM Tris-HCl pH8.0平衡過的抗Pfu聚合酶C抗體柱。實(shí)施例3(1)用抗Pfu聚合酶C抗體柱純化含有Pfu聚合酶C的復(fù)合體與實(shí)施例1記載的方法相同，在2個(gè)培養(yǎng)瓶中將激烈熱球菌DSM3638培養(yǎng)16小時(shí)。收集細(xì)菌后，將菌體懸浮到34.7ml含有2mM PMSF的緩沖液C(50mM Tris-HCl、pH8.0，0.1mM ATP)中，加到超聲波破碎儀上。將破碎液12,000rpm離心10分鐘，將所得上清46ml供給用緩沖液C平衡過的抗Pfu聚合酶C抗體柱。用緩沖液C洗滌柱子后，用洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸-鹽酸、pH2.5，1mM ATP)洗脫含有Pfu聚合酶C的復(fù)合體。用1M Tris-HCl pH9.0中和洗脫液后，用旋轉(zhuǎn)濃縮儀Centripro CF-50進(jìn)行濃縮，作為Pfu聚合酶C復(fù)合體的濃縮液。(2)Pfu聚合酶C復(fù)合體的分析將Pfu聚合酶C復(fù)合體的濃縮液進(jìn)行SDS-PAGE(12.5％聚丙烯酰胺凝膠，使用25mM Tris-HCl、192mM甘氨酸、0.1％SDS，pH8.4的溶液作電泳緩沖液)，按以下的方法，用抗Pfu聚合酶C抗體對(duì)所得凝膠進(jìn)行Western印跡。將SDS-PAGE后的膠浸到含40mMε-氨基-正己酸的封閉緩沖液1(25mM Tris-HCl，20％甲醇，pH9.4)中。接著將在封閉緩沖液2(0.3M Tris-HCl，20％甲醇，pH10.4)中浸泡過的紙、在25mM Tris-HCl，20％甲醇，pH10.4浸泡過的紙，在含有ε-氨基-正己酸酸的封閉緩沖液1中浸泡的PVDF膜，上述膠和在含40mMε-氨基-正己酸的封閉緩沖液1中浸泡過的紙逐層重疊到半干印跡轉(zhuǎn)移裝置(サイエンテイフイツク公司)上2mA/cm2封閉1小時(shí)。將該P(yáng)VDF膜浸到含有0.01％硫柳汞的封閉液(ブロツクエ一ス)(雪印乳業(yè)株式會(huì)社)中，振蕩10分鐘后，將膜浸到用含有0.01％硫柳汞的封閉液(ブロツクエ一ス)稀釋了1000倍的抗Pfu聚合酶C抗血清中。室溫放置1小時(shí)后，用含有0.02％吐溫20的TBS緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl)洗滌，每次10分鐘，洗滌3次，再用TBS緩沖液洗滌。然后將膜浸泡到用含有0.01％硫柳汞的封閉液(ブロツクエ一ス)稀釋了5000倍的過氧化酶標(biāo)記的抗兔IgG(Fc)抗體(オルガノンテク二カ公司)中。室溫放置1小時(shí)后，用含有0.02％吐溫20的TBS緩沖液洗PVDF膜，每次洗10分鐘，洗3次，再用TBS緩沖液洗滌，將膜浸到柯尼卡免疫染色試劑HRP-100(柯尼卡公司)中進(jìn)行顯色。如圖1所示，用考馬斯亮蘭-R-250對(duì)SDS-PAGE后的膠進(jìn)行染色的結(jié)果與前述的Western印跡的結(jié)果表明上述的復(fù)合體中含有不與抗PFU聚合酶抗體反應(yīng)的7種蛋白質(zhì)(圖1所示的F1～F7)。
因?yàn)榭紤]到不與抗Pfu聚合酶C抗體反應(yīng)的帶是借助于Pfu聚合酶C而吸附到柱上的蛋白質(zhì)，所以用以下方法分析蛋白質(zhì)的N端氨基酸序列。將實(shí)施例3(1)中所得的Pfu聚合酶C復(fù)合體的濃縮液進(jìn)行與上面同樣的SDS-PAGE，封阻到PVDF膜上。用考馬斯亮蘭-R-250對(duì)該膜進(jìn)行染色后，切出目的帶，以該膜的片段作樣品，用G1000A蛋白質(zhì)測(cè)序儀(ヒュ一レツトパツカ一ド公司)，末端根據(jù)自動(dòng)Edman分解法測(cè)定目的蛋白質(zhì)的N端氨基酸序列。結(jié)果如表1所示。另外，所得F1～F5及F7的N端氨基酸序列分別顯示于序列表的序列號(hào)7～12中。
表1樣品 N末端的氨基酸序列F1 MDKEGFLNKVREAVDVVKLHF2 MFTGKVLIPVKVLKKFENWNF3 MIGSIFYSKKFNLHRPSEYHF4 MKDYRPLLGAIKVKGDNVFSF5 MDIEVLRRLLERELSSEHF6 未能進(jìn)行分析F7 PFEIVFEGAKEFAQLID實(shí)施例4盒式DNA的制備用EcoRI(寶酒造)完全消化實(shí)施例1中制備的激烈熱球菌基因組DNA 10μg，將其中的500ng與50ng的EcoRI盒(寶酒造)混合后，進(jìn)行連接。將連接反應(yīng)液中經(jīng)乙醇沉淀回收的DNA溶解到20μl的滅菌水中，將之作為EcoRI盒式DNA進(jìn)行以下操作。
同前面的操作相同，分別制備添加了HindIII盒、XbaI盒、SaII盒、PstI盒和Sau3AI盒(全部為寶酒造)的盒式DNA。另外，在添加XbaI盒的時(shí)候，使用用XbaI和NheI 2套酶消化的基因組DNA，將所得DNA分別命名為XbaI盒式DNA及NheI/XbaI盒式DNA。在添加SalI盒的時(shí)候，使用用SalI及XhoI的2套酶消化的基因組DNA，將所得DNA分別命名為SalI盒式DNA及XhoI/SalI盒式DNA。在添加Sau3AI盒時(shí)，使用經(jīng)BglII消化的基因組DNA，將所得DNA命名為BglII/Sau3AI盒式DNA。實(shí)施例5(1)含有F1基因的粘?？寺〉倪x擇在實(shí)施例3中所得F1 N末端氨基酸序列的基礎(chǔ)上合成序列表序列號(hào)13及14中分別顯示其氨基酸序列的引物F1-1和F1-2。以實(shí)施例4中制備的EcoRI盒式DNA 1μl作模板，應(yīng)用各100pmol的F1-1和盒式引物C1(寶酒造)進(jìn)行第1輪PCR，以其反應(yīng)液1μl作模板，應(yīng)用各100pmol的F1-2和盒式引物(寶酒造)進(jìn)行第2輪的PCR。這2輪PCR中應(yīng)用Pfu聚合酶(α型酶)(Stratagene公司)。反應(yīng)液的組成及反應(yīng)條件如下20mM Tris-HCl、pH8.2，10mMKCl，20mM MgCl2，6mM(NH4)2SO4，0.2mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP，1％Triton X-100，0.1％BSA及2.3單位的Pfu DNA聚合酶(最終體積為100μl)，94℃(30秒)～45℃(30秒)～72℃(2分)為1個(gè)循環(huán)，第1輪PCR 30個(gè)循環(huán)，第2輪PCR為25個(gè)循環(huán)。以后的實(shí)施例中應(yīng)用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR時(shí)也應(yīng)用相同組成的反應(yīng)液。將擴(kuò)增的大約550bp的DNA片段亞克隆到質(zhì)粒載體pUC 119(寶酒造)中，測(cè)定其堿基序列。其后，以得到的序列為基礎(chǔ)，合成其氨基酸序列分別顯示于序列表序列號(hào)15和16中的引物F1S1和F1S2。應(yīng)用F1S1和F1S2，以實(shí)施例1所示的粘粒DNA作模板進(jìn)行PCR，篩選含有F1基因的粘粒克隆。用Takara PCR擴(kuò)增試劑盒(寶酒造)，依照附帶說明書進(jìn)行PCR。結(jié)果證明在粘粒克隆No.22，46，61，133，178，180，210及317中含有F1基因。(2)F1基因的亞克隆以實(shí)施例4中制備的HindIII盒式DNA 1μl作模板，用各200pmol的F1S1和盒式引物C2，或F1S2和盒式引物C2進(jìn)行PCR。PCR中的酶用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液與實(shí)施例5(1)中的相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。結(jié)果，用F1S2和盒式引物C2得到570 bp的DNA片段，但應(yīng)用F1S1和盒式引物C2未見到DNA的擴(kuò)增。由此可以猜想，HindIII位點(diǎn)在F1基因起始密碼子的正上游，存在于從F1S1的退火位置開始，用PfuDNA聚合酶不能擴(kuò)增的距離內(nèi)。于是，從含有同基因的粘?？寺≈腥我膺x出No.61，用HindIII進(jìn)行消化，分離出約1.5kb以上的DNA片段，亞克隆到質(zhì)粒載體pTV118N(寶酒造)。以所得各重組質(zhì)粒作模板，用F1S1和F1S2作引物進(jìn)行PCR，以檢測(cè)有無F1基因，結(jié)果表明在大約2kb的HindIII片段中含有F1基因。將該DNA片段中的F1基因連接到pTV118N載體的lac啟動(dòng)子下游的質(zhì)粒命名為pF1-4-10。另外，當(dāng)對(duì)該質(zhì)粒中所含插入DNA片段制作NcoI、EcoRI、BamHI、PstI、SacI和NdeI的限制性圖譜時(shí)，得到如圖2所示的結(jié)果。(3)含有F1基因的DNA片段堿基序列的測(cè)定分別將質(zhì)粒pF1-4-10及從該質(zhì)粒中切出的NcoI-HindIII、EcoRI-EcoRI、BamHI-PstI、EcoRI-HindIII、HindIII-EcoRI及HindIII-BamHI片段亞克隆到質(zhì)粒載體pTV119N(寶酒造)中，根據(jù)雙脫氧法測(cè)定所得各質(zhì)粒的插入DNA片段的堿基序列。綜合這些結(jié)果得到的pF1-4-10插入DNA片段的堿基序列中的2009bp的序列在序列表的序列號(hào)17中顯示。分析該堿基序列的結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含F(xiàn)1 N末端氨基酸序列的開放閱讀框。該序列顯示于序列表的序列號(hào)18中，由該序列推算的F1翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列在序列表的序列號(hào)19中顯示。當(dāng)檢索該氨基酸序列與已知的蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性時(shí)發(fā)現(xiàn)，它與來源于流感嗜血桿菌屬的單鏈DNA特異的核酸外切酶[科學(xué)(Science)，第269卷，第496～512頁(yè)(1995)]間具有同源性。前半部分的同源性為23.2％，后半部分為24.3％。(4)F1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以實(shí)施例5(2)中的質(zhì)粒pF1-4-10為模板，應(yīng)用序列表的序列號(hào)20中顯示其堿基序列的引物F1Nc及上述引物F1S2進(jìn)行PCR。該P(yáng)CR中應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，其反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同。使用1ng的模板DNA及各20pmol的兩引物，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(2分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。將擴(kuò)增出的大約460bp的DNA片段與用NcoI和BglII(均為寶酒造)消化所得的片段、由BglII和HindIII消化上述質(zhì)粒pF1-4-10所得的DNA片段一起整合到質(zhì)粒載體pTV118N(寶酒造)的NcoI-HindIII位點(diǎn)間。將該質(zhì)粒命名為pF1Nc-2。通過用雙脫氧法確定堿基序列證實(shí)，該質(zhì)粒插入的DNA片段中，用PCR擴(kuò)增的區(qū)域未出現(xiàn)因PCR引起的突變。(5)純化F1標(biāo)準(zhǔn)品的制備在含有100μg/ml氨芐青霉素的2L LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)實(shí)施例5(4)中得到的質(zhì)粒pF1Nc-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109所得到的大腸桿菌JM 109/pF1Nc2，培養(yǎng)16小時(shí)。收集細(xì)菌后，用與實(shí)施例2(1)同樣的方法，得到熱處理上清液33ml。然后，將該溶液加到用緩沖液D(50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巰基乙醇，10％甘油)平衡過的RESOURCE Q柱上(Pharmacia公司)，應(yīng)用FPLC系統(tǒng)(Pharmacia公司)進(jìn)行色譜分析。用0～500mM NaCl的直線濃度梯度進(jìn)行洗脫。用340mM NaCl時(shí)洗脫出F1。
收集F1部分得到10ml的酶溶液，用旋轉(zhuǎn)濃縮儀Centripro CF50濃縮后，用PD-10柱(Pharmacia公司)置換成緩沖液D，將3.5ml溶液提供給用同種緩沖液平衡過的HiTrap Blue柱(Pharmacia公司)。應(yīng)用FPLC系統(tǒng)用緩沖液D洗滌柱子后，用含有2M氯化鈉的緩沖液D洗脫出F1。將這一部分5ml用旋轉(zhuǎn)濃縮儀Centricon 10濃縮后，將120μl的濃縮液提供給用含有2mM 2-巰基乙醇，75mM氯化鈉的50mM Tris-HCl、pH8.0平衡過的Superdex 200凝膠過濾柱(Pharmacia公司)。用同一緩沖液進(jìn)行洗脫，結(jié)果在相當(dāng)于大約49kD分子量的位置洗脫出F1。該分子量相當(dāng)于F1以單體存在時(shí)的分子量。(6)核酸外切酶活性的測(cè)定如下檢測(cè)F1純化標(biāo)準(zhǔn)品的5′→3′及3′→5′核酸外切酶活性。
首先用SspI(寶酒造)消化質(zhì)粒載體pUC 119(寶酒造)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從膠中回收386bp的DNA片段，進(jìn)行純化。用[γ-32P]-ATP(Amersham)和聚核苷酸酶(寶酒造)標(biāo)記該DNA片段的5′端，將所得的32P-標(biāo)記的DNA片段用作5′→3′核酸外切酶活性的檢測(cè)底物。另外，用Sau3AI(寶酒造)消化質(zhì)粒載體pUC 119，同樣回收所得的341bp的DNA片段進(jìn)行純化。再用[α-32P]-dCTP(Amersham)和Klenow片段(寶酒造)進(jìn)行末端修飾反應(yīng)，標(biāo)記該DNA片段的3′末端，作為3′→5′核酸外切酶活性用的檢測(cè)底物。用NICK柱(Pharmacia公司)進(jìn)行凝膠過濾，以純化上述2種標(biāo)記DNA，用于以下的反應(yīng)。
用HaeIII(寶酒造)完全消化這些標(biāo)記的DNA片段2ng及λ-DNA(寶酒造)，制備含有所得消化產(chǎn)物12.5μg及上述F1純化標(biāo)準(zhǔn)品10μl的反應(yīng)液(200mM Tris-HCl、pH7.7，15mM MgCl2，2mM 2-巰基乙醇)，85℃反應(yīng)2.5、5或7.5分鐘后，用乙醇沉淀，沉淀出DNA。用液閃儀測(cè)定上清中存在的放射活性，由此求出因核酸外切酶活性造成的底物分解量。5′→3′核酸外切酶活性測(cè)定時(shí)加入50fmol的F1純化標(biāo)準(zhǔn)品，3′→5′核酸外切酶活性測(cè)定時(shí)加入125pmol的F1純化標(biāo)準(zhǔn)品。其結(jié)果分別顯示于圖3和圖4中。
圖3為5′→3′核酸外切酶活性的結(jié)果，圖4為3′→5′核酸外切酶活性測(cè)定的結(jié)果。圖中橫軸為反應(yīng)時(shí)間，縱軸表示上清中游離的放射活性占反應(yīng)液全部包含的放射活性的比率。另外，圖中黑點(diǎn)為本發(fā)明的F1純化標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果，白點(diǎn)為不加F1純化標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng)作為空白時(shí)所得的結(jié)果。如圖中所示，本發(fā)明的F1純化標(biāo)準(zhǔn)品具有5′→3′和3′→5′雙向核酸外切酶活性。另外，上述結(jié)果提示5′→3′核酸外切酶活性比3′→5′核酸外切酶活性大約強(qiáng)500倍。實(shí)施例6(1)含有F2基因的粘?？寺〉倪x擇在實(shí)施例3所得F2 N末端氨基酸序列的基礎(chǔ)上，合成序列表中序列號(hào)21和22中顯示其堿基序列的引物F2-2及F2-3。以實(shí)施例4中制備的XbaI盒式DNA 1μl作模板，用100pmol的引物F2-2和20pmol的盒式引物C1進(jìn)行第1輪PCR，再以其反應(yīng)液1μl為模板，用100pmol的引物F2-3和20pmol的盒式引物C2進(jìn)行第2輪PCR。這2輪PCR中使用Pfu聚合酶C。反應(yīng)液的組成及反應(yīng)條件如下10mM Tris-HCl、pH9.2，75mM KCl，3.5mM MgCl2，各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，0.1％Triton X-100，0.01％BSA，和2.0單位的Pfu聚合酶C(終體積為100μl)，94℃(30秒)～45℃(30秒)～72℃(2分)為1個(gè)循環(huán)，第1輪進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，第2輪進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增的約250bp的DNA片段亞克隆到質(zhì)粒載體pUC 119中，測(cè)定其DNA序列后，以所得序列為基礎(chǔ)，合成其堿基序列顯示于序列表的序列號(hào)23和24中的引物F2S3和F2S4。應(yīng)用該引物，以實(shí)施例1中制備的粘粒DNA作模板進(jìn)行PCR，選擇含有F2基因的粘?？寺?。PCR中應(yīng)用的酶為Pfu DNA聚合酶，應(yīng)用各20pmol的引物，反應(yīng)液與實(shí)施例5(1)相同，94℃(30秒)～55℃(3秒)～72℃(2分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。結(jié)果表明No.172的粘?？寺≈泻蠪2基因。(2)F2基因的亞克隆以實(shí)施例4的NheI/XbaI及XhoI/SalI盒式DNA各1μl作模板，應(yīng)用各20pmol的F2S3和盒式引物C2或F2S4和盒式引物C2作為引物進(jìn)行PCR。PCR中的酶應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行50個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用F2S3及盒式引物C2的引物對(duì)，擴(kuò)增出分別針對(duì)NheI/XbaI和XhoI/SalI盒式DNA的大約700及1400bp的DNA片段，但用F2S3及盒式引物C2的引物對(duì)時(shí)未見到DNA的擴(kuò)增。由此我們猜想，NheI和XhoI位點(diǎn)存在于從F2S4引物退火的位置開始用Pfu DNA聚合酶不能擴(kuò)增的距離內(nèi)。
于是，切出用NheI消化No.172所得的各種DNA片段，亞克隆到質(zhì)粒載體pTV118N(寶酒造)中。以所得各重組質(zhì)粒為模板，應(yīng)用F2S3和F2S4作引物進(jìn)行PCR，檢測(cè)是否存在F2基因時(shí)證明約8kb的NheI片段中存在F2基因。于是將該NheI片段整合到pTV118N的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pF2172Nh。另外，當(dāng)對(duì)該質(zhì)粒中包含的插入DNA片段制作限制性酶譜時(shí)得到如圖5所示的結(jié)果。
以圖5中所示的限制性酶譜為基礎(chǔ)，用HindIII消化質(zhì)粒pF2172Nh，切出大約1.5kb的HindIII片段，亞克隆到質(zhì)粒載體pTV118N中。檢測(cè)重組質(zhì)粒中F2基因的插入方向，均在載體的lac啟動(dòng)子的反方向插入。將此質(zhì)粒命名為pF2172H16。檢測(cè)用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109而得到的大腸桿菌JM 109/pF2172H16的F2表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)并不高表達(dá)。于是，為了將F2基因連接到載體的正方向，用HindIII和EcoRI消化pF2172H16，將切出的HindIII-EcoRI片段連接到質(zhì)粒載體pTV119Nd(將寶酒造公司的質(zhì)粒載體pTV119N的NcoI位點(diǎn)變成NdeI)中。將所得重組質(zhì)粒命名為pF2172HE11，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM 109命名為大腸桿菌JM 109/pF2172HE11。(3)F2標(biāo)準(zhǔn)品的制備在含有1mM IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的2L LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)實(shí)施例6(2)中得到的大腸桿菌JM 109/pF2172HE11，培養(yǎng)16小時(shí)。收集細(xì)菌后，將菌體懸浮到23.4ml的超聲緩沖液中，用與實(shí)施例2(1)同樣的方法得到19.5ml的熱處理上清液。然后，把該溶液供給用緩沖液D平衡過的RESOURCE Q柱。
將過柱的F2部分22ml提供給用緩沖液D平衡過的RESOURCE S柱(Pharmacia公司)。用FPLC系統(tǒng)，用0～500mM NaCl直線濃度梯度進(jìn)行洗脫，當(dāng)用170mM NaCl的時(shí)候洗脫出F2部分。用離心超濾儀Centricon-10濃縮該部分，將所得到的75μl濃縮液提供給用含有2mM 2-巰基乙醇、75mM氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)平衡過的Superdex 200柱凝膠過濾柱。用同一緩沖液進(jìn)行洗脫，結(jié)果在大約120kDa或45kDa分子量的位置洗脫出F2。這一分子量是F2形成6聚體或2聚體時(shí)的分子量。(4)測(cè)定含有F2基因的DNA片段的堿基序列用雙脫氧法測(cè)定上述質(zhì)粒pF2172HE11插入DNA片段的堿基序列。序列表的序列號(hào)25中顯示了所得堿基序列中的957bp的序列。對(duì)該堿基序列進(jìn)行分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有F2的N末端氨基酸序列的開放閱讀框。該開放閱讀框的堿基序列及由該堿基序列推算的F2翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列分別在序列表的序列號(hào)25、26中顯示。對(duì)該氨基酸序列與已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列間的同源性進(jìn)行了檢索，未發(fā)現(xiàn)具有同源性的蛋白質(zhì)。實(shí)施例7(1)含有F4基因的粘粒克隆的選擇以實(shí)施例3中得到的F4 N末端氨基酸序列為基礎(chǔ)合成序列表的序列號(hào)28及29中顯示了其堿基序列的引物F4-1和F4-2。以實(shí)施例4的HindIII盒式DNA 1μl為模板，用100pmol的引物F4-1和20pmol的盒式引物C1進(jìn)行第1次PCR，以其反應(yīng)液1μl作模板，用F4-2和盒式引物C2進(jìn)行第2次PCR。PCR中酶應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)的相同，以94℃(30秒)～45℃(30秒)～72℃(2分)為1個(gè)循環(huán)，第1次進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，第2次進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。將由該反應(yīng)擴(kuò)增出的約1100bp的DNA片段亞克隆到質(zhì)粒載體pUC 119中，用M4和RV引物(寶酒造)根據(jù)雙脫氧法測(cè)定其堿基序列的一部分后，以所得序列為基礎(chǔ)，合成序列表的序列號(hào)30及31中顯示了其堿基序列的引物F4S1和F4S2。應(yīng)用F4S1和F4S2引物，以實(shí)施例1中制備的粘粒DNA作模板進(jìn)行PCR，選擇出含有F4基因的粘?？寺　CR中的酶應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(1分)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。結(jié)果表明粘?？寺o.16，26，88，112，250，269，427和451中含有F4基因。(2)F4基因的亞克隆以實(shí)施例4的XbaI盒式DNA 1μl為模板，應(yīng)用各20pmol的F4S2和盒式引物C2進(jìn)行PCR。PCR中酶用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行50個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。結(jié)果用F4S2和盒式引物C2擴(kuò)增出約700bp的DNA片段。另外，以HindIII盒式DNA作模板，用F4-2和盒式引物C2，同樣條件下進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出大約1100bp的DNA片段。由此預(yù)計(jì)F4基因存在于大約1.6kb的XbaI-HindIII片段中。于是用XbaI和HindIII消化粘粒No.16，切出1.6kb左右的DNA片段，亞克隆到pTV 118N載體中。以所得各重組質(zhì)粒為模板，應(yīng)用F4S1和F4S2引物進(jìn)行PCR，以此來檢測(cè)有無F4基因。結(jié)果得到具有含F(xiàn)4基因的1.6kb XbaI-HindIII片段的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pF4-1-4。另外對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行NcoI、EcoRI、BamHI、PstI、SacI和NdeI限制性酶消化時(shí)證明該質(zhì)?；虿迦隓NA片段中沒有這些酶的位點(diǎn)。(3)含有F4基因的DNA片段堿基序列的測(cè)定用雙脫氧法來測(cè)定上述質(zhì)粒pF4-1-4的插入DNA片段的堿基序列。
序列表的序列號(hào)32中顯示了所得堿基序列中的1012bp的序列。對(duì)該堿基序列進(jìn)行分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有F4 N末端氨基酸序列的開放閱讀框。序列表的序列號(hào)33和34中分別顯示了該開放閱讀框的堿基序列和由該堿基序列推算的F4翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列。對(duì)該氨基酸序列與已知蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性進(jìn)行了檢索，未發(fā)現(xiàn)具有同源性的蛋白質(zhì)。(4)F4表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以實(shí)施例7(3)中的質(zhì)粒pF4-1-4為模板，用序列表的序列號(hào)35中顯示了其堿基序列的引物F4NNd和序列表的序列號(hào)36中顯示了其堿基序列的引物F4CEc，應(yīng)用Pfu DNA聚合酶和與實(shí)施例5(1)組成相同的反應(yīng)液進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件如下使用1ng的模板DNA，各20pmol的2種引物，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(2分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。用NdeI和EcoRI(均為寶酒造公司)消化擴(kuò)增的大約450bp的DNA片段，將所得DNA片段整合到上述質(zhì)粒載體pTV119Nd的NdeI和EcoRI間，制作成質(zhì)粒pF4Nd-6。再用雙脫氧法確認(rèn)該質(zhì)粒中插入DNA片段的堿基序列，未發(fā)現(xiàn)因PCR而造成的變異。(5)純化F4標(biāo)準(zhǔn)品的制備在含有100μg/ml氨芐青霉素的2L LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)用實(shí)施例7(4)中得到的質(zhì)粒pF4Nd-6轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109而得到的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌JM 109/p4Nd-6，培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)。收集細(xì)菌后，將菌體懸浮到33.4ml的超聲緩沖液中，用與實(shí)施例2(1)同樣的方法得到28ml熱處理的上清液。然后將該溶液供給用緩沖液D平衡過的RESOURCEQ柱，用FPLC系統(tǒng)進(jìn)行色譜分析。洗脫通過0～500mM NaCl直線濃度梯度進(jìn)行。在325mM NaCl的濃度下洗脫出F4。
用PD-10柱子將收集到的F4級(jí)分的3ml溶液置換到含有150mMNaCl的緩沖液D中，將所得6.9ml溶液供給用同一緩沖液平衡過的HiTrap Heparin柱上，向通過柱子的7.2ml F4洗脫液中加入終濃度為1M的(NH4)2SO4。將該溶液提供給用含有1M(NH4)2SO4的緩沖液D平衡過的HiTrap Phenyl柱(Pharmacia公司)。應(yīng)用FPLC系統(tǒng)分別用1M、0.5M(NH2)2SO4洗柱后，用緩沖液D洗脫出F4。用旋轉(zhuǎn)濃縮儀Centricon-10濃縮該部分5ml，將所得76μl的濃縮液供給用含有2mM 2-巰基乙醇、75mM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液、pH8.0平衡過的Superdex 200凝膠過濾柱。用同一緩沖液進(jìn)行洗脫，結(jié)果在分子量相當(dāng)于39kDa的位置洗脫出F4。該分子量是F4形成2聚體或3聚體時(shí)的分子量。實(shí)施例8(1)含有F7基因的粘粒克隆的選擇以實(shí)施例3中得到的F7 N末端氨基酸序列為基礎(chǔ)，合成序列表的序列號(hào)37和38中顯示了其堿基序列的引物F7-1和F7-2。以實(shí)施例4中制備的1μl HindIII盒式DNA為模板，應(yīng)用100pmol的F7-1和20pmol的盒式引物C1進(jìn)行第1輪PCR，以其反應(yīng)液1μl作模板，應(yīng)用100pmol的引物F7-2和20pmol的盒式引物C2進(jìn)行第2輪PCR。反應(yīng)液的組成和反應(yīng)條件與實(shí)施例6(1)相同。將擴(kuò)增出的大約830bp的DNA片段亞克隆到質(zhì)粒載體pUC 119中，測(cè)定其堿基序列后，以所得序列為基礎(chǔ)合成序列表的序列號(hào)39和40中顯示了其堿基序列的引物F7S1和F7S2。應(yīng)用這些引物，以實(shí)施例1中的粘粒DNA為模板進(jìn)行PCR，選擇含有F7基因的粘?？寺?。PCR中酶應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同，反應(yīng)以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。結(jié)果表明粘?？寺o.15，96，114，167，277，348，386，400，419，456，457和484中含有F7基因。(2)F7基因的亞克隆以實(shí)施例4中制備的HindIII盒式DNA 1μl作模板，用各20pmol的F7S2和盒式引物C2進(jìn)行PCR。PCR中酶應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。結(jié)果擴(kuò)增出大約900bp的片段。參照該結(jié)果以及實(shí)施例8(1)中用F7-2和盒式引物C2擴(kuò)增的結(jié)果，可以推測(cè)F7基因存在于大約1.0kb的HindIII片段中。于是，用HindIII消化從含有同一基因的粘粒中任意選出的No.15，切出大約1.0kb的DNA片段，將之亞克隆到質(zhì)粒載體pTV118N中。以所得各重組質(zhì)粒為模板，用F7S1和F7S2作引物進(jìn)行PCR，以此來檢測(cè)有無F7基因時(shí)證實(shí)F7基因存在于1.0kb的HindIII片段中。將該DNA片段中的F7基因連接到pTV118N載體的lac啟動(dòng)子下游的質(zhì)粒命名為pF7-HH-18，而將反方向連接的質(zhì)粒命名為pF7-1-8。另外，對(duì)該質(zhì)粒中所含插入DNA片段制作限制性酶譜時(shí)得到如圖6所示的結(jié)果。(3)含有F7基因的DNA片段堿基序列的測(cè)定將上述2種質(zhì)粒及從這些質(zhì)粒中切出的BamHI-HindIII、NdeI-HindIII、HindIII-NedI和HindIII-BamHI片段分別亞克隆到質(zhì)粒載體pTV119Nd中，制備出這樣的質(zhì)粒，根據(jù)雙脫氧法測(cè)定這些質(zhì)粒插入部分的堿基序列。綜合這些結(jié)果而得到的上述質(zhì)粒插入DNA片段的堿基序列中989bp的序列顯示于序列表的序列號(hào)41中。對(duì)該堿基序列進(jìn)行分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有F7 N末端氨基酸序列的開放閱讀框。該開放閱讀框的堿基序列及由該序列而推算的F7翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列分別顯示于序列表的序列號(hào)2和1中。對(duì)該氨基酸序列與已知蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性進(jìn)行了檢索，發(fā)現(xiàn)與涉及真核生物DNA復(fù)制的增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigenPCNA)[EMBO J.第11卷，第5111～5120頁(yè)(1995)；核酸研究(Nucleic Acids Research)，第18卷，第261～265頁(yè)(1990)；美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Nati.Acad.Sci.USA)，第84卷，第1575～1579頁(yè)(1987)]之間具有同源性。與各文獻(xiàn)中記載的蛋白質(zhì)的同源性分別為24、28和24％。(4)純化F7標(biāo)準(zhǔn)品的制備用含有100μg/ml氨芐青霉素的2L LB培養(yǎng)基培養(yǎng)用實(shí)施例8(2)中得到的質(zhì)粒pF7-HH-18轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109而得到的大腸桿菌JM 109/pF7-HH-18，培養(yǎng)16小時(shí)。收集細(xì)菌后，將菌體懸浮到45ml的超聲緩沖液中，用與實(shí)施例2(1)同樣的方法得到41.9ml的熱處理上清液。然后，以2L的緩沖液A作外液對(duì)該溶液進(jìn)行透析，每次2小時(shí)，共3次。將透析后的酶液36ml給用緩沖液A平衡過的RESOURCE Q柱上樣，應(yīng)用FPLC系統(tǒng)進(jìn)行色譜分析。洗脫用0～500mM的NaCl直線濃度梯度進(jìn)行。結(jié)果，用340mM的NaCl洗脫出F7。
用旋轉(zhuǎn)濃縮儀Centripro-CF50濃縮收集到的F7的10ml溶液，用PD-10柱置換成含有1M(NH4)2SO4的緩沖液A，將所得3.3ml溶液供給用同一緩沖液平衡了的HiTrap Phenyl柱。應(yīng)用FPLC系統(tǒng)，依次用1M和0.5M的(NH4)2SO4洗滌柱子后，用緩沖液A洗脫出F7。用離心超濾儀Centricon-10濃縮該部分4ml。將濃縮液供給用含有2mM 2-巰基乙醇，75mM NaCl的50mM磷酸鈣緩沖液(pH6.5)平衡了的Superdex 200凝膠過濾柱。用同一緩沖液進(jìn)行洗脫，結(jié)果在分子量相當(dāng)于99kDa的位置洗脫出F7。該分子量是F7形成3聚體時(shí)的分子量。(5)F7對(duì)引物延伸反應(yīng)的影響為了檢測(cè)F7對(duì)各種聚合酶的引物延伸反應(yīng)的影響，在有無添加F7的情況下比較Pfu聚合酶C、Pfu DNA聚合酶(α型DNA聚合酶，Stratagene公司)以及來自隱蔽熱網(wǎng)菌的Poc DNA聚合酶I和II[PocDNA聚合酶I和II，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol)第177卷，第2164～2177頁(yè)(1995)l的活性。
DNA聚合酶活性的測(cè)定，參照實(shí)施例2(1)中記載的Pfu聚合酶C的活性測(cè)定方法進(jìn)行。使用M13噬菌體單鏈DNA(M13mp18ssDNA，寶酒造)的45個(gè)堿基的合成寡核苷酸-HT引物退火產(chǎn)物(M13-HT引物)作為底物。序列表的序列號(hào)42中顯示了HT引物的堿基序列。
也就是說，制備含有表2記載的DNA聚合酶和F7的終體積為50μl的反應(yīng)液[20mM Tris-HCl、pH7.7，15mM MgCl2，2mM 2-巰基乙醇，0.01μg/μl M13-HT引物，各40μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，60nM[3H]-dTTP(Amersham公司)]，75℃反應(yīng)5分鐘。將反應(yīng)液放置冰浴中停止反應(yīng)后，將其中的40μl吸到DE紙(Whattman公司)上，用5％Na2HPO4洗滌5次后，用液閃儀測(cè)定DE紙上殘存的放射活性。
如表2所示，可以看出對(duì)使用的所有DNA聚合酶來講，F(xiàn)7的添加使DNA聚合酶的活性上升。
表2DNA聚合酶 F7 酶活性(cpm)空白1 - 61空白2 10pmol 35Pfu聚合酶C(25fmol) - 888Pfu聚合酶C(25fmol) 5pmol 2897Pfu聚合酶C(25fmol) 10pmol 3175Pfu DNA聚合酶(120fmol) - 907Pfu DNA聚合酶(120fmol) 0.48pmol 1363Pfu DNA聚合酶(120fmol) 4.8pmol1637Poc DNA聚合酶I(74pmol) - 62Poc DNA聚合酶I(74pmol) 10pmol 69Poc DNA聚合酶II(6.0pmol) - 433Poc DNA聚合酶II(6.0pmol) 10pmol 1443注表中的Pfu聚合酶C的量是由2種DNA聚合酶結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)各1分子組成蛋白質(zhì)時(shí)的量，另外，F(xiàn)7的量是作為3聚體蛋白質(zhì)時(shí)的量。
進(jìn)一步對(duì)引物延伸活性進(jìn)行了詳細(xì)研究。用M13-HT引物作底物，用[γ-32P]-ATP(Amersham)和T4多核苷酸酶(寶酒造)標(biāo)記引物的5′末端。
制備含有以下樣品的1μl的樣品液①18fmol的Pfu聚合酶C，②18fmol的Pfu聚合酶C+2pmol的F7，③0.24pmol的Pfu DNA聚合酶，④0.24pmol的Pfu DNA聚合酶+0.78pmol的F7。向這些樣品液中分別加入含0.01μl/μl32P標(biāo)記M13-HT引物的9μl反應(yīng)液(20mM Tris-HCl(pH9.0)，15mM MgCl2，2mM 2-巰基乙醇，各40μM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，75℃反應(yīng)2.5分鐘或5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，冰浴反應(yīng)液停止反應(yīng)，再加入1μl的200mM EDTA，5.5μl的反應(yīng)終止液(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚藍(lán)，0.05％二甲苯氰)，95℃進(jìn)行5分鐘的熱變性處理。將該反應(yīng)液中的1.6μl，用含有8M尿素的6％聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行放射自顯影。所得放射自顯影圖顯示于圖7中。
圖中“Pfu-C”及“Pfu”分別表示用Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶所得的結(jié)果，“2.5”和“5”分別表示反應(yīng)時(shí)間(分)。另外，圖中“-”和“+”分別表示用未添加F7和添加F7的反應(yīng)液所得的結(jié)果。另外，圖中兩邊的泳道是用[γ-32P]-ATP(Amersham公司)和T4多核苷酸酶(寶酒造)標(biāo)記λ-EcoT14I消化產(chǎn)物(寶酒造)5′末端進(jìn)行電泳的結(jié)果，用它來推算延伸產(chǎn)物的長(zhǎng)度。
如圖7中所示，未添加F7的時(shí)候，用Pfu聚合酶C，300～600bp堿基程度的DNA為主要延伸產(chǎn)物，與此相對(duì)，添加F7時(shí)，低鏈長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物減少，同時(shí)超過1000堿基的延伸產(chǎn)物的比率增加。另外，即便是Pfu DNA聚合酶，在添加F7時(shí)也可顯著延伸延伸產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)。由此表明，F(xiàn)7可增大Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶雙方的引物延伸速度。
為了分析更高分子的引物延伸反應(yīng)物，將用32P標(biāo)記的M13-HT引物作底物時(shí)的Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶的引物延伸反應(yīng)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。向上述的①～④的樣品液各1μl中加入含終濃度0.01μg/μl的M13-HT引物的9μl反應(yīng)液(20mM Tris-HCl、pH9.0，15mM MgCl2，2mM 2-巰基乙醇，各40μM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，84nM[α-32P]-dCTP)，75℃反應(yīng)2.5分鐘。反應(yīng)終了后，向冰浴的反應(yīng)液中依次加入1.11μl的200mMEDTA，1.23μl的500mM NaOH，2.47μl的6倍濃度加樣緩沖液(0.125％溴酚藍(lán)，0.125％二甲苯氰，9％甘油)，將其中6μl進(jìn)行0.5％瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行放射自顯影。所得放射自顯影如圖8所示。
圖中“Pfu-C”和“Pfu”分別表示用Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶所得的結(jié)果，圖中“-”和“+”分別表示在F7不存在和存在的條件下所得的結(jié)果。再者，圖中M道是與上述同樣進(jìn)行末端標(biāo)記了的λ-EcoT14I消化物。如圖8所示，用Pfu聚合酶C時(shí)，在F7不存在的條件下，在2.5kb附近見到延伸產(chǎn)物的弱信號(hào)，與此相對(duì)，在F7存在的條件下可看到M13ssDNA完整一周的7.3kb的信號(hào)。另外，用Pfu聚合酶時(shí)，F(xiàn)7存在的條件下，在2.7kb附近見到信號(hào)，而F7不存在時(shí)未見到信號(hào)。以上結(jié)果提示F7可提高兩DNA聚合酶的延伸反應(yīng)。實(shí)施例9(1)含有編碼RFC小亞基同源體的基因的粘粒克隆的選擇檢測(cè)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的RFC小亞基的氨基酸序列[科學(xué)(Science)，第273卷，第1058～1073頁(yè)(1996)]與來源于其它生物的RFC(RF-C)小亞基氨基酸序列的同源性，為了從它們間較保守區(qū)域的氨基酸序列尋找編碼RFC小亞基的基因，合成引物RF-F1，RF-F3，RF-F4，RF-R1，RF-R2，RF-R3和RF-R4。序列表的序列號(hào)43～49中分別顯示了這些引物的堿基序列。以激烈熱球菌的基因組DNA作模板，聯(lián)合應(yīng)用這些引物進(jìn)行PCR，尋找編碼RFC小亞基的基因。該P(yáng)CR中應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，應(yīng)用0.25μg的模板DNA和各100pmol的引物，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同。用RF-F1和RF-R4進(jìn)行第1輪PCR的時(shí)候，各應(yīng)用1μl的反應(yīng)液作模板，用RF-F4和RF-R4、或RF-F1和RF-R1進(jìn)行第2輪PCR，另外用RF-F1和RF-R3進(jìn)行第1輪PCR的時(shí)候，以各1μl的反應(yīng)液作模板，用RF-F3和RF-R2進(jìn)行第2輪PCR，分別得到約240bp、140bp和140bp的擴(kuò)增DNA片段。將這些DNA片段分別亞克隆到質(zhì)粒載體pUC 119中，測(cè)定其堿基序列后，參照所得序列，合成序列表的序列號(hào)50～54中分別顯示了堿基序列的引物RF-S1，RF-S2，RF-S3，RF-S4和RF-S5。應(yīng)用引物RF-S1和RF-S3，以實(shí)施例1中制備的粘粒DNA作模板進(jìn)行PCR，選擇認(rèn)為含有編碼RFC小亞基同源體基因的粘?？寺　CR中應(yīng)用TaKaRa PCR擴(kuò)增試劑盒，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(2分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。結(jié)果表明粘?？寺o.254，310，313，377和458中包含目的基因(PFU-RFC基因)。(2)PFU-RFC基因的亞克隆以實(shí)施例4中制備的XbaI和EcoRI盒式DNA 1μg為模板，應(yīng)用100pmol的RF-S1和200pmol的盒式引物C2或100pmol的RF-S2和20pmol的盒式引物C2進(jìn)行PCR。PCR時(shí)酶應(yīng)用Pfu聚合酶C，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例6(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。結(jié)果，用XbaI盒作模板的時(shí)候，用RF-S1和盒式引物C2擴(kuò)增出大約2kb的DNA片段；以EcoRI盒作模板的時(shí)候，用RF-S2和盒式引物C2擴(kuò)增出大約1.5kb的DNA片段。將這些DNA片段分別亞克隆到質(zhì)粒載體pUC 119中，將所得重組質(zhì)粒命名為pRFSXS1-26和pRFSES2-8。制作這些質(zhì)粒的限制性酶譜，結(jié)果推測(cè)NdeI和BamHI位點(diǎn)不存在于PFU-RFC基因內(nèi)。
分別用NdeI和BamHI消化上述(1)的5克隆的粘粒，觀察其電泳帶時(shí)發(fā)現(xiàn)在5kb附近有共同帶。猜想PFU-RFC基因存在于該DNA片段中，切出來自克隆No.254的約5kb的NdeI-BamHI片段，亞克隆到上述的pTV 119Nd載體中。應(yīng)用RF-S1和RF-S3引物對(duì)所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行PCR，以檢測(cè)有無PFU-RFC基因，結(jié)果證明PFU-RFC基因存在于NdeI-BamHI片段。于是將該NdeI-BamHI片段整合到pTV119Nd載體的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pRFS254NdB。另外，對(duì)該質(zhì)粒制作限制性酶譜，得到如圖9所示的結(jié)果。
按照?qǐng)D9中所示的限制性酶譜，用以下的方法從pRFS254NdB中切出各片段，亞克隆到pTV118N載體(寶酒造)。首先，用XbaI和SacI消化pRFS254NdB得到大約500bp的DNA片段，用XbaI和NcoI消化得到大約2kb的DNA片段，用NcoI和BamHI消化得到約1.1kb的DNA片段，再將這些片段與用SacI和BamHI消化形成的開環(huán)pTV118N混合進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒命名為pRFS254SXNB。(3)含有PFU-RFC基因的DNA片段堿基序列的測(cè)定用雙脫氧法測(cè)定實(shí)施例9(2)中所得質(zhì)粒pRFS254NdB中所包含的插入DNA片段的堿基序列。序列表的序列號(hào)55中顯示了所得堿基序列中的3620對(duì)堿基。推算由該堿基序列所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，與已知RFC小亞基的序列進(jìn)行比較，結(jié)果推測(cè)PFU-RFC的氨基酸序列中存在1個(gè)介在序列(intein)。該介在序列由序列表的序列號(hào)55中的721～2295號(hào)編碼。(4)構(gòu)建除去介在序列的PFU-RFC基因表達(dá)質(zhì)粒參照實(shí)施例9(3)中所得堿基序列和已知的RFC小亞基的氨基酸序列以及編碼它們的基因的堿基序列，合成序列表的序列號(hào)56和57中顯示了其堿基序列的引物RF-CBΔI和RF-CAΔI。使用這兩個(gè)引物5′端磷酸化的產(chǎn)物，以上述的質(zhì)粒pRFS254SXNB作模板進(jìn)行反向PCR。反向PCR時(shí)，使用TaKaRa Ex Taq，按該酶使用說明書制備出100μl的反應(yīng)液。向該反應(yīng)液中加入15ng的質(zhì)粒pRFS254SXNB和各20pmol的引物，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。用DNA平端化試劑盒(寶酒造)將反向PCR中得到的擴(kuò)增DNA片段平端化處理后，使自身連接構(gòu)建質(zhì)粒，將之命名為質(zhì)粒pRFS254ISΔI。
再者，用XbaI和NcoI消化該質(zhì)粒，分離出大約400bp的XbaI-NcoI片段，將該片段與從實(shí)施例9(2)中得到的質(zhì)粒pRFS254NdB分離出的約500bp的XbaI-SacI片段、約1.1kb的NcoI-BamHI片段混合，亞克隆到質(zhì)粒載體pTV118N的BamHI-SacI位點(diǎn)間。將所得重組質(zhì)粒命名為pRFS254SNc，另外，將用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM 109命名為大腸桿菌JM 109/pRFS254SNc。證明該轉(zhuǎn)化體高表達(dá)PFU-RFC。(5)不包含介在序列的編碼PFU-RFC的基因堿基序列的測(cè)定將來自實(shí)施例9(4)才得到的質(zhì)粒pRFS254SXNB的約400bp的XbaI-NcoI片段亞克隆到質(zhì)粒載體pTV118N載體中，通過測(cè)定該插入DNA片段的堿基序列來確認(rèn)編碼除去的介在序列區(qū)域部分的堿基序列。通過該結(jié)果和實(shí)施例9(3)的結(jié)果測(cè)定不含介在序列的編碼PFU-RFC的基因的堿基序列。如此所得的不包含介在序列的編碼PFU-RFC的開放閱讀框的堿基序列和從該堿基序列推出的PFU-RFC的氨基酸序列分別顯示于序列表的序列號(hào)4和3中。(6)純化PFU-RFC標(biāo)準(zhǔn)品的制備用2L含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)實(shí)施例9(4)中得到的大腸桿菌JM 109/pRFS254SNc，培養(yǎng)16小時(shí)。收集細(xì)菌后，將菌體懸浮到44.1ml的超聲緩沖液中，用與實(shí)施例2(1)相同的方法得到35.2ml的熱處理上清液。然后，將該溶液供給用緩沖液D平衡過的RFSOURCE Q柱，應(yīng)用FPLC系統(tǒng)進(jìn)行色譜分析。PFU-RFC通過RFSOURCE Q柱。
將通過柱子的PFU-RFC 35ml供給用緩沖液D平衡過的RESOURCE S柱(Pharmacia)。應(yīng)用FPLC系統(tǒng)，用0～500mMNaCl直線濃度梯度進(jìn)行洗脫，在170mM NaCl的時(shí)候洗脫出PFU-RFC部分，共2.9ml。用centricon-10進(jìn)行濃縮，將所得105μl濃縮液供給用含有2mM 2-巰基乙醇、75mM氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液、pH8.0平衡過的Superdex 200凝膠過濾柱。用同一緩沖液進(jìn)行洗脫，結(jié)果在約150kDa分子量的位置洗脫出PFU-RFC。該分子量是PFU-RFC形成4聚體時(shí)的分子量。(7)PFU-RFC對(duì)引物延伸反應(yīng)的影響用與實(shí)施例8(5)同樣的方法檢測(cè)PFU-RFC和F7的存在對(duì)Pfu聚合酶C的引物延伸反應(yīng)的影響。結(jié)果如表3所示。如表3所示，PFU-RFC能稍微促進(jìn)Pfu聚合酶C的活性。還觀察到同時(shí)添加F7和PFU-RFC時(shí)的活性促進(jìn)作用是只加F7時(shí)的2倍以上。
表3Pfu聚合酶C F7 PFU-RFC酶活性(cpm)- - - 10090fmol - - 36690fmol 9.6pmol - 274390fmol - 356fmol46390fmol 9.6pmol 356fmol8740注表中Pfu聚合酶C的量是由2個(gè)DNA聚合酶組成蛋白質(zhì)各1分子構(gòu)成蛋白質(zhì)時(shí)的量，另外，F(xiàn)7、PFU-RFC的量分別是3聚體、4聚體蛋白質(zhì)的量。實(shí)施例10(1)抗Pfu DNA聚合酶抗體的制備應(yīng)用離心超濾儀Centricon-10通過超濾濃縮12ml(30,000單位)克隆的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)后，將所得0.1ml濃縮液供給用含2mM 2-巰基乙醇、75mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡過的Superdex 200凝膠過濾柱(Pharmacia公司)。用同一緩沖液進(jìn)行洗脫，在相當(dāng)于大約76kDa分子量的位置洗脫出PfuDNA聚合酶，回收該部分。用離心超濾儀Centricon-10濃縮該部分0.8ml，以該濃縮液作抗原制備抗Pfu DNA聚合酶多克隆抗體。用生理鹽水稀釋上述濃縮液，使Pfu DNA聚合酶的濃度達(dá)2mg/ml，向其中加入等量的氟氏完全佐劑使之乳化。把它注射到兔子皮下，每次250μl，每隔3周，共注射4次。最后一次免疫10天后采全血，將之室溫放置60分鐘后，離心，得到含抗Pfu DNA聚合酶多克隆抗體的抗血清60ml。向該抗血清26ml中加入26ml的飽和硫酸銨，4℃1小時(shí)45分，緩慢攪拌后離心。將沉淀懸浮到5ml的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中，在用同一緩沖液平衡過的PD-10柱(Pharmacia公司)上進(jìn)行脫鹽。將10ml該溶液供給用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡過的蛋白A柱(Pharmacia公司)，用同一緩沖液洗滌后，用0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0)洗脫。用1M Tris-HCl、pH9.0中和洗脫出的含有抗Pfu DNA聚合酶多克隆抗體的部分，然后用旋轉(zhuǎn)濃縮儀Centripro-CF-50濃縮，用PD-10柱置換成偶聯(lián)緩沖液(0.5M氯化鈉，0.2M碳酸氫鈉，pH8.3)，制備出含有抗Pfu DNA聚合酶抗體的溶液。(2)抗Pfu DNA聚合酶抗體柱的制備用1mM鹽酸6ml洗滌HiTrap NHS-活化柱(Pharmacia公司)后，將上述的抗Pfu DNA聚合酶多克隆抗體溶液0.9ml(含有相當(dāng)于4.5mg的抗Pfu DNA聚合酶抗體)上柱。用與實(shí)施例2(3)同樣的方法制備抗Pfu DNA聚合酶抗體柱。(3)用抗Pfu DNA聚合酶抗體柱驗(yàn)證Pfu DNA聚合酶與F7復(fù)合體的形成用實(shí)施例1記載的相同方法培養(yǎng)激烈熱球菌DSM 3638，得到每份培養(yǎng)液9L的菌體。將該菌體懸浮到33ml的含有2mM PMSF的緩沖液C(50mM Tris-HCl、pH8.0，1mM ATP)中，加到超聲破碎儀上。將所得破碎液1200rpm離心10分鐘，將所得44ml上清供給用緩沖液C平衡過的抗Pfu DNA聚合酶抗體柱。用含有0.1M NaCl的緩沖液C洗柱后，用洗脫緩沖液(50mM Tris-HCl、pH8.0，0.8M尿素)洗脫出Pfu DNA聚合酶復(fù)合體，將該溶液作SDS-PAGE(12.5％聚丙烯酰胺膠，用25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH8.4作電泳液)。依照常規(guī)方法用考馬斯亮蘭-R-250對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行染色，結(jié)果如圖10所示，除Pfu DNA聚合酶的帶以外，檢測(cè)出相當(dāng)于上述F7位置的條帶。
于是，將該洗脫液的濃縮液按上述同樣方法進(jìn)行SDS-PAGE，用與實(shí)施例3(2)同樣的方法，用抗Pfu DNA聚合酶抗體對(duì)所得凝膠進(jìn)行Western印跡。圖10所示的SDS-PAGE結(jié)果和上述的Western印跡的結(jié)果證明相當(dāng)于F7位置的條帶是不與抗Pfu DNA聚合酶抗體起反應(yīng)的蛋白質(zhì)。
再用與實(shí)施例3(2)同樣的方法分析條帶中存在的蛋白質(zhì)N末端的氨基酸序列，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)為F7。(4)用凝膠過濾層析驗(yàn)證Pfu DNA聚合酶與F7的復(fù)合體的形成用PD-10柱，將實(shí)施例8(4)中得到的F7標(biāo)準(zhǔn)品1.2ml置換到含2mM 2-巰基乙醇、75mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH8.0)的緩沖液中后，用離心超濾儀Centricon-10濃縮成50μl。
將實(shí)施例10(1)記載的Pfu DNA聚合酶的0.1mM溶液，上述F7的0.1mM(以3聚體計(jì)算)溶液，和Pfu DNA聚合酶0.1mM與F70.1mM的混合物各10μl，從60℃到90℃加熱30分鐘。將加熱處理過的各溶液供給用含有20mM 2-巰基乙醇、75mM氯化鈉的50mMTris-HCl緩沖液，pH8.0平衡過的Superdex 200 PC 3.2/30凝膠過濾柱(Pharmacia公司)，用同一緩沖液進(jìn)行洗脫。分別在相當(dāng)于76kDa和約128kDa分子量的位置洗脫出Pfu DNA聚合酶和F7。與此相對(duì)，當(dāng)為Pfu DNA聚合酶和F7混合物的時(shí)候，在相當(dāng)于320kDa的主峰和相當(dāng)于約128kDa的次峰洗脫出。將具有這2個(gè)峰的洗脫級(jí)分分別進(jìn)行SDS-PAGE(12.3％聚丙烯酰胺膠，使用25mM Tris-HCl、192mM甘氨酸、0.1％SDS，pH8.4作電泳液)，在相當(dāng)于大約320kDa的部分為Pfu DNA聚合酶和F7，但相當(dāng)于大約180kDa的部分只含有F7。由此可證明Pfu DNA聚合酶和F7形成復(fù)合體。(5)Pfu DNA聚合酶-F7復(fù)合體的延伸活性在實(shí)施例10(4)的凝膠過濾中得到了大約相當(dāng)于76kDa的PfuDNA聚合酶和相當(dāng)于320kDa的Pfu DNA聚合酶與F7的混合體，從所得洗脫液中各取20μl，按照以實(shí)施例8(5)中所示的非標(biāo)記M13-HT引物作底物的活性測(cè)定方法，分別測(cè)定其引物延伸活性。同時(shí)用實(shí)施例2(1)記載的以活化DNA作底物的方法進(jìn)行攝取活性的測(cè)定。結(jié)果如圖11所示。檢測(cè)兩部分引物延伸活性對(duì)攝取活性的比值，約320kDa的部分為0.65，約76kDa的部分為0.29，由此表明通過與F7形成復(fù)合體促進(jìn)了Pfu DNA聚合酶的引物延伸活性。實(shí)施例11(1)含有編碼RFC大亞基同源體基因的粘?？寺〉倪x擇檢測(cè)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的RFC大亞基的氨基酸序列[科學(xué)(Science)，第273卷，第1058～1073頁(yè)(1996)]與實(shí)施例9中記載的不含介在序列的PFU-RFC小亞基氨基酸序列間的同源性，參照它們之間較保守區(qū)域的氨基酸序列，合成用于尋找編碼RFC大亞基基因的引物RFLS 15。序列表的序列號(hào)60中顯示了引物RFLS 15的堿基序列。將該引物和與RFC兩亞基蛋白質(zhì)中存在的類似氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的上述引物RF-F1聯(lián)合應(yīng)用，以激烈熱球菌的基因組DNA作模板進(jìn)行PCR。該P(yáng)CR中應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，0.23μg的模板DNA和各100pmol的引物，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同。從該P(yáng)CR擴(kuò)增出的2種DNA片段中分離出與預(yù)想的來自PFU-RFC小亞基基因的擴(kuò)增產(chǎn)物大小不同的約630bp的擴(kuò)增DNA片段。將該DNA片段亞克隆到質(zhì)粒載體pUC 119中，測(cè)定其堿基序列后，參照所得堿基序列，合成序列表的序列號(hào)61和62中分別顯示了其堿基序列的引物RFLS-S3和RFLS-S4。
應(yīng)用這兩個(gè)引物，以實(shí)施例1中制備的粘粒DNA為模板進(jìn)行PCR，選擇出認(rèn)為含有編碼RFC大亞基同源體基因的粘?？寺?。PCR中酶應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(2分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。該結(jié)果表明粘粒克隆No.254,310，313，377和458中含有目的基因(PFU-RFCLS基因)。這些粘?？寺〉男蛱?hào)與含有上述PFU-RFC基因的粘?？寺⌒蛱?hào)一致。于是檢測(cè)序列表的序列號(hào)55中所示質(zhì)粒pRFS254NdB的插入DNA片段的堿基序列，證明其編碼的是位于PFU-RFC基因正下游的，從該序列的3109號(hào)開始的開放閱讀框編碼RFC大亞基的同源體(PFU-RFCLS)。但是，該質(zhì)粒pRFS254NdB中不含有PFU-RFCLS基因的全長(zhǎng)。(2)PFU-RFCLS基因的亞克隆為了分離含有PFU-RFCLS基因全長(zhǎng)的DNA片段，用NheI消化上述克隆No.254，切出所得各種DNA片段，亞克隆到質(zhì)粒載體pTV118N(寶酒造)中。以所得各重組質(zhì)粒為模板，應(yīng)用RFLS-S3和RFLS-S4作引物進(jìn)行PCR，以驗(yàn)證是否存在PFU-RFCLS基因時(shí)證明約1.1kb的NheI片段中存在RFLS基因。于是將該NheI片段整合到pTV118N中的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pRFLSNh。另外，對(duì)該質(zhì)粒中包含的插入DNA片段制作了限制性酶譜，得到如圖12所示的結(jié)果。
再通過雙脫氧法測(cè)定該質(zhì)粒中包含的插入DNA片段的堿基序列。將所得堿基序列中編碼PFU-RFCLS的開放閱讀框部分的堿基序列顯示于序列表的序列號(hào)63中。另外，由該序列所推出的PFU-RFCLS的氨基酸序列顯示于序列表的序列號(hào)64中。實(shí)施例12(1)含有F5基因的粘?？寺〉倪x擇以實(shí)施例3中得到的F5 N末端氨基酸序列為基礎(chǔ)，合成序列表的序列號(hào)65和66中分別顯示了其堿基序列的引物F5-1-1和F5-2。以實(shí)施例4中制備的PstI盒式DNA 1μl作模板，應(yīng)用各100pmol的F5-1-1和盒式引物C1(寶酒造)進(jìn)行第1輪PCR，以其反應(yīng)液1μl為模板，應(yīng)用各100pmol的F5-2和盒式引物C2(寶酒造)進(jìn)行第2輪PCR。在第2輪PCR中應(yīng)用TaKaRa PCR擴(kuò)增試劑盒(寶酒造)，按照附帶的說明書進(jìn)行。將擴(kuò)增出的大約900bp的DNA片段亞克隆到質(zhì)粒載體pTV118N(寶酒造)。將所得質(zhì)粒命名為pF5P2，測(cè)定其堿基序列。其后，以所得序列為基礎(chǔ)，合成序列表的序列號(hào)67和68中分別顯示了其堿基序列的引物F5S1和F5S2。應(yīng)用所得的F5S1和F5S2，以實(shí)施例1中的粘粒DNA作模板進(jìn)行PCR，選擇含有F5基因的粘粒克隆。PCR中應(yīng)用TaKaRa PCR擴(kuò)增試劑盒按照附帶的說明書進(jìn)行。結(jié)果表明粘?？寺o.15，96，114，167，277，348，386，400，419，456，457和484中含有F5基因。這些粘?？寺〉男蛱?hào)與含有F7基因的粘粒克隆相一致。于是檢測(cè)序列表的序列號(hào)41中所示的堿基序列，證明該序列上，在F7基因下游892號(hào)以后包含F(xiàn)5基因的前半部分。(2)F5基因的亞克隆為了亞克隆F5基因，應(yīng)用實(shí)施例8中得到的質(zhì)粒pF7-HH-18和上述引物pF5P2，制作F5基因周圍的NcoI、BamHI、PstI、HindIII和NdeI(寶酒造)的限制性酶譜，得到如圖13所示的結(jié)果。
以圖13所示的限制性酶譜為基礎(chǔ)，切出用NdeI消化粘?？寺o.15而得到的大約900bp的片段，亞克隆到質(zhì)粒載體pTV118Nd。將F5基因正向插入到lac啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒命名為pF5NNF-1。(3)含有F5基因的DNA片段堿基序列的測(cè)定用雙脫氧法測(cè)定上述質(zhì)粒pF5NNF-1插入DNA片段的堿基序列。分析所得堿基序列的結(jié)果發(fā)現(xiàn)它所編碼的蛋白質(zhì)N末端氨基酸序列是與F5的一致的開放閱讀框。該開放閱讀框的堿基序列如序列表的序列號(hào)69所示，由該堿基序列推出的F5的氨基酸序列顯示于序列表的序列號(hào)70中。對(duì)該氨基酸序列與已知蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性進(jìn)行了檢索，未發(fā)現(xiàn)同源的蛋白質(zhì)。(4)F5表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以上述質(zhì)粒pF5NNF-1為模板，應(yīng)用序列表的序列號(hào)71和72中分別顯示了其堿基序列的引物F5Nco和F5CBam，進(jìn)行PCR。該P(yáng)CR中應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同。使用1ng的模板DNA和各20pmol的兩種引物，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(2分)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。用NcoI和BamHI(均為寶酒造公司)消化擴(kuò)增出的大約640bp的DNA片段，將所得片段與用NcoI和BamHI制備的開環(huán)pET15b(ノバジエン公司)連接。將該質(zhì)粒命名為pF5NBPET。用雙脫氧法確認(rèn)該質(zhì)粒中插入的DNA片段中PCR擴(kuò)增區(qū)域的堿基序列，確證未因PCR而造成突變。
檢測(cè)用質(zhì)粒pF5NBPET轉(zhuǎn)化的大腸桿菌HMS174(DE3)-大腸桿菌HMS174(DE3)/pF5NBPET中F5的表達(dá)情況，結(jié)果提示該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中有相當(dāng)于F5分子量的蛋白質(zhì)表達(dá)。實(shí)施例13(1)F3基因的亞克隆以實(shí)施例3中得到的F3 N末端氨基酸序列為基礎(chǔ)，合成序列表的序列號(hào)73和74中分別顯示了其堿基序列的引物F3-1和F3-3-1。以實(shí)施例4的BglII/Sau3AI盒式DNA 1μl作模板，應(yīng)用100pmol的引物F3-1和20pmol的盒式引物C1進(jìn)行第1輪PCR，以其反應(yīng)液1μl為模板，應(yīng)用F3-3-1和盒式引物C2進(jìn)行第2輪PCR。PCR中酶應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，應(yīng)用與實(shí)施例5(1)組成相同的反應(yīng)液，反應(yīng)以94℃(30秒)～45℃(30秒)～72℃(2分)為1個(gè)循環(huán)，第1輪進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，第2輪進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。將該反應(yīng)擴(kuò)增出的大約500bp的DNA片段亞克隆到質(zhì)粒載體pTV118N中，用M4和RV引物(寶酒造)通過雙脫氧法測(cè)定其堿基序列的一部分后，以所得序列為基礎(chǔ)合成序列表的序列號(hào)75，76，77和78中分別顯示了其堿基序列的引物F3S1、F3S2、F3S3和F3S4。應(yīng)用F3S1和F3S2引物，以實(shí)施例1中制備的粘粒DNA作模板進(jìn)行PCR，尋找含有F3基因的粘粒克隆，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)含有F3基因的粘?？寺?。于是應(yīng)用F3S3或F3S4引物和引物C2，以實(shí)施例4的各種盒式DNA作模板進(jìn)行PCR，繪制F3基因周圍的限制性酶識(shí)別部位，結(jié)果推測(cè)在SalI位點(diǎn)和HindIII位點(diǎn)間的大約2.6kb的片段中存在F3基因。在該結(jié)果的基礎(chǔ)上，用SalI和HindIII消化激烈熱球菌的基因組DNA 4μg，取出2.6kb左右的DNA片段，將之亞克隆到pTV118N載體中。以所得的各重組質(zhì)粒為模板，應(yīng)用引物F3S4和引物RV-N(寶酒造)進(jìn)行PCR，以此來檢測(cè)有無F3基因。結(jié)果得到具有2.6kb SalI-HindIII片段的質(zhì)粒，該片段中含有F3基因，將該質(zhì)粒命名為pF3SH92。檢測(cè)用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109而得到的大腸桿菌JM 109/pF3SH92中F3的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)有相當(dāng)于F3分子量的蛋白質(zhì)的表達(dá)。(2)含有F3基因的DNA片段堿基序列的測(cè)定用雙脫氧法測(cè)定上述質(zhì)粒pF3SH92插入DNA片段的堿基序列。對(duì)所得堿基序列進(jìn)行分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)它所編碼的蛋白質(zhì)N端氨基酸序列是與F3一致的開放閱讀框。該開放閱讀框的堿基序列和由該堿基序列推出的F3的氨基酸序列分別顯示于序列表的序列號(hào)79和80中。對(duì)該氨基酸序列與已知蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)與來源于分支的枝動(dòng)桿菌(Mycoplana ramosa)的乙?；郯钒被饷竅細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)，第178卷，第5781～5786頁(yè)(1996)]，以及人的組蛋白脫乙?；竅科學(xué)(Science)，第272卷，第408～411頁(yè)(1996)]間具有同源性。實(shí)施例14以下的實(shí)施例中，市售酶的活性以各酶的表示為基礎(chǔ)。另外，含有市售酶的反應(yīng)液的制備，若無特殊說明，按各酶的說明書進(jìn)行，或使用附帶的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行制備。應(yīng)用GeneAmp PCR儀9600型(GeneAmpPCR System 9600，PE(珀金-埃爾默)公司)進(jìn)行PCR。(1)抗PFU-RFC抗體的制備用50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巰基乙醇，75mMNaCl稀釋實(shí)施例9(6)的PFU-RFC標(biāo)準(zhǔn)品至濃度為1mg/100μl，加入等量的氟氏完全佐劑使之乳化。將之注射到兔子皮下，每次50μl，每間隔3周，共注射4次。最后一次免疫10天后采全血，室溫放置60分鐘后，離心，得到含有抗PFU-RFC多克隆抗體的抗血清50ml。向20ml抗血清中加入20ml的飽和硫酸銨溶液，4℃45分鐘緩慢攪拌后離心。將所得沉淀懸浮到50ml的20mM磷酸鈉緩沖液、pH7.0中，以2L同一緩沖液作外液進(jìn)行2小時(shí)的透析，共透析3次。將透析后的溶液14ml加入用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡過的蛋白A柱(Pharmacia公司)，用同一緩沖液洗滌后，用0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0)進(jìn)行洗脫。用1M Tris-HCl、pH9.0中和洗脫出的抗PFU-RFC抗體后，用旋轉(zhuǎn)濃縮儀Centripro-CF-50進(jìn)行濃縮，用PD-10柱(Pharmacia公司)置換成偶聯(lián)緩沖液(0.5M氯化鈉，0.2M碳酸氫鈉、pH8.3)，制備成含有抗PFU-RFC抗體的溶液。(2)抗PFU-RFC抗體柱的制備用1mM鹽酸6ml洗滌HiTrap NHS-活化柱(Pharmacia公司)后，將上述的抗PFU-RFC多克隆抗體溶液0.95ml(相當(dāng)于含有3.8mg的抗PFU-RFC抗體)上樣。以后按與實(shí)施例2(3)相同的方法制備抗PFU-RFC抗體柱。(3)用抗PFU-RFC抗體柱純化含有PFU-RFC的復(fù)合體用與實(shí)施例1相同的方法培養(yǎng)激烈熱球菌DSM 3638，得到每份10L的培養(yǎng)液。將該菌體懸浮到含有2mM PMSF的緩沖液C(50mMTris-HCl、pH8.0，0.1mM ATP)33ml中，加到超聲破碎儀上。將所得破碎液12000rpm離心10分鐘，將所得上清39ml供給用含有0.1M NaCl的緩沖液C平衡過的抗PFU-RFC抗體柱。用含有0.1MNaCl的緩沖液C洗滌柱子后，85℃加熱1小時(shí)，用含有0.1M NaCl的緩沖液C洗脫出PFU-RFC復(fù)合體。將該洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE(12.5％聚丙烯酰胺凝膠，用25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH8.4作電泳液)，依照常規(guī)方法用考馬斯亮藍(lán)-R-250對(duì)電泳后的膠進(jìn)行染色，結(jié)果除PFU-RFC的帶以外，在相當(dāng)于F7的33kDa的位置檢測(cè)出1條帶，在60kDa附近檢測(cè)出2條帶。
于是用與實(shí)施例3(2)同樣的方法分析這3條帶中存在的蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列，如圖14所示，相當(dāng)于上述F7位置的蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列與F7一致，60kDa附近的2種蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列均與上述PFU-RFCLS N末端的氨基酸序列一致。
通過與這些蛋白質(zhì)結(jié)合的考馬斯亮藍(lán)的量來對(duì)該洗脫液中包含的PFU-RFC、PFU-RFCLS、F7進(jìn)行定量。將洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE(12.3％聚丙烯酰胺凝膠，使用25mM Tris-HCl、192mM甘氨酸、0.1％SDS、pH8.4作電泳液)，依照常規(guī)方法用考馬斯亮藍(lán)-R-230對(duì)電泳后的帶進(jìn)行染色，切出泳帶后，用500μl的70％蟻酸提取考馬斯亮藍(lán)，測(cè)定630nm處的吸光度。以濃度已知的實(shí)施例8(4)中的F7標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)施例9(6)中的PFU-RFC標(biāo)準(zhǔn)品制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，在此基礎(chǔ)上可證明500μl洗脫液中含有208μg的PFU-RFC，55μg的PFU-RFCLS，51μg的F7蛋白質(zhì)。以下將PFU-RFC、PFU-RFCLS和F7 3種蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體稱作RFC-N復(fù)合體。(4)RFC-N復(fù)合體對(duì)引物延伸反應(yīng)的影響為了檢測(cè)實(shí)施例14(3)中得到的RFC-N復(fù)合體對(duì)各種聚合酶的引物延伸反應(yīng)的影響，比較添加RFC-N復(fù)合體時(shí)和只添加其構(gòu)成成分F7時(shí)，Pfu聚合酶C、Pfu DNA聚合酶(α型DNA聚合酶，Stratagene)的活性。DNA聚合酶活性的測(cè)定，除使用50fmol的Pfu聚合酶C或Pfu DNA聚合酶外，用與實(shí)施例8(5)中記載的同一方法進(jìn)行。DNA聚合酶活性的測(cè)定如實(shí)施例8(5)所示，使用M13噬菌體單鏈DNA(M13mp18ssDNA，寶酒造公司)的45個(gè)堿基的合成寡核苷酸HT引物退火時(shí)的產(chǎn)物(M13-HT引物)。序列表的序列號(hào)42中顯示了HT引物的堿基序列。用Pfu DNA聚合酶時(shí)的結(jié)果如圖15所示。F7和RFC-N復(fù)合體的添加量用反應(yīng)液中所含F(xiàn)7、RFC-N復(fù)合體的摩爾數(shù)表示。如圖15所示RFC-N復(fù)合體與單獨(dú)F7相比能更好的提高Pfu DNA聚合酶活性。
再用實(shí)施例8(5)記載的方法檢測(cè)引物延伸活性。按如下的組成制備測(cè)定時(shí)應(yīng)用的反應(yīng)液①100fmol的F7，②0.05μl的RFC-N復(fù)合體(含有60fmol的F7)，③10fmol的Pfu聚合酶C，④10fmol的Pfu聚合酶C+100fmol的F7，⑤100fmol的Pfu聚合酶C+0.05μl的RFC-N復(fù)合體，⑥20fmol的F7，⑦0.02μl的RFC-N復(fù)合體(含24fmol的F7)，⑧10fmol的Pfu DNA聚合酶，⑨10fmol的PfuDNA聚合酶+20fmol的F7，⑩10fmol的Pfu DNA聚合酶+0.02μl的RFC-N復(fù)合體。分別向各種測(cè)定用反應(yīng)液1μl中加入含有0.01μg/μl的32P標(biāo)記的M13-HT引物的反應(yīng)液9μl(20mM Tris-HCl(μH9.0)、15mM氯化鎂，2mM 2-巰基乙醇，各40μM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，75℃反應(yīng)2.3分鐘。反應(yīng)終了后，冰冷反應(yīng)液停止反應(yīng)，再加入1μl的200mM EDTA、5μl的反應(yīng)終止液(93％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚藍(lán)，0.05％二甲苯氰)，95℃進(jìn)行5分鐘的熱變性處理。用含有8M尿素的6％聚丙烯酰胺凝膠對(duì)該反應(yīng)液中的1.6μl進(jìn)行電泳后，進(jìn)行放射自顯影。
然后用實(shí)施例8(5)記載的方法分析較長(zhǎng)鏈的引物延伸反應(yīng)物。向上述①～⑩的樣品液各1μl中加入含有終濃度為0.01μg/μl的M13-HT引物的9μl反應(yīng)液(20mM Tris-HCl、pH9.0，0.15mM氯化鎂，2mM 2-巰基乙醇，各40μM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，84nM[α-32P]-dCTP)，75℃反應(yīng)2.5分鐘。反應(yīng)終了后，向冰冷后的反應(yīng)液中依次加入1.11μl的200mM EDTA，1.23μl的500mM NaOH，2.47μl的6倍濃度的加樣緩沖液(0.125％溴酚藍(lán)，0.125％二甲苯氰，9％甘油)將其中的6μl進(jìn)行0.5％堿性瓊脂糖凝膠電泳，之后進(jìn)行放射自顯影。
與單用F7相比，添加RFC-N復(fù)合體時(shí)均能增加Pfu聚合酶C和Pfu DNA聚合酶的長(zhǎng)鏈延伸產(chǎn)物的量。
對(duì)于長(zhǎng)鏈延伸產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)，無論是哪種聚合酶，用F7單獨(dú)和RFC-N復(fù)合體可看到模板全長(zhǎng)的7.2kb。實(shí)施例15 rRFC-M表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(1)構(gòu)建能同時(shí)表達(dá)PFU-RFCLS和PFU-RFC的質(zhì)粒。參照實(shí)施例11(2)中得到的堿基序列合成序列表的序列號(hào)81中顯示了其堿基序列的引物RFLS-NdeN和序列號(hào)82中顯示了其堿基序列的RFLS-S9。使用這兩種引物，以上述的質(zhì)粒pRFLSNh為模板進(jìn)行PCR。PCR中酶應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)的相同，添加10ng的質(zhì)粒pRFLSNh和各20pmol的引物，以94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(3分)為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。用NdeI和PstI消化PCR中得到的擴(kuò)增DNA片段，分離出大約920bp的NdeI-PstI片段，將該片段與實(shí)施例11(2)中從質(zhì)粒pRFLSNh分離出的大約600bp的PstI-EcoRI片段、實(shí)施例9(4)中得到的從質(zhì)粒pRFS254SNc分離出的約2kb的EcoRI-BamHI片段混合，亞克隆到質(zhì)粒載體pTV119Nd的NdeI-BamHI位點(diǎn)間。將所得重組質(zhì)粒命名為pRFC 10，另外將用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM 109命名為大腸桿菌JM 109/pRFC 10。證明前面的轉(zhuǎn)化體高表達(dá)PFU-RFCLS和PFU-RFC。(2)編碼PFU-RFCLS和PFU-RFC的基因堿基序列的測(cè)定用雙脫氧法測(cè)定實(shí)施例15(1)中得到的質(zhì)粒pRFC 10中插入DNA片段中用PCR擴(kuò)增出的區(qū)域的堿基序列，未發(fā)現(xiàn)因PCR造成的變異。由該結(jié)果和實(shí)施例9(3)和實(shí)施例11(2)的結(jié)果可測(cè)定出編碼不含PFU-RFCLS和介在序列的PFU-RFCLS和介在序列的PFU-RFC的基因的堿基序列顯示于序列表的序列83中，其限制性酶譜在圖16中顯示。實(shí)施例16 rRFC-M標(biāo)準(zhǔn)品的制備將實(shí)施例15(1)中得到的大腸桿菌JM 109/pRFC 10在LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，pH7.2)500ml×4中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中存在100μg/ml的氨芐青霉素、1mM的IPTG，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)。收集細(xì)菌后，將菌體懸浮到35.9ml的超聲波緩沖液(50mM Tris-HCl、pH8.0，2mM 2-巰基乙醇，10％甘油，2mM PMSF(苯甲基磺酰氧))中，加到超聲破碎儀上。12000rpm離心10分鐘，80℃進(jìn)行15分鐘的熱處理。其后再度12000rpm離心10分鐘，得到33.0ml的熱處理酶液。然后將該溶液供給用緩沖液A(50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巰基乙醇，10％甘油)平衡過的RESOURCE Q柱(Pharmacia公司)用FPLC系統(tǒng)(Pharmacia公司)進(jìn)行色譜分析。洗脫通過0～500mM的氯化鈉直線濃度梯度進(jìn)行。
通過SDS-PAGE(12.5％聚丙乙烯酰胺凝膠，用25mMTris-HCl，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH8.4作電泳)分析洗脫液，結(jié)果PFU-RFCLS和PFU-RFC均在240mM氯化鈉的濃度被洗脫出。如實(shí)施例9(6)所述，將從只表達(dá)PFU-RFC的菌體得到的洗脫液供給RESOURCE Q柱時(shí)，不吸附到RESOURCE Q柱上，但將從同時(shí)表達(dá)PFU-RFCLS和PFU-RFC的菌體得到的洗脫液供給RESOURCE Q柱時(shí)，它吸附到柱上。如上所述，在240mM氯化鈉濃度下能同時(shí)洗脫出PFU-RFCLS和PFU-RFC。該結(jié)果提示這兩種蛋白質(zhì)形成了復(fù)合體。以下將該復(fù)合體稱作rRFC-M復(fù)合體。
用旋轉(zhuǎn)濃縮儀Centripro-CF50濃縮收集rRFC-M復(fù)合體部分而得到的4.8ml酶溶液，然后用PD-10柱(Pharmacia公司)置換到含有150mM氯化鈉的緩沖液A中，將3.5ml溶液供給用含150mM氯化鈉的緩沖液A平衡過的heparin柱(Pharmacia公司)。應(yīng)用FPLC系統(tǒng)，用150mM→650mM氯化鈉直線濃度梯度進(jìn)行展開，在450mM氯化鈉的時(shí)候洗脫出rRFC-M復(fù)合體部分。用離心超濾儀Centricon-10(Amicon公司)濃縮該部分洗脫液3.9ml，將115μl的濃縮液供給用50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巰基乙基、75mM氯化鈉平衡過的Superdex 200凝膠過濾柱(Pharmacia公司)。用同一緩沖液進(jìn)行洗脫，結(jié)果rRFC-M復(fù)合體的保留時(shí)間為26.3分鐘。與同一條件下分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的洗脫位置進(jìn)行比較，結(jié)果推算出rRFC-M復(fù)合體大約370kDa。
為了求出rRFC-M復(fù)合體中各亞基的構(gòu)成比，再將前面約370kDa分子量的洗脫級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE。
按照常規(guī)方法用考馬斯亮蘭-R-250對(duì)電泳后的凝膠染色，然后切出PFU-RFCLS和PFU-RFC的蛋白質(zhì)帶，用500μl的70％蟻酸抽提。測(cè)各抽提液630nm的吸光度，以實(shí)施例9(6)中制備的PFU-RFC制作出定量曲線，與之進(jìn)行比較計(jì)算出各蛋白質(zhì)量的摩爾數(shù)。
結(jié)果，PFU-RFCLS和PFU-RFC以1∶4的比例存在。如上所示用凝膠過濾算出的rRFC-M復(fù)合體的分子量約為370kDa，在此基礎(chǔ)上我們認(rèn)為rRFC-M復(fù)合體是由2分子的PFU-RFCLS和8分子的PFU-RFC形成的。于是，以前述的rRFC-M復(fù)合體為1個(gè)單位算出摩爾數(shù)。實(shí)施例17 F3表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(1)以實(shí)施例13中制備的質(zhì)粒pF3SH92作模板，應(yīng)用序列表的序列號(hào)84中破.基序列顯示的引物F3Nd和序列表的序列號(hào)76中堿基序列顯示的引物F3S2進(jìn)行PCR。PCR中酶應(yīng)用Pfu DNA聚合酶，反應(yīng)液的組成與實(shí)施例5(1)相同，添加1ng的質(zhì)粒pF3SH92和各20pmol的引物，94℃(30秒)～55℃(30秒)～72℃(1分)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。用NdeI和PstI消化PCR的擴(kuò)增DNA片段，分離出約0.5kb的NdeI-PstI片段，將該片段與從質(zhì)粒pF3SH92分離出的大約1.1kb的PstI-EcoRI片段混合，亞克隆到質(zhì)粒載體pTV119Nd的NdeI-EcoRI位點(diǎn)間。將如此得到的重組質(zhì)粒命名為pF3-19。另外將用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM 109命名為大腸桿菌JM 109/pF3-19。證明該轉(zhuǎn)化體高表達(dá)F3。(2)編碼F3基因堿基序列的測(cè)定用雙脫氧法確認(rèn)實(shí)施例17(1)中得到的質(zhì)粒pF3-19中插入DNA片段中PCR擴(kuò)增區(qū)域的堿基序列，確證未因PCR而造成變異。實(shí)施例18 純化F3標(biāo)準(zhǔn)品的制備在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH7.2)500ml×4中，培養(yǎng)實(shí)施例17(1)中得到的大腸桿菌JM 109/pF3-19，培養(yǎng)16小時(shí)。收集細(xì)菌后，將菌體懸浮到50ml超聲緩沖液[50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巰基乙醇，10％甘油，2mM PMSF(苯甲基磺酰氟)]中，加入超聲破碎儀。12000rpm離心10分鐘后，將上清于80℃進(jìn)行15分鐘的熱處理。其后，再12000rpm離心10分鐘，將所得44ml熱處理上清液供給用實(shí)施例16記載的緩沖液A平衡過的RESOURCE Q柱(Pharmacia公司)，用FPLC系統(tǒng)(Pharmacia公司)進(jìn)行色譜分析。展開通過0→500mM的NaCl直線濃度梯度進(jìn)行。用140mM～240mMNaCl洗脫出包含F(xiàn)3的部分，向11ml溶液中加入含有3M硫酸銨的緩沖液A5.5ml，供給用含1M硫酸銨的緩沖液A平衡過的HiTrap butyl柱(Pharmacia公司)。應(yīng)用FPLC系統(tǒng)，用含有1M硫酸銨的緩沖液A洗柱，然后用含0.5M硫酸銨的緩沖液A洗脫F3。將該部分6ml供給用含有0.5M硫酸銨的緩沖液A平衡過的HiTrap phenyl柱(Pharmacia公司)。應(yīng)用FPLC系統(tǒng)，用含0.5M硫酸銨的緩沖液A洗柱后，用緩沖液A洗脫出F3。用離心超濾儀Centricon-10(Amicon公司)濃縮該部分9.5ml，將155μl的濃縮液供給用50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM 2-巰基乙醇，75mM NaCl平衡過的Superdex 200凝膠過濾柱(Pharmacia公司)。用同一緩沖液進(jìn)行洗脫，結(jié)果在保留時(shí)間42.1分鐘的位置洗脫出F3。與在同一條件下分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的洗脫位置進(jìn)行比較，推測(cè)分子量約25kDa。F3分子量的理論值是37kDa，在此基礎(chǔ)上推算F3為單體。實(shí)施例19 純化F5標(biāo)準(zhǔn)品的制備在氨芐青霉素的濃度為100μg/ml的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH7.2)500ml×4中培養(yǎng)實(shí)施例12(4)中得到的質(zhì)粒pF5NBPET轉(zhuǎn)化的大腸桿菌HMS 174(DE3)-大腸桿菌HMS174(DE3)/pF5NBPET，培養(yǎng)16小時(shí)。收集細(xì)菌后，將菌體懸浮到61ml的超聲緩沖液中，加入到超聲破碎儀。將破碎后的菌體12000rpm離心10分鐘后，將上清液80℃熱處理15分鐘。其后，再12000rpm離心10分鐘，向所得60.5ml熱處理上清中加入8.71g的硫酸銨，4℃攪拌2小時(shí)后12000rpm離心10分鐘。用19ml的緩沖液A溶解沉淀物，用緩沖液A進(jìn)行透析。透析后的酶液供給用緩沖液A平衡過的RESOURCE Q柱(Pharmacia公司)，用FPLC系統(tǒng)(Pharmacia公司)進(jìn)行色譜分析。展開通過0→500mM NaCl直線濃度梯度進(jìn)行。從350mM到450mM NaCl的時(shí)候洗脫出含有F5的部分，用離心超濾儀Centricon-10(Amicon公司)濃縮該部分的11ml溶液，將222μl的濃縮液供給用50mM Tris-HCl、pH8.0，0.2mM2-巰基乙醇、75mM NaCl平衡了的Superdex 200凝膠過濾柱(Pharmacia公司)。用同一緩沖液進(jìn)行洗脫，結(jié)果在保留時(shí)間32.5分的位置洗脫出F5。與在同一條件下分子量標(biāo)記物的洗脫位置相比較，推測(cè)分子量約145kDa。該分子量是F5形成7聚體時(shí)的分子量。實(shí)施例20 引物的制作以λDNA的堿基序列為基礎(chǔ)合成λ1B～λ5、λ7～λ9的8種引物。引物λ1B～λ5、λ7～λ9的堿基序列分別列于序列表的序列號(hào)85～92中。聯(lián)合應(yīng)用這些引物以λDNA作模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出的DNA片段的鏈長(zhǎng)如表4所示。
表4引物對(duì) 擴(kuò)增DNA片段的鏈長(zhǎng)λ1B/λ20.5kbλ1B/λ31kbλ1B/λ42kbλ1B/λ54kbλ1B/λ78kbλ1B/λ810kbλ1B/λ912kb實(shí)施例21F1蛋白質(zhì)對(duì)DNA聚合酶的影響檢測(cè)實(shí)施例5中得到的F1蛋白質(zhì)對(duì)PCR的影響。為了以λDNA為模板進(jìn)行1～4kb DNA片段的擴(kuò)增反應(yīng)引物對(duì)分別使用引物λ1B和λ3，引物λ1B和λ4、引物λ1B和λ5，制備有如下組成的反應(yīng)液10mM Tris-HCl、pH9.2，75mM氯化鈣，6mM氯化鎂，各0.40mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，0.01％BSA和1.25單位的Pfu聚合酶C，500pg的模板DNA，各5pmol的各組引物，73pmol的F1蛋白質(zhì)(終體積為75μl)。各反應(yīng)液，以98℃0秒～68℃0秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。本說明書中“98℃0秒”“68℃0秒”等描述表示設(shè)定的是這樣一種反應(yīng)程序當(dāng)溫度達(dá)到設(shè)定溫度的同時(shí)，馬上朝另一設(shè)定溫度變化。
反應(yīng)終了后，取反應(yīng)液5μl進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠(寶酒造)電泳，確認(rèn)擴(kuò)增片段。
結(jié)果確證與使用的引物對(duì)相對(duì)應(yīng)擴(kuò)增出1kb、2kb、4kb的DNA片段。另一方面，上述反應(yīng)液中未添加F1蛋白質(zhì)時(shí)，用上述反應(yīng)條件進(jìn)行PCR時(shí)未看到任何擴(kuò)增片段。實(shí)施例22F1、F3、F5蛋白質(zhì)對(duì)DNA聚合酶的影響應(yīng)用實(shí)施例5得到的F1蛋白質(zhì)，實(shí)施例18中得到的F3蛋白質(zhì)，實(shí)施例19中得到的F5蛋白質(zhì)，檢測(cè)它們以λDNA作模板，通過PCR對(duì)約6kb DNA片段擴(kuò)增反應(yīng)的影響。除引物對(duì)使用引物λ1和λ6外，制備與實(shí)施例21組成相同的反應(yīng)液。分別向反應(yīng)液中加入F1蛋白質(zhì)173pmol，F(xiàn)3蛋白質(zhì)10pmol，F(xiàn)5蛋白質(zhì)1pmol，終體積為25μl。各反應(yīng)液以98℃1秒～68℃2分為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。反應(yīng)終了后，取5μl反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)擴(kuò)增片段。
結(jié)果確認(rèn)在分別存在F1、F3、F5蛋白質(zhì)的條件下均得到6kb的擴(kuò)增片段。而在不添加這些蛋白質(zhì)的情況下未見到擴(kuò)增片段。實(shí)施例23F2、F4蛋白質(zhì)對(duì)DNA聚合酶的影響應(yīng)用實(shí)施例6中得到的F2蛋白質(zhì)、實(shí)施例7中得到的F4蛋白質(zhì)，檢測(cè)它們以λDNA為模板，通過PCR對(duì)4kb DNA片段擴(kuò)增反應(yīng)的影響。除引物對(duì)使用引物λ1B和λ5，0.75單位的Pfu聚合酶C、1ng的模板λDNA外，制備與實(shí)施例21同樣組成的反應(yīng)液。另外，向反應(yīng)液中分別加入1.095pmol、終體積為25μl的F2蛋白質(zhì)、F4蛋白質(zhì)。各反應(yīng)液以94℃30秒～55℃30秒～72℃2分為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。反應(yīng)終了后，取5μl反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)擴(kuò)增片段。
結(jié)果確認(rèn)在分別存在F2、F4蛋白質(zhì)的條件下均擴(kuò)增出4kb的片段。而在不添加這些蛋白質(zhì)的時(shí)候，未見到擴(kuò)增片段。實(shí)施例24 rRFC-M復(fù)合體對(duì)DNA聚合酶的影響為了檢測(cè)rRFC-M復(fù)合體對(duì)各種聚合酶引物延伸反應(yīng)的影響，比較rRFC-M復(fù)合體和F7共存時(shí)與只存在F7時(shí)Pfu聚合酶C、PfuDNA聚合酶(α型DNA聚合酶，Stratagene公司)的活性。
DNA聚合酶活性的測(cè)定除應(yīng)用50fmol的Pfu聚合酶C或Pfu DNA聚合酶，添加400fmol的rRFC-M復(fù)合體和0～200fmol的F7之外，用與實(shí)施例8(5)同樣的方法進(jìn)行。應(yīng)用Pfu DNA聚合酶時(shí)的結(jié)果如圖17所示。對(duì)于Pfu DNA聚合酶的效果是rRFC-M復(fù)合體與F7共存時(shí)比單用F7時(shí)酶的活性升高。另外，對(duì)于Pfu聚合酶C的效果也有與Pfu DNA聚合酶同樣的傾向。實(shí)施例25 rRFC-M復(fù)合體與F7蛋白質(zhì)共存對(duì)PCR的影響為了以λDNA作模板實(shí)行4kb DNA片段的擴(kuò)增反應(yīng)，除應(yīng)用引物λ1B和λ5，使用0.375單位的Pfu聚合酶C外，制備與實(shí)施例21同樣組成的反應(yīng)液。另外，分別向反應(yīng)液中加入終體積23μl的312.5fmol的rRFC-M復(fù)合體，125fmol的F7蛋白質(zhì)。以98℃0秒～68℃10秒為1個(gè)循環(huán)，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。反應(yīng)終止后，取反應(yīng)液5μl，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠(寶酒造)電泳，確認(rèn)擴(kuò)增片段。
結(jié)果在rRFC-M復(fù)合體，與F7蛋白質(zhì)共存的反應(yīng)體系中可以確證擴(kuò)增出針對(duì)所使用引物的4kb的DNA片段。而在未添加這些蛋白質(zhì)的情況下未見到擴(kuò)增片段。
再以λDNA為模板，針對(duì)8～12kb DNA片段的擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。除分別使用引物λ1B和λ7、引物λ1B和λ8、引物λ1B和λ9引物對(duì)，再應(yīng)用0.375單位的Pfu聚合酶C、2.5ng的模板λDNA外，制備與實(shí)施例21同樣組成的反應(yīng)液。再向反應(yīng)液分別加入312.5fmol的rRFC-M復(fù)合體，125fmol的F7蛋白質(zhì)，使其終體積為25μl。以98℃0秒～68℃3分為1個(gè)循環(huán)，對(duì)各反應(yīng)液進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。反應(yīng)終了后，取3μl反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠(寶酒造)電泳，確認(rèn)擴(kuò)增片段。
結(jié)果在rRFC-M復(fù)合體與F7蛋白質(zhì)共存在的體系中確證到與使用的引物對(duì)應(yīng)的8kb、10kb、12kb的DNA擴(kuò)增片段。而在什么都沒加的體系中只看到8kb的DNA片段。實(shí)施例26 rRFC-M復(fù)合體與F7蛋白質(zhì)共存對(duì)Pfu DNA聚合酶的影響為了以λDNA作模板進(jìn)行4kb的DNA片段的擴(kuò)增反應(yīng)，分別使用引物對(duì)一引物λ1B和λ3，引物λ1B和λ4、引物λ1B和λ5，制備具有以下組成的反應(yīng)液Pfu DNA聚合酶附加緩沖液，0.2mMdATP、dCTP、dGTP、dTTP和各0.5單位的Pfu聚合酶，500ng的模板DNA，各2.5pmol的各種引物，2.5pmol的rRFC-M復(fù)合體蛋白質(zhì)和0.5pmol的F7蛋白質(zhì)(終體積為25μl)。以94℃30秒～55℃30秒～72℃1分為1個(gè)循環(huán)，對(duì)各反應(yīng)液進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。反應(yīng)終了后，取5μl反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)擴(kuò)增片段。
結(jié)果確證在rRFC-M復(fù)合體和F7蛋白質(zhì)共存的體系中擴(kuò)增出與使用的引物相對(duì)應(yīng)的1kb、2kb、4kb的DNA片段。而在未添加這些蛋白質(zhì)的時(shí)候，只看到1kb～2kb的DNA片段。實(shí)施例27 rRFC-M復(fù)合體與F7蛋白質(zhì)共存對(duì)混合型DNA聚合酶的影響將2種DNA聚合酶混合使用，檢測(cè)rRFC-M復(fù)合體和F7蛋白質(zhì)共存對(duì)PCR的影響。
為了以λDNA作模板進(jìn)行1kb DNA片段的擴(kuò)增反應(yīng)，使用引物對(duì)引物λ1B和λ3，制備具有如下組成的反應(yīng)液TaKaRa LATaq用附加緩沖液(加Mg2+)，各0.4mM dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1.25單位的LA Taq DNA聚合酶(寶酒造)，500pg的模板DNA，各5pmol的各種引物，62.5fmol的RFC復(fù)合體蛋白質(zhì)和12.5fmol的F7蛋白質(zhì)(終體積25μl)。以98℃0秒～68℃10秒為1個(gè)循環(huán)，對(duì)各反應(yīng)液進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。反應(yīng)終了后，取5μl反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)擴(kuò)增片段。
結(jié)果證實(shí)添加了rRFC-M復(fù)合體和F7蛋白質(zhì)的體系，與上述反應(yīng)液中只加了rRFC-M復(fù)合體的體系，只添加F7蛋白質(zhì)的體系，只添加LA Taq DNA聚合酶的體系相比較時(shí)，添加rRFC-M復(fù)合體和F7蛋白質(zhì)的體系能最有效地?cái)U(kuò)增1kb的DNA片段。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明提供能提高DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的DNA聚合酶相關(guān)因子。該因子可對(duì)各種DNA聚合酶起作用，另外還可由于使用DNA聚合酶的各種工程，作為基因工程學(xué)研究的試劑應(yīng)用。再者，應(yīng)用編碼本發(fā)明DNA聚合酶相關(guān)因子的基因可通過基因工程學(xué)方法制備該酶。
序列表序列號(hào)1序列長(zhǎng)度249序列類型氨基酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Met Pro Phe Glu Ile Val Phe Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Gln5 10 15Leu Ile Asp Thr Ala Ser Lys Leu Ile Asp Glu Ala Ala Phe Lys20 25 30Val Thr Glu Asp Gly Ile Ser Met Arg Ala Met Asp Pro Ser Arg35 40 45Val Val Leu Ile Asp Leu Asn Leu Pro Ser Ser Ile Phe Ser Lys50 55 60Tyr Glu Val Val Glu Pro Glu Thr Ile Gly Val Asn Met Asp His65 70 75Leu Lys Lys Ile Leu Lys Arg Gly Lys Ala Lys Asp Thr Leu Ile80 85 90Leu Lys Lys Gly Glu Glu Asn Phe Leu Glu Ile Thr Ile Gln Gly95 100 105Thr Ala Thr Arg Thr Phe Arg Val Pro Leu Ile Asp Val Glu Glu110 115 120Met Glu Val Asp Leu Pro Glu Leu Pro Phe Thr Ala Lys Val Val125 130 135Val Leu Gly Glu Val Leu Lys Asp Ala Val Lys Asp Ala Ser Leu140 145 150Val Ser Asp Ser Ile Lys Phe Ile Ala Arg Glu Asn Glu Phe Ile155 160 165Met Lys Ala Glu Gly Glu Thr Gln Glu Val Glu Ile Lys Leu Thr170 175 180Leu Glu Asp Glu Gly Leu Leu Asp Ile Glu Val Gln Glu Glu Thr185 190 195Lys Ser Ala Tyr Gly Val Ser Tyr Leu Ser Asp Met Val Lys Gly200 205 210Leu Gly Lys Ala Asp Glu Val Thr Ile Lys Phe Gly Asn Glu Met215 220 225Pro Met Gln Met Glu Tyr Tyr Ile Arg Asp Glu Gly Arg Leu Thr230 235 240Phe Leu Leu Ala Pro Arg Val Glu Glu245序列號(hào)2序列長(zhǎng)度750序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類基因組DNA序列ATGCCATTTG AAATCGTATT TGAAGGTGCA AAAGAGTTTG CCCAACTTAT AGACACCGCA 60AGTAAGTTAA-TAGATGAGGC CGCGTTTAAA GTTACAGAAG ATGGGATAAG CATGAGGGCC 120ATGGATCCAA GTAGAGTTGT CCTGATTGAC CTAAATCTCC CGTCAAGCAT ATTTAGCAAA 180TATGAAGTTG TTGAACCAGA AACAATTGGA GTTAACATGG ACCACCTAAA GAAGATCCTA 240AAGAGAGGTA AAGCAAAGGA CACCTTAATA CTCAAGAAAG GAGAGGAAAA CTTCTTAGAG 300ATAACAATTC AAGGAACTGC AACAAGAACA TTTAGAGTTC CCCTAATAGA TGTAGAAGAG 360ATGGAAGTTG ACCTCCCAGA ACTTCCATTC ACTGCAAAGG TTGTAGTTCT TGGAGAAGTC 420CTAAAAGATG CTGTTAAAGA TGCCTCTCTA GTGAGTGACA GCATAAAATT TATTGCCAGG 480GAAAATGAAT TTATAATGAA GGCAGAGGGA GAAACCCAGG AAGTTGAGAT AAAGCTAACT 540CTTGAAGATG AGGGATTATT GGACATCGAG GTTCAAGAGG AGACAAAGAG CGCATATGGA 600GTCAGCTATC TCTCCGACAT GGTTAAAGGA CTTGGAAAGG CCGATGAAGT TACAATAAAG 660TTTGGAAATG AAATGCCCAT GCAAATGGAG TATTACATTA GAGATGAAGG AAGACTTACA 720TTCCTACTGG CTCCAAGAGT TGAAGAGTGA 750序列號(hào)3序列長(zhǎng)度327序列類型氨基酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Met Ser Glu Glu Ile Arg Glu Val Lys Val Leu Glu Lys Pro Trp5 10 15Val Glu Lys Tyr Arg Pro Gln Arg Leu Asp Asp Ile Val Gly Gln20 25 30Glu His Ile Val Lys Arg Leu Lys His Tyr Val Lys Thr Gly Ser35 40 45Met Pro His Leu Leu Phe Ala Gly Pro Pro Gly Val Gly Lys Thr50 55 60Thr Ala Ala Leu Ala Leu Ala Arg Glu Leu Phe Gly Glu Asn Trp65 70 75Arg His Asn Phe Leu Glu Leu Asn Ala Ser Asp Glu Arg Gly Ile80 85 90Asn Val Ile Arg Glu Lys Val Lys Glu Phe Ala Arg Thr Lys Pro95 100 105Ile Gly Gly Ala Ser Phe Lys Ile Ile Phe Leu Asp Glu Ala Asp110 115 120Ala Leu Thr Gln Asp Ala Gln Gln Ala Leu Arg Arg Thr Met Glu125 130 135Met Phe Ser Ser Asn Val Arg Phe Ile Leu Ser Cys Asn Tyr Ser140 145 150Ser Lys Ile Ile Glu Pro Ile Gln Ser Arg Cys Ala Ile Phe Arg155 160 165Phe Arg Pro Leu Arg Asp Glu Asp Ile Ala Lys Arg Leu Arg Tyr170 175 180Ile Ala Glu Asn Glu Gly Leu Glu Leu Thr Glu Glu Gly Leu Gln185 190 195Ala Ile Leu Tyr Ile Ala Glu Gly Asp Met Arg Arg Ala Ile Asn200 205 210Ile Leu Gln Ala Ala Ala Ala Leu Asp Lys Lys Ile Thr Asp Glu215 220 225Asn Val Phe Met Val Ala Ser Arg Ala Arg Pro Glu Asp Ile Arg230 235 240Glu Met Met Leu Leu Ala Leu Lys Gly Asn Phe Leu Lys Ala Arg245 250 255Glu Lys Leu Arg Glu Ile Leu Leu Lys Gln Gly Leu Ser Gly Glu260 265 270Asp Val Leu Val Gln Met His Lys Glu Val Phe Asn Leu Pro Ile275 280 285Glu Glu Pro Lys Lys Val Leu Leu Ala Asp Lys Ile Gly Glu Tyr290 295 300Asn Phe Arg Leu Val Glu Gly Ala Asn Glu Ile Ile Gln Leu Glu305 310 315Ala Leu Leu Ala Gln Phe Thr Leu Ile Gly Lys Lys320 325序列號(hào)4序列長(zhǎng)度984序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類基因組DNA序列ATGAGCGAAG AGATTAGAGA AGTTAAGGTT CTAGAAAAAC CCTGGGTTGA GAAGTATAGA 60CCTCAAAGAC TTGACGACAT TGTAGGACAA GAGCACATAG TGAAAAGGCT CAAGCACTAC 120GTCAAAACTG GATCAATGCC CCACCTACTC TTCGCAGGCC CCCCTGGTGT CGGAAAGACT 180ACAGCGGCTT TGGCCCTTGC AAGAGAGCTT TTCGGCGAAA ACTGGAGGCA TAACTTCCTC 240GAGTTGAATG CTTCAGATGA AAGAGGTATA AACGTAATTA GAGAGAAAGT TAAGGAGTTT 300GCGAGAACAA AGCCTATAGG AGGAGCAAGC TTCAAGATAA TTTTCCTTGA TGAGGCCGAC 360GCTTTAACTC AAGATGCCCA ACAAGCCTTA AGAAGAACCA TGGAAATGTT CTCGAGTAAC 420GTTCGCTTTA TCTTGAGCTG TAACTACTCC TCCAAGATAA TTGAACCCAT ACAGTCTAGA 480TGTGCAATAT TCCGCTTCAG ACCTCTCCGC GATGAGGATA TAGCGAAGAG ACTAAGGTAC 540ATTGCCGAAA ATGAGGGCTT AGAGCTAACT GAAGAAGGTC TCCAAGCAAT ACTTTACATA 600GCAGAAGGAG ATATGAGAAG AGCAATAAAC ATTCTGCAAG CTGCAGCAGC TCTAGACAAG 660AAGATCACCG ACGAAAACGT ATTCATGGTA GCGAGTAGAG CTAGACCTGA AGATATAAGA 720GAGATGATGC TTCTTGCTCT CAAAGGCAAC TTCTTGAAGG CCAGAGAAAA GCTTAGGGAG 780ATACTTCTCA AGCAAGGACT TAGTGGAGAA GATGTACTAG TTCAGATGCA CAAAGAAGTC 840TTCAACCTGC CAATAGAGGA GCCAAAGAAG GTTCTGCTTG CTGATAAGAT AGGAGAGTAT 900AACTTCAGAC TCGTTGAAGG GGCTAATGAA ATAATTCAGC TTGAAGCACT CTTAGCACAG 960TTCACCCTAA TTGGGAAGAA GTGA 984序列號(hào)5序列長(zhǎng)度613序列類型氨基酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Met Asp Glu Phe Val Lys Ser Leu Leu Lys Ala Asn Tyr Leu Ile5 10 15Thr Pro Ser Ala Tyr Tyr Leu Leu Arg Glu Tyr Tyr Glu Lys Gly20 25 30Glu Phe Ser Ile Val Glu Leu Val Lys Phe Ala Arg Ser Arg Glu35 40 45Ser Tyr Ile Ile Thr Asp Ala Leu Ala Thr Glu Phe Leu Lys Val50 55 60Lys Gly Leu Glu Pro Ile Leu Pro Val Glu Thr Lys Gly Gly Phe65 70 75Val Ser Thr Gly Glu Ser Gln Lys Glu Gln Ser Tyr Glu Glu Ser80 85 90Phe Gly Thr Lys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Ile Lys Glu Gly Glu95 100 105Ser Phe Ile Ser Thr Gly Ser Glu Pro Leu Glu Glu Glu Leu Asn110 115 120Ser Ile Gly Ile Glu Glu Ile Gly Ala Asn Glu Glu Leu Val Ser125 130 135Asn Gly Asn Asp Asn Gly Gly Glu Ala Ile Val Phe Asp Lys Tyr140 145 150Gly Tyr Pro Met Val Tyr Ala Pro Glu Glu Ile Glu Val Glu Glu155 160 165Lys Glu Tyr Ser Lys Tyr Glu Asp Leu Thr Ile Pro Met Asn Pro170 175 180Asp Phe Asn Tyr Val Glu Ile Lys Glu Asp Tyr Asp Val Val Phe185 190 195Asp Val Arg Asn Val Lys Leu Lys Pro Pro Lys Val Lys Asn Gly200 205 210Asn Gly Lys Glu Gly Glu Ile Ile Val Glu Ala Tyr Ala Ser Leu215 220 225Phe Arg Ser Arg Leu Lys Lys Leu Arg Lys Ile Leu Arg Glu Asn230 235 240Pro Glu Leu Asp Asn Val Val Asp Ile Gly Lys Leu Lys Tyr Val245 250 255Lys Glu Asp Glu Thr Val Thr Ile Ile Gly Leu Val Asn Ser Lys260 265 270Arg Glu Val Asn Lys Gly Leu Ile Phe Glu Ile Glu Asp Leu Thr275 280 285Gly Lys Val Lys Val Phe Leu Pro Lys Asp Ser Glu Asp Tyr Arg290 295 300Glu Ala Phe Lys Val Leu Pro Asp Ala Val Val Ala Phe Lys Gly305 310 315Val Tyr Ser Lys Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Asn Lys Phe Tyr Leu320 325 330Pro Asp Val Pro Leu Tyr Arg Arg Gln Lys Pro Pro Leu Glu Glu335 340 345Lys Val Tyr Ala Ile Leu Ile Ser Asp Ile His Val Gly Ser Lys350 355 360Glu Phe Cys Glu Asn Ala Phe Ile Lys Phe Leu Glu Trp Leu Asn365 370 375Gly Asn Val Glu Thr Lys Glu Glu Glu Glu Ile Val Ser Arg Val380 385 390Lys Tyr Leu Ile Ile Ala Gly Asp Val Val Asp Gly Val Gly Val395 400 405Tyr Pro Gly Gln Tyr Ala Asp Leu Thr Ile Pro Asp Ile Phe Asp410 415 420Gln Tyr Glu Ala Leu Ala Asn Leu Leu Ser His Val Pro Lys His425 430 435Ile Thr Met Phe Ile Ala Pro Gly Asn His Asp Ala Ala Arg Gln440 445 450Ala Ile Pro Gln Pro Glu Phe Tyr Lys Glu Tyr Ala Lys Pro Ile455 460 465Tyr Lys Leu Lys Asn Ala Val Ile Ile Ser Asn Pro Ala Val Ile470 475 480Arg Leu His Gly Arg Asp Phe Leu Ile Ala His Gly Arg Gly Ile485 490 495Glu Asp Val Val Gly Ser Val Pro Gly Leu Thr His His Lys Pro500 505 510Gly Leu Pro Met Val Glu Leu Leu Lys Met Arg His Val Ala Pro515 520 525Met Phe Gly Gly Lys Val Pro Ile Ala Pro Asp Pro Glu Asp Leu530 535 540Leu Val Ile Glu Glu Val Pro Asp Val Val His Met Gly His Val545 550 555His Val Tyr Asp Ala Val Val Tyr Arg Gly Val Gln Leu Val Asn560 565 570Ser Ala Thr Trp Gln Ala Gln Thr Glu Phe Gln Lys Met Val Asn575 580 585Ile Val Pro Thr Pro Ala Lys Val Pro Val Val Asp Ile Asp Thr590 595 600Ala Lys Val Val Lys Val Leu Asp Phe Ser Gly Trp Cys605 610序列號(hào)6序列長(zhǎng)度1263序列類型氨基酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Met Glu Leu Pro Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Phe Glu Met Leu Gln5 10 15Arg Glu Ile Asp Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Lys Lys Ala Arg Ser20 25 30Gln Gly Lys Asp Pro Ser Thr Asp Val Glu Ile Pro Gln Ala Thr35 40 45Asp Met Ala Gly Arg Val Glu Ser Leu Val Gly Pro Pro Gly Val50 55 60Ala Gln Arg Ile Arg Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Asp Lys Glu Ile65 70 75Val Ala Leu Lys Ile Val Asp Glu Ile Ile Glu Gly Lys Phe Gly80 85 90Asp Phe Gly Ser Lys Glu Lys Tyr Ala Glu Gln Ala Val Arg Thr95 100 105Ala Leu Ala Ile Leu Thr Glu Gly Ile Val Ser Ala Pro Leu Glu110 115 120Gly Ile Ala Asp Val Lys Ile Lys Arg Asn Thr Trp Ala Asp Asn125 130 135Ser Glu Tyr Leu Ala Leu Tyr Tyr Ala Gly Pro Ile Arg Ser Ser140 145 150Gly Gly Thr Ala Gln Ala Leu Ser Val Leu Val Gly Asp Tyr Val155 160 165Arg Arg Lys Leu Gly Leu Asp Arg Phe Lys Pro Ser Gly Lys His170 175 180Ile Glu Arg Met Val Glu Glu Val Asp Leu Tyr His Arg Ala Val185 190 195Ser Arg Leu Gln Tyr His Pro Ser Pro Asp Glu Val Arg Leu Ala200 205 210Met Arg Asn Ile Pro Ile Glu Ile Thr Gly Glu Ala Thr Asp Asp215 220 225Val Glu Val Ser His Arg Asp Val Glu Gly Val Glu Thr Asn Gln230 235 240Leu Arg Gly Gly Ala Ile Leu Val Leu Ala Glu Gly Val Leu Gln245 250 255Lys Ala Lys Lys Leu Val Lys Tyr Ile Asp Lys Met Gly Ile Asp260 265 270Gly Trp Glu Trp Leu Lys Glu Phe Val Glu Ala Lys Glu Lys Gly275 280 285Glu Glu Ile Glu Glu Ser Glu Ser Lys Ala Glu Glu Ser Lys Val290 295 300Glu Thr Arg Val Glu Val Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Lys Leu Tyr305 310 315Glu Lys Phe Arg Ala Glu Ile Ala Pro Ser Glu Lys Tyr Ala Lys320 325 330Glu Ile Ile Gly Gly Arg Pro Leu Phe Ala Gly Pro Ser Glu Asn335 340 345Gly Gly Phe Arg Leu Arg Tyr Gly Arg Ser Arg Val Ser Gly Phe350 355 360Ala Thr Trp Ser Ile Asn Pro Ala Thr Met Val Leu Val Asp Glu365 370 375Phe Leu Ala Ile Gly Thr Gln Met Lys Thr Glu Arg Pro Gly Lys380 385 390Gly Ala Val Val Thr Pro Ala Thr Thr Ala Glu Gly Pro Ile Val395 400 405Lys Leu Lys Asp Gly Ser Val Val Arg Val Asp Asp Tyr Asn Leu410 415 420Ala Leu Lys Ile Arg Asp Glu Val Glu Glu Ile Leu Tyr Leu Gly425 430 435Asp Ala Ile Ile Ala Phe Gly Asp Phe Val Glu Asn Asn Gln Thr440 445 450Leu Leu Pro Ala Asn Tyr Val Glu Glu Trp Trp Ile Gln Glu Phe455 460 465Val Lys Ala Val Asn Glu Ala Tyr Glu Val Glu Leu Arg Pro Phe470 475 480Glu Glu Asn Pro Arg Glu Ser Val Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Leu485 490 495Glu Val Asp Pro Glu Phe Leu Ala Lys Met Leu Tyr Asp Pro Leu500 505 510Arg Val Lys Pro Pro Val Glu Leu Ala Ile His Phe Ser Glu Ile515 520 525Leu Glu Ile Pro Leu His Pro Tyr Tyr Thr Leu Tyr Trp Asn Thr530 535 540Val Asn Pro Lys Asp Val Glu Arg Leu Trp Gly Val Leu Lys Asp545 550 555Lys Ala Thr Ile Glu Trp Gly Thr Phe Arg Gly Ile Lys Phe Ala560 565 570Lys Lys Ile Glu Ile Ser Leu Asp Asp Leu Gly Ser Leu Lys Arg575 580 585Thr Leu Glu Leu Leu Gly Leu Pro His Thr Val Arg Glu Gly Ile590 595 600Val Val Val Asp Tyr Pro Trp Ser Ala Ala Leu Leu Thr Pro Leu605 610 615Gly Asn Leu Glu Trp Glu Phe Lys Ala Lys Pro Phe Tyr Thr Val620 625 630Ile Asp Ile Ile Asn Glu Asn Asn Gln Ile Lys Leu Ara Asp Ara635 640 645Gly Ile Ser Trp Ile Gly Ala Arg Met Gly Arg Pro Glu Lys Ala650 655 660Lys Glu Arg Lys Met Lys Pro Pro Val Gln Val Leu Phe Pro Ile665 670 675Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ser Arg Asp Ile Lys Lys Ala Ala Glu680 685 690Glu Gly Lys Ile Ala Glu Val Glu Ile Ala Phe Phe Lys Cys Pro695 700 705Lys Cys Gly His Val Gly Pro Glu Thr Leu Cys Pro Glu Cys Gly710 715 720Ile Arg Lys Glu Leu Ile Trp Thr Cys Pro Lys Cys Gly Ala Glu725 730 735Tyr Thr Asn Ser Gln Ala Glu Gly Tyr Ser Tyr Ser Cys Pro Lys740 745 750Cys Asn Val Lys Leu Lys Pro Phe Thr Lys Arg Lys Ile Lys Pro755 760 765Ser Glu Leu Leu Asn Arg Ala Met Glu Asn Val Lys Val Tyr Gly770 775 780Val Asp Lys Leu Lys Gly Val Met Gly Met Thr Ser Gly Trp Lys785 790 795Ile Ala Glu Pro Leu Glu Lys Gly Leu Leu Arg Ala Lys Asn Glu800 805 810Val Tyr Val Phe Lys Asp Gly Thr Ile Arg Phe Asp Ala Thr Asp815 820 825Ala Pro Ile Thr His Phe Arg Pro Arg Glu Ile Gly Val Ser Val830 835 840Glu Lys Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Thr His Asp Phe Glu Gly Lys845 850 855Pro Leu Val Ser Glu Asp Gln Ile Val Glu Leu Lys Pro Gln Asp860 865 870Val Ile Leu Ser Lys Glu Ala Gly Lys Tyr Leu Leu Arg Val Ala875 880 885Arg Phe Val Asp Asp Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Gly Leu Pro Arg890 895 900Phe Tyr Asn Ala Glu Lys Met Glu Asp Leu Ile Gly His Leu Val905 910 915Ile Gly Leu Ala Pro His Thr Ser Ala Gly Ile Val Gly Arg Ile920 925 930Ile Gly Phe Val Asp Ala Leu Val Gly Tyr Ala His Pro Tyr Phe935 940 945His Ala Ala Lys Arg Arg Asn Cys Asp Gly Asp Glu Asp Ser Val950 955 960Met Leu Leu Leu Asp Ala Leu Leu Asn Phe Ser Arg Tyr Tyr Leu965 970 975Pro Glu Lys Arg Gly Gly Lys Met Asp Ala Pro Leu Val Ile Thr980 985 990Thr Arg Leu Asp Pro Arg Glu Val Asp Ser Glu Val His Asn Met99510001005Asp Val Val Arg Tyr Tyr Pro Leu Glu Phe Tyr Glu Ala Thr Tyr101010151020Glu Leu Lys Ser Pro Lys Glu Leu Val Arg Val Ile Glu Gly Val102510301035Glu Asp Arg Leu Gly Lys Pro Glu Met Tyr Tyr Gly Ile Lys Phe104010451050Thr His Asp Thr Asp Asp Ile Ala Leu Gly Pro Lys Met Ser Leu105510601065Tyr Lys Gln Leu Gly Asp Met Glu Glu Lys Val Lys Arg Gln Leu107010751080Thr Leu Ala Glu Arg Ile Arg Ala Val Asp Gln His Tyr Val Ala108510901095Glu Thr Ile Leu Asn Ser His Leu Ile Pro Asp Leu Arg Gly Asn110011051110Leu Arg Ser Phe Thr Arg Gln Glu Phe Arg Cys Val Lys Cys Asn111511201125Thr Lys Tyr Arg Arg Pro Pro Leu Asp Gly Lys Cys Pro Val Cys113011351140Gly Gly Lys Ile Val Leu Thr Val Ser Lys Gly Ala Ile Glu Lys114511501155Tyr Leu Gly Thr Ala Lys Met Leu Val Ala Asn Tyr Asn Val Lys116011651170Pro Tyr Thr Arg Gln Arg Ile Cys Leu Thr Glu Lys Asp Ile Asp117511801185Ser Leu Phe Glu Tyr Leu Phe Pro Glu Ala Gln Leu Thr Leu Ile119011951200Val Asp Pro Asn Asp Ile Cys Met Lys Met Ile Lys Glu Arg Thr120512101215Gly Glu Thr Val Gln Gly Gly Leu Leu Glu Asn Phe Asn Ser Ser122012251230Gly Asn Asn Gly Lys Lys Ile Glu Lys Lys Glu Lys Lys Ala Lys123512401245Glu Lys Pro Lys Lys Lys Lys Val Ile Ser Leu Asp Asp Phe Phe125012551260Ser Lys Arg序列號(hào)7序列長(zhǎng)度20序列類型氨基酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Met Asp Lys Glu Gly Phe Leu Asn Lys Val Arg Glu Ala Val Asp5 10 15Val Val Lys Leu His20序列號(hào)8序列長(zhǎng)度20序列類型氨基酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Met Phe Thr Gly Lys Val Leu Ile Pro Val Lys Val Leu Lys Lys5 10 15Phe Glu Asn Trp Asn20序列號(hào)9序列長(zhǎng)度20序列類型氨基酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Met Ile Gly Ser Ile Phe Tyr Ser Lys Lys Phe Asn Leu His Arg5 10 15Pro Ser Glu Tyr His20序列號(hào)10序列長(zhǎng)度20序列類型氨基酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Met Lys Asp Tyr Arg Pro Leu Leu Gly Ala Ile Lys Val Lys Gly5 10 15Asp Asn Val Phe Ser20序列號(hào)11序列長(zhǎng)度18序列類型氨基酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Met Asp Ile Glu Val Leu Arg Arg Leu Leu Glu Arg Glu Leu Ser5 10 15Ser Glu His序列號(hào)12序列長(zhǎng)度17序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Pro Phe Glu Ile Val Phe Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Gln Leu5 10 15Ile Asp序列號(hào)13序列長(zhǎng)度17序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列ATGGATAARG ARGGNTT 17序列號(hào)14序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列AATAAAGTWA GRGARGCNGT 20序列號(hào)15序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列CTCTGCGGCA ATTCTTGCAA 20序列號(hào)16序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列CTTGCAAAGA AGTATGTAAC 20序列號(hào)17序列長(zhǎng)度2009序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類基因組DNA序列AAGCTTCCAA AGAACTGGCG TTACGACCCA GAGACTGCAA AGTTGCTCGT CCGCTGATCC 60TTCCCTATAT TTTCATTTGG TGTTTTTCAT GGATAAGGAG GGTTTTTTGA ACAAGGTTAG 120GGAGGCTGTG GATGTAGTAA AGCTCCACAT CGAGTTAGGT CATACTATAA GGATAATCTC 180TCATAGGGAT GCGGATGGAA TAACCTCTGC GGCAATTCTT GCAAAGGCTT TGGGAAGAGA 240AGGAGCGAGC TTTCACATTT CGATTGTTAA ACAGGTAAGT GAAGATCTTT TAAGAGAATT 300AAAGGATGAA GATTACAAAA TCTTCATTTT TTCCGACCTG GGTAGTGGTT CTTTAAGTTT 360GATAAAAGAG TATCTTAAGG AAAAAACTGT TATAATCCTT GATCACCATC CTCCGGAAAA 420TGTGAAGTTG GAAGAAAAGC ATATACTTGT TAATCCAGTT CAATTTGGCG CAAATAGCGT 480TAGGGATCTG AGTGGATCTG GGGTTACATA CTTCTTTGCA AGGGAGCTAA ATGAAAAGAA 540TAGGGACCTT GCTTACATTG CAATAGTGGG AGCAGTTGGG GATATGCAAG AGAACGATGG 600AGTTTTCCAT GGGATGAACC TTGATATTAT TGAAGATGGG AAATCTCTGG GAATTCTTGA 660GGTTAAAAAA GAATTGCGCC TGTTTGGTAG GGAAACTAGA CCTCTCTATC AAATGCTCGC 720ATATGCCACA AATCCGGAAA TTCCTGAAGT TACTGGAGAC GAGAGGAAGG CCATAGAGTG 780GTTAAAGAAC AAGGGCTTCA ATCCCGAGAA AAAATATTGG GAATTAAGTG AGGAGGAAAA 840GAAAAAGTTA CATGATTTCC TAATCATTCA CATGATCAAG CATGGAGCTG GAAAAGAGGA 900TATAGATAGG CTAATAGGAG ACGTTGTTAT TAGTCCCTTA TATCCTGAAG GGGATCCCAG 960GCACGAGGCT AGAGAATTTG CTACCCTATT AAACGCTACA GGCAGGTTAA ACTTGGGCAA 1020CTTAGGAGTG GCTGTATGTT TGGGAGATGA GGAGGCTTTC AGAAAGGCCC TAAAGATGGT 1080TGAAGACTAC AAGAGGGAGC AAATTGAAGC AAGAAAGTGG CTACTTCAAA ATTGGAACAG 1140TGAAGTTTGG GAGGGGGATC ATGTTTACGT CTTATATGTG GGAAAGAGTA TTAGAGATAC 1200TCTCGTTGGA ATAGCAGCTA GCATGGCCAT CAATGCTGGA CTGGCAGATC CTGAAAAGCC 1260GGTTATAGTG TTTGCAGATA CTGATGAAGA TCCAAACCTT CTCAAAGGTT CAGCTAGAAC 1320AACTGAAAGG GCTTTAGCTA AGGGTTACAA TTTGGGAGAA GCTCTTAGGA AAGCGGCTGA 1380GCTAGTGAAT GGGGAAGGGG GAGGACACGC GATAGCTGCA GGTATAAGAA TTCCCAGGGC 1440CAGGTTGGCG GAGTTTAGAA AATTAATAGA TAAAATCCTT GGAGAACAGG TGAGCAAAGG 1500TGGAGATAAA AGCGAAAGCT GAAATATTGT GGGAGTACAG CGATGAGAAG GTTGCTGAGG 1560CTATTGCGAA GTCTGTTGAT GTTGATAATA TTTCTCTCCC TCCAAACCTC AAGAAAAGTT 1620TAAATCTTAT GACGTTTTCC GATGGAGCGA AGGTAATAAC AAAGGTTAAA TATCATGGAG 1680AAATTGAGAC TCTCATAGTT GCTCTCGATG ATTTGATATT CGCTGTAAAA GTTGCTGAGG 1740AGGTGTTATG ATGGTGNGAA AAGGGNAACA ACAACANGGG ATAAGGGAAG NTGAAGCAAT 1800GGTATATTAT TTATGCTCCN GANTTCTTGG GCGGGGTAGA GGTAGGATTA ACGCCAGCAG 1860ACGATCCAGA GAAAGTACTC AACAGAGTCG TTGAAGTTAC TCTGAAGGAT GTTACAGGAG 1920ACTTTACAAA GAGTCACGTG AAGCTCTATT TCCAAGTATA TGATGTCAAG GGACAGAATG 1980CCTACACAAA GTTCAAGGGA ATGAAGCTT 2009序列號(hào)18序列長(zhǎng)度1434序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類基因組DNA序列ATGGATAAGG AGGGTTTTTT GAACAAGGTT AGGGAGGCTG TGGATGTAGT AAAGCTCCAC 60ATCGAGTTAG GTCATACTAT AAGGATAATC TCTCATAGGG ATGCGGATGG AATAACCTCT 120GCGGCAATTC TTGCAAAGGC TTTGGGAAGA GAAGGAGCGA GCTTTCACAT TTCGATTGTT 180AAACAGGTAA GTGAAGATCT TTTAAGAGAA TTAAAGGATG AAGATTACAA AATCTTCATT 240TTTTCCGACC TGGGTAGTGG TTCTTTAAGT TTGATAAAAG AGTATCTTAA GGAAAAAACT 300GTTATAATCC TTGATCACCA TCCTCCGGAA AATGTGAAGT TGGAAGAAAA GCATATACTT 360GTTAATCCAG TTCAATTTGG CGCAAATAGC GTTAGGGATC TGAGTGGATC TGGGGTTACA 420TACTTCTTTG CAAGGGAGCT AAATGAAAAG AATAGGGACC TTGCTTACAT 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Ser Met Ala Ile Asn Ala Gly Leu Ala Asp Pro Glu Lys380 385 390Pro Val Ile Val Phe Ala Asp Thr Asp Glu Asp Pro Asn Leu Leu395 400 405Lys Gly Ser Ala Arg Thr Thr Glu Arg Ala Leu Ala Lys Gly Tyr410 415 420Asn Leu Gly Glu Ala Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Val Asn Gly425 430 435Glu Gly Gly Gly His Ala Ile Ala Ala Gly Ile Arg Ile Pro Arg440 445 450Ala Arg Leu Ala Glu Phe Arg Lys Leu Ile Asp Lys Ile Leu Gly455 460 465Glu Gln Val Ser Lys Gly Gly Asp Lys Ser Glu Ser470 475序列號(hào)20序列長(zhǎng)度31序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列TTCATTTGGT GTTTTCCATG GATAAGGAGG G 31序列號(hào)21序列長(zhǎng)度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列AAAGTWYTAA TWCCWGTNAA RGT23序列號(hào)22序列長(zhǎng)度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列AAAGTWYTAA AAAARTTYGA RAA23序列號(hào)23序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GATACTGCTA GAAGATTGGA20序列號(hào)24序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列TTCGTACAGT 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Glu Ala Lys Glu Leu Ile35 40 45Glu Glu Ala Ile Lys Glu Gly Ile Ile Glu Glu Thr Pro Glu Gly50 55 60Leu Ile Val His Glu Asp Ala Ile Thr Glu Lys Glu Ser Lys Arg65 70 75Asp Ile Phe Gly Glu Met Val Glu Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Glu80 85 90Leu Ser Glu Ile Glu Val Leu Glu Glu Ile Glu Lys Met Lys Glu95 100 105Arg Tyr Gly Asn Leu Asp Lys Lys Ile Leu Ala Tyr Leu Phe Gly110 115 120Leu Ser Lys Gly Val Asn Met Glu Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Glu125 130 135Asp Glu序列號(hào)35序列長(zhǎng)度33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列AAAGCTAAGG GAGGACATAT GAAAGACTAT AGG33序列號(hào)36序列長(zhǎng)度35序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列TCAAACCACT CCTCGAATTC CTCAGTGTAC TTTTC 35序列號(hào)37序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列CCWTTYGARA TWGTWTTYGA 20序列號(hào)38序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GGWGCWAARG ARTTYGCNCA 20序列號(hào)39序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列AACTTATAGA CACCGCAAGT 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21序列號(hào)57序列長(zhǎng)度21序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列ACTACAGCGG CTTTGGCCCT T 21序列號(hào)58序列長(zhǎng)度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GATGAGTTCG TGTCCGTACA ACT 23序列號(hào)59序列長(zhǎng)度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列ACAAAGCCAG CCGGAATATC TG22序列號(hào)60序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GCTTCTAAAT CATTDATNGC 20序列號(hào)61序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GCGTGGATAG AGAGCTGGTT 20序列號(hào)62序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列CTCTGGGTTA ACCTCTTGTA 20序列號(hào)63序列長(zhǎng)度1437序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類基因組DNA序列ATGCCAGAGC TTCCCTGGGT AGAAAAATAC AGGCCAAAAA AGTTAAGTGA AATTGTAAAC 60CAAGAAGAGG CTATAGAGAA AGTTAGAGCG TGGATAGAGA GCTGGTTGCA TGGCCACCCC 120CCTAAGAAAA AAGCGCTATT ATTAGCAGGA CCCCCAGGGA GCGGAAAGAC AACCACAGTC 180TACGCTCTAG CAAATGAGTA CAACTTTGAA GTCATTGAGC TCAACGCGAG TGATGAGAGA 240ACTTATGAAA AAATCTCCAG GTATGTTCAA GCAGCATACA CTATGGATAT CCTCGGAAAG 300AGGAGGAAGA TAATCTTCCT CGATGAAGCA GATAATATAG 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Lys Ala140 145 150Glu Leu Val Glu Tyr Lys Arg Leu Thr Gln Arg Asp Val Met Asn155 160 165Ala Leu Ile Arg Ile Leu Lys Arg Glu Gly Ile Thr Val Pro Lys170 175 180Glu Ile Leu Leu Glu Ile Ala Lys Arg Ser Ser Gly Asp Leu Arg185 190 195Ala Ala Ile Asn Asp Leu Gln Thr Val Val Val Gly Gly Tyr Glu200 205 210Asp Ala Thr Gln Val Leu Ala Tyr Arg Asp Val Glu Lys Thr Val215 220 225Phe Gln Ala Leu Gly Leu Val Phe Gly Ser Asp Asn Ala Lys Arg230 235 240Ala Lys Met Ala Met Trp Asn Leu Asp Met Ser Pro Asp Glu Phe245 250 255Leu Leu Trp Val Asp Glu Asn Ile Pro His Leu Tyr Leu Asn Pro260 265 270Glu Glu Ile Ala Gln Ala Tyr Asp Ala Ile Ser Arg Ala Asp Ile275 280 285Tyr Leu Gly Arg Ala Ala Arg Thr Gly Asn Tyr Ser Leu Trp Lys290 295 300Tyr Ala Ile Asp Met Met Thr Ala Gly Val Ala Val Ala Gly Arg305 310 315Lys Arg Arg Gly Phe Val Lys Phe Tyr Pro Pro Asn Thr Leu Lys320 325 330Ile Leu Ala Glu Ser Lys Glu Glu Arg Glu Ile Arg Glu Ser lle335 340 345Ile Lys Lys Ile Ile Arg Glu Met His Met Ser Arg Leu Gln Ala350 355 360Ile Glu Thr Met Lys Ile Ile Arg Glu Ile Phe Glu Asn Asn Leu365 370 375Asp Leu Ala Ala His Phe Thr Val Phe Leu Gly Leu Ser Glu Lys380 385 390Glu Val Glu Phe Leu Ala Gly Lys Glu Lys Ala Gly Thr Ile Trp395 400 405Gly Lys Ala Leu Ala Leu Arg Arg Lys Leu Lys Glu Leu Gly Ile410 415 420Arg Glu Glu Glu Lys Pro Lys Val Glu Ile Glu Glu Glu Glu Glu425 430 435Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Glu Lys Glu Glu Ile Glu Glu Lys440 445 450Pro Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Lys Glu Lys Glu Lys Pro455 460 465Lys Lys Gly Lys Gln Ala Thr Leu Phe Asp Phe Leu Lys Lys470 475序列號(hào)65序列長(zhǎng)度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列ATGGATATWG ARGTDYTNAG RAG 23序列號(hào)66序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列ATWGARGTWY TWAGRAGRYT 20序列號(hào)67序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GAGAGAGAAC TTTCAAGCGA 20序列號(hào)68序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列CTCTAAGAAG ATATGCCTCT 20序列號(hào)69序列長(zhǎng)度558序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類基因組DNA序列ATGGATATTG AGGTTCTCAG AAGATTATTG GAGAGAGAAC TTTCAAGCGA AGAACTGACT 60AAAATAGAGG AAGAATTTTA TGACGATTTA GAAAGCTTTA GAAAAGCCTT GGAAATCAAT 120GCCGAGAGAC ATGAAGAAAG AGGAGAGGAC ATTCACAAAA AGCTGTATTT AGCTCAACTA 180TCTTTGGTTA GGAATCTTGT TAGAGAAATA TTAAGGATTA GGTTGCATAA GATTGTTGAT 240ATGGCATTTG AGGGAGTTCC CAGAAATTTA GTTGGAGATG AAAAGAAAAT ATACAAGATA 300ATAACAGCTT TCATAAATGG AGAACCTCTT GAAATTGAAA CGGCAGGAGA AGAGAGTATT 360GAAGTTATTG AAGAGGAAAA AGAAACATCT CCTGGGATAA TAGAGGCATA TCTTCTTAGA 420GTTGATATTC CCAAAATATT GGATGAAAAT TTGAGAGAAT ATGGGCCCTT CAAGGCTGGC 480GATCTTGTTG TATTGCCGAA GTCTATTGGC AGGGTACTCA TTCAGAGGGA TGCCGCGGAT 540AAGGTATTGA TACAATTG558序列號(hào)70序列長(zhǎng)度186序列類型氨基酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類肽序列Met Asp Ile Glu Val Leu Arg Arg Leu Leu Glu Arg Glu Leu Ser5 10 15Ser Glu Glu Leu Thr Lys Ile Glu Glu Glu Phe Tyr Asp Asp Leu20 25 30Glu Ser Phe Arg Lys Ala Leu Glu Ile Asn Ala Glu Arg His Glu35 40 45Glu Arg Gly Glu Asp Ile His Lys Lys Leu Tyr Leu Ala Gln Leu50 55 60Ser Leu Val Arg Asn Leu Val Arg Glu Ile Leu Arg Ile Arg Leu65 70 75His Lys Ile Val Asp Met Ala Phe Glu Gly Val Pro Arg Asn Leu80 85 90Val Gly Asp Glu Lys Lys Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ala Phe Ile95 100 105Asn Gly Glu Pro Leu Glu Ile Glu Thr Ala Gly Glu Glu Ser Ile110 115 120Glu Val Ile Glu Glu Glu Lys Glu Thr Ser Pro Gly Ile Ile Glu125 130 135Ala Tyr Leu Leu Arg Val Asp Ile Pro Lys Ile Leu Asp Glu Asn140 145 150Leu Arg Glu Tyr Gly Pro Phe Lys Ala Gly Asp Leu Val Val Leu155 160 165Pro Lys Ser Ile Gly Arg Val Leu Ile Gln Arg Asp Ala Ala Asp170 175 180Lys Val Leu Ile Gln Leu185序列號(hào)71序列長(zhǎng)度33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列TTTAATTTG GGGATAACCAT GGATATTGAG GTT 33序列號(hào)72序列長(zhǎng)度31序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列TAGGATGGGT TTTGGATCCT CTCATTGGAG G 31序列號(hào)73序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列ATGATWGGWW SWATHTTYTA20序列號(hào)74序列長(zhǎng)度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列AAGAAGTTTA ATYTDCAYAG RCC23序列號(hào)75序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列TGAGTATCAT CCAGAGAATC20序列號(hào)76序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列TCACATCGGG ATCGTTCCAG20序列號(hào)77序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GATTTTGACG CTCATCATGG20序列號(hào)78序列長(zhǎng)度20序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GGAAAGAACG ATTTCGAGTC 20序列號(hào)79序列長(zhǎng)度1005序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類基因組DNA序列ATGATTGGCT CAATATTTTA TTCCAAGAAG TTTAACCTCC ATAGACCTAG TGAGTATCAT 60CCAGAGAATC CCAAGAGACT CGAAATCGTT CTTTCCAAGG TCAGAGAGCT TGGACTTGAA 120GAAAGAATAG AAGAACCAAA CCCAGTTGAA GAGACTTTCG TTGAGAAAAT TCACGACAGG 180GATTACATCA ACTTCGTTAA AGAGGCCGTT GAAAAAGGAA TCACAAGACT TGATCCAGAC 240ACTTATGTTT CTCCTGGGAC TTGGAGTGCG GCATTGTTAG CTTTAGGAGC CGCAAGGAGT 300GCAGCTTTAT CAGCCCTTCA CTATGGAGGC CTCCACATGG CTCTAGTTAG GCCCCCTGGG 360CATCATGCAG GGAGAAGAGG AAGGGCCATG GGTGCCCCAA CACTAGGCTT CTGCATCTTC 420AACAACGCGG CCTCTGCAGT TGTCACCTTG AAAGAAGAGG GAGTTGGAAA AGTTGTTGTA 480ATAGATTTTG ACGCTCATCA 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Tyr Val Ser Pro Gly Thr Trp Ser Ala80 85 90Ala Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Arg Ser Ala Ala Leu Ser Ala95 100 105Leu His Tyr Gly Gly Leu His Met Ala Leu Val Arg Pro Pro Gly110 115 120His His Ala Gly Arg Arg Gly Arg Ala Met Gly Ala Pro Thr Leu125 130 135Gly Phe Cys Ile Phe Asn Asn Ala Ala Ser Ala Val Val Thr Leu140 145 150Lys Glu Glu Gly Val Gly Lys Val Val Val Ile Asp Phe Asp Ala155 160 165His His Gly Asn Gly Thr Gln Glu Ile Phe Trp Asn Asp Pro Asp170 175 180Val Ile His Ile Asp Leu His Glu Arg Asp Ile Tyr Pro Gly Ser185 190 195Gly Asp Val Ser Glu Val Gly Gly Ser Asn Ala Tyr Gly Ser Lys200 205 210Ile Asn Leu Pro Met Pro His Tyr Ser Gly Asp Gly Asp Tyr Ile215 220 225Tyr Val Trp Asp Glu Ile Val Leu Pro Ile Val Glu Glu Val Lys230 235 240Pro Lys Val Ile Val Ile Ser Ala Gly Phe Asp Gly Phe Lys Gly245 250 255Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Leu Thr Glu Ser Phe Tyr Ser Tyr260 265 270Ala Gly Ala Thr Leu Asn Lys Tyr Pro Leu Ala Phe Ile Leu Glu275 280 285Gly Gly Tyr Gly Val Gly Leu Asp Lys Gly Phe Pro 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AATAGAAGAA AAACCCGAAG AAGAGAAAGA AGAGGAGAAG 1380AAAGAAAAGG AAAAGCCAAA GAAAGGCAAA CAAGCAACTC TCTTTGACTT TCTTAAAAAG 1440TGATTACCCT TTTTCTTCTA TTAGAGCTCC GAATAAAGTT GGCCCTCTAA TTTTTTCTAT 1500TGTCTCCTCC ACATTAATCT TTACGAATTC GAGCTCCAGC AACAACAATA ACCCAAGATG 1560GAAAGGACTT TGGAGTAAGG TACTTTGGAT TACCGGCAGG TCATGAGTTC GCAGCATTCT 1620TAGAGGACAT TGTGGATGTT AGTAGAGAAG AAACAAACCT TATGGACGAG ACAAAACAGG 1680CCATCAGAAA CATAGACCAG GATGTAAGAA TATTGGTGTT TGAAACTCCA ACATGCCCAT 1740ACTGTCCACT TGCCGTTAGA ATGGCTCACA AGTTTGCCAT TGAAAACACA AAAGCTGGGA 1800AAGGTAAGAT ACTTGGGGAT ATGGTCGAGG CCATTGAGTA TCCAGAGTGG GCTGACCAGT 1860ACAATGTAAT GGCAGTACCA AAAATTGTTA TTCAGGTCAA CGGAGAAGAC AGAGTAGAAT 1920TTGAAGGAGC TTATCCAGAG AAAATGTTCT TAGAGAAGTT ACTCTCAGCT CTCAGCTGAT 1980CTACTGTTTT TCCTTCTTTT CTTCTGTTCT GTTATTGCCT AGGATAAGCT TAATAATACT 2040TTGATACCTT TCTTAGTTTA GGTGTGTGAG AGTATGAGCG AAGAGATTAG AGAAGTTAAG 2100GTTCTAGAAA AACCCTGGGT TGAGAAGTAT AGACCTCAAA GACTTGACGA CATTGTAGGA 2160CAAGAGCACA TAGTGAAAAG GCTCAAGCAC TACGTCAAAA CTGGATCAAT GCCCCACCTA 2220CTCTTCGCAG GCCCCCCTGG TGTCGGAAAG ACTACAGCGG CTTTGGCCCT TGCAAGAGAG 2280CTTTTCGGCG AAAACTGGAG GCATAACTTC CTCGAGTTGA ATGCTTCAGA TGAAAGAGGT 2340ATAAACGTAA TTAGAGAGAA AGTTAAGGAG TTTGCGAGAA CAAAGCCTAT AGGAGGAGCA 2400AGCTTCAAGA TAATTTTCCT TGATGAGGCC GACGCTTTAA CTCAAGATGC CCAACAAGCC 2460TTAAGAAGAA CCATGGAAAT GTTCTCGAGT AACGTTCGCT TTATCTTGAG CTGTAACTAC 2520TCCTCCAAGA TAATTGAACC CATACAGTCT AGATGTGCAA TATTCCGCTT CAGACCTCTC 2580CGCGATGAGG ATATAGCGAA GAGACTAAGG TACATTGCCG AAAATGAGGG CTTAGAGCTA 2640ACTGAAGAAG GTCTCCAAGC AATACTTTAC ATAGCAGAAG GAGATATGAG AAGAGCAATA 2700AACATTCTGC AAGCTGCAGC AGCTCTAGAC AAGAAGATCA CCGACGAAAA CGTATTCATG 2760GTAGCGAGTA GAGCTAGACC TGAAGATATA AGAGAGATGA TGCTTCTTGC TCTCAAAGGC 2820AACTTCTTGA AGGCCAGAGA AAAGCTTAGG GAGATACTTC TCAAGCAAGG ACTTAGTGGA 2880GAAGATGTAC TAGTTCAGAT GCACAAAGAA GTCTTCAACC TGCCAATAGA GGAGCCAAAG 2940AAGGTTCTGC TTGCTGATAA GATAGGAGAG TATAACTTCA GACTCGTTGA AGGGGCTAAT 3000GAAATAATTC AGCTTGAAGC ACTCTTAGCA CAGTTCACCC TAATTGGGAA GAAGTGATGA 3060AGTATGCCAG AGCTTCCCTG GGTAGAAAAA TACAGGCCAA AAAAGTTAAG TGAAATTGTA 3120AACCAAGAAG AGGCTATAGA GAAAGTTAGA GCGTGGATAG AGAGCTGGTT GCATGGCCAC 3180CCCCCTAAGA AAAAAGCCGT ATTATTAGCA GGACCCCCAG GGAGCGGAAA GACAACCACA 3240GTCTACGCTC TAGCAAATGA GTACAACTTT GAAGTCATTG AGCTCAACGC GAGTGATGAG 3300AGAACTTATG AAAAAATCTC CAGGTATGTT CAAGCAGCAT ACACTATGGA TATCCTCGGA 3360AAGAGGAGGA AGATAATCTT CCTCGATGAA GCAGATAATA TAGAGCCCAG CGGAGCTAAG 3420GAAATCGCAA AACTAATTGA TAAGGCCAAA AATCCAATAA TAATGGCTGC AAATAAGTAC 3480TGGGAAGTTC CAAAAGAGAT CCGAGAAAAA GCTGAGCTAG TAGAGTACAA GAGGTTAACC 3540CAGAGAGATG TAATGAATGC CTTAATAAGG ATCC 3574序列號(hào)84序列長(zhǎng)度33序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列TACTTGTAAT ATTCTCATAT GATTGGCTCA ATA33序列號(hào)85序列長(zhǎng)度35序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GATGAGTTCG TGTCCGTACA ACTGGCGTAA TCATG 35序列號(hào)86序列長(zhǎng)度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GGTTATCGAA ATCAGCCACA GCGCC 25序列號(hào)87序列長(zhǎng)度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GCGTACCTTT GTCTCACGGG CAA23序列號(hào)88序列長(zhǎng)度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GATAGCTGTC GTCATAGGAC TC 22序列號(hào)89序列長(zhǎng)度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列CTTAACCAGT GCGCTGAGTG ACT 23序列號(hào)90序列長(zhǎng)度28序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列GACAATCTGG AATACGCCAC CTGACTTG 28序列號(hào)91序列長(zhǎng)度28序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列TTGCCACTTC CGTCAACCAG GCTTATCA 28序列號(hào)92序列長(zhǎng)度29序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)直鏈序列的種類其它核酸(合成DNA)序列TGTCCGTCAG CTCATAACGG TACTTCACG 29
權(quán)利要求
1.耐熱性DNA聚合酶相關(guān)因子，它能促進(jìn)DNA聚合酶所具有的DNA合成活性。
2.權(quán)利要求1的DNA聚合酶相關(guān)因子，它還具有與DNA聚合酶結(jié)合的活性。
3.權(quán)利要求2的DNA聚合酶相關(guān)因子，它具有與DNA聚合酶結(jié)合的活性，該DNA聚合酶含有具有序列表的序列號(hào)5或6中所示氨基酸序列的DNA聚合酶組成蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1～3任一權(quán)項(xiàng)中的DNA聚合酶相關(guān)因子，它含有選自序列表的序列號(hào)1，3，19，27，34，64，70和80中的至少一種氨基酸序列，或者含有該堿基序列中有1個(gè)以上的氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加或插入的氨基酸序列。
5.編碼DNA聚合酶相關(guān)因子的基因，該DNA聚合酶相關(guān)因子具有促進(jìn)DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的活性，它含有選自序列表的序列號(hào)1，3，19，27，34，64，70和80中的至少一種氨基酸序列，或者含有該堿基序列中有1個(gè)以上的氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加或插入的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求5的基團(tuán)，它含有選自序列表的序列號(hào)2，4，18，26，33，63，69和79中的至少一種堿基序列，或含有該堿基序列中有1個(gè)以上的堿基發(fā)生了置換、缺失、添加或插入的堿基序列。
7.編碼DNA聚合酶相關(guān)因子的基團(tuán)，能與權(quán)利要求5或6中的基因進(jìn)行雜交，且具有促進(jìn)DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的活性。
8.DNA聚合酶相關(guān)因子的制備方法，其特征在于其工序如下培養(yǎng)含有權(quán)利要求5-7任一權(quán)項(xiàng)中基因的轉(zhuǎn)化體，從該培養(yǎng)物中獲取能促進(jìn)DNA聚合酶所具有的DNA合成活性的耐熱性DNA聚合酶相關(guān)因子。
9.使用DNA聚合酶合成DNA的方法，其特征在于在權(quán)利要求1-4任一權(quán)項(xiàng)中的DNA聚合酶相關(guān)因子存在的條件下合成DNA。
10.權(quán)利要求9的DNA合成方法，它是在2種以上的DNA聚合酶相關(guān)因子存在的條件下合成DNA。
11.權(quán)利要求10的DNA合成方法，它是在F7、PFU-RFC和PFU-RFCLS作為DNA聚合酶相關(guān)因子存在的條件下合成DNA。
12.權(quán)利要求9-11任一權(quán)項(xiàng)中的DNA合成方法，其中DNA聚合酶為耐熱性DNA聚合酶。
13.權(quán)利要求12的DNA合成方法，它通過PCR來實(shí)施。
14.試管內(nèi)合成DNA試劑盒，它含有權(quán)利要求1-4任一權(quán)項(xiàng)中的DNA聚合酶相關(guān)因子和DNA聚合酶。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，它還含有進(jìn)行DNA合成反應(yīng)所必要的試劑。
16.權(quán)利要求14或15的試劑盒，它含有2種以上的DNA聚合酶相關(guān)因子。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，它所含有的DNA聚合酶相關(guān)因子是F7、PFU-RFC和PFU-RFCLS。
18.權(quán)利要求14-17任一權(quán)項(xiàng)中的試劑盒，它所含有的DNA聚合酶為耐熱性DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進(jìn)DNA聚合酶DNA合成活性的耐熱性DNA聚合酶相關(guān)因子,具有與DNA聚合酶結(jié)合活性的耐熱性DNA聚合酶相關(guān)因子及其制備方法,編碼上述DNA聚合酶相關(guān)因子的基因,在上述DNA聚合酶相關(guān)因子存在下,用DNA聚合酶合成DNA的方法及其含有上述DNA聚合酶相關(guān)因子的試劑盒。通過利用本發(fā)明的DNA聚合酶相關(guān)因子,提供比以往優(yōu)越的試管內(nèi)DNA合成及DNA擴(kuò)增體系。
文檔編號(hào)C12N9/12GK1268975SQ98808652
公開日2000年10月4日 申請(qǐng)日期1998年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月26日
發(fā)明者上森隆司, 佐藤好美, 藤田朋子, 三宅一惠, 向井博之, 淺田起代蔵, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社